JP2008074830A - Antioxidant, and food, medicine and cosmetic containing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、渦鞭毛藻類によって産生される抗酸化剤、特に、スーパーオキシド消去剤に関する。 The present invention relates to antioxidants produced by dinoflagellates, in particular superoxide scavengers.
一般に天然物由来の抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸(ビタミンC)やトコフェロール類(ビタミンE)などの抗酸化ビタミン類、アントシアニンのような抗酸化ポリフェノールがよく知られており、現在、医薬品、食品、化粧品またはこれらの添加物として広く利用されている。
また、我々の生活の中における、喫煙・飲酒、ストレス、アンバランスな食生活等は、生活習慣病の要因となるといわれているが、その予防手段または治療手段として、抗酸化剤の摂取が提案されている。
In general, as antioxidants derived from natural products, for example, antioxidant vitamins such as ascorbic acid (vitamin C) and tocopherols (vitamin E), and antioxidant polyphenols such as anthocyanins are well known. It is widely used as food, cosmetics or additives.
In addition, smoking / drinking, stress, and unbalanced eating habits in our lives are said to be a cause of lifestyle-related diseases, but it is suggested that antioxidants be taken as preventive or therapeutic measures. Has been.
ここで、抗酸化剤には水溶性のものと脂溶性のものがあり、上記のような生活習慣病の予防等のためには、その両方を摂取することが望ましいとされている。
しかしながら、例えば代表的な水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸は、熱に対して不安定であるという問題点を有する。
Here, there are water-soluble and fat-soluble antioxidants, and it is desirable to take both of them for the prevention of lifestyle-related diseases as described above.
However, for example, ascorbic acid, which is a typical water-soluble antioxidant, has a problem that it is unstable to heat.
一方、赤潮プランクトン由来の抗酸化剤として、ラフィド藻類や緑藻類で報告されている(非特許文献1)。しかしながら、これらのプランクトン由来の抗酸化剤は熱によって該抗酸化作用が失活してしまうという問題がある。 On the other hand, rafid algae and green algae have been reported as antioxidants derived from red tide plankton (Non-patent Document 1). However, these plankton-derived antioxidants have a problem that the antioxidant action is deactivated by heat.
本発明は、上記課題を解決することを目的としたものであって、新規な抗酸化剤を提供することを目的とする。さらには、熱に安定および/または水に可溶な抗酸化剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a novel antioxidant. It is another object of the present invention to provide an antioxidant that is stable to heat and / or soluble in water.
かかる状況のもと、発明者が鋭意検討した結果、渦鞭毛藻類より抽出した抗酸化剤が、上記課題を解決しうることを見出した。
これまで、抗酸化活性は、その大半が1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH法)または化学発光法で測定されていた。しかしながら、本願発明者が鋭意検討した結果、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性は、その赤潮プランクトンの種類によっては、DPPH法や化学発光法等では、鉄複合体のような妨害物質などが存在するために、抗酸化活性が検出されない場合があることを見出した。
そこで、本願発明者らは、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性を、電子スピン共鳴(ESR法)で測定を試みた。
すなわち、本願発明者らが、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性について、従来とは異なる方法で抗酸化活性を測定することにより、従来測定できなかった種類の赤潮プランクトンについても抗酸化活性の測定に成功し、本発明を完成するに至ったものである。
Under such circumstances, as a result of intensive studies by the inventors, it has been found that an antioxidant extracted from dinoflagellates can solve the above problems.
Until now, most of the antioxidant activity was measured by 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH method) or chemiluminescence method. However, as a result of intensive studies by the inventor of the present application, the antioxidant activity derived from red tide plankton is due to the presence of interfering substances such as iron complexes in the DPPH method and chemiluminescence method depending on the type of red tide plankton. Furthermore, it has been found that antioxidant activity may not be detected.
Therefore, the present inventors tried to measure the antioxidant activity derived from red tide plankton by electron spin resonance (ESR method).
In other words, the present inventors succeeded in measuring the antioxidant activity of red tide plankton that could not be measured by measuring the antioxidant activity derived from red tide plankton using a method different from the conventional method. Thus, the present invention has been completed.
具体的には、以下の手段により達成された。
(1)渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
(2)前記抗酸化剤は、スーパーオキシドを消去するものである、(1)に記載の抗酸化剤。
(3)前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium属に属する、(1)または(2)に記載の抗酸化剤。
(4)前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium impudicumである、(1)または(2)に記載の抗酸化剤。
(5)前記抗酸化剤は、水溶性である、(1)〜(4)のいずれか1項に記載の抗酸化剤。
(6)前記抗酸化剤は、100℃で30分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、(1)〜(5)のいずれか1項に記載の抗酸化剤。
(7)(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗酸化剤を含む食品。
(8)(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗酸化剤を含む薬品。
(9)(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗酸化剤を含む化粧料。
Specifically, it was achieved by the following means.
(1) Antioxidants derived from dinoflagellates.
(2) The antioxidant according to (1), wherein the antioxidant eliminates superoxide.
(3) The antioxidant according to (1) or (2), wherein the dinoflagellate belongs to the genus Gymnodinium.
(4) The antioxidant according to (1) or (2), wherein the dinoflagellate is Gymnodinium impudicum.
(5) The antioxidant according to any one of (1) to (4), wherein the antioxidant is water-soluble.
