JP2008094802A - ペプチド化合物及びタンパク質のトポロジー解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 一般式(I)又は(II)で表されるペプチド化合物;係る化合物を用いて架橋反応を行い、架橋タンパク質分子を検出するタンパク質のトポロジー解析方法。
[化1]
(式中、A1はアミノ基が保護されメチレン基結合カルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸又はアスパラギン酸;A2aはカルボキシル基が活性エステル化されグアニジド基が正に荷電したアルギニンである。)
[化2]
(式中、A1は前記と同様;A2bはグアニジド基が正に荷電したアルギニン;A3はカルボキシル基が活性エステル化されたフェニルアラニンを除く中性アミノ酸、ヒスチジン及びアルギニンのいずれか;A4及びA5は中性アミノ酸、ヒスチジン及びアルギニンのいずれかであり;m及びnは0又は1、m+nは1以下である。)
【選択図】 なし
Description
Plant & Cell Physiology,33(3),291−297(1992)
本発明のペプチド化合物(以下、単に「ペプチド化合物」と略記することがある)は、下記一般式(I)又は(II)で表されることを特徴とする。
したがって、架橋されるタンパク質分子の架橋部位間の距離が、本発明のペプチド化合物における、主鎖骨格となるペプチド鎖の長さに近ければ、該ペプチド化合物を用いることで架橋産物が形成され得るが、さらに、架橋されるタンパク質分子の架橋部位近傍が親水性を有していると、より架橋産物が形成され易い。特に、架橋部位近傍が負電荷を帯びている場合に、最も架橋産物が形成され易い。このように、本発明のペプチド化合物を用いて得られた架橋産物を検出することで、架橋部位間の距離だけでなく、架橋部位近傍の荷電状態や親水性・疎水性等のタンパク質に関する情報を容易に得ることができる。
そして、中でもA3としては、カルボキシル基が活性エステル化されたグリシン又はアラニンが好ましい。
本発明の化合物を架橋剤として用いた場合、活性エステル化されたカルボキシル基は、この中に含まれるカルボニル基が、架橋対象のタンパク質中の反応部位、具体的には求核性部位と反応して、架橋産物を生じる。
例えば、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N’−ジイロプロピルカルボジイミド(DIC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)等のカルボジイミド系の脱水縮合剤を用いる方法が挙げられる。
また、これ以外にも、カルボキシル基を活性化して、アミノ基と反応させる方法でも良い。このような方法として、例えば、活性エステル法、酸無水物法、酸ハライド法等が挙げられる。
酸無水物法では、カルボキシル基を、例えば、酢酸、メタンスルホン酸及びp−トルエンスルホン酸等のいずれかと反応させて、酸無水物とする方法が挙げられる。
酸ハライド法では、カルボキシル基を、例えば、カルボニルクロライドとして、活性化する方法が挙げられる。
これらカルボキシル基の活性化には、従来公知の方法を適用すれば良い。
したがって、本発明の化合物を用いて、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で架橋反応を行い、架橋されたタンパク質分子(架橋産物)を検出することで、タンパク質のトポロジー解析方法を行うことができる。
また、タンパク質複合体を架橋する場合には、架橋産物は、該タンパク質複合体を各構成タンパク質に分離する操作を行ってから、検出に供することが好ましい。
なお、ここでは、タンパク質複合体を各構成タンパク質に分離する方法として電気泳動を挙げたが、電気泳動以外の方法で分離しても良い。
アミノ基がアセチル化されたグルタミン酸、アルギニン、アラニンがこの順に結合されたペプチド化合物(26.5g,0.063mol)とN−ヒドロキシスクシンイミド(14.5g,0.126mol)をジオキサン500mlに溶解し、10℃まで冷却した後、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(26g,0.126mol)を加えた反応混合物を4℃で24時間放置した。
放置後、沈殿物をろ過して除去しジオキサンで洗浄した。そして、ろ液と洗液を一緒にした後、減圧濃縮して油状残渣を得た。この油状残渣はすぐ結晶化したので、エーテルを加えてろ別し、ジクロロメタン/石油エーテル混合溶媒を用いて再結晶を行い、前記式(II)において、A1が、アセチル基でアミノ基が保護されかつメチレン基に結合しているカルボキシル基がN−ヒドロキシスクシンイミドで活性エステル化されたグルタミン酸であり、A2bが、水素イオンの配位によりグアニジド基が正電荷を帯びたアルギニンであり、A3が、カルボキシル基がN−ヒドロキシスクシンイミドで活性エステル化されたアラニンであり、m及びnが0である、本発明のペプチド化合物の結晶を31g得た(収率80%)。
pH8のリン酸−ホウ酸緩衝液に、濃度が5×10-4Mとなるようにニワトリ卵白リゾチーム(分子量14.3kD)を溶解させた溶液を調製し、この溶液1mlに対し、5×10-4Mの合成例で得られた本発明の架橋剤のエチルアルコール溶液0.2mlを混合し、30℃で8時間放置し、架橋反応液を得た。
得られた反応液を、常法に従ってSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析したところ、用いた上記リゾチームの分子量のほぼ2倍の分子量である新たなタンパク質バンドを検出した。これは上記架橋剤で二つの上記リゾチーム分子が架橋された架橋産物であった。
一方、本実施例で用いた架橋剤は、正電荷を帯びていて親水性が高く、該架橋剤がリゾチーム分子の架橋部位近傍に接近できたことから、リゾチーム分子の架橋部位近傍の表面は、負電荷を帯び、親水性が高いことが推測された。
Claims (7)
- 前記A3が、カルボキシル基が活性エステル化されたグリシン又はアラニンであることを特徴とする請求項2に記載のペプチド化合物。
- 前記A1中における保護基がアセチル基であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
- 前記A1及び/又はA3中の活性エステルが、シアネート化合物、イソチオシアネート化合物、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシマレイミド及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾールのいずれかと、カルボキシル基とを反応させて得られるものであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
- タンパク質分子間又はタンパク質複合体内における架橋剤用であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
- 請求項6に記載のペプチド化合物を用いて、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で架橋反応を行い、架橋されたタンパク質分子を検出することを特徴とするタンパク質のトポロジー解析方法。
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