JP2006226752A - Plate for bio-sample discrimination device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、DNAやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させて得られる輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別装置用プレートに関する。 The present invention relates to a plate for a biological sample discriminating apparatus that discriminates a biological sample by detecting a transport reaction obtained by moving a biological sample such as DNA, protein or the like in a buffer.
一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはDNAとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。 When a general biological sample is considered, DNA and protein exist largely. In recent years, with the rapid development of molecular biology, the involvement of genes in various diseases has been understood fairly accurately, and attention has been focused on medical treatments targeting genes.
DNAに関しては、現在SNPs(single nucleotide polymorphismの略で「1塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における1暗号(1塩基)の違いの総称である。)が注目されている。その理由としては、SNPsの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じSNPsを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。 With regard to DNA, SNPs (abbreviation of single nucleotide polymorphism, which is generally translated as “single nucleotide polymorphism” and is a general term for the difference of one code (one base) in a gene) are currently attracting attention. The reason for this is that the classification of SNPs can predict the prevalence of many diseases and the effects and susceptibility of each individual to drugs. Furthermore, there are absolutely no humans on the planet who have the same SNPs, even if they are parents and children. This is because it is considered that the individual can be completely identified from not doing so.
現在SNPsを調べる方法としては、DNAの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング(塩基配列の決定)が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング(Sanger法)である。なお、シーケンシングは、このSanger法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって1塩基長の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。 Currently, as a method for examining SNPs, sequencing (determination of base sequence) in which the base sequence of DNA is directly read from the end is most commonly used. There are several reports on the sequencing method, but the most common method is dideoxy sequencing (Sanger method). Sequencing is based on a technique that separates and identifies the difference in length of one base length by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with high resolution or capillary electrophoresis in any method including the Sanger method. This is true.
また他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。 Another method is affinity ligand capillary electrophoresis.
アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力(酵素と基質、抗原と抗体の親和力等)を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである(例えば、特許文献1参照)。 Affinity ligand capillary electrophoresis uses intermolecular affinity, particularly specific affinity in the ecosystem (enzyme and substrate, antigen and antibody affinity, etc.) to give specificity to separation. Specifically, When an affinity ligand that specifically recognizes the base sequence is added to the electrophoresis solution in the capillary tube and the sample is electrophoresed, only the molecular species that interact in the sample mixture will change in the moving speed. The analysis is performed with attention (for example, see Patent Document 1).
一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。 On the other hand, proteins exist in cells, tissues, and biological fluids, regulate biological activities, supply energy to cells, synthesize important substances, maintain biological structures, and communicate between cells and intracellular information. Involved in transmission. Currently, it has become clear that proteins have multiple functions depending on the various environments, the presence of other interacting proteins, and the degree and type of modification that the protein has undergone.
タンパク質は、20種類のアミノ酸が遺伝子の指示(配列情報)により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子(ゲノム)から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。 Proteins are made by connecting 20 types of amino acids in order according to gene instructions (sequence information), and the types are said to be tens of millions. If you know the sequence of the gene, what amino acid is what? You can get information on whether they are connected in order. A complete set of proteins made from the genes (genomes) of organisms is called a proteome, and now the analysis of the proteome has been actively promoted after the nucleotide sequence of the human genome has been deciphered.
そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母 two−hybrid アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある(例えば、特許文献2〜特許文献6)。
本発明は、流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、短時間で正確な検出結果が得られ、取り扱いも容易で且つ小型で軽量、安価な生体サンプル判別装置用プレートを提供することを目的とする。 The present invention provides an accurate detection result in a short time when detecting a transport reaction when a biological sample is moved in a buffer filled in a flow path, is easy to handle, is small, lightweight, and inexpensive. It aims at providing the plate for biological sample discrimination devices.
上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形300ミクロン、内径100ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。しかしながら、内部試料を検出するために検出窓として焼いたり、薬品で溶かすなどしてコーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。 As described above, in the analysis of biological samples, a method using a capillary electrophoresis apparatus is widely used. In many cases, a capillary that is a part that actually performs a transport reaction uses a glass tube having an outer diameter of about 300 microns and an inner diameter of about 100 microns, and the surface is coated with polyimide or the like to make it difficult to break. However, in order to detect the internal sample, a part of the coating is peeled off by baking as a detection window or dissolving with chemicals. At this time, the part where the coating is peeled off is easily broken, and it is necessary to be careful in handling. It is still dangerous if it breaks.