(6) The antioxidant according to any one of (1) to (5), wherein the antioxidant activity does not decrease even when heat-treated at 100 ° C. for 30 minutes or more.
(7) A food containing the antioxidant according to any one of (1) to (6).
(8) The chemical | medical agent containing the antioxidant of any one of (1)-(6).
(9) A cosmetic comprising the antioxidant according to any one of (1) to (6).
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。 Hereinafter, the contents of the present invention will be described in detail. In the present specification, “to” is used to mean that the numerical values described before and after it are included as a lower limit value and an upper limit value.
本発明の抗酸化剤は、渦鞭毛藻類由来のものであり、好ましくは、Scrippsiella属、Gymnodinium属、Alexandrium属、Karenia属、Heterocapsa属、Akashiwo属由来のものであり、より好ましくは、Gymnodinium 属由来のものである。Gymnodinium 属由来の渦鞭毛藻類としては、Gymnodinium impudicum、Gymnodium catenatum等が挙げられ、本発明では、Gymnodinium impudicum由来のものが特に好ましい。 The antioxidant of the present invention is derived from dinoflagellates, preferably from the genus Scrippsiella, Gymnodinium, Alexandrium, Karenia, Heterocapsa, Akashiwo, more preferably from the genus Gymnodinium belongs to. Examples of dinoflagellates derived from the genus Gymnodinium include Gymnodinium impudicum and Gymnodium catenatum. In the present invention, those derived from Gymnodinium impudicum are particularly preferred.
本発明の抗酸化剤は、特に、水溶性を有するものであることが好ましい。すなわち、本発明の抗酸化剤は、水によって抽出することも可能となり、また、水溶性の食品等にも添加することも可能になる。
さらに、本発明の抗酸化剤は、熱安定性を有するものであることが好ましい。特に、100℃で30分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、すなわち、活性比が1以上であることが好ましい。より好ましくは、200℃で30分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しないものが好ましい。
さらに、本発明の抗酸化剤は、乾燥状態でも、抗酸化活性が低下しないものとすることができる。
The antioxidant of the present invention is particularly preferably water-soluble. That is, the antioxidant of the present invention can be extracted with water, and can also be added to water-soluble foods.
Furthermore, the antioxidant of the present invention preferably has thermal stability. In particular, it is preferable that the antioxidant activity does not decrease even when heat-treated at 100 ° C. for 30 minutes or more, that is, the activity ratio is 1 or more. More preferably, those whose antioxidant activity does not decrease even when heat-treated at 200 ° C. for 30 minutes or more are preferred.
Furthermore, the antioxidant of the present invention can be such that the antioxidant activity does not decrease even in a dry state.
以下、本発明の抗酸化剤の分取方法の一例を説明する。まず、渦鞭毛藻類を大量培養する。このときの培地は、海産微細藻類を培養する場合に用いられているものであれば格別の制限はなく、例えばGuillard氏のf/2培地や岩崎氏のSWII培地などを用いることができる。しかしながら、渦鞭毛藻類については高濃度の栄養物質に曝されるとむしろ増殖が悪くなることもあり、また既存の培養液にはCuなど微細藻類の増殖を阻害する成分も含まれるため、その組成については培養条件や用いる種類に応じて若干の改変を行っても良い。
また、培養液の調製は蒸留水から行う必要はなく、ガラスフィルターなどで予めろ過され、暗所で数ヶ月程度エイジングされた天然ろ過海水に必要な栄養素を栄養強化したものが簡便でかつ好ましい結果が得られる。
得られた渦鞭毛藻類は、必要により、超音波処理を行ってもよい。
そして、培養、採取された本発明の渦鞭毛藻類は、死滅させ又は死滅させずにそのまま又は乾燥物の形で、あるいは、水もしくは水性溶媒による抽出物、又はメタノール、エタノールその他比較的極性の高い有機溶媒による抽出の形で、抗酸化物として利用できる。
本発明の渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤は、水溶液の形でも熱に対して安定であり、また、高熱条件で乾燥末にしても活性を失わないものとすることができる。
Hereinafter, an example of the method for separating the antioxidant of the present invention will be described. First, a large amount of dinoflagellate is cultured. The medium at this time is not particularly limited as long as it is used for culturing marine microalgae. For example, Guillard's f / 2 medium or Iwasaki's SWII medium can be used. However, when dinoflagellates are exposed to a high concentration of nutrients, their growth may rather worsen, and the existing culture fluid also contains components such as Cu that inhibit the growth of microalgae, so its composition As for, slight modifications may be made depending on the culture conditions and the type used.
In addition, it is not necessary to prepare the culture solution from distilled water, and it is simple and preferable that the nutrients necessary for natural filtered seawater that has been filtered in advance with a glass filter and aged for several months in the dark are fortified. Is obtained.
The obtained dinoflagellate algae may be subjected to ultrasonic treatment if necessary.
Then, the dinoflagellate of the present invention that has been cultured and collected is killed or not killed as it is or in the form of a dried product, or an extract with water or an aqueous solvent, or methanol, ethanol, or other relatively polar substances. It can be used as an antioxidant in the form of extraction with an organic solvent.
The antioxidant derived from the dinoflagellate of the present invention is stable to heat even in the form of an aqueous solution, and can be such that it does not lose its activity even when dried under high heat conditions.
