JP2008128774A - Substrate for substance analysis and system - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、基板上で実施可能な溶質分子の新規な二次元分離とその検出技術に関する。より詳細には、円盤状の基板上で等電点電気泳動に続いて沈降分離(遠心分離)を実施し、分離された溶質分子を正確に検出等する技術に関する。 The present invention relates to a novel two-dimensional separation of solute molecules that can be performed on a substrate and a detection technique thereof. More specifically, the present invention relates to a technique for accurately detecting a separated solute molecule by performing sedimentation separation (centrifugation) following isoelectric focusing on a disk-shaped substrate.
基板に所定形状に形成された領域や流路において、種々のハイブリダイゼーションや分子間の相互作用又は反応などの生化学的プロセスを進行させ、これを検出する技術がある。DNAチップ(DNAマイクロアレイ)やタンパクチップと称されるセンサーチップはその代表的なものである。このようなセンサーチップ用基板の形態や構造は目的に応じて様々であるが、その中には、円盤状をなす基板上に反応場や流路を形成したものが提案されている。 There is a technique for detecting and detecting biochemical processes such as various hybridizations and interactions or reactions between molecules in a region or a channel formed in a predetermined shape on a substrate. Sensor chips called DNA chips (DNA microarrays) and protein chips are typical examples. The form and structure of such a sensor chip substrate vary depending on the purpose. Among them, a substrate in which a reaction field or a flow path is formed on a disk-like substrate has been proposed.
例えば、特許文献1には、円盤状をなしている基板上に、放射状をなす溝構造が複数形成された構成のバイオアッセイ用基板が開示されている。このバイオアッセイ用基板の用途の一つはDNAチップである。
For example,
特許文献2には、円盤状基板上に配設した反応場に電界印加を行うように工夫した技術が開示されている。この技術は、ハイブリダイゼーション反応の精度向上をひとつの目的としている。
特許文献3には、基板上に形成したキャピラリ内をゲル状の媒体を充填しおいて、試料の電気泳動を実施する技術が開示されている。キャピラリは、基板の内径側から外径側に延びており、遠心力によりキャピラリ内にゲルの流れを形成し、このゲルの流れと逆の方向に電気泳動を行う。
次に、試料溶液中に含まれる複数種の溶質分子をその性質や分子量に基づいて分離(分画)する方法として、「二次元電気泳動法」が知られている。この二次元電気泳動法は、広義には、順番に二つの方向(次元)へ電気泳動を行って溶質分子の分離・解析を行う方法を指すが、狭義には、等電点電気泳動を行い、続く二次元目にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下略称、SDS-PAGE)を行う方法を意味し、現在この方法は、特に、多種類のタンパク質の分離・分析に広く利用されている。なお、等電点電気泳動は、pH勾配の存在下で溶質分子(両性電解質)を電気泳動すると等電点(電荷が0となる点)まで移動して止まって、各溶質分子が等電点の順に並ぶという原理であり、SDS-PAGEは、アクリルアミドとN,N’-メチレンビスアクリルアミドの混合溶液中で重合形成した分子ふるい中を、溶質分子にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を結合して分子量に対応する負電荷を与え、これにより陽極側へ移動させて分画する原理である。 Next, “two-dimensional electrophoresis” is known as a method for separating (fractionating) a plurality of types of solute molecules contained in a sample solution based on their properties and molecular weight. This two-dimensional electrophoresis method, in a broad sense, refers to a method of separating and analyzing solute molecules by sequentially performing electrophoresis in two directions (dimensions), but in a narrow sense, performing isoelectric focusing. This means a method of performing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter abbreviated as SDS-PAGE) in the second dimension, and this method is currently widely used for separation and analysis of many kinds of proteins. In isoelectric focusing, when a solute molecule (amphoteric electrolyte) is electrophoresed in the presence of a pH gradient, it moves to the isoelectric point (the point at which the charge becomes 0) and stops, and each solute molecule is isoelectric. SDS-PAGE is a molecular sieve in which sodium dodecyl sulfate (SDS) is bound to a solute molecule in a molecular sieve polymerized in a mixed solution of acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide. This is the principle of applying a negative charge corresponding to, and moving it to the anode side for fractionation.
近年では、上記二次元電気泳動法を基板上で行う技術が提案されている。例えば、第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体が互いに間隔をおいて形成された基板を用いて、第1の電気泳動分離媒体に電場を形成した後、この第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して垂直方向に電場を与えることにより、第2の分離媒体に分離する技術が提案されている(特許文献4参照)。また、マイクロチップの分離チャンネルに泳動電場を形成し、微量のタンパク質試料を、分子量と等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法も提案されている(特許文献5参照)。
本発明では、円盤状基板の形態的特性を有効に活用して、試料中の溶質分子群の分離、検出、回収、分析(測定)を、短時間で簡易に、かつ、高精度に実施できる新規な二次元分離泳動技術を提供することを主な目的とする。 In the present invention, the morphological characteristics of the disk-shaped substrate can be effectively utilized to perform separation, detection, recovery, and analysis (measurement) of a solute molecule group in a sample in a short time with high accuracy. The main purpose is to provide a novel two-dimensional separation electrophoresis technique.
本発明では、まず、円盤状をなす基板の所定箇所に設けられた試料導入部と、前記試料導入部に連通し、等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子を分離可能な一次元目分離路と、前記一次元目分離路に連通し、前記基板の半径方向外側へ延設されたキャピラリからなる二次元目分離路と、前記二次元目分離路から分離溶液を回収する回収部と、を少なくとも備えた物質分析用基板を提供する。 In the present invention, first of all, a sample introduction part provided at a predetermined position of a disk-shaped substrate and a first dimension that communicates with the sample introduction part and can separate solute molecules in the sample by isoelectric focusing. A separation path, a second dimension separation path composed of a capillary communicated with the first dimension separation path and extending radially outward of the substrate, and a recovery unit for recovering the separation solution from the second dimension separation path; , At least a substrate for substance analysis.