また、サンプルの注入においても、加圧や吸引で行うのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するもののキャピラリー内の緩衝剤の粘度や温度変化により注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。 In addition, sample injection is generally performed by pressurization or suction, but it is necessary to inject a certain amount, but the injection amount depends on changes in the viscosity and temperature of the buffer in the capillary, although it is adjusted over time. However, there is a problem that it is different for each experiment. The amount of sample has a great influence on the measurement result and is a very important item.
また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行うことは困難であり、必要以上の泳動距離と時間をかけて測定することになるという問題があった(特許文献1参照)。 In addition, in the case of an apparatus using such a capillary, it is difficult to perform electrophoresis in a short flow path because of the configuration, and there is a problem that the measurement takes an excessive migration distance and time. (See Patent Document 1).
また、前述した特許文献2の遺伝子診断装置と診断方法においては、リニアポリマーとDNA結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用DNAコンジュゲートとDNA試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管1本1本に、分離用DNAコンジュゲートとDNA試料を充填するのは面倒な作業であり、また分離用DNAコンジュゲートとDNA試料を充填する際に、それらの量がキャピラリー管間で異なれば、測定結果にも影響が及ぼされる可能性があった。 Moreover, in the gene diagnosis apparatus and diagnosis method of Patent Document 2 described above, it is necessary to fill a capillary tube filled with a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent with a DNA conjugate for separation and a DNA sample. is there. As described above, it is troublesome to fill each capillary tube with the DNA conjugate for separation and the DNA sample, and when the DNA conjugate for separation and the DNA sample are filled, the amount of them is reduced. If they differ between capillary tubes, the measurement results may be affected.
さらに、試料の分離を行うのに、例えば、特許文献3,4に記載の方法では、複数のキャビラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも3つ電極を設けて、該少なくとも3つ設けられた電極のうちの2つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、正確な測定結果が得られないという問題がある。また、例えば、特許文献5,6に記載の方法では、プラットホームに微細チャンネルを埋設し、該プラットホームの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させているが、この方法では、試料を向心方向にしか移動させることができないという問題に加え、該微小チャンネルの形状がかなり複雑であるという問題もある。
Furthermore, in order to separate the sample, for example, in the methods described in
本発明は、流路に充填された緩衝材中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、煩雑な準備作業が不要で精度の良い生体サンプル判別装置用プレートを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a plate for a biological sample discriminating apparatus that does not require complicated preparation work and is accurate when detecting a transport reaction when a biological sample is moved in a buffer material filled in a flow path. And
前記従来の課題を解決するために、生体サンプルを緩衝剤中で電気泳動により移動させて得られる輸送反応を検出して該生体サンプルの判別を行う流路が複数設けられた生体サンプル判別装置用プレートにおいて、前記複数の流路の各流路に1対の電極を設け、前記1対の電極のうち一方の電極を前記生体サンプル判別装置用プレートの中心部に設けた電極と電気的に接続し、前記1対の電極のうち他方の電極を前記生体サンプル判別装置用プレートの外周部に設けた電極と電気的に接続し、前記生体サンプル判別装置用プレートの中心部に設けた電極と前記生体サンプル判別装置用プレートの外周部に設けた電極との間の電位差に基づいて前記生体サンプルが緩衝剤中で電気泳動することを特徴とする。 In order to solve the above-mentioned conventional problem, for a biological sample discriminating apparatus provided with a plurality of flow paths for detecting a transport reaction obtained by moving a biological sample by electrophoresis in a buffer and discriminating the biological sample In the plate, a pair of electrodes is provided in each of the plurality of channels, and one of the pair of electrodes is electrically connected to an electrode provided in a central portion of the biological sample discriminating apparatus plate. And the other electrode of the pair of electrodes is electrically connected to an electrode provided on an outer peripheral portion of the biological sample discriminating device plate, and an electrode provided at a central portion of the biological sample discriminating device plate and the electrode The biological sample is electrophoresed in a buffer based on a potential difference with an electrode provided on the outer periphery of the biological sample discriminating apparatus plate.
さらに、前記電極は導電性フィルムまたは金属膜からなることを特徴とする。 Furthermore, the electrode is made of a conductive film or a metal film.