さらに、本発明の抗酸化剤は安全で食用可能なものとすることができ、液体・粉末の形態を問わず安定な抗酸化剤として極めて利用価値が高いもので、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品などとして有用である。 Furthermore, the antioxidant of the present invention can be safe and edible, and is extremely useful as a stable antioxidant regardless of the form of liquid or powder. Useful as cosmetics, food and drinks.
医薬品若しくは医薬部外品としての抗酸化剤として利用する場合、本発明の抗酸化剤をそれ自体で投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の抗酸化剤を1種又は2種以上配合してもよい。本発明の抗酸化剤の投与方法は特に限定されず、内用剤および外用剤のいずれでもよく、内用剤が好ましい。内用剤は、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。また、本発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、内用剤として用いる場合、成人一日あたり0.05〜50g、好ましくは0.5〜5gの範囲で用いることができる。また、外用剤として用いる場合、成人一日あたり0.01〜100g、好ましくは0.1〜10gの範囲で用いることができる。
When used as an antioxidant as a pharmaceutical or quasi drug, the antioxidant of the present invention may be administered by itself, but preferably as a pharmaceutical composition that can be produced by methods well known to those skilled in the art. Can be administered. Examples of the pharmaceutical composition include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, and syrups. Said pharmaceutical composition can be manufactured by adding a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive. Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include, for example, excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, and dissolution. Examples thereof include agents or solubilizers, tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, and pressure-sensitive adhesives. You may mix |
また、抗酸化剤を含む化粧料としては、化粧水、美容液、水系ファンデーション、水系チーク、水系アイシャドー、水系マスカラ、水系リップ、クレンジング、洗顔料、シャンプー、メイクアップリムーバ、乳液、マッサージ剤およびパック剤等を好ましい例として挙げることができる。 Cosmetics containing antioxidants include lotions, cosmetic liquids, aqueous foundations, aqueous teaks, aqueous eye shadows, aqueous mascaras, aqueous lips, cleansings, facial cleansers, shampoos, makeup removers, emulsions, massage agents and A pack agent etc. can be mentioned as a preferable example.
抗酸化剤を含む飲食品としては、健康食品、ダイエット食品、即席食品類、嗜好飲料類、小麦粉製品、菓子類、基礎調味料、複合調味料、乳製品、冷凍食品、水産加工品、畜産加工品および農産加工品その他の市販食品などが好ましい例として挙げられる。 Foods and drinks containing antioxidants include health foods, diet foods, instant foods, beverages, flour products, confectionery, basic seasonings, compound seasonings, dairy products, frozen foods, marine products, livestock processing Products, agricultural processed products and other commercially available foods are preferable examples.
さらに、本発明の抗酸化剤は、一般に、医薬品又は医薬部外品、飲食品等に用いられる各種担体や添加剤を含んでいてもよい。各種担体としては、各種キャリアー担体、イクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤溶媒、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤、懸濁化剤、小麦粉、米粉、でん粉、コーンスターチ、プリサッカライド、ミルクタンパク質、コラーゲン、米油、レシチンなどが挙げられる。添加剤としては、例えば、ビタミン類、甘味料、有機酸、着色剤、香料、湿化防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、天然の植物抽出物、飼料添加物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、フルーツ抽出物、野菜抽出物などが挙げられる。 Furthermore, the antioxidant of the present invention may generally contain various carriers and additives used for pharmaceuticals or quasi drugs, foods and drinks, and the like. Various carriers include various carrier carriers, extenders, diluents, extenders, dispersants, excipients, binder solvents, solubilizers, buffers, dissolution promoters, gelling agents, suspending agents, Examples include wheat flour, rice flour, starch, corn starch, presaccharide, milk protein, collagen, rice oil, and lecithin. Examples of additives include vitamins, sweeteners, organic acids, colorants, fragrances, anti-wetting agents, fibers, electrolytes, minerals, nutrients, antioxidants, preservatives, fragrances, wetting agents, natural plants Examples include extracts, feed additives, coffee extracts, cocoa extracts, fruit extracts, vegetable extracts, and the like.
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The materials, amounts used, ratios, processing details, processing procedures, and the like shown in the following examples can be changed as appropriate without departing from the spirit of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the specific examples shown below.
実施例1
各種赤潮プランクトン由来の水溶性抽出物の抗酸化活性を測定した。
Example 1
The antioxidant activity of various red tide plankton-derived water-soluble extracts was measured.
試料
下記に示す赤潮プランクトン(水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所より取得)について、抗酸化活性を測定した。
Sample Antioxidant activity was measured for the red tide plankton shown below (obtained from Fisheries Research Center Seto Inland Sea Fisheries Research Institute).
採用した赤潮プランクトンの詳細は以下の通りである。
下記の培地を用いて培養を行った。
(1)Sample 1、2、5、6
(培地)
天然ろ過海水1000mLにNaNO3 45mg、NaH2PO4・2H2O 4mg、Fe−EDTA 0.21mg、Mn−EDTA 0.17mg、CoCl2・6H2O 0.12mg、H2SeO3 0.5μg、EDTA・2Naを0.5mgと、ビタミン混合溶液1mL(ただし1000mL中にThiamine-HCl 0.1mg、Ca-pantothenate 0.1mg、p-Aminobenzoic acid 10μg、Biotine 1μg、Inositol 5mg、Thymine 3mg、Vitamine B12 1μg、Folic acid 2μgを含有する)を添加した後に、pHを調製することなく75℃で2時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
Culturing was performed using the following medium.