この発明では、試料導入→等電点電気泳動による一次元目分離→キャピラリ内での二次元目分離→キャピラリ(二次元目分離路)からの試料回収、という一連の作業工程を、同一基板上で、各工程の実行タイミングを制御しながら行うことが可能となる。 In this invention, a series of operation steps of sample introduction → first-dimensional separation by isoelectric focusing → second-dimensional separation in the capillary → sample recovery from the capillary (second-dimensional separation path) are performed on the same substrate. Thus, it is possible to carry out while controlling the execution timing of each process.
本発明では、前記二次元目分離路における試料分離手段や方法は、特に限定していないが、例えば、この二次元目分離路では、前記基板を回転させた際に得られる遠心力によって、沈降平衡時の分子量に依存した濃度勾配が形成される構成としてもよい。即ち、二次元目分離を沈降平衡法に基づいて行うようにしてもよい。 In the present invention, the sample separation means and method in the second dimension separation path are not particularly limited. For example, in the second dimension separation path, sedimentation is caused by centrifugal force obtained when the substrate is rotated. It is good also as a structure in which the concentration gradient depending on the molecular weight at the time of equilibrium is formed. That is, the second dimension separation may be performed based on the sedimentation equilibrium method.
この「沈降平衡法」は、遠心力の作用によって溶質分子が沈降して濃度勾配が生じると、その濃度勾配に逆らう拡散力が働き、最終的には遠心力と核酸力の釣り合い(沈降平衡)に基づいて分子量に依存した濃度勾配が形成されるという原理に基づいた方法であって、所定のデータ解析によって、溶質分子の分子量、解離定数(あるいは平衡定数)、化学量論、さらには、分子量と沈降係数から求めた摩擦係数により分子形状の推測も可能である。 In this “sedimentation equilibrium method”, when a solute molecule settles due to the action of centrifugal force and a concentration gradient occurs, a diffusion force works against the concentration gradient, and finally the balance between centrifugal force and nucleic acid force (precipitation equilibrium). Is a method based on the principle that a concentration gradient depending on the molecular weight is formed based on the molecular weight of the solute molecule, the molecular weight of the solute molecule, the dissociation constant (or equilibrium constant), the stoichiometry, and the molecular weight. The molecular shape can be estimated from the friction coefficient obtained from the sedimentation coefficient.
なお、超遠心分析には、比較的低速の遠心で行う前記沈降平衡法と、高速で行う沈降速度法がある。この「沈降速度法」は、前記沈降平衡法に較べて短時間(1−2時間)で行える方法であって、分子の均一性に関しては平衡法よりも敏感である。このため、一般に、試料の均一性の検定に用いられ、同時に各成分の沈降係数を決定することもできる。沈降係数と分子量が与えられると分子の大まかな形状も推定することができる。原理的には沈降界面の形状の経時変化を調べることによって、沈降係数だけでなく、拡散係数を同時に測定でき、その結果、Svedbergの式から分子量を求めることもでき、界面の形状の経時変化をLammの方程式の数値解でシミュレートし、最小自乗法で沈降係数sと拡散係数Dを同時に求めることによって、分子量を比較的正確に求める方法("SVEDBERG"、後述)なども提案されている。この方法は、長時間遠心している間に会合が徐々に進んだりする系で沈降平衡法が応用できないときなどに、採用することができ、分子量がそれほど大きくなければ比較的よい分子量の推定値を得ることができる。 The ultracentrifugation analysis includes the sedimentation equilibrium method performed by relatively low-speed centrifugation and the sedimentation velocity method performed at high speed. This “sedimentation rate method” is a method that can be performed in a shorter time (1-2 hours) than the sedimentation equilibrium method, and is more sensitive to molecular homogeneity than the equilibrium method. For this reason, it is generally used for a sample uniformity test, and at the same time, the sedimentation coefficient of each component can be determined. Given the sedimentation coefficient and molecular weight, the rough shape of the molecule can also be estimated. In principle, not only the sedimentation coefficient but also the diffusion coefficient can be measured at the same time by examining the time-dependent change in the shape of the sedimentation interface.As a result, the molecular weight can be obtained from the Svedberg equation. A method of calculating molecular weight relatively accurately ("SVEDBERG", described later) by simulating with a numerical solution of Lamm's equation and simultaneously obtaining the sedimentation coefficient s and the diffusion coefficient D by the method of least squares has been proposed. This method can be used when the sedimentation equilibrium method cannot be applied in a system in which the association gradually progresses while centrifuging for a long time. If the molecular weight is not so large, a relatively good molecular weight estimate can be obtained. Obtainable.
次に、本発明では、上記構成の物質分析用基板を扱うシステムを提供する。具体的には、前記円盤状基板を目的に沿う所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動手段と、前記試料導入部に対する試料給手段と、前記一次元目分離路に対する電圧印加手段と、前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路内に分離させた溶質分子を検出する検出手段と、を少なくとも備える物質分析システムを提供する。 Next, the present invention provides a system for handling the substance analysis substrate having the above-described configuration. Specifically, a substrate rotation driving means that can rotate while controlling the disk-like substrate at a predetermined speed according to the purpose, a sample supply means for the sample introduction unit, a voltage application means for the first-dimensional separation path, Provided is a substance analysis system comprising at least detection means for detecting solute molecules separated in the second-dimensional separation path based on the centrifugal force obtained by the rotation.
