JP2007101308A - Target substance detecting element, device, and method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、金属のプラズモン共鳴を利用し、検体中の標的物質を高感度に検出する検出素子、検出装置及び検出方法に関するものである。 The present invention relates to a detection element, a detection apparatus, and a detection method for detecting a target substance in a specimen with high sensitivity using metal plasmon resonance.
血液中には、ガン・肝炎・糖尿病・骨粗しょう症など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際には、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来る。そのため、疾病マーカーのモニタリングは、次世代の医療技術として期待されている。未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の1つは、生物学的なリガンド−アナライト相互作用を利用して特定の化合物を識別するセンサを基本としたものである。 There are multiple markers in blood for specific diseases such as cancer, hepatitis, diabetes, and osteoporosis. When affected, the concentration of a specific protein increases during normal times. By monitoring these from normal times, it is possible to detect serious illnesses early. Therefore, monitoring of disease markers is expected as the next generation medical technology. One method for analyzing raw and unpurified proteins is based on sensors that use biological ligand-analyte interactions to identify specific compounds.
センサには、蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、光干渉法など幾つかの検出方法を利用した種々の方式のものがある。どの場合もリガントをセンサ表面に固定し、検体中のアナライトを高感度にかつ選択性よく選別して結合することにより夾雑物を排除し、目的とするタンパク質のみを高効率に基板表面に固定化することが共通のステップとなる。蛍光免疫法では、リガンド−アナライト複合体にさらに蛍光色素で標識した第二のリガントをさらに結合させ、蛍光色素を励起し、蛍光量を測定することでアナライトの濃度を測定する。プラズモン共鳴法では、金属プラズモンが界面物質の屈折率変化に高感度に反応することを利用して、金属薄膜や金属の微粒子の上に固定化されたリガンドに結合するアナライトの濃度を測定している。 There are various types of sensors using several detection methods such as fluorescence immunoassay, plasmon resonance, and optical interference. In any case, the ligand is immobilized on the sensor surface, and the analyte in the sample is selected with high sensitivity and selectivity to eliminate impurities, and only the target protein is immobilized on the substrate surface with high efficiency. Is a common step. In the fluorescence immunization method, a second ligand labeled with a fluorescent dye is further bound to the ligand-analyte complex, the fluorescent dye is excited, and the amount of fluorescence is measured to measure the concentration of the analyte. In the plasmon resonance method, the concentration of analyte bound to a ligand immobilized on a metal thin film or metal fine particle is measured by utilizing the fact that metal plasmon reacts sensitively to changes in the refractive index of the interface substance. ing.
また、最近では、さらなる性能向上を目的として、金属の微細構造を用いたセンサが開発されている。特許文献1は、金属薄膜上に絶縁体微小球を固定化し、上面を金属でコートしたセンサを開示しており、機械的な動作を必要とせずに高感度検出を可能とするという利点がある。特許文献2には、スペクトルの線幅を減少させることを目的として、微細孔内に金属微粒子を充填し、表面に金属薄膜を形成させ相互作用させることを特徴とする発明が開示されている。
しかし、上記に開示されている技術では、センシングに用いる吸光スペクトルのピーク幅が広く感度が低い場合があり、また、微細孔内に配置された金属ドットには、検体液・洗浄液が届きにくく正確な検出ができない場合がある。そこで、標的物質を捕捉する化学物質センサとしてはさらなる性能向上が望まれている。 However, with the technology disclosed above, the peak width of the absorption spectrum used for sensing may be wide and the sensitivity may be low, and it is difficult for the sample liquid / cleaning liquid to reach the metal dots placed in the micropores, making it accurate. May not be detected. Therefore, further improvement in performance is desired as a chemical substance sensor for capturing a target substance.
本発明は、上記課題に鑑み、標的物質を捕捉する化学センサの更なる性能向上を目的として、発明されたものである。 In view of the above problems, the present invention has been invented for the purpose of further improving the performance of a chemical sensor for capturing a target substance.
本発明により提供される標的物質検出素子は、検体中の標的物質をプラズモン共鳴法を利用して検出するために用いられる素子であって、基板と、該基板上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成された誘電体層と、該誘電体層上に形成された金属パターン層とを有することを特徴とする標的物質検出素子である。 A target substance detection element provided by the present invention is an element used for detecting a target substance in a specimen using a plasmon resonance method, and includes a substrate, a metal thin film formed on the substrate, A target substance detection element comprising a dielectric layer formed on the metal thin film and a metal pattern layer formed on the dielectric layer.