さらに、前記導電性フィルムは前記生体サンプル判別装置用プレートの流路形成面の反対面に貼付されてなることを特徴とする。 Furthermore, the conductive film is affixed to the surface opposite to the flow path forming surface of the biological sample discrimination device plate.
さらに、前記金属膜は流路形成されていないプレートと流路形成されたプレートの流路形成面の反対面との間に挟まれてなることを特徴とする。 Further, the metal film is sandwiched between a plate in which no flow path is formed and a surface opposite to the flow path forming surface of the plate in which the flow path is formed.
さらに、前記金属膜は、銅或いはアルミニウム、金のいずれかであることを特徴とする。 Furthermore, the metal film is any one of copper, aluminum, and gold.
本発明の生体サンプル判別装置用プレートによれば、全ての正電極印加部、全ての負電極印加部を連結したことにより、2本の電極のみで全ての流路に同時に電圧を印加することができる。また、生体サンプル判別装置用プレートを遠心しながら電圧印加する場合においても、電極は一定の場所に固定できるため、装置構成を簡略化することができる。 According to the biological sample discriminating device plate of the present invention, by connecting all the positive electrode application units and all the negative electrode application units, it is possible to apply a voltage to all the flow paths simultaneously with only two electrodes. it can. In addition, even when applying a voltage while centrifuging the biological sample discriminating apparatus plate, the electrode configuration can be simplified because the electrode can be fixed at a certain place.
(実施の形態1)
以下、図1〜図14を用いて、本実施の形態1における生体サンプル判別装置用プレートについて説明する。
(Embodiment 1)
Hereinafter, the biological sample discriminating apparatus plate according to the first embodiment will be described with reference to FIGS.
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。 The present invention realizes that biological samples can be easily and inexpensively and accurately distinguished in a short time by moving biological samples in a buffer and performing biological, enzymatic, immunological and chemical reactions. To do.
なお、本実施の形態1では、説明を具体的にするために、前記生体サンプルがDNAサンプルで、前記緩衝剤が分離用DNAコンジュゲート及びDNA結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル判別プレートが、流路中に充填させた分離用DNAコンジュゲート中に、定量された前記DNAサンプルを添加して電気泳動を行い、該流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出して、該DNAサンプルのSNPs(一塩基多型)の有無を判別するものとする。 In the first embodiment, for the sake of concrete explanation, it is assumed that the biological sample is a DNA sample and the buffering agent contains a DNA conjugate for separation and a DNA binding control agent. However, by adding the quantified DNA sample to the separation DNA conjugate packed in the flow channel and performing electrophoresis, the fluorescence or absorbance in the flow channel is detected, and the DNA sample The presence or absence of SNPs (single nucleotide polymorphisms) shall be determined.
まず、本実施の形態1における生体サンプル判別装置用プレートの構成について説明する。図1は、本実施の形態1における生体サンプル判別装置用プレートの流路形成面を示す図である。
図2は図1に示すプレート1に形成されたパターン2の詳細形状を示す図である。
First, the configuration of the biological sample discriminating apparatus plate according to the first embodiment will be described. FIG. 1 is a diagram showing a flow path forming surface of the biological sample discriminating apparatus plate according to the first embodiment.