(1)
(Culture medium)
NaNO 3 45 mg, NaH 2 PO 4 .2H 2 O 4 mg, Fe-EDTA 0.21 mg, Mn-EDTA 0.17 mg, CoCl 2 .6H 2 O 0.12 mg, H 2 SeO 3 0.5 μg , 0.5 mg of EDTA · 2Na and 1 mL of vitamin mixed solution (however, in 1000 mL Thiamine-HCl 0.1 mg, Ca-pantothenate 0.1 mg, p-Aminobenzoic acid 10 μg,
(培養方法)
予め135℃で1時間程度乾熱滅菌された1リットルの容器に培養液を350mL分注し、1000mLにストレプトマイシンを20g含有する溶液を1mL添加し、細胞密度が3万cells/mL程度まで増殖したストック培養液を25mL分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は120μmol/m2/s(光合成有効光量子束密度)に設定し、16時間明:8時間暗の明暗周期を与え、培養温度22℃で培養を行うことにより、8日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
(Culture method)
350 mL of the culture solution was dispensed into a 1 liter container previously sterilized by dry heat at 135 ° C. for about 1 hour, 1 mL of a solution containing 20 g of streptomycin was added to 1000 mL, and the cell density was increased to about 30,000 cells / mL. A 25 mL aliquot of the stock culture was collected and immediately inoculated into a fresh culture.
No aeration or agitation was performed. For the light irradiation, a white fluorescent lamp is used as a light source, the illuminance is set to 120 μmol / m 2 / s (photosynthesis effective photon flux density), a light / dark cycle of 16 hours light: 8 hours dark is given, and the culture temperature is 22 ° C. By culturing, the maximum cell density was reached in 8 days and algae could be collected.
(集藻方法)
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、2200rpmで2分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
(Algae collection method)
The cultured algae were collected using a swinging centrifuge at 2200 rpm under mild conditions for 2 minutes.
(2)Sample3、4
(培地)
天然ろ過海水1000mLに対して、NaNO3 170mg、NaH2PO4・2H2O 15.6mg、Fe−EDTA 0.84mg、Mn−EDTA 0.69mg、CoCl2・6H2O 0.24mg、H2SeO3 1μg、EDTA・2Na 2mg、ビタミン混合溶液1mL(ただし1000mL中にThiamine-HCl 0.1mg、Ca-pantothenate 0.1mg、p-Aminobenzoic acid 10μg、 Biotine 1μg、Inositol 5mg、Thymine 3mg、Vitamine B12 1μg、Folic acid 2μgを含有する)を添加した後に、pHを調製することなく75℃で2時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
(2)
(Culture medium)
For 1000 mL of natural filtered seawater, NaNO 3 170 mg, NaH 2 PO 4 .2H 2 O 15.6 mg, Fe-EDTA 0.84 mg, Mn-EDTA 0.69 mg, CoCl 2 .6H 2 O 0.24 mg,
(培養方法)
予め135℃で1時間程度乾熱滅菌された1リットルの容器に培養液を350mL分注し、1000mLにストレプトマイシンを20g含有する溶液を1mL添加し、細胞密度が5万cells/mL程度まで増殖したストック培養液を25mL分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は120μmol/m2/s(光合成有効光量子束密度)に設定し、16時間明:8時間暗の明暗周期を与え、培養温度24℃で培養を行うことにより、6日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
(Culture method)
350 mL of the culture solution was dispensed into a 1 liter container previously sterilized by dry heat at 135 ° C. for about 1 hour, 1 mL of a solution containing 20 g of streptomycin was added to 1000 mL, and the cell density was increased to about 50,000 cells / mL. A 25 mL aliquot of the stock culture was collected and immediately inoculated into a fresh culture.
No aeration or agitation was performed. For the light irradiation, a white fluorescent lamp is used as a light source, the illuminance is set to 120 μmol / m 2 / s (photosynthesis effective photon flux density), a light / dark cycle of 16 hours light: 8 hours dark is given, and the culture temperature is 24 ° C. By culturing, the maximum cell density was reached in 6 days, and algae could be collected.
(集藻方法)
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、2000rpmで2分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
(Algae collection method)
The cultured algae were collected using a swing-type centrifuge at 2000 rpm under mild conditions for 2 minutes.