本発明により提供される標的物質検出装置は、検体中の標的物質を検出するための装置であって、(1)流路と、(2)前記流路に検体を供給するための送液手段と、(3)前記流路中に配置された前記標的物質の捕捉体を有する標的物質検出素子と、(4)前記標的物質検出素子にプラズモン共鳴法による検出用の光を照射する光照射手段と、(5)前記光照射手段により照射された光の変化を検出するための光検出手段と、を有し、前記標的物質検出素子が、本発明のものであることを特徴とする標的物質検出装置である。 A target substance detection apparatus provided by the present invention is an apparatus for detecting a target substance in a sample, and includes (1) a channel and (2) a liquid feeding means for supplying the sample to the channel. And (3) a target substance detection element having a capturing body for the target substance arranged in the flow path, and (4) a light irradiation means for irradiating the target substance detection element with light for detection by a plasmon resonance method And (5) a light detecting means for detecting a change in light emitted by the light irradiating means, wherein the target substance detecting element is that of the present invention. It is a detection device.
本発明により提供される標的物質検出方法は、検体中の標的物質を検出する方法であって、標的物質検出素子を配置した反応場に対して前記検体を送液しながら、該反応場におけるプラズモン共鳴スペクトルの変化を測定する工程と、前記プラズモン共鳴スペクトルの変化に基づいて前記検体中の標的物質を検出する工程とを有し、前記標的物質検出素子として本発明の素子を用いることを特徴とする標的物質検出方法である。 The target substance detection method provided by the present invention is a method for detecting a target substance in a specimen, and the plasmon in the reaction field is fed while the specimen is fed to the reaction field in which the target substance detection element is arranged. A step of measuring a change in a resonance spectrum, and a step of detecting a target substance in the sample based on the change in the plasmon resonance spectrum, wherein the element of the present invention is used as the target substance detection element, This is a target substance detection method.
本発明で開示した標的物質検出素子を用いることで、プラズモン共鳴をより効果的に利用することができ、標的物質検出感度を向上させることが可能となる。 By using the target substance detection element disclosed in the present invention, plasmon resonance can be used more effectively, and the target substance detection sensitivity can be improved.
本発明の標的物質検知素子においては、金属薄膜と金属パターンを誘電体を介して形成したことで、金属薄膜で生ずる表面プラズモン共鳴と金属パターンで生ずる局在プラズモン共鳴を利用することができる。すなわち、本発明においては表面プラズモン共鳴と局在プラズモン共鳴の相互作用を利用して検体中の標的物質を検出するに十分な感度を達成できる。さらに検体中の標的物質とセンサの反応領域とのアクセスビリティーが高く保たれるため、反応に要する時間が低減される。 In the target substance detection element of the present invention, the metal thin film and the metal pattern are formed via the dielectric, so that the surface plasmon resonance generated in the metal thin film and the localized plasmon resonance generated in the metal pattern can be used. That is, in the present invention, sensitivity sufficient to detect a target substance in a specimen can be achieved by utilizing the interaction between surface plasmon resonance and localized plasmon resonance. Furthermore, since the accessibility between the target substance in the sample and the reaction region of the sensor is kept high, the time required for the reaction is reduced.
以下、図を参照しながら本発明に関わる実施形態につき述べる。ここでは本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明をおこなうが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。 Embodiments relating to the present invention will be described below with reference to the drawings. Here, in order to fully understand the present invention, specific embodiments will be described in detail, but the present invention is not limited to the contents described here.
