JP2008035701A

JP2008035701A - Method for detecting antibody by using cell-free method for synthesizing protein, and method for screening specific protein

Info

Publication number: JP2008035701A
Application number: JP2004335392A
Authority: JP
Inventors: Yaeta Endo; 弥重太遠藤; Tatsuya Sawazaki; 達也澤崎; Tomio Ogasawara; 富夫小笠原; Masateru Tsuchimochi; 政照土持; Yuko Matsubara; 祐子松原
Original assignee: CellFree Sciences Co Ltd
Current assignee: CellFree Sciences Co Ltd
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2008-02-21
Also published as: WO2006054683A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a system for surely and quickly assaying an antibody in a specimen. <P>SOLUTION: This method for enabling the measurement of the objective antibody in the test specimen is found out by preparing a specific protein as a fused protein by a cell-free means for synthesizing the protein and bringing the unpurified fused protein in contact with the test specimen, as a result of various examinations for improving the method for expressing the specific protein as an important factor for solving above problem. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、無細胞タンパク質合成方法を利用した検体中の抗体の測定方法に関する。さらに詳しくは、蛍光標識タンパク質と特定タンパク質の融合タンパク質を無細胞タンパク質合成手段によって調製し、この融合タンパク質を利用する検体中の抗体の測定方法に関する。その他、本発明は、検出用試薬、試薬キット、及び特定タンパク質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring an antibody in a specimen using a cell-free protein synthesis method. More specifically, the present invention relates to a method for measuring an antibody in a specimen using a fusion protein of a fluorescence-labeled protein and a specific protein prepared by a cell-free protein synthesis means. In addition, the present invention relates to a detection reagent, a reagent kit, and a screening method for a specific protein.

各種病原体ゲノムの解析が進展してきた今日、種々の感染症に対するゲノムワイドなワクチン開発も可能となってきた。しかしながら、従来からの組み換え法による遺伝子からのタンパク質発現技術には未解決な問題が多く、特に高品質の抗原タンパク質を調製することは今日でも容易ではない。
本発明者等は、先に、真核生物遺伝子から高品質タンパク質の合成に優れた特性を発揮するコムギ胚芽を利用する系を確立している。細胞抽出液に翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成法である。これまでに公知となっている無細胞タンパク質合成法には以下の特許文献１〜５がある。
特開平６−９８７９０特開平６−２２５７８３特開平７−１９４特開平９−２９１特開平７−１４７９９２ With the progress of analysis of various pathogen genomes, it has become possible to develop genome-wide vaccines against various infectious diseases. However, there are many unsolved problems in conventional protein expression techniques from genes by recombinant methods, and it is not easy even today to prepare particularly high-quality antigenic proteins.
The inventors of the present invention have previously established a system using wheat germ that exhibits excellent properties for the synthesis of high-quality proteins from eukaryotic genes. This is a so-called cell-free protein synthesis method in which a protein is synthesized in a test tube by adding a translation template, a substrate amino acid, an energy source, various ions, a buffer solution, and other effective factors to the cell extract. Conventionally known cell-free protein synthesis methods include the following patent documents 1 to 5.
JP-A-6-98790 JP-A-6-225783 JP-A-7-194 JP-A-9-291 JP 7-147992 A

本発明の課題は、検体中の抗体を確実かつ迅速に検定できる系を提供することである。そのため、本発明者等は、無細胞タンパク質合成手段がこの測定系に利用することが可能かを種々検討した。 The subject of this invention is providing the system which can test | inspect the antibody in a test substance reliably and rapidly. Therefore, the present inventors have studied variously whether cell-free protein synthesis means can be used in this measurement system.

本発明者は、上記課題を解決する重要なファクターとして、特定タンパク質の発現方法を種々検討した。その結果、特定タンパク質を融合タンパク質として無細胞タンパク質合成手段で調製し、この融合タンパク質をプローブとして試験検体と接触させることによって、目的とする試験検体中の抗体を測定可能であることを見出し、本発明を完成した。 The inventor of the present invention has studied various methods for expressing a specific protein as an important factor for solving the above problems. As a result, it was found that the antibody in the target test sample can be measured by preparing a specific protein as a fusion protein by cell-free protein synthesis means, and contacting this test sample with the fusion protein as a probe. Completed the invention.