この物質分析システムは、基板への試料供給→一次元目分離路で等電点分離を行う際の電圧印加→基板を回転させて得られる遠心力による沈降平衡(二次元目分離)→沈降平衡により濃度勾配を形成した分離された溶質分子の検出、という一連の作業工程を、同一基板上で、各工程の実行タイミングをコンピュータで制御しながら自動で行うことができる。 In this material analysis system, sample supply to the substrate → voltage application during isoelectric separation in the first dimension separation path → sedimentation equilibrium by centrifugal force obtained by rotating the substrate (second dimension separation) → sedimentation equilibrium Thus, a series of operation steps of detecting the separated solute molecules forming a concentration gradient can be automatically performed on the same substrate while controlling the execution timing of each step by a computer.
さらに本システムでは、(1)前記一次元目分離路から前記二次元目分離路への試料の移行を促進させる手段、(2)前記二次元分離路からの試料の回収を促進させる手段、以上(1)、(2)のいずれか一方又は両方を備えるように工夫してもよい。(1)、(2)のいずれの促進手段もその具体的な方法は特に限定されない。これらの手段を採用すると、一次元目分離路から前記二次元目分離路への試料の移行を円滑に行ったり、前記二次元分離路からの試料の回収を円滑に実施したりすることができる。 Further, in this system, (1) means for promoting the transfer of the sample from the first-dimensional separation path to the second-dimensional separation path, (2) means for promoting the recovery of the sample from the two-dimensional separation path, You may devise so that any one or both of (1) and (2) may be provided. The specific method of any of the promotion means (1) and (2) is not particularly limited. By adopting these means, it is possible to smoothly transfer the sample from the first dimension separation path to the second dimension separation path, or to smoothly collect the sample from the second dimension separation path. .
また、本システムの前記検出手段としては、例えば、前記二次元分離路の選択された位置へ蛍光励起光を照射する手段と、前記二次元分離路に存在する蛍光標識分子から発せられた蛍光を捕捉する手段と、を少なくとも備える手段を採用することが可能である。 The detection means of the present system includes, for example, a means for irradiating a selected position of the two-dimensional separation path with fluorescence excitation light and a fluorescence emitted from a fluorescently labeled molecule existing in the two-dimensional separation path. It is possible to employ a means including at least a means for capturing.
本発明によれば、分析目的の溶質分子を含む試料の導入(供給)、溶質分子群の二次元分離、二次元分離された溶質分子の検出・回収・分析(測定)等を、短時間で簡易に、かつ、高精度に基板上で実施することができる。 According to the present invention, introduction (supply) of a sample containing a solute molecule for analysis, two-dimensional separation of a solute molecule group, detection / recovery / analysis (measurement) of a two-dimensionally separated solute molecule, etc. can be performed in a short time. It can be carried out easily and with high accuracy on the substrate.
以下、本発明に係る物質分析用基板の実施形態例ついて、添付図面を参照にしながら説明する。まず、図1は、本発明に係る物質分析用基板の構成を簡略化して示す図(上方視、平面図)である。 Embodiments of a substance analysis substrate according to the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings. First, FIG. 1 is a diagram (upper view, plan view) showing a simplified configuration of a substrate for substance analysis according to the present invention.
図1中に符号1で示された物質分析用基板(以下、単に「基板」と称する。)は、上方外観視、円盤状を呈す形態を備えている。この基板1の口径サイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、基板上の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変形可能である。
A substrate for substance analysis (hereinafter simply referred to as “substrate”) denoted by
この基板1は、所定波長の励起光(例えば、蛍光励起光)を透過可能な材料で形成されており、例えば、石英等のガラス、ポリカーボネートやポリスチレン等の合成樹脂材料で形成されている。なお、射出成形可能な合成樹脂材料を採用すると、ランニングコストの低減を達成できる。
The
同基板1には、後述する等電点泳動を一次元目分離路で行なう目的で、基板1中に所定個所に配置される正負電極に導通しており、外部電源(図示せず。)からの電圧を前記正負電極に送り込むための導体層が設けられている(図示せず。)。この導体層は、例えば、ITO(インジウム−スズ−オキサイド)やアルミニウムなどの光透過性があり、かつ導電性を有する材料によって形成することができる。例えば、ITOやアルミニウムをスパッタリングや電子ビーム蒸着等によって、所定厚(例えば、150nm程度)に成膜する。この導体層に光透過性があるので、基板裏面側からの光ピックアップを採用することが可能となる。
The
基板1上には、本発明の目的沿って、所定形状の領域や流路を形成するが、例えば、基板上層をポリイミド樹脂によって形成すると、SiO2などの無機酸化膜などで形成する場合よりも、原材料コスト面で有利であり、また、厚膜形成も前記無機酸化膜などに比較して容易であるので、成膜コストも安いという利点がある。
In accordance with the object of the present invention, a region and a channel having a predetermined shape are formed on the
特に、基板上層を感光性ポリイミド樹脂で形成すると、フォトレジストを用いた表面処理を行うことによって、所定形状及びサイズの領域、キャピラリ、流路等などを簡易に形成することができる。例えば、感光性ポリイミド樹脂をスピンコート等で5μm程度の厚さに基材に塗布し、レーザービーム露光装置等を用いて、パターン露光及び現像することによって、所定形状及びサイズの領域、キャピラリ、流路等などを簡易に形成することができる。 In particular, when the upper layer of the substrate is formed of a photosensitive polyimide resin, a region having a predetermined shape and size, a capillary, a channel, and the like can be easily formed by performing a surface treatment using a photoresist. For example, a photosensitive polyimide resin is applied to a substrate to a thickness of about 5 μm by spin coating or the like, and pattern exposure and development are performed using a laser beam exposure apparatus or the like, whereby a predetermined shape and size region, capillary, flow A road or the like can be easily formed.