<標的物質検出素子>
本発明にかかる標的物質検出素子の好ましい構成の一例について、図2を参照しながら説明する。基板201は、本発明において目的とするプラズモン共鳴法による標的物質の検出を可能とする基板であれば、特に制限はない。ここでは、安価でかつ入手しやすいガラスやプラスチックなどを用いることが好ましい。ここで示した例では、基板201上に設けられた金属薄膜202と、パターン形状の金属層204が誘電体203を挟んで積層されている。ここで誘電体203とパターン形状の金属層204は、基板の厚さ方向に積層された同一のパターン形状の柱状体を構成している。
<Target substance detection element>
An example of a preferable configuration of the target substance detection element according to the present invention will be described with reference to FIG. If the board |
このように金属薄膜202上にパターン形状の金属層204を誘電体203を介して配することで、金属薄膜202で生ずる表面プラズモン共鳴とパターン形状の金属層204で生ずる局在プラズモン共鳴をとの相互作用を利用して標的物質の検出感度を向上させることができる。さらにパターン形状の金属層204は相互作用を得やすい位置に設けることができ、この場合一層の効果が望まれる。
Thus, by arranging the pattern-
金属薄膜202や204は、検体や緩衝溶液との界面で、プラズモンが生ずる物質からなるものであれば特に制限はない。本構成では、Au、Ag、Cu、Ptなどの貴金属単体や、これら元素から構成される金属間化合物、合金などを用いることが好ましい。また、金属薄膜202の厚さは、好ましくは10〜200nmの範囲とすることができ、膜厚や照射光の波長帯域を考慮して金属材料を適宜選択して用いるとよい。例えばAuの場合には、50nm程度の膜厚が好ましい。金属薄膜204の厚さも、好ましくは10〜200nmの範囲とすることができ、膜厚や照射光の波長帯域を考慮して金属材料を適宜選択して用いるとよい。
The metal
また、誘電体層203は、所望のプラズモン共鳴法による検出を可能とする層であれば特に制限はない。ただし、低誘電率素材を用いることが望ましい。好適な素材としては、Al2O3、Sb2O3、BeO、Bi2O3、BiF3、CaF2、CeO2、CeF3、HfO2、LaF3、La2O3、PbCl2、PbF2、LiF、MgF2、MgO、NdF3、Nd2O3、Pr6O11、Sc2O3、SiO、SiO2、Si2O3、NaF、Ta2O5、TiO2、TlCl、ThO2、ThF4、Y2O3、ZnSe、ZnS、ZrO2、各種ポリマー材料があげられる。その層厚は、好ましくは20〜1000nmの範囲とすることができ、層厚や照射光の波長帯域を考慮して構成材料を適宜選択して用いるとよい。例えば、SiO2を用いる場合には100nm程度の柱状構造を用いることが好ましい。また、誘電体層203およびその上に設けられるパターン状金属層(204、304、310など)の厚さは光学的特性の変化を検出するために用いる光の波長の1/10から1/2の範囲とすることができる。
The
柱状体の配列方法は、正方配列でも三角配列でも六方配列でもよく、規則的に配列していれば特に制限はない。また柱状体間の距離は、50〜1000nmの範囲の中で適宜選択して用いることが可能である。 The arrangement method of the columnar bodies may be a square arrangement, a triangular arrangement, or a hexagonal arrangement, and is not particularly limited as long as they are regularly arranged. The distance between the columnar bodies can be appropriately selected and used within the range of 50 to 1000 nm.
標的物質捕捉体205は、標的物質と特異的な結合対を形成するものであれば、特に制限はない。ここでは抗体や核酸を用いることが好ましい。
The target substance capturing
標的物質検出素子としては、図2に示したものとは別に、図3(a)及び(b)に示す構造のものを用いることができる。 As the target substance detection element, one having the structure shown in FIGS. 3A and 3B can be used separately from the element shown in FIG.
図3(a)の標的物質検出素子306は、基板301の上に金属薄膜を設け、金属薄膜302の上に連続した誘電体層303を設け、さらにその上層に孤立した(パターン状)金属層304を設けて構成されている。金属層304には、捕捉体305を固定化させている。基板301、誘電体層303、金属層304の材料は、図2を参照して上述したものと同等のものが適宜使用できる。図3(b)に示す標的物質検出素子312は、基板307の上に金属薄膜308を設け、金属薄膜308上に連続した誘電体層309を設け、さらにその上層に周期的に穴の開いた金属層310(開口(ホール)を有する金属層)を設けて構成されている。金属層310には捕捉体311を固定化させている。この構成の標的物質検知素子においても上述したのと同様の材料を適宜用いることができる。
In the target
また、パターン状の金属層304及びホールを有する金属層310は、リソグラフィー技術や、インプリント技術を用いてパターンを整列させてあることが好ましい。
The patterned
図2に示す金属パターン層を有する柱状体、図3(a)に示すパターン状の金属層、図3(b)に示すホールの断面形状、サイズ、配置密度、規則的な配置の態様は、目的とするプラズモン共鳴を利用した標的物質の検出が可能となるように選択する。 The columnar body having the metal pattern layer shown in FIG. 2, the pattern-like metal layer shown in FIG. 3A, the cross-sectional shape, size, arrangement density, and regular arrangement of the holes shown in FIG. Selection is made so that the target substance can be detected using the target plasmon resonance.