すなわち、本発明は、以下からなる。
１．蛍光標識タンパク質と特定タンパク質の融合タンパク質を無細胞タンパク質合成手段によって調製し、この融合タンパク質を含む合成液をプローブとして、試験検体と接触させ、試験検体中の抗体を検出することを含む抗体検出方法。
２．融合タンパク質を精製することなく、試験検体と接触させる前項１に記載の方法。
３．融合タンパク質が、コムギ胚芽抽出液による無細胞タンパク質合成手段によって調製される前項１又は２に記載の方法。
４．コムギ胚芽抽出液が、混入する胚乳成分および低分子タンパク質合成阻害物質が実質的に除去されたコムギ胚芽抽出液である前項１〜３の何れか一に記載の方法。
５．コムギ胚芽抽出液から、以下のいずれか１から選ばれるＡＴＰを介する糖のリン酸化系の制御が行われている前項４に記載の方法。
１）単糖類の除去、
２）リン酸化糖の除去、
３）多糖類から単糖類の生成の制御、
４）単糖類からリン酸化糖の生成の制御。
６．特定タンパク質が、抗原性物質である前項１〜５の何れか一に記載の方法。
７．特定タンパク質が、リン酸化タンパク質である前項１〜５の何れか一に記載の方法。
８．検出方法が以下の何れか一から選ばれる前項１〜７の何れか一に記載の方法。
１）蛍光相関分析法、２）蛍光強度分布解析法
９．抗原性物質が、肝炎ウイルスである前項６に記載の方法。
１０．抗原性物質が、植物花成誘導因子である前項６に記載の方法。
１１．抗原性物質が、Epstein-Barr virus（EBV）である前項６に記載の方法。
１２．リン酸化タンパク質が、プロテインカイネースである前項７に記載の方法。
１３．前項１〜１２の何れか一に記載の方法に使用する検出キット。
１４．前項１〜１２の何れか一に記載の方法で得られた融合タンパク質を含む検出用試薬又は試薬キット。
１５．以下の工程を含む無細胞タンパク質合成手段によって調製した特定タンパク質のスクリーニング方法。
１）所望の候補遺伝子の選択された領域である候補特定タンパク質及び蛍光標識タンパク質をコードする遺伝子（融合タンパク質をコード
するタンパク質）を調製する工程
２）１）で調製した遺伝子からｍＲＮＡを合成する工程
３）２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として無細胞タンパク質合成手段で翻訳する工程
４）３）で合成され融合タンパク質を精製することなく、試験検体と接触させ、抗体反応を検出する工程 That is, this invention consists of the following.
1. An antibody detection method comprising preparing a fusion protein of a fluorescence-labeled protein and a specific protein by a cell-free protein synthesis means, contacting a test sample with a synthetic solution containing the fusion protein as a probe, and detecting an antibody in the test sample .
2. 2. The method according to item 1 above, wherein the fusion protein is contacted with the test sample without purification.
3. 3. The method according to item 1 or 2, wherein the fusion protein is prepared by means of cell-free protein synthesis using a wheat germ extract.
4). 4. The method according to any one of items 1 to 3, wherein the wheat germ extract is a wheat germ extract from which the endosperm components and the low molecular protein synthesis inhibitor to be mixed are substantially removed.
5. 5. The method according to item 4 above, wherein the sugar phosphorylation system is controlled via ATP selected from any one of the following from a wheat germ extract.
1) removal of monosaccharides,
2) removal of phosphorylated sugar,
3) control of the production of monosaccharides from polysaccharides,
4) Control of production of phosphorylated saccharide from monosaccharides.
6). 6. The method according to any one of 1 to 5 above, wherein the specific protein is an antigenic substance.
7). 6. The method according to any one of 1 to 5 above, wherein the specific protein is a phosphorylated protein.
8). 8. The method according to any one of 1 to 7 above, wherein the detection method is selected from any one of the following.
1) Fluorescence correlation analysis method, 2) Fluorescence intensity distribution analysis method 7. The method according to item 6 above, wherein the antigenic substance is hepatitis virus.
10. 7. The method according to item 6 above, wherein the antigenic substance is a plant flowering inducer.
11. 7. The method according to item 6 above, wherein the antigenic substance is Epstein-Barr virus (EBV).
12 8. The method according to item 7 above, wherein the phosphorylated protein is protein kinase.
13. The detection kit used for the method as described in any one of 1 to 12 above.
14 A reagent for detection or a reagent kit comprising the fusion protein obtained by the method according to any one of items 1 to 12.
15. A screening method for a specific protein prepared by a cell-free protein synthesis means comprising the following steps.
1) Step of preparing a candidate specific protein that is a selected region of a desired candidate gene and a gene encoding a fluorescently labeled protein (protein encoding a fusion protein) 2) Step of synthesizing mRNA from the gene prepared in 1) 3) A step of translating the mRNA synthesized in 2) by a cell-free protein synthesis means using a translation template as a translation template 4) A step of detecting an antibody reaction by contacting the test sample without purifying the fusion protein synthesized in 3)