FIG. 2 is a diagram showing the detailed shape of the pattern 2 formed on the
本実施の形態1におけるプレート1には図2に示すパターン2が8個放射方法に形成されており、同時に8検体のDNA判別が可能である。
Eight patterns 2 shown in FIG. 2 are formed in the radiation method on the
図1に示すように本実施の形態1におけるプレート1の外形は8センチ四方の正方形で4角のうち3角はRが設けられ、残りの1角は面取りされている。
As shown in FIG. 1, the outer shape of the
更に穴4を設けているが、これは外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。材料はアクリル系の樹脂を使用し厚みは2mmである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ50μmのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。また、重心5は本プレートの重心であり、重心5を中心に本プレートを回転部に固定するための回転部固定用穴3を設けている。
Further, a hole 4 is provided, which is designed so that the pattern location can be specified by making the outer shape asymmetric. The material is acrylic resin and the thickness is 2 mm. Grooves are formed on the flow path forming surface, and a sealed flow path is formed by bonding an acrylic film having a thickness of 50 μm. The center of gravity 5 is the center of gravity of the main plate, and a rotating
パターン2は、緩衝剤である分離用DNAコンジュゲートが注入される緩衝剤注入口6と、注入された緩衝剤を一旦保持するための緩衝剤注入部7と、DNAサンプルが注入されるサンプル注入口8と、注入されたDNAサンプルを一旦保持すためのサンプル注入部9と、チャンバー部16と、サンプル保持部20と、バッファ部21と、正電圧の印加部である正電極部12と、負電圧の印加部である負電極部13と、これらを接続する流路とからなる。
Pattern 2 includes a buffer injection port 6 into which a separating DNA conjugate as a buffer is injected, a
ここで、緩衝剤注入部7、サンプル注入部9、チャンバー部16、サンプル保持部20、バッファ部21、正電極部12、負電極部13の各部周辺の形状について詳細に説明する。緩衝剤注入部7とサンプル注入部9は同様の形状をしており、図3は周辺の断面図を示したものである。試料注入口40は緩衝剤注入口6およびサンプル注入口8にあたり、試料注入部41は緩衝剤注入部7およびサンプル注入部9である。また、溝42は緩衝剤注入部7およびサンプル注入部9からのびる流路にあたる。非導電性フィルム43は前述したフィルムであり、溝42にフタをするように貼り付けることで密閉流路が形成されている。
Here, the shape around each part of the
チャンバー部16は流路15によりサンプル注入部9と接続されている。サンプル保持部20は流路17と流路18によりチャンバー部16と接続されている。ここで、流路17は流路18と比較して細くなっている。本実施例の形態では流路17は100μm、流路18は200μmである。バッファ部21は流路17、流路18、流路19によりチャンバー部16とサンプル保持部20と接続されており、流路22によりバッファ部21の空気抜きが可能となる。チャンバー部16、サンプル保持部20、バッファ部21は同様の形状をしており、図4に周辺の断面図を示す。穴44はチャンバー部16、サンプル保持部20、バッファ部21にあたる部分であり、溝45、溝46は各部からのびる流路にあたる部分である。ここで、穴44は流路形成面から見て深さ1.5mmの器上になっている。
The
正電極部12は正電圧の印加部であり、負電極部13は負電圧の印加部である。これらは流路14を介して接続されており、さらには流路10,流路11により緩衝剤注入部7ともそれぞれ接続されている。図5は正電極部12と負電極部13の周辺の断面図であり、下方が流路形成面である。電極部47はプレートを貫通した穴で、正電極部12と負電極部13にあたる部分であり、溝48,溝49はそこからのびる流路である。プレートの両面にはフィルムが貼り付けてあり、非導電性フィルム43は流路形成面側に貼りつけられており、密閉流路を形成している。また、流路形成面の反対面に電極層として導電性フィルム50が貼りつけられており、導電性フィルム50に電極を押し当てることにより電圧を印加することができる。
The
次に、電極層について詳細に説明する。図6は本実施の形態1における生体サンプル判別プレートの流路形成面の反対面を示した図である。 Next, the electrode layer will be described in detail. FIG. 6 is a diagram showing a surface opposite to the flow path forming surface of the biological sample discrimination plate in the first embodiment.
電極層は導電性フィルム50で形成されており、図6に示すように、流路形成面の反対面において、プレート外周部に円弧状に配置した正電極接触部24と正電極部12を連結した正電極層と、プレート中心部の孔の周りに円弧状に配置した負電極接触部25と負電極部13を連結した負電極層とで構成されている。そのため、2本の電極を正電極接触部24と負電極接触部25にそれぞれ押し当てることにより全ての流路に同時に電圧を印加することができる。
The electrode layer is formed of a
ここで、電極層が金属膜で形成される場合についても説明しておく。図7に電極層を金属膜で形成したプレートの流路形成面側の図を示す。プレートは流路形成プレートと電極層形成プレートを貼り合わせた形であり、流路形成プレートは外形が円形になっており、中心部に孔が設けられており、電極層が露出している。図8に正電極部12−正電極接触部24と負電極部13−負電極接触部25の周辺の断面図を示す。流路形成プレート51は前述のパターン2の流路が形成されたプレートである。
Here, the case where the electrode layer is formed of a metal film will also be described. FIG. 7 shows a flow path forming surface side of a plate in which an electrode layer is formed of a metal film. The plate has a shape in which a flow path forming plate and an electrode layer forming plate are bonded together, and the flow path forming plate has a circular outer shape, a hole is provided in the center, and the electrode layer is exposed. FIG. 8 is a cross-sectional view of the periphery of the positive electrode portion 12 -positive
電極形成プレート52は前述の電極層のパターン形状に金属膜が塗布されたプレートであり、電極層53は正電極層および負電極層にあたる部分である。電極部54は正電極部12及び負電極部13にあたる部分であり、溝55と溝56はそれらからのびる流路にあたる部分である。電極接触部47は正電極接触部24および負電極接触部25にあたる部分であり、電極層によって連結されている。また、電極接触部57は非導電性フィルム43、流路形成プレート51のいずれによっても被覆されず外部に露出しているため、電極接触部57に電極を押し当てることによって電圧を印加することができる。
The
それでは、以下前述した該DNAサンプルのSNPs(一塩基多型)の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を図2を利用して説明する。 Now, an example of specific operations and operations until the presence or absence of SNPs (single nucleotide polymorphisms) in the DNA sample described above will be described with reference to FIG.