続いて、具体的に基板上の形態構成について具体的に説明する。まず、基板1の中央には、同基板1を保持して回転させることが可能な回転軸(図示せず。)が導入され得る中心孔Hが設けられている。なお、前記回転軸を電圧供給手段とし、中心孔Hの内周壁面に露出させた上記導体層へ通電してもよい。
Subsequently, the configuration on the substrate will be specifically described. First, a central hole H into which a rotation shaft (not shown) capable of holding and rotating the
中心孔Hの近傍には、所定容量の試料を導入することができる試料導入部2が設けられており、この試料導入部2は、流路21を介して一次元目分離路3に連通している。この一次元目分離路3は、例えば、キャピラリをなすように形成されており、このキャピラリ内で等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子群(例えば、両性電解質であるタンパク質群)を分離可能な構成となっている。
In the vicinity of the center hole H, a
ここで、等電点電気泳動の手順について図2及び図3に基づいて説明する。図2は、等電点電気泳動の作業手順を示したワークフロー図であり、図3は、一次元目分離路5の構成概念と等電点電気泳動の原理を示す図である。なお、図2中の「電気泳動路」は、一次元目分離路を意味する。
Here, the procedure of isoelectric focusing will be described with reference to FIGS. FIG. 2 is a workflow diagram showing the work procedure of isoelectric focusing, and FIG. 3 is a diagram showing the configuration concept of the first-
まず、第1のステップ(図2中のS1)では、一次元目分離路3内へ等電点電気泳動によって分離したい溶質分子群を含む試料を、上記試料導入部2から導入する。試料中の溶質分子群は両性電解質であれば分離の対象とすることができ、通常はタンパク質が被分離物質とされる場合が多い。
First, in the first step (S1 in FIG. 2), a sample including a solute molecule group to be separated by isoelectric focusing is introduced from the
次に、第2のステップ(図2中のS2)では、一次元目分離路3内に電圧印か可能に配置された正極31側に酸性溶液311、負極32側に塩基性溶液321を注入する。酸性溶液311としてはリン酸溶液、塩基性溶液321としては水酸化ナトリウム溶液が汎用されるが、それぞれ酸性、塩基性の溶液であれば用いることができる。続いて、第3のスタップ(図2中のS3参照)において、正極31及び負極32に対して外部電源Vから電圧を印加する。
Next, in the second step (S2 in FIG. 2), the
以上のステップS1〜S3により、一次元目分離路3内には、正極31側を酸性、負極32側を塩基性としたpH勾配が形成され、溶質分子群Pはそれぞれの溶質分子の等電点に相当する泳動位置へフォーカシングされる。
Through the above steps S1 to S3, a pH gradient is formed in the first-
ここで、一般に等電点電気泳動は、定電流条件下において行なわれるが、等電点電気泳動開始後、イオン勾配の形成が進んで、一次元目分離路(等電点電気泳動路)3の正極31及び負極32間を移動するイオン性物質が減少してくると、該一次元目分離路3の電気的抵抗は次第に大きくなることから、上記定電流を維持するためには、正極31及び負極32間には大きな電圧を印加する必要があり、この際、一次元目分離路3内では多量のジュール熱が発生する。
Here, in general, isoelectric focusing is performed under a constant current condition, but after the start of isoelectric focusing, the formation of an ion gradient proceeds, and the first-dimensional separation path (isoelectric focusing path) 3 When the ionic substance moving between the
このジュール熱は、一次元目分離路1内に対流を発生させてイオン勾配を不安定化するとともに、特に分離対象の溶質分子群Pがタンパク質である場合には、その化学的性状に変化を及ぼすおそれがある。
This Joule heat generates convection in the first-
図3に示すように、一次元目分離路3には温度管理ユニットUを設けておいて前記ジュール熱を放熱し、イオン勾配の不安定化及び被分離物質の熱変性を防止できるように工夫する。温度管理ユニットUは、熱伝導部U1と熱交換部U2とから構成し、熱伝導部U1には銅板やヒートパイプ等の熱伝導性素材を、熱交換部U2にはペルチェ素子やヒートポンプ、放熱板とファン等の熱交換手段を、それぞれ特に限定されることなく採用することが可能である。
As shown in FIG. 3, the first-
さらに、温度管理ユニットUには、ジュール熱の放熱機能のみならず、一次元目分離路3全体を一定温度に保つ機能を付与することが好ましい。これにより、等電点電気泳動ごとの温度条件のバラつきをなくし、等電点電気泳動の再現性を高めることが可能となる。
Furthermore, it is preferable to give the temperature management unit U not only a function of radiating Joule heat but also a function of keeping the entire first-
次に、一次元目分離路(等電点電気泳動路)3の内壁表面の好適な構成について、図4に基づいて説明する。この一次元目分離路3の内壁表面33には、いわゆる両性担体34を固相化しておくようにする。図4では、一次元目分離路3の内壁面33に固相化された両性担体および該両性担体の有するカルボキシル基とアミノ基を模式的に示している。
Next, a preferred configuration of the inner wall surface of the first-dimensional separation path (isoelectric focusing electrophoresis path) 3 will be described with reference to FIG. A so-called