(3)Sample7
(培地)
天然ろ過海水1000mLに対して、NaNO3 170mg、NaH2PO4・2H2O 15.6mg、Fe−EDTA 0.84mg、Mn−EDTA 0.69mg、NaSiO3 122mg、CoCl2・6H2O 0.24mg、H2SeO3 1μg、EDTA・2Na 2mgと、ビタミン混合溶液1mL(ただし1000mL中にThiamine-HCl 0.1mg、Ca-pantothenate 0.1mg、p-Aminobenzoic acid 10μg、Biotine 1μg、Inositol 5mg、Thymine 3mg、Vitamine B12 1μg、Folic acid 2μgを含有する)を添加した後に、pHを調製することなく75℃で2時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
(3) Sample7
(Culture medium)
NaNO 3 170 mg, NaH 2 PO 4 .2H 2 O 15.6 mg, Fe-EDTA 0.84 mg, Mn-EDTA 0.69 mg, NaSiO 3 122 mg, CoCl 2 .6H 2 O 0. 24 mg, H 2 SeO 3 1 μg, EDTA ·
(培養方法)
予め135℃で1時間程度乾熱滅菌された1リットルの容器に培養液を350mL分注し、1000mLにストレプトマイシンを20g含有する溶液を1mL添加し、細胞密度が50万cells/mL程度まで増殖したストック培養液を25mL分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は120μmol/m2/s(光合成有効光量子束密度)に設定し、16時間明:8時間暗の明暗周期を与え、培養温度22℃で培養を行うことにより、5日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
(Culture method)
350 mL of the culture solution was dispensed into a 1 liter container previously sterilized by dry heat at 135 ° C. for about 1 hour, 1 mL of a solution containing 20 g of streptomycin was added to 1000 mL, and the cell density was increased to about 500,000 cells / mL. A 25 mL aliquot of the stock culture was collected and immediately inoculated into a fresh culture.
No aeration or agitation was performed. For the light irradiation, a white fluorescent lamp is used as a light source, the illuminance is set to 120 μmol / m 2 / s (photosynthesis effective photon flux density), a light / dark cycle of 16 hours light: 8 hours dark is given, and the culture temperature is 22 ° C. By culturing, the maximum cell density was reached in 5 days, and algae could be collected.
(集藻方法)
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、2000rpmで2分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
(Algae collection method)
The cultured algae were collected using a swing-type centrifuge at 2000 rpm under mild conditions for 2 minutes.
(水溶性画分の調製方法)
上記方法により得られた各種赤潮プランクトンは、以下の方法により、水溶性画分を調整した。
各種赤潮プランクトンは調製時まで−30℃で冷凍保存した。各種赤潮プランクトンのクロロフィル含量を確認し最終濃度が60μg/mLになるように純水を添加し、ピペッティング後細胞を完全に破壊するため超音波処理を行った。超音波処理は1分間を目処に約10回繰り返して細胞が完全に壊れるまで実施した。すべての処理は4℃の低温で行った。超音波処理後のプランクトン懸濁液を遠心(15000rpm、5min)し、上清を水溶性画分のSampleとした。
(Method for preparing water-soluble fraction)
The various red tide plankton obtained by the above method was adjusted for water-soluble fraction by the following method.
Various red tide planktons were stored frozen at −30 ° C. until preparation. The chlorophyll content of various red tide planktons was confirmed, pure water was added so that the final concentration was 60 μg / mL, and sonication was performed to completely destroy the cells after pipetting. The ultrasonic treatment was repeated about 10 times for 1 minute until the cells were completely broken. All treatments were performed at a low temperature of 4 ° C. The plankton suspension after sonication was centrifuged (15000 rpm, 5 min), and the supernatant was used as a sample of a water-soluble fraction.
(各種Sample中のクロロフィルの定量方法)
赤潮プランクトンの現存量を把握するために、通常湿重量、乾燥重要及び炭素量などの数字が用いられる。ところが赤潮プランクトンの多くは粘質性の多糖類を細胞外に多量に分泌し、その量は遠心分離など物理的な刺激が加わることで更に増加する。このため如何に巧妙に培養した赤潮プランクトンを得たとしても、水溶性の多糖類に包合された液体培地の持ち込みは避けられず、それらの量は真に赤潮プランクトンが含有する体積の2倍にも達することがある。また液体培地が塩分を多量に含む海水を基本とするために、乾燥重量についてもミネラル分の重量が持ち込まれるために正確な量を把握することができない。このように、赤潮プランクトンには種類により多糖類の分泌量にバラツキがあるため、培養した赤潮プランクトンを一律に生物量として把握するには、炭素量で把握することが望ましい。ただし液体培地中には空気中の24倍もの二酸化炭素が含まれているために、その測定には精密な酸処理などを行う必要があり、煩雑でしかも測定結果の誤差が大きい。赤潮プランクトンは陸上植物と同じように細胞の中に葉緑体を有しており、それが細胞容積あたりに占める量は種類を超えてほぼ一定であることが既に知られている。このため、種類の異なる赤潮プランクトンの現存量を正確に把握するためには、広く一律に含まれるクロロフィル量を指標として評価することが望ましい。
よって、本実施例では、クロロフィル量を測定した。クロロフィル量は、ろ過や遠心分離などにより液体培地を可能な限り取り除かれたSampleに対して、冷却された98%ジメチルホルムアミドを適宜添加し、超音波でSampleを破砕してクロロフィルの抽出を行った。ジメチルホルムアミドは抽出力が高いため、溶媒を添加後一晩冷蔵庫で保存するだけでも十分な量のクロロフィルを抽出できた。得られた色素はクロロフィルの測定を目的とした蛍光光度計(励起波長:460nm、放射波長:665nm)を用いて定量化した。検量線は市販の精製クロロフィル粉末を同様に有機溶媒で適宜希釈したもので作成した。
(Quantification method of chlorophyll in various samples)
In order to ascertain the existing amount of red tide plankton, numbers such as wet weight, critical dryness and carbon content are usually used. However, many red tide planktons secrete a large amount of viscous polysaccharides outside the cell, and the amount is further increased by physical stimulation such as centrifugation. For this reason, no matter how skillfully cultivated red tide plankton is obtained, it is inevitable to bring in a liquid medium encapsulated in water-soluble polysaccharides, the amount of which is twice the volume of red tide plankton. May also be reached. In addition, since the liquid medium is based on seawater containing a large amount of salt, it is impossible to grasp the exact amount of dry weight because the weight of mineral is brought in. Thus, since the red tide plankton varies in the amount of polysaccharide secretion depending on the type, it is desirable to grasp the cultivated red tide plankton by the carbon amount in order to grasp the cultured red tide plankton uniformly as the biomass. However, since 24 times as much carbon dioxide as in the air is contained in the liquid medium, it is necessary to perform a precise acid treatment for the measurement, which is complicated and results in a large error in measurement results. It is already known that red tide plankton has chloroplasts in cells like terrestrial plants, and its amount per cell volume is almost constant across cell types. For this reason, in order to accurately grasp the existing amount of red tide plankton of different types, it is desirable to evaluate the amount of chlorophyll contained widely as an index.