本発明によると、蛍光標識タンパク質と特定タンパク質の融合タンパク質を用いることで血清中の当該特定タンパク質に対する抗体を容易に検出可能であり、種々の感染菌、ウイルスなどの検出に新たな手段を提供し、より一層の臨床検査の簡便化及び確実な結果を得ることが可能となった。さらに、融合タンパク質と試験検体中の抗体の検出反応により、特定タンパク質のスクリーニングも可能となった。 According to the present invention, by using a fusion protein of a fluorescently labeled protein and a specific protein, an antibody against the specific protein in serum can be easily detected, providing a new means for detecting various infectious bacteria and viruses. Therefore, it is possible to further simplify clinical tests and obtain reliable results. Furthermore, screening of specific proteins became possible by the detection reaction of the fusion protein and the antibody in the test sample.

Embodiments of the Invention

本発明は、蛍光標識タンパク質と特定タンパク質の融合タンパク質を無細胞タンパク質合成手段によって調製し、この融合タンパク質を含む合成液をプローブとして、試験検体と接触させ、検体中の抗体を検出することを含む抗体検出方法に関する。さらには、融合タンパク質と試験検体中の抗体の検出反応により、特定タンパク質のスクリーニング方法に関する。
本発明で無細胞タンパク質合成手段とは、広く動物及び植物の抽出物を使った技術を意味し、その詳細は後記する。 The present invention includes preparing a fusion protein of a fluorescently labeled protein and a specific protein by a cell-free protein synthesis means, contacting a test sample with a synthetic solution containing the fusion protein as a probe, and detecting an antibody in the sample. The present invention relates to an antibody detection method. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a specific protein by detecting a fusion protein and an antibody in a test sample.
In the present invention, the cell-free protein synthesis means widely means a technique using animal and plant extracts, and details thereof will be described later.

本発明で、融合タンパク質とは、特定タンパク質と、標識として機能する蛍光標識タンパク質の融合物である。特定タンパク質とは、測定対象とする抗体に認識されるタンパク質を意味し、具体的には抗原性タンパク質、リン酸化タンパク質などが例示されるが、特には限定されない。なお、候補特定タンパク質とは、測定対象となる抗体に認識されうる可能性あるタンパク質を意味する。抗原性タンパク質とは、各種臨床検査で測定対象となる細菌、ウイルス、因子、酵素等を意味し、好適な候補としては例えば肝炎ウイルス（A、B、C、D、E型など）、Epstein-Barr virus（EBV）、アレルギ性因子などが例示されるが、特には限定されない。また、リン酸化タンパク質としては、プロテインカイネースが例示されるが、特には限定されない。
蛍光標識タンパク質とは、特に限定されるものではなく、標識能を有している限り適応可能である。例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＢＦＰ(Blue Fluorescent Protein)、ＣＦＰ(Cyan Fluorescent Protein)、ＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)、ＹＦＰ(Yellow Fluorescent Protein)、ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)、ＥＣＦＰ(Enhanced Cyan Fluorescent Protein)、ＥＲＦＰ(Enhanced Red Fluorescent Protein)、ＥＹＦＰ(Enhanced Yellow Fluorescent Protein)、ＴＭＲ（TetraMethyl−Rhodamine）等が好適に例示される。
また、試験検体とは、ヒト、動物の血清などが例示されるが、特には限定されない。 In the present invention, the fusion protein is a fusion product of a specific protein and a fluorescently labeled protein that functions as a label. The specific protein means a protein recognized by the antibody to be measured, and specific examples include antigenic protein and phosphorylated protein, but are not particularly limited. The candidate specific protein means a protein that may be recognized by the antibody to be measured. Antigenic protein means bacteria, viruses, factors, enzymes, etc. to be measured in various clinical tests. Suitable candidates include hepatitis virus (A, B, C, D, E type, etc.), Epstein- Examples include Barr virus (EBV) and allergic factors, but are not particularly limited. Moreover, although protein kinase is illustrated as a phosphorylated protein, it is not specifically limited.
The fluorescently labeled protein is not particularly limited and can be applied as long as it has a labeling ability. For example, GFP (Green Fluorescent Protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) Preferred examples include Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), and TMR (TetraMethyl-Rhodamine).
Examples of the test specimen include human and animal serum, but are not particularly limited.