一次元目分離路3の内壁面33には、両性担体34が均一に固相化されている。両性担体34は、例えば、グリシン、ギリシルグリシン、アミン、エピクロロヒドリン等が重合した高分子化合物であって、その分子構造中にカルボキシル基とアミノ基を有するものである。図4では、両性担体34に関してカルボキシル基とアミノ基を各1つ有する構成を模式的に示しているが、両性担体34が有するカルボキシル基とアミノ基はそれぞれ複数であってよい。
An
両性担体34の分子構造中に存在するカルボキシル基は、一次元目分離路3内の溶媒のpHに依存して、水素イオンを電離して放出する。一方、アミノ基は同溶媒のpHに依存して、溶媒中の水素イオンを配位結合により取り込み、溶媒中に水酸化物イオンが多い状態を形成する。
The carboxyl group present in the molecular structure of the
上述したように、一次元目分離路3の正極31及び負極32に電圧を印加すると(図2中のS3参照)、この一次元目分離路3内に正極31側を酸性、負極32側を塩基性としたpH勾配が形成される。このとき両性担体34のカルボキシル基及びアミノ基は、pH勾配の形成に伴って周囲の溶媒のpHが変化すると、上記したように、溶媒溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、pH勾配の形成を促進する機能を発揮する。そして、一旦形成されたpH勾配が何らかの要因で変化した場合にも、同様に溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、pH勾配を安定して維持する機能を発揮する。
As described above, when a voltage is applied to the
このように、両性担体34を一次元目分離路3の内壁面33に固相化した構成では、一次元目分離路3の溶媒に迅速にpH勾配を形成することができ、この結果、安定して精度の高い等電点電気泳動を行なうことが可能となる。
Thus, in the configuration in which the
ここで、再び図1を参照すると、基板1には、上記一次元目分離路3に連通するように設けられた二次元目分離路4が配設されている。この二次元目分離路4は、基板1の半径方向(図1中の矢印X参照)に延設されており、複数設けられた二次元目分離路4群は、上方視、放射状を呈している(図1参照)。
Here, referring again to FIG. 1, the
この二次元目分離路4は、遠心力を利用した二次元目分離工程を行なうことができるように構成されたキャピラリである。すなわち、基板1は、その中心部に中心孔Hを備えており(既述)、この中心孔6に図示しない回転軸を挿着させた上で、図1中の矢印R方向へ所定速度で回転させると、基板1の半径方向に形成された二次元目分離路4に遠心力を加えることができる。なお、図1においては、二次元目分離路4は計8つのみ図示しているが、二次元目分離路4の数は任意に設計することが可能である。
The second-
ここで、さらに、基板1を用いた二次元分離方法について、図1及び図5を参照しながらより具体的に説明する。
Here, the two-dimensional separation method using the
まず、基板1の中央領域に、上方視、円形(リング)状に設けられた一次元目分離路(電点電気泳動路)3には、その分離路内の一箇所に絶縁部33(図1参照)が設けられており、該絶縁部33を隔てて正極31と負極32が配設されている。図2に示した作業ステップ(既述)に従って、一次元目分離路(電点電気泳動路)3内へ試料、酸性溶液311及び塩基性溶液312を注入し、正極31と負極32対して電圧を印加すると、正極31と負極32間にpH勾配が形成され、前記試料中の溶質分子群P(図3参照)は、各溶質分子の等電点にフォーカシングされ、一次元目分離路(電点電気泳動路)3内に配列する。
First, in the central region of the
このような一次元目分離に続いて、一次元目分離路(電点電気泳動路)3内において周方向に配列されている溶質分子群Pを、二次元目分離路4へ導入する。この二次元目分離4においては、基板1を回転させて得られる遠心力を利用する二次元目分離を行なう。
Following such first-dimensional separation, the solute molecule group P arranged in the circumferential direction in the first-dimensional separation path (electric focusing electrophoresis path) 3 is introduced into the second-
この際、溶質分子群Pを含む等電点分離液(一次元目分離液)を、一次元目分離路3から二次元目分離路4へ導入する。この等電点分離液の導入方法は、毛細管現象を利用して移動させる方法、遠心力によって移動させる方法、負圧吸引、正圧押出、又は親媒性原理を利用する制御方法などを、特に限定されず採用することができる。
At this time, an isoelectric point separation liquid (first-dimensional separation liquid) containing the solute molecule group P is introduced from the first-
このうち、親媒性原理を利用する制御方法は、一次元目分離路(電点電気泳動路)3と二次元目分離路4との接続部M(図1、図5参照)に、溶質分子の通過を親媒性原理によって制御可能な領域を設けて、一次元目分離路3から二次元目分離路4への等電点分離液の移動を制御する方法である。
Among these methods, the control method using the amphiphilic principle is that a solute is present in the connecting portion M (see FIGS. 1 and 5) between the first-dimensional separation path (electric focusing electrophoresis path) 3 and the second-
具体的には、上記接続部Mを疎水性領域としておき、親水性の溶質分子の通過を遮断しておき、適切なタイミングで、当該疎水性領域を親水性へ変換して親水性の溶質分子を通過させる。好適な一例としては、疎水性領域を酸化チタンによって形成する方法が挙げられる。 Specifically, the connecting portion M is set as a hydrophobic region, the passage of the hydrophilic solute molecule is blocked, and the hydrophobic region is converted to hydrophilic at an appropriate timing to thereby convert the hydrophilic solute molecule. Pass through. A suitable example is a method of forming a hydrophobic region with titanium oxide.