標的物質しては、標的物質捕捉体と特異的な結合対を形成するものであれば、特に制約はない。検体中に含まれる標的物質は、非生体物質と生体物質に大別できる。 The target substance is not particularly limited as long as it forms a specific binding pair with the target substance capturing body. Target substances contained in a specimen can be roughly classified into non-biological substances and biological substances.
検出対象として重要な非生体物質としては、環境汚染物質としての塩素置換数/位置の異なるPCB類、同じく塩素置換数/位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質等が挙げられる。 Examples of non-biological substances important as detection targets include PCBs having different chlorine substitution numbers / positions as environmental pollutants, dioxins having different chlorine substitution numbers / positions, and endocrine disrupting substances called so-called environmental hormones.
生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される。具体的には、DNA、RNA、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などを挙げることができる。 The biological material is selected from nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids, and complexes thereof. Specific examples include DNA, RNA, aptamer, gene, chromosome, cell membrane, virus, antigen, antibody, lectin, hapten, hormone, receptor, enzyme, peptide, sphingosaccharide, sphingolipid and the like.
更には、前記の「生体物質」を有する、あるいはそれを産生する細菌や細胞そのもので、かつ標的物質捕捉素子により補正可能なものも検出対象とすることができる。 Furthermore, bacteria or cells themselves that contain or produce the “biological substance” and can be corrected by the target substance capturing element can also be detected.
<標的物質検出装置>
本発明の標的物質検出装置の一例について、図1を参照しながら説明する。光源101は、目的とする測定に利用できるものであればよく、例えば、白色光源を用いることができる。中でも、ハロゲンランプを用いることが好ましい。分光器102としては、1nm程度の波長分解能で分光できれば特に制限はない。本発明では、マルチチャネル検出器や分光光度計を用いることが好ましい。検体リザーバー103としては、標的物質の非特異吸着が少ない材料で構成させたリザーバー、もしくは、チップ中にリザーバーを作りこんでもかまわない。例えば、非特異吸着防止コーティングしたエッペンドルフチューブを用いることが好ましい。洗浄液リザーバー104の構造及びその構成材料も、検体の形態や、検出対象としての標的物質に応じて適宜選択すればよい。ここでは、生化学用のガラスもしくはプラスチックチューブを用いることが好ましい。流路切り替えバルブ105としては、流体のチューブを切り替えられれば特に制限はない。例えば、三方向バルブを用いることが好ましい。送液手段106としては、シリンジポンプやチューブポンプ、ダイヤフラムポンプなどを適宜選択して用いることができる。廃液タンク107としては、ポンプにシリンジポンプを使用した場合、シリンジがそのまま廃液タンクになる。チューブポンプやダイヤフラムポンプを用いた場合は、ビーカーや瓶を廃液タンクとして用いることができる。また、検体が少量しかない場合は廃液にせず、循環用の流路やチューブを用い検体を循環させてやってもよい。送液および廃液チューブ108,109としては、標的物質の吸着ができる限り少ない材質のチューブが好ましい。標的物質検出素子110としては、図2に示すプラズモン光学素子や、図3の(a)及び(b)に示す素子が適宜選択して使用される。流路111としては、検体量ができる限り減らすことができるよう微小なものであることが好ましい。また、流路表面に標的物質ができる限り吸着しないようコーティングが施されていることが好ましい。カバー112としては、透明な材料でかつ、基板113とともに流路を形成でき得る材料であることが好ましい。
<Target substance detection device>
An example of the target substance detection apparatus of the present invention will be described with reference to FIG. The
図1の構成を有する装置を用いた標的物質の検出は以下のようにして行なうことができる。まず、バルブ105を調節して洗浄液リサーバー104から標的物質検出素子110を配置した流路111に洗浄液を供給して、流路内を十分に洗浄する。洗浄廃液は廃液タンク107に回収する。洗浄終了後、バルブ105を調節して、検体(液)103を流路111内に所定の流速で供給し、標的物質検出素子110に接触させる。この時、流路内を定速で検体103を流し、廃液タンクに回収する。検体が標的物質検出素子上の捕捉体と接触する反応場に到達する時点を考慮して、光源101から測定用の光を照射し、コリメトリーレンズ115を介して流路の所定位置に集光し、反射光を分光器102で受光して反射光のスペクトルを得る。標的物質検出素子110の有する捕捉体に標的物質が捕捉されるとプラズモン共鳴によるスペクトル変化が生じ、そのスペクトル変化に基づいて検体中における標的物質の有無を検出することができる。例えば、所定の時間間隔(インターバル)をもってスペクトルを検出して記録し、経時的なスペクトルの変化を求め、それを利用して標的物質の高感度での検出が可能となる。
Detection of a target substance using the apparatus having the configuration of FIG. 1 can be performed as follows. First, the
また、異なる捕捉体の複数を区分して配置した複数の反応場を流路内に設けることで、複数の捕捉体に対応する複数の標的物質の検出が可能となる。複数の反応場は、同一標的物質捕捉素子内に設けてもよいし、図6に示すように、流路の上流から下流に向けてそれぞれが異なる標的物質を検出し得る標的物質検出素子を直列に配置してもよい。 In addition, by providing a plurality of reaction fields in which a plurality of different capture bodies are divided and provided in the flow path, it is possible to detect a plurality of target substances corresponding to the plurality of capture bodies. A plurality of reaction fields may be provided in the same target substance capturing element, or, as shown in FIG. 6, target substance detection elements that can detect different target substances from the upstream to the downstream of the flow path in series. You may arrange in.