Therefore, in this example, the amount of chlorophyll was measured. The amount of chlorophyll was extracted from the sample from which liquid medium was removed as much as possible by filtration, centrifugation, etc., and cooled 98% dimethylformamide was added as appropriate, and the sample was crushed with ultrasound to extract chlorophyll. . Since dimethylformamide has a high extractability, a sufficient amount of chlorophyll could be extracted by simply storing it in the refrigerator overnight after adding the solvent. The obtained dye was quantified using a fluorometer (excitation wavelength: 460 nm, emission wavelength: 665 nm) for the purpose of measuring chlorophyll. A calibration curve was prepared by appropriately diluting commercially available purified chlorophyll powder with an organic solvent.
(抗酸化活性試験−化学発光法によるスーパーオキシド消去活性(SOD様活性))
従来から、抗酸化活性試験に用いられている化学発光法によって測定した。具体的には、以下の方法により行った。
<0.6mM EDTA含Tris−HCl緩衝液の作製>
Tris (hydoroxymetyhl) aminomethane(トリス)48.4gを1000mLの純水で溶解し、0.4Mトリス水溶液を作製した。200mLの2N塩酸を800mLの蒸留水で希釈し、0.4N塩酸水溶液を作製した。0.2Mトリス水溶液500mLと0.2N塩酸水溶液384mLを混ぜ合わせ、さらに蒸留水116mLを加えて、全量で1000mLにした。pHを測定して0.4Mトリス水溶液または0.4N塩酸水溶液にて調整した(0.2Mトリス−塩酸緩衝液 pH7.6)。22.3mg(60mM)のEDTAを10 mLの蒸留水に溶かし、100mLのTris-HCl緩衝液にその1mLを添加した。
(Antioxidant activity test-Superoxide scavenging activity by chemiluminescence method (SOD-like activity))
Conventionally, it was measured by the chemiluminescence method used for the antioxidant activity test. Specifically, the following method was used.
<Preparation of Tris-HCl buffer containing 0.6 mM EDTA>
Tris (hydoroxymetyhl) aminomethane (Tris) (48.4 g) was dissolved in 1000 mL of pure water to prepare a 0.4 M Tris aqueous solution. 200 mL of 2N hydrochloric acid was diluted with 800 mL of distilled water to prepare a 0.4N hydrochloric acid aqueous solution. A 0.2 M Tris aqueous solution (500 mL) and a 0.2 N hydrochloric acid aqueous solution (384 mL) were mixed, and distilled water (116 mL) was further added to make a total volume of 1000 mL. The pH was measured and adjusted with 0.4 M Tris aqueous solution or 0.4 N hydrochloric acid aqueous solution (0.2 M Tris-hydrochloric acid buffer pH 7.6). 22.3 mg (60 mM) EDTA was dissolved in 10 mL distilled water and 1 mL was added to 100 mL Tris-HCl buffer.
<2μM L−012水溶液(Mw:310.67)の作製>
蒸留水で200μM(6.2 mg/mL(20 mM)を100倍希釈)に調整し、試験開始時に100倍に希釈した。使用まで氷冷した。
<1mM ヒポキサンチン水溶液(HPX)(Mw:136.11)の作製>
蒸留水で1mM(100mM 13.6mg/mL(完全に解けない懸濁状態)を100倍希釈)に調整した。
<キサンチンオキシダーゼ(XOD)(10U)の作製>
0.6mM EDTAで希釈し、20mU/mLに調整した(終濃度:5mU/mL)。使用時まで氷冷した。
<Preparation of 2 μM L-012 aqueous solution (Mw: 310.67)>
It was adjusted to 200 μM (6.2 mg / mL (20 mM) diluted 100-fold) with distilled water, and diluted 100-fold at the start of the test. Ice-cooled until use.
<Preparation of 1 mM hypoxanthine aqueous solution (HPX) (Mw: 136.11)>
It was adjusted to 1 mM with distilled water (100 mM 13.6 mg / mL (suspension state that cannot be completely dissolved) diluted 100 times).
<Preparation of xanthine oxidase (XOD) (10 U)>
It was diluted with 0.6 mM EDTA and adjusted to 20 mU / mL (final concentration: 5 mU / mL). Ice-cooled until use.