本発明の融合タンパク質は、無細胞タンパク質合成手段で調製される。例えば、翻訳鋳型となるｍＲＮＡは、各種蛍光標識タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡと標的抗体に対する特定タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡが挿入されたベクターを基に、転写鋳型を調製し、RNA polymeraseを用いて転写を行い、得られたRNAを精製又は精製せずに翻訳に用いうる。翻訳によって調製される融合タンパク質がそのまま標的抗体検出用のプローブとなりうる。
試験検体との接触は、融合タンパク質を精製することなくそのまま、好適には、適当な希釈をおこなうことで接触によって抗体の検出を行う。抗体の検出方法としては、特定タンパク質が、抗原性タンパク質の場合には抗原抗体反応、リン酸化タンパク質の場合には抗リン酸化抗体の検出である。
検出は、蛍光標識をマーカーとして、１分子蛍光分析装置を使って、マイクロプレートウェル中の反応液について蛍光相関分析法（FCS：Fluorescence Correlation Spectroscopy）又は蛍光強度分布解析法（FIDA：Fluorescence Intensity Distribution Analysis）で行うことが好適である。この分析法は、どちらか一方でも反応の有無を知ることができるが、両方行えば、より精度よく反応の有無を知ることができる。また、融合タンパク質を含む無細胞タンパク質合成後の合成液を適当な希釈液で希釈し、試験検体と接触させた後に、そのまま測定装置で検出することができる。測定は、レーザー光を照射し、液中の蛍光分子の揺らぎを測定するので、特にｐＨ、測定時間の条件はなく、温度も室温で可能である。FCS測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、得られた情報に基づいて並進拡散時間を求める。FIDA測定では、微小領域内の蛍光を発している分子の蛍光強度と数を測定する。これら装置はオリンパス社より入手可能である。 The fusion protein of the present invention is prepared by cell-free protein synthesis means. For example, mRNA as a translation template is prepared by preparing a transcription template based on a gene DNA encoding various fluorescently labeled proteins and a gene DNA encoding a specific protein for the target antibody, and transcribed using RNA polymerase. And the RNA obtained can be used for translation with or without purification. The fusion protein prepared by translation can be used as a target antibody detection probe as it is.
The contact with the test sample is carried out as it is without purifying the fusion protein, and the antibody is preferably detected by contact by appropriately diluting. The antibody detection method includes antigen-antibody reaction when the specific protein is an antigenic protein, and detection of an anti-phosphorylated antibody when the specific protein is a phosphorylated protein.
Detection is performed using a single molecule fluorescence analyzer with a fluorescent label as a marker, and a fluorescence correlation analysis method (FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy) or a fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis). ) Is preferable. This analysis method can know the presence or absence of reaction in either one, but if both are performed, it can know the presence or absence of reaction more accurately. In addition, the synthesized solution after cell-free protein synthesis including the fusion protein can be detected with a measuring device as it is after being diluted with an appropriate diluent and brought into contact with the test sample. Measurement is performed by irradiating a laser beam and measuring fluctuations of fluorescent molecules in the liquid, so that there are no particular conditions for pH and measurement time, and the temperature can be room temperature. In FCS measurement, fluctuations of fluorescent molecules in a minute region are measured, and translational diffusion time is obtained based on the obtained information. In FIDA measurement, the fluorescence intensity and number of molecules emitting fluorescence in a minute region are measured. These devices are available from Olympus.

本発明の特徴点は、調製された融合タンパク質を未精製のまま試験検体と接触させうることである。マイクロプレート中で或いは予め無細胞タンパク質合成手段で調製された融合タンパク質を精製することなく適当な希釈を緩衝液〔例えば、0.1% PBST（0.1% Tween20, 137mM NaCl, 8.1mM Na₂HPO₄, 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄）〕で行い、マイクロプレート上で検体との接触を行う。接触は、ｐＨの調節は特に必要なく、温度も室温で可能である。これにより、従来の抗体検出方法では、調製した抗原の精製が必須であったが、本発明の抗体検出方法では必要としないので、検出方法として簡便である。 A feature of the present invention is that the prepared fusion protein can be brought into contact with a test specimen without purification. Appropriate dilutions in buffer solution [eg 0.1% PBST (0.1% Tween20, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 2.68] without purification of the fusion protein previously prepared in a microplate or by cell-free protein synthesis means mM KCl, 1.47 mM KH ₂ PO ₄ )], and contact with the specimen on the microplate. The contact is not particularly required to adjust the pH, and the temperature can also be room temperature. Thereby, in the conventional antibody detection method, purification of the prepared antigen is indispensable, but since it is not required in the antibody detection method of the present invention, the detection method is simple.