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
(実施例1)
<標的物質検出素子>
本実施例で使用した標的物質検出素子の作製手順について、図9を参照しながら説明する。基板901としては、厚さ525μmのシリコンウエハーを用いる。基板の上に、50nmのAu薄膜902を蒸着し、膜を形成する。さらにSiO2層903をスパッタリングにより50nm形成した後、ポジ型の電子線レジスト(ZEP520)904をスピンコーターでコーティングする。その後、電子線描画装置を用い、200nm程度の領域に電子線で露光する。その後、現像をおこない、ホールパターンを形成した後、さらにAuを20nm程度成膜する。さらに、リフトオフプロセスにより、レジストとレジスト上のAuを除去する。最後に、AuをマスクとしてSF6ガスにより、SiO2層のエッチングをおこない素子が完成する。
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited only to the contents described herein.
Example 1
<Target substance detection element>
The procedure for producing the target substance detection element used in this example will be described with reference to FIG. As the
素子完成後は、アセトン、IPA、超純水を用い超音波洗浄をおこなう。さらに捕捉体205として、抗体を用い、1時間程度浸漬することにより、物理吸着させ固定化する。
After completion of the element, ultrasonic cleaning is performed using acetone, IPA, and ultrapure water. Further, an antibody is used as the capturing
<標的物質検出装置>
本実施例で使用した装置につき、図1を参照しながら説明する。光源101としてはハロゲンランプを、分光器102としてはマルチチャネル検出器(浜松フォトニクス)を用いる。検体リザーバー103としてはエッペンドルフチューブを、洗浄液リザーバー104としては生化学用のガラスボトルを用いる。流路切り替えバルブ105としては三方向バルブ(GLサイエンス)を、送液手段106としてはシリンジポンプ(kd Scientific KDS200)を用いる。廃液タンク107としてはシリンジを、送液および廃液チューブ108、109としてはテフロンチューブを用いる。標的物質検出素子110としては、上述の図1に示す構成を有する素子を用いる。流路111としては、カバー(PDMS基板)112に形成した1mm幅、100μm幅、40mm長のものを用いる。基板113としては、石英ガラスを用い、コリメートレンズとしては、平凸シリンダーレンズ(シグマ光機、20mm×40mm)を用いる。
<Target substance detection device>
The apparatus used in this example will be described with reference to FIG. A halogen lamp is used as the
<標的物質の測定>
図1の装置において、抗PSA抗体を固定化させた標的物質検出素子206を装置にセットし以下のプロトコールをおこなう。
(1)三方バルブを洗浄液側に切り替え、pHを7.4に調整したバッファー溶液を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し、標的物質検出素子をよく洗浄する。
(2)バルブを検体側に切り替え、検体を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し抗原抗体反応をおこす。
(3)検体を送液しながら、一定時間ごとに反射スペクトルを測定する。
(4)再び、バルブを洗浄液側に切り替え、バッファー溶液を流速0.1(ml/min.)で10分間流し、非特異的に吸着した抗原を洗い流す。
<Measurement of target substance>
In the apparatus of FIG. 1, the target
(1) The three-way valve is switched to the cleaning liquid side, and a buffer solution whose pH is adjusted to 7.4 is allowed to flow at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to thoroughly wash the target substance detection element.