<操作手順>
まず、50μLのL−012、10μLのTris-HCl緩衝液、20μLのXOD、10μLの精製水を含む溶液を96wellプレートに分注し、25℃で1分間インキュベートした。そして、このときL−012の自動酸化による試料で抑制されない非特異的発光を測定した。発光が安定したところでHPX(100μL)をインジェクターを用い添加した。5分間の化学発光の積算値を求めた。化学発光法の消去活性をSOD活性検量線を用いてSOD様活性値に換算した。
<Operation procedure>
First, a solution containing 50 μL of L-012, 10 μL of Tris-HCl buffer, 20 μL of XOD, and 10 μL of purified water was dispensed into a 96-well plate and incubated at 25 ° C. for 1 minute. And the nonspecific light emission which was not suppressed by the sample by the auto-oxidation of L-012 at this time was measured. When luminescence was stabilized, HPX (100 μL) was added using an injector. The integrated value of chemiluminescence for 5 minutes was determined. The erasing activity of the chemiluminescence method was converted to an SOD-like activity value using an SOD activity calibration curve.
(抗酸化活性試験−電子スピン共鳴(ESR)法によるSOD様活性)
使用材料
〈試薬〉
0.1Mリン酸緩衝液(P.B.)(pH7.4):市販品のリン酸(和光純薬製、No.167−1449)を精製水に溶解して作製した。
2mMのHyp(F.W.:136.1):HPX(Sigma製、H−9377)13.6 mgを上記P.B.50mLに溶解した。溶解しにくいので温めながら一晩攪拌しながら溶解させた。
0.4U/mLのXOD:XOD(ラボテック製、Cow milk由来、E.C. 1.1.3.22) 20μL(20 U/mL)に上記P.B.980μLを添加した(50倍希釈)。
DMPO(5,5-Dimethyl-Prroloine-N-oxide):DMPO(ラボテック製)を精製水と、割合(重量比)が1:1となるように混合した。
DMSO(Dimethyl sulfoxide):DMSO(関東化学製、No.10378−00)を用いた。
SOD(Superoxide dismutase):SOD(Sigma製、s−5395、E.C. 1.15.1.1) (Sigma、s−5395)を5000 U/mLに調整したSOD溶液を50、25、 12.5、6.25、3.125 U/mLに希釈して使用した。
(Antioxidant activity test-SOD-like activity by electron spin resonance (ESR) method)
Materials used <Reagent>
0.1 M phosphate buffer (P.B.) (pH 7.4): A commercially available phosphoric acid (No. 167-1449, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was dissolved in purified water.
2 mM Hyp (FW: 136.1): HPX (manufactured by Sigma, H-9377) 13.6 mg B. Dissolved in 50 mL. Since it was difficult to dissolve, it was dissolved while stirring overnight while warming.
0.4 U / mL of XOD: XOD (manufactured by Labotech, derived from Cow milk, EC 1.1.3.22) 20 μL (20 U / mL) of the above P.I. B. 980 μL was added (50-fold dilution).
DMPO (5,5-Dimethyl-Prroloine-N-oxide): DMPO (manufactured by Labotech) was mixed with purified water so that the ratio (weight ratio) was 1: 1.
DMSO (Dimethyl sulfoxide): DMSO (manufactured by Kanto Chemical Co., No. 10378-00) was used.
SOD (Superoxide dismutase): SOD (manufactured by Sigma, s-5395, EC 1.15.1.1) SOD solution prepared by adjusting Sigma (s-5395) to 5000 U / mL, 50, 25, 12 Dilute to 0.5, 6.25, 3.125 U / mL.
〈機器〉
電子スピン共鳴装置 JES−FA100(日本電子)
〈方法〉
各種プランクトン水溶性抽出物のSOD様活性を、DMPOを用いたESRスピントラッピング法により測定し、SOD様活性濃度に換算した。
すべてのSampleを0.1MのP.B.で2倍希釈して使用した。スーパーオキシドはHPX/XOD系で生成させた。
また消去活性のマーカーとしてEpigallocatechin 3-gallate(EGCG、ロッシュビタミン社(現DSM社)製)1mg/mLを100倍希釈(8.15nM)したものを用いた。
<machine>
Electron spin resonance device JES-FA100 (JEOL)
<Method>
The SOD-like activity of various plankton water-soluble extracts was measured by the ESR spin trapping method using DMPO and converted to the SOD-like activity concentration.
All Samples are 0.1M P.M. B. Was used after being diluted 2 times. Superoxide was generated in the HPX / XOD system.
Further, Epigallocatechin 3-gallate (EGCG, manufactured by Roche Vitamin Co., Ltd. (currently DSM)) 1 mg / mL diluted 100-fold (8.15 nM) was used as a marker for erasing activity.
〈手順〉
以下の試薬を下記の順に直径15mmのテストチューブに加えた。
HPX 50μL
DMSO 30μL
Sample 50μL
DMPO 20μL
XOD 50μL
XOD添加後に10秒間Vortexによって攪拌し、水溶液用セルに吸入した。XOD添加から60秒後にESR測定を開始した。
<procedure>
The following reagents were added to a 15 mm diameter test tube in the following order:
HPX 50μL
DMSO 30μL
Sample 50μL
DMPO 20μL
XOD 50μL
After addition of XOD, the mixture was stirred for 10 seconds by Vortex and sucked into an aqueous solution cell. ESR measurement was started 60 seconds after XOD addition.