酸化チタンは、通常は疎水性であるが、紫外線を照射することにより親水性へと変化する物質である。そのため、接続部Mを酸化チタンで形成すれば、一次元目分離工程を行っている段階における等電点分離液の二次元目分離路4への移動を遮断することができ、一次元目分離工程終了後に、接続部Mを狙って紫外線を照射して疎水性を親水性へと変換することにより、等電点分離液を二次元目分離路4へ確実、かつ円滑に導入することが可能となる。
Titanium oxide is a substance that is usually hydrophobic but changes to hydrophilicity when irradiated with ultraviolet rays. Therefore, if the connection part M is formed of titanium oxide, the movement of the isoelectric point separation liquid to the second
このようにして、一次元目分離3から二次元目分離路4へ導入された等電点分離液は、二次元目分離路5において、基板1の回転によって得られる遠心力を利用した遠心分離法、あるいは沈降平衡法による二次元目分離工程に供される。
In this way, the isoelectric separation liquid introduced from the
「遠心分離法」においては、被分離物質の分子量に基づいた分離を行なう。一例として、ショ糖濃度勾配遠心法がある。このショ糖濃度勾配遠心法によれば、二次元目分離路4内にショ糖溶液を充填し、遠心してショ糖濃度勾配を形成することで、該濃度勾配中において、被分離物質をそれぞれの分子量に基づいて分離することができる。このようにして、二次元目分離が行なわれた溶質分子群は、二次元目分離路4より分取され、例えば、質量分析計による同定等の後段の解析に供することができる。
In the “centrifugation method”, separation is performed based on the molecular weight of the substance to be separated. An example is sucrose concentration gradient centrifugation. According to this sucrose concentration gradient centrifugation method, a sucrose solution is filled in the second-
また、「沈降平衡法」は、溶媒中に存在する物質(溶質)を遠心力の作用によって沈降させて、この沈降力とこれに逆らう溶質の拡散力とが平衡(沈降平衡)した時における溶質の濃度分布を、干渉光学系あるいは光電走査装置等により測定し、溶質の分子量を求める方法である。 In addition, the “sedimentation equilibrium method” is a method in which a substance (solute) present in a solvent is precipitated by the action of centrifugal force, and this sedimentation force and the diffusive force of the solute against this equilibrium (balance sedimentation). In this method, the concentration distribution of the solute is measured by an interference optical system, a photoelectric scanning device, or the like to obtain the molecular weight of the solute.
この沈降平衡法で求められる分子量は、溶質の分子構造によらないのが特徴であり、高度に荷電している溶質であっても、精度良く分子量を計測することができる。従って、沈降平衡法は、等電点電気泳動後の二次元目分離工程に好適に採用することができ、二次元目分離路4において行なう二次元目分離工程として適した方法ということができる。沈降平衡法により、分子量を計測された溶質分子は、分子量に基づく物質同定解析等の後段の解析に供することができる。なお、本発明では、沈降速度法を用いてもよい。
The molecular weight determined by this sedimentation equilibrium method is characterized by not depending on the molecular structure of the solute, and even with a highly charged solute, the molecular weight can be accurately measured. Therefore, the sedimentation equilibrium method can be suitably employed in the second dimensional separation step after isoelectric focusing, and can be said to be a method suitable as the second dimensional separation step performed in the second
図5は、二次元目分離路4内に、沈降平衡によって溶質分子が濃度勾配を形成している様子と、二次元分離路4内の所定濃度位置に存在する溶質分子を検出する概念を示す図である。
FIG. 5 shows how the solute molecules form a concentration gradient in the second-
二次元目分離路4内のいかなる濃度位置に溶質分子が存在するかを検出することによって、当該溶質分子の分子量等を知ることができる。検出手段の一例を挙げると、一次元目分離路3と二次元目分離路4の接続部Mに蛍光物質を存在させておく。なお、この作業は、例えば、二次元目分離路4におけるショ糖勾配設定後に行うことができる。
By detecting at which concentration position in the second
そして、一次元目分離路3から二次元目分離路4に対して溶液を強制的に送り込み、遠心力によって溶質分子(例えば、タンパク質)が沈降していく過程で前記蛍光物質を結合させる。そして、蛍光物質によって標識された溶質分子、あるいは蛍光を発生するように改変された溶質分子に対して、光源5から所定波長の蛍光励起光Qを、二次元分離路4の所定濃度位置4aを狙って照射し、該二次元目分離路4から戻ってくる蛍光励起光Fをディテクタ6で検出することができる。この蛍光検出によって、試料中に所定分子量の溶質分子が存在するか否か、あるいは蛍光強度分析により当該溶質分子の存在量などを知ることができる。
Then, the solution is forcibly fed from the first-
蛍光標識によって沈降平衡の精度に悪影響が出ることが予想されるが、溶質分子と蛍光物質が結合したものの密度は、溶質分子と蛍光物質の平均密度程度になっていることが予想されるので、これを基に補正を行うことができる。なお、溶質物質の光吸収やレイリー散乱などの原理によって、二次元分離路4内の所定濃度位置に存在する溶質分子を検出することも可能である。
Although it is expected that the accuracy of sedimentation equilibrium will be adversely affected by fluorescent labeling, the density of solute molecules and fluorescent substances is expected to be about the average density of solute molecules and fluorescent substances. Correction can be performed based on this. Note that it is also possible to detect solute molecules present at a predetermined concentration position in the two-
以上のような二次元目分離を経た状態の分離液を、二次元目分離路4から回収して、二次元目分離路4に連通する回収部5に貯留する。なお、二次元目分離路4から回収部5への二次元分離液の移行方法は、毛細管現象を利用して移動させる方法、遠心力によって移動させる方法、負圧吸引、正圧押出、又は親媒性原理を利用する制御方法などを、特に限定されず採用することができる。
The separation liquid that has undergone the second-dimensional separation as described above is collected from the second-
このうち、親媒性原理を利用する制御方法は、二次元目分離路4と回収部5の接続部N(図1参照)に、溶質分子の通過を親媒性原理によって制御可能な領域を設けて、二次元目分離路4から回収部5への二次元分離液の移動を制御する方法である。
Among these, the control method using the philicity principle is a region in which the passage of the solute molecules can be controlled by the philicity principle at the connection portion N (see FIG. 1) of the second-