(2) The valve is switched to the sample side, and the sample is allowed to flow at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to cause an antigen-antibody reaction.
(3) Measure the reflection spectrum at regular intervals while feeding the specimen.
(4) Switch the valve to the washing solution side again, and flow the buffer solution at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to wash away the non-specifically adsorbed antigen.
上記プロトコールにより、図4に示すように反応時間ごとのスペクトルが得られる。このスペクトルをグラフソフトにより関数フィッティングし、スペクトルのピーク値を求めることにより、図5に示すように抗原抗体反応のタイムコースが得られる。さらに、洗浄後、検体中の標的物質の濃度をもとめることも可能である。 According to the above protocol, a spectrum for each reaction time is obtained as shown in FIG. By fitting this spectrum with graph software and obtaining the peak value of the spectrum, the time course of the antigen-antibody reaction can be obtained as shown in FIG. Furthermore, it is possible to determine the concentration of the target substance in the specimen after washing.
疾病マーカーは、病気になると濃度が増加するたんぱく質であるので、正常なときの値と比較することにより、罹患したかどうか診断することが可能となる。また、標的タンパクと抗体の反応の様子を調べることにより、より精度の高い診断をおこなうことも可能となる。 Since a disease marker is a protein whose concentration increases when a disease occurs, it can be diagnosed as to whether or not the disease marker is affected by comparison with a normal value. Further, by examining the reaction between the target protein and the antibody, it becomes possible to make a more accurate diagnosis.
(実施例2)
<標的物質検出素子>
図2に示す標的物質検出素子を四つ直列に並べ、それぞれに異なる種類の抗体を固定化させたものを標的物質検出素子として用いる。
<標的物質検出装置>
本実施例で使用した装置を図6を参照しながら説明する。光源601としてはハロゲンランプを、分光器602としては4ch同時測定が可能なマルチチャネル検出器を用いる。検体リザーバー603としてはエッペンドルフチューブを、洗浄液リザーバー604としては生化学用のガラスボトルを用いる。流路切り替えバルブ605としては三方向バルブ(GLサイエンス)を、ポンプ606としてはシリンジポンプ(kd Scientific KDS200)を用いる。廃液タンク607としてはシリンジを、送液および廃液チューブ608,609としてはテフロンチューブを用いる。流路611としては、PDMS基板612に形成した1mm幅、100μm幅、40mm長のものを用いる。基板613としては石英ガラスを、コリメートレンズとしては、平凸シリンダーレンズ(シグマ光機、20mmx40mm)を用いる。光ファイバー616としては、光源からの光量が各波長帯域で充分とれれば特に制限はない。ここでは、可視光波長帯域のファイバーを用いることが好ましい。
(Example 2)
<Target substance detection element>
Two target substance detection elements shown in FIG. 2 are arranged in series, and different types of antibodies are immobilized on the target substance detection elements.
<Target substance detection device>
The apparatus used in this example will be described with reference to FIG. A halogen lamp is used as the
<標的物質の測定>
図6の装置において、抗CEA抗体、抗AFP抗体、抗PSA抗体及び抗PAP抗体を固定化させた標的物質検出素子を装置にセットし以下のプロトコールをおこなう。
(1)三方バルブを洗浄液側に切り替え、pHを7.4に調整したバッファー溶液を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し、標的物質検出素子をよく洗浄する。
(2)バルブを検体側に切り替え、検体を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し抗原抗体反応をおこす。
(3)検体を送液しながら、一定時間ごとに反射スペクトルを測定する。
(4)再び、バルブを洗浄液側に切り替え、バッファー溶液を流速0.1(ml/min.)で10分間流し、非特異的に吸着した抗原を洗い流す。
<Measurement of target substance>
In the apparatus of FIG. 6, the target substance detection element on which the anti-CEA antibody, anti-AFP antibody, anti-PSA antibody and anti-PAP antibody are immobilized is set in the apparatus and the following protocol is performed.
(1) The three-way valve is switched to the cleaning liquid side, and a buffer solution whose pH is adjusted to 7.4 is allowed to flow at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to thoroughly wash the target substance detection element.
(2) The valve is switched to the sample side, and the sample is allowed to flow at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to cause an antigen-antibody reaction.
(3) Measure the reflection spectrum at regular intervals while feeding the specimen.
(4) Switch the valve to the washing solution side again, and flow the buffer solution at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to wash away the non-specifically adsorbed antigen.