ESR測定条件
共鳴周波数: 9.42GHz
出力:4mW
磁場変調: 100kHz
観測磁場: 335.5± 5mT
測定時間: 2min
変調幅: 0.07mT
増幅率: 200
ESR measurement conditions Resonance frequency: 9.42 GHz
Output: 4mW
Magnetic field modulation: 100 kHz
Observation magnetic field: 335.5 ± 5mT
Measurement time: 2min
Modulation width: 0.07mT
Gain: 200
SOD様活性を求める場合に使用する検量線作成の際には、Sampleの代わりに活性既知のSODを添加した。0.1M P.B.添加時(コントロール)のスペクトルのMnマーカーに対する相対強度をI0、SOD添加時に観測されたスペクトルのMnマーカーに対する相対強度をIと表した場合、
X軸:SOD活性
Y軸:(I0/I)−1
とし、検量線を作成した。
測定は、各試料につき2回行った。抗酸化活性は、SOD活性検量線を用いてSOD様活性濃度に換算することにより求めた。
In preparing a calibration curve used for obtaining SOD-like activity, SOD with known activity was added instead of Sample. 0.1M P.I. B. When the relative intensity of the spectrum at the time of addition (control) with respect to the Mn marker is represented as I 0 and the relative intensity of the spectrum observed at the time of addition of SOD with respect to the Mn marker is represented by I,
X axis: SOD activity Y axis: (I 0 / I) -1
A calibration curve was created.
The measurement was performed twice for each sample. Antioxidant activity was determined by converting to an SOD-like activity concentration using an SOD activity calibration curve.
化学発光法によるSOD様活性および電子スピン共鳴(ESR)法によるSOD様活性の結果をそれぞれ図1および図2に示した。
この結果、渦鞭毛藻類において、抗酸化活性があることが認められた。
特に、Sample4、6では、化学発光法およびESR法において相関関係が認められた。しかしながら、渦鞭毛藻類(特に、Gymnodinium属)については、化学発光法SOD様活性が全く認められないか、極めて低いSOD様活性であったものについて、ESR法でSOD様活性を測定することにより、高いSOD様活性が認められた。すなわち、ESR法でSOD様活性を測定することにより、渦鞭毛藻類(特に、Gymnodinium属)も抗酸化性物質を産生することが明らかになった。
The results of SOD-like activity by the chemiluminescence method and SOD-like activity by the electron spin resonance (ESR) method are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
As a result, it was confirmed that the dinoflagellate has an antioxidant activity.
In particular, in
実施例2
上記のうち、Sample1、Sample3および、Chattonella ovata(CO)の抽出物(いずれも60μgクロロフィル当量/mL)、アスコルビン酸(ASA)69.8μM(12.3μg/mL)の熱安定性を調べた。
Example 2
Among these, the thermal stability of
上記Sampleを、16.5mm×45mmのバイアル瓶に300μLずつ分注し、乾熱滅菌器(SANYO製、MOV−112S)で30、60、90、120分間100℃および30、60分間200℃で加熱処理をし、室温に戻した後、SOD様活性を測定した。このときの状態は、乾燥した状態であった。加熱処理をしない試料のSOD様活性を1とし、それぞれ加熱処理した後のSOD様活性を、SOD様活性の比(%)として求めた。その結果を図3および図4に示した。
図3に示すように、Sample1(Gymnodinium属)は加熱30分でSOD様活性が1.4倍になり、100分で約2倍のSOD様活性を示した。Sample1以外のCO、Sample3、ASAは加熱30分でSOD様活性が半分以下となった。
図4においても、Sample1は100℃の加熱処理と同様に、加熱することで活性が4倍まで高くなった。
Dispense 300 μL of the sample into 16.5 mm × 45 mm vials and dry heat sterilizer (SANYO, MOV-112S) for 30, 60, 90, 120 minutes at 100 ° C. and 30, 60 minutes at 200 ° C. After heat treatment and returning to room temperature, SOD-like activity was measured. The state at this time was a dry state. The SOD-like activity of the sample without heat treatment was set to 1, and the SOD-like activity after each heat treatment was determined as the ratio (%) of the SOD-like activity. The results are shown in FIG. 3 and FIG.
As shown in FIG. 3, Sample 1 (Gymnodinium genus) exhibited an SOD-like activity of 1.4 times after heating for 30 minutes and an SOD-like activity of about 2 times after 100 minutes. CO,
Also in FIG. 4, the activity of
また、他のGymnodinium属由来のSampleについても同様に行ったところ、図3および4と同様に熱処理することにより、活性がより高くなる傾向にある。
すなわち、Gymnodinium属については、熱処理/乾燥処理をしても、高いSOD様活性を示すことが明らかになった。
In addition, when other samples derived from the genus Gymnodinium were also performed in the same manner, the heat treatment tends to be higher by heat treatment as in FIGS.
That is, it was revealed that Gymnodinium genus shows high SOD-like activity even after heat treatment / dry treatment.
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- 2007-04-16 JP JP2007106913A patent/JP2008074830A/en active Pending
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