具体的には、上記接続部Nの場合と同様に、接続部Nを疎水性領域としていて親水性の溶質分子の通過を遮断しておき、適切なタイミングで、当該疎水性領域を親水性へ変換して親水性の溶質分子を通過させる。好適な一例としては、疎水性領域を酸化チタンによって形成する方法が挙げられる。酸化チタンは、通常は疎水性であるが、紫外線を照射することにより親水性へと変化する物質である。そのため、接続部Mを酸化チタンで形成すれば、二次元目分離工程を行っている段階における分離液の回収部5への移動を遮断することができ、二次元目分離工程終了後に、接続部Nを狙って紫外線を照射して疎水性を親水性へと変換することにより、二次元分離液を回収部5へ確実、かつ円滑に導入することが可能となる。
Specifically, as in the case of the connecting portion N, the connecting portion N is made a hydrophobic region to block the passage of hydrophilic solute molecules, and the hydrophobic region is made hydrophilic at an appropriate timing. Convert to allow hydrophilic solute molecules to pass through. A suitable example is a method of forming a hydrophobic region with titanium oxide. Titanium oxide is a substance that is usually hydrophobic but changes to hydrophilicity when irradiated with ultraviolet rays. Therefore, if the connection part M is formed of titanium oxide, it is possible to block the movement of the separation liquid to the
なお、選択した二次元目分離路4の接続部MやNだけを狙って紫外線を照射すると、当該二次元目分離路4の二次元分離液だけを一つの回収部5に回収することが可能となる。
In addition, when the ultraviolet rays are irradiated aiming at only the connection parts M and N of the selected second-
次に、図6は、本発明に係る物質分析用基板の別の実施形態例(符号10)を示す図である。基板の材料構成、層構造、接続部の構成等は、図1に示す基板1と同様であるので、説明を割愛する。
Next, FIG. 6 is a figure which shows another embodiment example (code | symbol 10) of the board | substrate for substance analysis based on this invention. The material configuration, layer structure, connection portion configuration, and the like of the substrate are the same as those of the
図6に示された基板10は、中心孔Hの周辺に、二つの試料導入部2,2が設けられているとともに、回収部5,5と、導入制御部6,6が設けられている。それぞれの配置箇所は、中心孔Hを囲んで周方向均等な位置であって、かつ、中心孔Hからの距離も同じとなる位置が選択されている。円盤状をなす基板の形態的均一性を確保するためである。
The
ここで、試料導入部2,2からは分析目的の溶質分子群を含む試料のほかに、一次元目分離路3での等電点分離で使用する酸性溶液311や塩基性溶液312、あるいは、二次元目分離路4に対するショ糖溶液の導入などにも使用される。
Here, in addition to the sample containing the solute molecule group for analysis from the
また、本実施形態においては、全ての二次元目分離路4群は、基板10の最外周側に形成された回収流路51に連通しており、そして、この回収流路51は、基板10の中央に位置する回収部5,5に連通している。したがって、二次元目分離路4からの二次元分離液は、共通する一つの回収流路51を通過して、回収部5,5に集められる構成となっている。なお、本実施形態において、基板1(図1)の接続部Nに相当する部分は、例えば、回収流路51と二次元目分離路4の接続部分に形成することができる。
Further, in the present embodiment, all the second-
導入制御部6,6は、加圧や吸引等の手段によって、試料溶液やその他の溶液(例えば、一次元目分離路3への酸性溶液311や塩基性溶液312、二次元目分離路へのショ糖溶液、洗浄溶液など)を目的に応じて所定個所に導入するときに使用される。
The
次に、図7に基づいて、本発明に係る物質分析用システムについて説明する。本システムは、上記説明した基板1(図1)や基板10(図6)を扱うシステムであり、基板1(又は10)を所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動部Aと、前記試料導入部2に対する試料供給部Bと、前記一次元目分離路3(の電極31,32)に対する電圧印加部C(図3参照)と、前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路4内で分離させた溶質分子を検出する検出部D(図5の符号5、6に相当)と、を備え、さらに、検出手段Dで得た生データ(例えば、蛍光強度信号)を解析する解析部Eを備えている。
Next, the substance analysis system according to the present invention will be described with reference to FIG. This system is a system that handles the substrate 1 (FIG. 1) and the substrate 10 (FIG. 6) described above. The substrate rotation drive unit A that can rotate the substrate 1 (or 10) while controlling the substrate 1 (or 10) at a predetermined speed; Based on the sample supply unit B for the
基板回転駆動部Aは、回転軸A1と、この回転軸A1に所定の回転駆動を与える駆動部A2と、回転速度を制御する制御部(図示せず。)等を有している。また、試料供給部Bは、試料貯留部B1、等電点pH勾配形成用溶液貯留部B2、ショ糖溶液貯留部B3、洗浄溶液貯留部(図示せず。)などの貯留部から所定の溶液を選択して、基板1(又は10)の試料導入部2に対して、それぞれ所定のタイミングで供給(導入)を行う役割を果たす。
The substrate rotation drive unit A includes a rotation axis A1, a drive unit A2 that applies a predetermined rotation drive to the rotation axis A1, a control unit (not shown) that controls the rotation speed, and the like. Further, the sample supply unit B has a predetermined solution from a storage unit such as the sample storage unit B1, the isoelectric point pH gradient forming solution storage unit B2, the sucrose solution storage unit B3, and the cleaning solution storage unit (not shown). Is selected and supplied (introduced) to the
電圧印加手段Cは、基板上の一次元目分離路(等電点分離路)3(の電極31,32)に対する電圧を印加する役割を果たし、その構成は、例えば、図3に示すとおりである。
The voltage application means C plays a role of applying a voltage to the first-dimensional separation path (isoelectric point separation path) 3 (
検出部Dは、既述した蛍光励起光を出射する光源5やディテクタ6、さらには、蛍光励起光Qや二次元目分離路から取得される蛍光Fの光進路途中に配置される光学系部材(波長選択や進路変更などを目的とすり部材)等から構成されている。解析部Eは、検出部Dから送られてくる生データ(例えば、蛍光強度信号)を解析することによって、検出された溶質分子の種類、分子量、量などを解析し、溶質分子に係わる情報リストやデータベースなどを作成する。なお、図8は、本発明に係る基板やシステムを用いて解析を行うまでの主なフローを示す図である。
The detection unit D is an optical system member that is arranged in the light path of the fluorescence F acquired from the
図9は、本発明に係る基板やシステムを用いて、二次元目分離路4内から取得された溶質分子を同定する方法の概念を示す図である。二次元目分離路4内に分離された溶質分子を回収し、例えば、質量分析器を利用して当該溶質分子の構造を同定(物質同定)する(図9の100)。
FIG. 9 is a diagram showing a concept of a method for identifying a solute molecule obtained from the second-