上記プロトコールにより、反応場ごとに図6に示すようなスペクトルが得られる。このスペクトルをグラフソフトにより関数フィッティングしスペクトルのピーク値を求めることにより、図7に示すようにそれぞれのマーカータンパク質について、反応のkinetics測定が可能となる。また、図7に示したkinetics測定の結果から、病原因の指標となるマーカータンパクの濃度を表1のように導き出すことも可能である。 According to the above protocol, a spectrum as shown in FIG. 6 is obtained for each reaction field. By fitting this spectrum with graph software and obtaining the peak value of the spectrum, the kinetics of the reaction can be measured for each marker protein as shown in FIG. Further, from the results of the kinetics measurement shown in FIG. 7, it is possible to derive the marker protein concentration as an index of the cause of the disease as shown in Table 1.
以上のように、複数の疾病マーカータンパク質とその抗体の反応プロファイルを測定することや標的物質の濃度を調べることにより、一つのタンパク質の測定より高精度に疾病の要因を調べることが可能になる。 As described above, by measuring the reaction profile of a plurality of disease marker proteins and their antibodies and examining the concentration of the target substance, it becomes possible to investigate the cause of the disease with higher accuracy than the measurement of one protein.
(実施例3)
<標的物質検出素子>
図2に示す標的物質検出素子を四つ直列に並べ、それぞれに異なる種類の抗体を固定化させたものを標的物質検出素子として用いる。
<標的物質検出装置>
本実施例で使用する装置につき、図8を参照しながら説明する。光源801としてはハロゲンランプを、分光器802としては4ch同時測定が可能なマルチチャネル検出器を用いる。検体リザーバー803としてはエッペンドルフチューブを、洗浄液リザーバー804としては生化学用のガラスボトルを用いる。流路切り替えバルブ805,816としては三方向バルブ(GLサイエンス)を、ポンプ806としてはチューブポンプ(kd Scientific KDS200)を用いる。廃液タンク807としてはビーカーを、送液および廃液チューブ808,809としてはテフロンチューブを用いる。流路811としては、PDMS基板212に形成した1mm幅、100μm幅、40mm長のものを用いる。基板413としては、石英ガラスを用い、コリメートレンズとしては、平凸シリンダーレンズ(シグマ光機、20mmx40mm)を用い、循環用チューブ817としては、テフロンチューブを用いる。
(Example 3)
<Target substance detection element>
Two target substance detection elements shown in FIG. 2 are arranged in series, and different types of antibodies are immobilized on the target substance detection elements.
<Target substance detection device>
The apparatus used in this embodiment will be described with reference to FIG. A halogen lamp is used as the
<標的物質の測定>
図8の装置において、抗CEA抗体、抗AFP抗体、抗PSA抗体及び抗PAP抗体を固定化させた標的物質検出素子を装置にセットし以下のプロトコールをおこなう。
(1)バルブ1を洗浄液側に、バルブ2を廃液タンク側に設定し、pHを7.4に調整したバッファー溶液を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し、標的物質検出素子をよく洗浄する。
(2)バルブ1を検体側に、バルブ2を循環用チューブ側に切り替え、検体を0.1(ml/min.)の流速で10分間流し抗原抗体反応をおこす。
(3)検体を送液しながら、一定時間ごとに反射スペクトルを測定する。
(4)再び、バルブを洗浄液側に切り替え、バッファー溶液を流速0.1(ml/min.)で10分間流し、非特異的に吸着した抗原を洗い流す。
<Measurement of target substance>
In the apparatus of FIG. 8, the target substance detection element on which the anti-CEA antibody, anti-AFP antibody, anti-PSA antibody and anti-PAP antibody are immobilized is set in the apparatus and the following protocol is performed.
(1) Set the valve 1 on the washing liquid side and the valve 2 on the waste tank side, and flow the buffer solution adjusted to pH 7.4 at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to detect the target substance. Clean the element thoroughly.
(2) The valve 1 is switched to the sample side and the valve 2 is switched to the circulation tube side, and the sample is allowed to flow for 10 minutes at a flow rate of 0.1 (ml / min.) To cause an antigen-antibody reaction.
(3) Measure the reflection spectrum at regular intervals while feeding the specimen.
(4) Switch the valve to the washing solution side again, and flow the buffer solution at a flow rate of 0.1 (ml / min.) For 10 minutes to wash away the non-specifically adsorbed antigen.