まず、検体となるDNAサンプルを準備する。 First, a DNA sample as a specimen is prepared.
本来DNAは2本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態1においては、判別したいSNPs部位を含む約60塩基長の1本鎖DNAを準備する。 Originally, DNA has a double-stranded helical structure, but in the first embodiment, a single-stranded DNA having a length of about 60 bases including a SNPs site to be discriminated is prepared.
抽出方法や1本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細説明は省略する。 Since the extraction method and single strand formation are not directly related to the present invention, detailed description thereof is omitted.
次に、緩衝剤としてDNAコンジュゲートを準備する。 Next, a DNA conjugate is prepared as a buffer.
DNAコンジュゲートとは、6〜12塩基長1本鎖DNAの5’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにDNAは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型DNAに対しての結合力が強く、変異型DNAに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、5’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。 The DNA conjugate is obtained by covalently bonding a high molecular linear polymer to the 5 'end of a 6 to 12 base long single-stranded DNA. Furthermore, DNA is a sequence that is complementary to the normal type but not complementary to the mutant type, has a strong binding force to the normal type DNA, and a weak binding force to the mutant type DNA. There are characteristics. In addition, when electrophoresed, the linear polymer bonded to the 5 'end has a characteristic that the migration speed is considerably slow.
以後記述する「DNAコンジュゲート」とは、電解質の役目もするpH緩衝剤およびMgCl2などのDNA結合力制御剤を含んだ物性とする。 The “DNA conjugate” described hereinafter has physical properties including a pH buffer that also serves as an electrolyte and a DNA binding force control agent such as MgCl 2 .
試料の準備が終わったところで、DNAコンジュゲートおよびDNAサンプルをプレート内へ注入する。DNAコンジュゲートはピペッター等により定量を緩衝剤注入口6から緩衝剤注入部7へ分注する。DNAサンプルも同様に定量をサンプル注入口8よりサンプル注入部9へ分注する。
When sample preparation is complete, the DNA conjugate and DNA sample are injected into the plate. The DNA conjugate is dispensed from the buffer injection port 6 to the
分注量としては、パターンのスケールにより異なるが本実施の形態1においては、DNAコンジュゲートは18マイクロリットル、DNAサンプルは2マイクロリットルとする。 As for the dispensing amount, although it differs depending on the scale of the pattern, in the first embodiment, the DNA conjugate is 18 microliters and the DNA sample is 2 microliters.