次に、同定された溶質分子(物質)と二次元目分離路4の観測位置(検出位置)との間を関係付けて、変換テーブルとしてデータベース化する(図9の101)。この変換テーブルの例を図10に示す。また、このとき、検出された蛍光強度と物質の量関係を取得し、例えば、図11のように関数化しておいてもよい。また、実際の測定段階では、計測生データから発現プロファイルイメージを形成し、上記変換テーブルを用いて、試料内に存在する全ての物質の種類とその存在量に係わる情報リストを作製してもよい。図12には、当該情報リストのファーマット例を示す。
Next, the identified solute molecule (substance) and the observation position (detection position) of the second-
次に、図13は、基板1や10にn本配設されている二次元目分離路群4-1〜4−nのそれぞれにおける溶質分子の検出位置(存在位置)の分布を示す例を示す。この図13に示す例では、二次元目分離路4−2において一箇所、二次元目分離路4−3において二個所において検出スポットがある。別途行った質量分析器による物質同定と蛍光強度検出と物質量との間の関数(図11参照)を利用して、各二次元目分離路に分散する確率を求めることができる。
Next, FIG. 13 shows an example of the distribution of detection positions (existing positions) of solute molecules in each of the n-dimensional separation path groups 4-1 to 4-n arranged n on the
次に図14においては、各蛍光強度データから物質量を推定する方法の一例を示す。ある複数の二次元目分離路4において同じ位置(例えば、図13の201、301)、ないしは近い位置に検出スポットがある物質について、各々の存在確率(図14の201−A,301−A参照9を基にした平行列をかけることによって、各々の物質量の存在量を推定することができる(図14の400参照)。なお、図15は、各蛍光強度データから物質の存在量を推定する方法概念を一般化した内容を示した図である。
Next, FIG. 14 shows an example of a method for estimating the substance amount from each fluorescence intensity data. With respect to a substance having a detection spot at the same position (for example, 201 and 301 in FIG. 13) or a close position in a plurality of second-
本発明は、分析目的の溶質分子を含む試料の導入(供給)、溶質分子群の二次元分離、二次元分離された溶質分子の検出・回収・分析(測定)等を、短時間で簡易に、かつ、高精度に基板上で実施する技術として利用できる。二次元分離した溶質分子は質量分析器等によって同定できる。例えば、生体内で発現しているタンパク室の網羅的解析(プロテオーム解析)に利用できる。 In the present invention, introduction (supply) of a sample containing a solute molecule for analysis, two-dimensional separation of a solute molecule group, detection / recovery / analysis (measurement) of a two-dimensionally separated solute molecule, etc. can be performed in a short time. And it can utilize as a technique implemented on a board | substrate with high precision. The two-dimensionally separated solute molecules can be identified by a mass analyzer or the like. For example, it can be used for comprehensive analysis (proteomic analysis) of protein chambers expressed in vivo.
Claims (5)
前記試料導入部に連通し、等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子を分離可能な一次元目分離路と、
前記一次元目分離路に連通し、前記基板の半径方向外側へ延設されたキャピラリからなる二次元目分離路と、
前記二次元目分離路から分離溶液を回収する回収部と、
を少なくとも備えた物質分析用基板。 A sample introduction part provided on a disk-shaped substrate;
A first-dimension separation path that communicates with the sample introduction section and is capable of separating solute molecules in the sample by isoelectric focusing;
A second dimension separation path comprising a capillary communicated with the first dimension separation path and extending radially outward of the substrate;
A recovery unit for recovering the separation solution from the second-dimensional separation path;
A substrate for substance analysis comprising at least.
前記基板を所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動手段と、
前記試料導入部に対する試料供給手段と、
前記一次元目分離路に対する電圧印加手段と、
前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路内に分離させた溶質分子を検出する検出手段と、
を少なくとも備える物質分析システム。 A system for handling the substance analysis substrate according to claim 1,
Substrate rotation driving means capable of rotating the substrate while controlling the substrate at a predetermined speed;
A sample supply means for the sample introduction section;
Voltage application means for the first-dimensional separation path;
Detection means for detecting solute molecules separated in the second-dimensional separation path based on the centrifugal force obtained by the rotation;
A material analysis system comprising at least
(2)前記二次元目分離路からの試料の回収を制御可能な手段、
以上(1)、(2)のいずれか一方又は両方を備えることを特徴とする請求項3記載の物質分析システム。 (1) Means capable of controlling the transfer of the sample from the first dimension separation path to the second dimension separation path,
(2) Means capable of controlling the recovery of the sample from the second dimension separation path,
4. The substance analysis system according to claim 3, comprising one or both of the above (1) and (2).
前記二次元目分離路の選択された位置へ蛍光励起光を照射する手段と、
前記二次元目分離路に存在する蛍光標識分子から発せられた蛍光を捕捉する手段と、
を少なくとも備える手段であることを特徴とする請求項3記載の物質分析システム。 The detection means includes
Means for irradiating the selected position of the second dimension separation path with fluorescence excitation light;
Means for capturing fluorescence emitted from fluorescently labeled molecules present in the second-dimension separation path;
The substance analysis system according to claim 3, wherein the substance analysis system comprises at least means.
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DE102008002214A1 (en) | 2007-06-05 | 2008-12-11 | Kabushiki Kaisha Itaya Seisaku Sho | Device for producing a helical part and control method thereof |
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