上記プロトコールにより、反応場ごとに図4に示すようなスペクトルが得られる。このスペクトルをグラフソフトにより関数フィッティングしスペクトルのピーク値を求めることにより、図7に示すようにそれぞれのマーカータンパク質について、反応のkinetics測定が可能となる。以上のように、複数の疾病マーカータンパク質とその抗体の反応プロファイルを測定することにより、一つのタンパク質の測定より高精度に疾病の要因を調べることが可能になる。 According to the above protocol, a spectrum as shown in FIG. 4 is obtained for each reaction field. By fitting this spectrum with graph software and obtaining the peak value of the spectrum, the kinetics of the reaction can be measured for each marker protein as shown in FIG. As described above, by measuring the reaction profile of a plurality of disease marker proteins and their antibodies, it becomes possible to investigate the cause of the disease with higher accuracy than the measurement of one protein.
101 光源
102 分光器
103 検体リザーバー
104 洗浄液リザーバー
105 流路切り替えバルブ
106 送液手段
107 廃液タンク
108 送液チューブ
109 廃液チューブ
110 標的物質検出素子
111 流路
112 カバー
113 基板
114 標的物質検出チップ
115 コリメートレンズ
201 基板
202 金属薄膜
203 誘電体
204 金属膜
205 捕捉体
206 標的物質検出素子
301 基板
302 金属薄膜
303 誘電体層
304 金属層
305 標的物質捕捉体
306 標的物質検出素子
307 基板
308 金属層
309 誘電体層
310 金属層(ホールを有する)
311 標的物質捕捉体
312 標的物質検出素子
601 光源
602 分光器
603 検体リザーバー
604 洗浄液リザーバー
605 流路切り替えバルブ
606 ポンプ
607 廃液タンク
608 送液チューブ
609 廃液チューブ
610 標的物質検出素子
611 流路
612 カバー
613 基板
614 標的物質検出チップ
615 カプラー
616 光ファイバー
801 光源
802 分光器
803 検体リザーバー
804 洗浄液リザーバー
805 流路切り替えバルブ
806 ポンプ
807 廃液タンク
808 送液チューブ
809 廃液チューブ
810 標的物質検出素子
811 流路
812 カバー
813 基板
814 標的物質検出チップ
815 カプラー
817 流路切り替えバルブ
818 検体循環チューブ
901 Si基板
902 金
903 SiO2層
904 ポジ型レジスト
905 金
DESCRIPTION OF
311 Target
Claims (7)
基板と、該基板上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成された誘電体層と、該誘電体層上に形成された金属パターン層とを有することを特徴とする標的物質検出素子。 An element used for detecting a target substance in a specimen using a plasmon resonance method,
A target substance detection comprising a substrate, a metal thin film formed on the substrate, a dielectric layer formed on the metal thin film, and a metal pattern layer formed on the dielectric layer element.
(1)流路と、
(2)前記流路に検体を供給するための送液手段と、
(3)前記流路中に配置された前記標的物質の捕捉体を有する標的物質検出素子と、
(4)前記標的物質検出素子にプラズモン共鳴法による検出用の光を照射する光照射手段と、
(5)前記光照射手段により照射された光の変化を検出するための光検出手段と、
を有し、
前記標的物質検出素子が、請求項1記載のものであることを特徴とする標的物質検出装置。 An apparatus for detecting a target substance in a specimen,
(1) a flow path;
(2) liquid feeding means for supplying the specimen to the flow path;
(3) a target substance detection element having a capturing body for the target substance disposed in the flow path;
(4) a light irradiation means for irradiating the target substance detection element with light for detection by a plasmon resonance method;
(5) a light detection means for detecting a change in light emitted by the light irradiation means;
Have
The target substance detection device according to claim 1, wherein the target substance detection element is the one according to claim 1.
標的物質検出素子を配置した反応場に対して前記検体を送液しながら、該反応場におけるプラズモン共鳴スペクトルの変化を測定する工程と、
前記プラズモン共鳴スペクトルの変化に基づいて前記検体中の標的物質を検出する工程とを有し、前記標的物質検出素子として請求項1記載の素子を用いることを特徴とする標的物質検出方法。 A method for detecting a target substance in a specimen,
Measuring the change in the plasmon resonance spectrum in the reaction field while sending the sample to the reaction field in which the target substance detection element is arranged;
And a step of detecting a target substance in the specimen based on a change in the plasmon resonance spectrum, wherein the element according to claim 1 is used as the target substance detection element.
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