本発明の融合タンパク質の調製における転写-翻訳は、以下のような無細胞合成手段による方法で調製される。転写鋳型は、インビトロ転写反応の鋳型分子として使用し得るＤＮＡをいい、適当なプロモーター配列の下流に目的とする融合タンパク質をコードする塩基配列を少なくとも有する。適当なプロモーター配列とは、転写反応において使用されるＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター配列をいい、例えば、SP6プロモーター、T7プロモーター等が挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡは上記のように測定対象とする抗体の抗原性タンパク質と蛍光標識タンパク質をコードするものである。
転写鋳型は、プロモーター配列と目的タンパク質をコードする塩基配列との間に翻訳効率を制御する活性を有する塩基配列を有することが好ましく、例えば、タバコモザイクウイルス由来のΩ配列などのＲＮＡウイルス由来の５'非翻訳領域、及び/又はコザック配列等を用いることができる。さらに、転写鋳型は、融合タンパク質をコードする塩基配列の下流に転写ターミネーション領域等を含む３'非翻訳領域を含むことが好ましい。３'非翻訳領域としては、終止コドンより下流の約１．０〜約３．０キロベース程度が好ましく用いられる。これらの３'非翻訳領域は必ずしも融合タンパク質をコードする遺伝子本来のそれである必要はない。本発明の方法の好ましい実施態様においては、融合タンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅・合成した反応産物を精製することなくそのまま転写鋳型とすることも可能である。尚、非特異的増幅により生じる短鎖ＤＮＡ（結果として目的産物の収量低下及び低分子翻訳産物ノイズを生じる）の生成を防ぐために、国際公開ＷＯ０２／１８５８６号に記載のプロモーター分断型プライマーを用いることもできる。
このようにして得られる転写鋳型ＤＮＡはクロロホルム抽出やアルコール沈殿により精製した後に転写反応に供してもよいが、ＰＣＲ反応後の反応液をそのまま転写鋳型溶液として使用することが可能である。
本発明において転写反応は、自体公知の方法を用いて調製された融合タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡ又はＰＣＲ法によって増幅・合成したＤＮＡを精製することなく調製された融合タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡから、インビトロ転写反応により翻訳鋳型であるｍＲＮＡを生成させる工程を含む。当該工程は、反応系（例えば、９６穴タイタープレートなどの市販の容器）に提供された転写鋳型を含む溶液、好ましくはＰＣＲ反応液と、転写鋳型中のプロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなど）やＲＮＡ合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液（「転写反応用溶液」ともいう）とを混合した後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約３０℃〜約４２℃で約３０分間〜約１６時間、好ましくは約２時間〜約５時間該混合液をインキュベートすることにより行われる。
なお、本発明の好ましい翻訳鋳型となるmRNAは、融合タンパク質をコードする遺伝子DNA（Chiu, W. –L.,et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)）が挿入されたpEU-ベクター（Sawasaki, T. et al.,PNAS, 99 (23), 14652-7（2002））を基に、Ω配列部分をＷＯ０３／０５６００９号公報に記載の配列番号136の塩基配列に置き換えた環状プラスミドDNAを鋳型として、SP６ RNApolymerase（Promega社製）を用いて転写を行うこともできる。
ついで、転写溶液は、タンパク質合成用細胞抽出液に直接添加する。ここで用いられるタンパク質合成用細胞抽出液としては、翻訳鋳型を翻訳して該鋳型にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等が用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds), IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、E.coli S30 extract system（Promega社製）やRTS 500 Rapid Translation System（Roche社製）に添付のもの等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではRabbit Reticulocyte Lysate Sytem（Promega社製）に添付のもの等、更にコムギ胚芽由来ではPROTEIOS^TM（TOYOBO社製）に添付のもの等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液の系を用いることが好ましく、植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウ等の種子が好ましく、特にコムギ種子胚芽抽出液を用いたものが好適である。さらに、抽出液の調製工程において混入した胚乳成分および低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去されたコムギ種子胚芽抽出液がより好適である。 Transcription-translation in the preparation of the fusion protein of the present invention is prepared by the following cell-free synthesis means. A transcription template refers to DNA that can be used as a template molecule for in vitro transcription reaction, and has at least a base sequence encoding a target fusion protein downstream of an appropriate promoter sequence. An appropriate promoter sequence refers to a promoter sequence that can be recognized by RNA polymerase used in a transcription reaction, and examples thereof include SP6 promoter, T7 promoter and the like. The DNA encoding the target protein encodes the antigenic protein of the antibody to be measured and the fluorescently labeled protein as described above.
The transcription template preferably has a base sequence having an activity of controlling translation efficiency between the promoter sequence and the base sequence encoding the target protein. For example, the transcription template can be derived from RNA virus-derived 5 such as Ω sequence derived from tobacco mosaic virus. 