次にモータ等にプレート1を固定し、重心5を軸に回転させる。この時分注されたDNAコンジュゲートとDNAサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。
Next, the
緩衝剤注入部7内のDNAコンジュゲートは流路10と11を通り正電極部12と負電極部13へ等分され正電極部12へ移動したDNAコンジュゲートはさらに流路14を通り定量保持部23まで移動する。負電極部13へ移動したDNAコンジュゲートも同様に流路14を通り定量部23まで移動する。回転開始から2分後、DNAコンジュゲートの移動が停止した状態が図9(a)である。また、定量保持部23周辺を拡大した図が図9(b)である。
The DNA conjugate in the
DNAコンジュゲート26は、正電極部12および負電極部13の7割程度まで充填されており、流路14を満たし、図9(b)に示すように定量保持部23まで達している。
The
正電極部12と負電極部13内に存在するDNAコンジュゲートの液面高さとサンプル定量部の液面高さは、重心5を中心とする同一円周上となる。
The liquid level height of the DNA conjugate existing in the
次に注入されたDNAサンプルの移動について図2および図10を用いて説明する。サンプル注入部9内のDNAサンプルは流路15を通りチャンバー部16さらには流路17、流路18を通り外周側に位置するサンプル保持部20まで達する。しかしながら図10に示すように流路18はサンプル保持部20の外周側で接続されかつサンプル保持部20には空気抜き用の穴が存在しない。そのためサンプル保持部20内に残った空気は抜けることはなく加圧された状態となる。
Next, the movement of the injected DNA sample will be described with reference to FIGS. The DNA sample in the sample injection section 9 passes through the
図10が回転開始から2分後のDNAサンプルの状態であり、27と28がDNAサンプルである。29が圧縮された空気であり、回転中のみこのような遠心力と加圧力とが平衡となった状態を維持する。本実施の形態では回転数4000rpmである。
FIG. 10 shows the state of the DNA sample 2 minutes after the start of rotation, and 27 and 28 are the DNA samples.
それでは次の動作を説明する。 Next, the following operation will be described.
プレート1を一定時間回転させDNAコンジュゲートとDNAサンプルの移動が停止した状態で回転を急停止させる。(例えば2秒で4000rpmより停止まで。)
するとサンプル保持部20内に存在していたDNAサンプル27は遠心力が無くなったため空気29の圧力によりサンプル保持部20から流路18へ逆流しようとする。さらに
DNAサンプル26はサンプル保持部20内の空気28が大気圧となるまで流路17、流路19へと移動しようとするが、この時流路17は流路19にくらべ細く形成されているためDNAサンプル27は流路17よりも流路19へ多く流れようとする。
The
Then, since the
そこで急停止した直後の状態を図11に示す。 FIG. 11 shows a state immediately after the sudden stop.
サンプル保持部20内のDNAサンプル27は空気29の膨張により流路18、19を通り定量保持部23およびバッファ部21まで達する。
The
特に定量保持部23では、充填されたDNAコンジュゲート26と接することになる。
In particular, the
このとき流路17を通りチャンバー部16へ移動するDNAサンプルも多少存在する。
At this time, there are some DNA samples that move to the
次に、プレート1を中速にて数秒間もう一度回転させる。この時減速を緩やかにすることが重要である。
Next, the
停止後の状態を図12に示す。 The state after the stop is shown in FIG.
流路19に充填されていたDNAサンプルはチャンバー部16へと流れるが、定量保持部23にはDNAサンプルが微量残存する。残存したDNAサンプルは他DNAサンプルに対して電気的にも絶縁された状態である。
Although the DNA sample filled in the
またこのように1回目の回転時と異なる動作をする理由は、回転速度が遅く減速度が緩やかであるためサンプル保持部20内の空気29が強く圧縮されることがないからである。よって逆流して流路19が再度充填されることもない。
The reason why the operation is different from the first rotation is that the rotation speed is slow and the deceleration is slow, so that the
以上の動作で定量保持部23に残存したサンプルDNAがSNPsの判別を行う最終試料となる。
With the above operation, the sample DNA remaining in the
次に、電気泳動を行う。電気泳動は正電極接触部24に正電極、負電極接触部25に負電極を押し当て、プレートを回転させながら数百Vの電圧を印加する。すると、流路14および定量保持部23において電界が発生し、定量保持部23に一定量残存したDNAサンプルは流路14中を正電極側(図13中A方向)へ移動する。
Next, electrophoresis is performed. In electrophoresis, a positive electrode is pressed against the positive
ここで、DNAコンジュゲートは遠心によって移動し、流路14及び正電極部および負電極部に充填されているため、電圧印加時にプレートの外周部方向に偏って保持されており導電性フィルム43に接触した状態になっている。そのため、確実に電圧を印加することができる。
Here, since the DNA conjugate moves by centrifugation and is filled in the
また、正電極接触部24および負電極接触部25はそれぞれ電極層を介して全ての流路の正電極部12、負電極部13と連結しているため、2本の電極をそれぞれ正電極接触部24と負電極接触部25に押し当てることにより、全ての流路に同時に電圧を印加することができ、同時に8つの流路で電気泳動を行うことができる。
Moreover, since the positive
また、正電極接触部24と負電極接触部25がそれぞれ同心円弧状に配置されているため、電極を接触させる場所によって各流路に印加される電圧に差が生じるが、プレートを回転させながら電圧を印加することにより、全ての流路に均等に電圧を印加することができ、安定して電気泳動を行うことができる。
In addition, since the positive
ちなみに、電気泳動を行う場合、遠心を行わずに電圧を印加しても電極層に流れる電流値は非常に小さいため、各流路の電極部までの抵抗が変化しても電極層での電圧損失は非常に小さくなり、各流路に印加される電圧低下はほとんど発生しない。そのため、電気泳動を行うのに大きな支障はない。しかし、より安定して確実に電気泳動を行うためには、プレートを回転しながら電圧を印加することが好ましい。 By the way, when performing electrophoresis, even if a voltage is applied without centrifugation, the current value that flows through the electrode layer is very small. The loss becomes very small, and a voltage drop applied to each flow path hardly occurs. Therefore, there is no big trouble in performing electrophoresis. However, in order to perform electrophoresis more stably and reliably, it is preferable to apply a voltage while rotating the plate.
流路14中にはDNAコンジュゲートが充填されており、DNAサンプルはDNAコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにDNAサンプル中の正常型DNAはDNAコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型DNAは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりDNAサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のDNAと変異型のDNAが分離していくこととなり、SNPsの判別が行えるのである。
The
図14は図13に示す流路14の一部である検出部30を電気泳動中にDNAをスキャンしたグラフである。
FIG. 14 is a graph obtained by scanning DNA during electrophoresis in the
DNAの検出は、蛍光標識(FITC)を修飾したDNAを470nmの光で励起し、520nm付近の光検出によって行った。DNAの検出は、260nmの吸光度によって行ってもよい。 The DNA was detected by exciting the DNA modified with a fluorescent label (FITC) with light at 470 nm and detecting light at around 520 nm. DNA may be detected by absorbance at 260 nm.
横軸が検出部30の部分の位置を表しDNAは左から右へ泳動する。つまり左側が定量部23で右側が正電極部12側である。縦軸は蛍光強度で、上から1分毎に計時変化した波形を表す。徐々に2つの山が分離していく様子がわかる。この場合DNAサンプル中には同量の正常型DNAと変異型DNAが存在していることが判定された。
The horizontal axis represents the position of the
グラフ右側の山が泳動速度が速いので変異型、左側が遅く泳動しているので正常型となる。 The peak on the right side of the graph is the mutant type because the migration speed is fast, and the left side is the normal type because the migration is slow.
以上のように、本実施の形態1によれば、サンプル保持部20をもうけることで回転動作のみによってプレート1上の定量部23にDNAサンプルを一定量保持し、正電極部12と負電極部13と流路14によって電気泳動できるような構成とした。さらには電気泳動する流路14を円弧状としたことで、細胞や血液等から特定のDNAを取り出したDNAサンプルを本生体サンプル判別装置用プレートにおいて測定する際に、極めて正確な検出結果を得ることが可能となる。
As described above, according to the first embodiment, by providing the
本発明の生体サンプル判別装置用プレートは、DNAサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。 The plate for a biological sample discriminating apparatus according to the present invention is useful as one that can discriminate a biological sample such as a DNA sample at low cost and simply.
1 プレート
2 流路パターン
3 回転部固定用穴
4 位置決め穴
5 プレート重心
6 緩衝剤注入口
7 緩衝剤注入部
8 サンプル注入口
9 サンプル注入部
10,11 流路
12 正電極部
13 負電極部
14,15 流路
16 チャンバー部
17,18,19 流路
20 サンプル保持部
21 バッファ部
22 流路
23 定量保持部
24 正電極接触部
25 負電極接触部
26 DNAコンジュゲート
27 DNAサンプル
28,29 空気
30 検出部
40 試料注入口
41 試料注入部
42 溝
43 非導電性フィルム
44 穴
45,46 溝
47 電極部
48,49 溝
50 導電性フィルム
51 流路形成プレート
52 電極形成プレート
53 電極層
54 電極部
55,56 溝
57 電極接触部
DESCRIPTION OF
Claims (5)
The said metal film is either copper, aluminum, or gold | metal | money, The plate for biological sample discrimination | determination apparatuses in any one of Claim 2 or Claim 4 characterized by the above-mentioned.
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