'Untranslated regions and / or Kozak sequences can be used. Furthermore, the transcription template preferably includes a 3 ′ untranslated region including a transcription termination region and the like downstream of the base sequence encoding the fusion protein. As the 3 ′ untranslated region, about 1.0 to about 3.0 kilobases downstream from the stop codon is preferably used. These 3 ′ untranslated regions do not necessarily have to be those of the gene encoding the fusion protein. In a preferred embodiment of the method of the present invention, the reaction product obtained by amplifying and synthesizing the DNA encoding the fusion protein by the PCR method can be directly used as a transcription template without purification. In order to prevent the generation of short-chain DNA (resulting in yield loss of the target product and low-molecular translation product noise) generated by non-specific amplification, a promoter-splitting primer described in International Publication WO02 / 18586 should be used. You can also.
The transcription template DNA thus obtained may be subjected to a transcription reaction after being purified by chloroform extraction or alcohol precipitation, but the reaction solution after the PCR reaction can be used as it is as a transcription template solution.
In the present invention, the transcription reaction is a transcription template DNA encoding a fusion protein prepared by a method known per se, or a transcription template DNA encoding a fusion protein prepared without purifying DNA amplified and synthesized by the PCR method. And a step of generating mRNA as a translation template by in vitro transcription reaction. This step includes a solution containing a transcription template provided in a reaction system (eg, a commercially available container such as a 96-well titer plate), preferably a PCR reaction solution, and an RNA polymerase (eg, SP6) compatible with the promoter in the transcription template. After mixing with a solution (also referred to as a “transcription reaction solution”) containing components necessary for a transcription reaction such as RNA polymerase or the like and a substrate for RNA synthesis (four types of ribonucleoside triphosphates), about 20 ° C. It is carried out by incubating the mixture at about 60 ° C., preferably about 30 ° C. to about 42 ° C. for about 30 minutes to about 16 hours, preferably about 2 hours to about 5 hours.
The mRNA serving as a preferred translation template of the present invention is a gene DNA encoding a fusion protein (Chiu, W. – L., et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)). Based on the inserted pEU-vector (Sawasaki, T. et al., PNAS, 99 (23), 14652-7 (2002)), the Ω sequence part is the base of SEQ ID NO: 136 described in WO 03/056009 Transcription can also be performed using SP6 RNApolymerase (manufactured by Promega) using the circular plasmid DNA replaced with the sequence as a template.
Next, the transcription solution is added directly to the cell extract for protein synthesis. The cell extract for protein synthesis used herein may be any cell extract that can translate a translation template to produce a protein encoded by the template. Specifically, Escherichia coli, Plant seed germs, cell extracts such as rabbit reticulocytes, and the like are used. These may be commercially available, or a method known per se, specifically, for Escherichia coli extracts, Pratt, JM et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, BD & Higgins, SJ, eds), IRL Press, Oxford (1984). Examples of commercially available cell extracts for protein synthesis include those attached to E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Translation System (Roche) from E. coli. Examples include those attached to Rabbit Reticulocyte Lysate System (manufactured by Promega), and those derived from wheat germ that are attached to PROTEIOS ^™ (manufactured by TOYOBO). Of these, it is preferable to use a plant seed germ extract system, and plant seeds are preferably gramineous plants such as wheat, barley, rice and corn, and seeds such as spinach, and in particular, wheat seed germ extract. Those using are suitable. Furthermore, a wheat seed germ extract from which the endosperm components and low molecular weight protein synthesis inhibitors mixed in the extract preparation step are substantially removed is more preferable.

本発明の最適の細胞抽出液は、コムギ胚芽由来の抽出液であり、さらに混入する胚乳成分や胚芽組織細胞中のタンパク質合成阻害をもたらすグルコースなどの代謝物質が実質的に除去された抽出液であるので、これを例にとって原料の調製方法を以下説明する。 The optimal cell extract of the present invention is an extract derived from wheat germ, and is an extract from which metabolites such as glucose that cause protein synthesis inhibition in the mixed endosperm components and germ tissue cells are substantially removed. Therefore, taking this as an example, a method for preparing the raw material will be described below.

通常、胚芽の部分は非常に小さいので胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まずコムギ種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。種子に加える力は、種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。具体的には、公知の粉砕装置を用いて、種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置、例えばピンミル、ハンマーミルを用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギの場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギの場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。 Usually, since the germ portion is very small, it is preferable to remove portions other than the germ as much as possible in order to obtain the germ efficiently. Usually, first, mechanical force is applied to wheat seeds to obtain a mixture containing embryos, endosperm crushed material, and seed coat crushed material, from which the endosperm crushed material, seed coat crushed material, etc. are removed to obtain a crude germ fraction ( A mixture containing an embryo as a main component and containing an endosperm crushed material and a seed coat crushed material) is obtained. The force applied to the seeds only needs to be strong enough to separate the germ from the seeds. Specifically, a mixture containing embryos, endosperm crushed material, and seed coat crushed material is obtained by pulverizing seeds using a known pulverizing apparatus.
The seeds can be pulverized using a generally known pulverizer, but it is preferable to use a pulverizer of a type that applies an impact force to the object to be pulverized, such as a pin mill or a hammer mill. The degree of pulverization may be appropriately selected according to the size of the seed germ used. For example, in the case of wheat, the pulverization is usually pulverized to a maximum length of 4 mm or less, preferably a maximum length of 2 mm or less. The pulverization is preferably performed by a dry method.
Next, a crude germ fraction is obtained from the obtained pulverized seed using a generally known classifier, for example, a sieve. For example, in the case of wheat, a crude embryo fraction having a mesh size of 0.5 mm to 2.0 mm, preferably 0.7 mm to 1.4 mm is usually obtained. Furthermore, if necessary, seed coat, endosperm, dust, etc. contained in the obtained crude germ fraction may be removed using wind power or electrostatic force.
In addition, a crude embryo fraction can be obtained by a method using the difference in specific gravity between embryo, seed coat, and endosperm, for example, heavy liquid sorting. In order to obtain a crude germ fraction containing more germs, a plurality of the above methods may be combined. Furthermore, the germ is sorted from the obtained crude germ fraction using, for example, visual observation or a color sorter.

このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水または水溶液もしくは界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデットＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデットＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ）が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、胚乳成分の除去に十分且つ胚芽成分のタンパク質合成活性に悪影響を及ぼさない濃度で使用され得るが、例えば０．５％の濃度で使用することができる。水または水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。 Since the embryo fraction obtained in this way may have an endosperm component attached thereto, it is usually preferable to further perform a washing treatment for germ purification. As the washing treatment, the embryo fraction is dispersed / suspended in water or an aqueous solution or an aqueous solution containing a surfactant, which is usually cooled to 10 ° C. or lower, preferably 4 ° C. or lower, and washed until the washing liquid does not become cloudy. preferable. Moreover, it is more preferable to disperse and suspend the embryo fraction in an aqueous solution containing a surfactant, usually at 10 ° C. or lower, preferably at 4 ° C. or lower, and wash until the cleaning liquid does not become cloudy. The surfactant is preferably a nonionic surfactant, and can be widely used as long as it is a nonionic surfactant. Specifically, for example, bridges (Brij), Triton, Nonidet P40 (Nonidet), Tween, etc., which are polyoxyethylene derivatives, are exemplified as preferable examples. Of these, nonidet P40 (Nonidet) is most suitable. These nonionic surfactants can be used at concentrations sufficient to remove the endosperm component and do not adversely affect the protein synthesis activity of the germ component, but can be used, for example, at a concentration of 0.5%. Either one or both of the cleaning treatment with water or an aqueous solution and the cleaning treatment with a surfactant may be performed. Further, these cleaning processes may be performed in combination with ultrasonic processing.

上記のように種子粉砕物から選別し、洗浄して得られた発芽能を有する胚芽を好ましくは抽出溶媒の存在下に細分化した後、得られた胚芽抽出液を分離し、更に精製することにより無細胞タンパク質合成用抽出液を得る。 After subdividing the germinated germ obtained from the seed pulverized product and washed as described above, preferably in the presence of an extraction solvent, the resulting germ extract is separated and further purified. To obtain an extract for cell-free protein synthesis.

抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよび／またはチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液の製造に用いられるものを採用すればよい。
必要量の抽出溶媒を胚芽に加え、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのがより好ましい。 As an extraction solvent, an aqueous solution containing a buffer, potassium ion, magnesium ion and / or a thiol group antioxidant can be used. Moreover, you may further add a calcium ion, an L-type amino acid, etc. as needed. For example, a solution containing N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES) -KOH, potassium acetate, magnesium acetate, L-type amino acid and / or dithiothreitol, or the method of Patterson et al. A partially modified solution (a solution containing HEPES-KOH, potassium acetate, magnesium acetate, calcium chloride, L-type amino acid and / or dithiothreitol) can be used as an extraction solvent. The composition and concentration of each component in the extraction solvent are known per se, and those used for producing a cell extract for cell-free protein synthesis may be employed.
The required amount of extraction solvent is added to the germ and the embryo is subdivided in the presence of the extraction solvent. The amount of the extraction solvent is usually 0.1 ml or more, preferably 0.5 ml or more, more preferably 1 ml or more with respect to 1 g of germ before washing. The upper limit of the amount of extraction solvent is not particularly limited, but is usually 10 ml or less, preferably 5 ml or less, per 1 g of germ before washing. The embryo to be subdivided may be frozen as in the prior art, but it is more preferable to use an embryo that has not been frozen.

細分化の方法としては、摩砕、圧砕等、従来公知の粉砕方法を採用することができるが、本発明者が開発した衝撃または切断により胚芽を細分化する方法（特願２００２−０２３１３９）が好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕または圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法は、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、好ましくは１０℃以下で操作が可能な範囲内、特に好ましくは４℃程度が適当である。
このような衝撃または切断による細分化においては、細分化した後に抽出溶媒を添加することもできるが、抽出溶媒の存在下に行うことがより好ましい。上記の方法は、「ブレンダー法」と称することもある。 As the fragmentation method, a conventionally known pulverization method such as grinding or crushing can be adopted. However, a method (Japanese Patent Application No. 2002-023139) for fragmenting embryos by impact or cutting developed by the present inventor is available. preferable. Here, “subdivide by impact or cutting” refers to the destruction of cell organelles such as plant embryo cell nuclei, mitochondria and chloroplasts, cell membranes and cell walls compared to conventional grinding or crushing. It means to destroy the plant germ under conditions that can be minimized.
The apparatus and method that can be used when subdividing are not particularly limited as long as the above conditions are satisfied. For example, it is preferable to use an apparatus having a blade-like object that rotates at high speed, such as a Waring blender. The rotation speed of the blade is usually 1000 rpm or more, preferably 5000 rpm or more, and usually 30000 rpm or less, preferably 25000 rpm or less. The rotation time of the blade is usually 5 seconds or longer, preferably 10 seconds or longer. The upper limit of the rotation time is not particularly limited, but is usually 10 minutes or less, preferably 5 minutes or less. The temperature at the time of fragmentation is preferably within a range where the operation can be carried out at 10 ° C. or less, particularly preferably about 4 ° C.
In such fragmentation by impact or cutting, an extraction solvent can be added after fragmentation, but it is more preferable to carry out in the presence of the extraction solvent. The above method may be referred to as a “blender method”.

次いで、胚芽抽出液について２〜４万Ｇ、好ましくは２．５〜３．５万Ｇ、さらに好ましくは３万Ｇの遠心分離を行い、遠心上清を取得する。この際、沈殿助剤として無機担体をいれておくことは沈殿物と上清との分離のためにより好ましい。この沈殿物中には、グリコシダーゼなどの酵素とカルシウムの複合体が含まれている。グリコシダーゼをあらかじめ除いておくことは、澱粉からグルコースの生成を最小限に抑えることに役立つ。好適な無機担体としては、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、海砂等が例示される。この無機担体の導入により、沈殿物が上清へ混入することをほぼ完全に防ぐことが出来る。沈殿助剤を遠心時に加えない場合は、沈殿物の上部に不溶性スラリーが存在し、これが混入したＳ-３０画分から調製した抽出液のタンパク質合成活性は低くなる。そこで、遠心後の遠心管からのＳ-３０画分の回収に当たっては混入を避けるために細心の注意が必要となる。
コムギ胚芽抽出液は、ゲルろ過等によりさらに精製することができる。ゲルろ過は、例えば予め適当な溶液で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用の細胞胚芽抽出液の製造に用いられるもの（例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトールまたはＬ型アミノ酸を含む溶媒）を採用すればよい。
このようにして得られた胚芽細胞抽出物は、ＲＮａｓｅ活性及びホスファターゼ活性が極めて低減されたものである。 Next, the embryo extract is centrifuged at 2-40,000 G, preferably 2.5-35,000 G, more preferably 30,000 G, and a supernatant is obtained. At this time, it is more preferable to add an inorganic carrier as a precipitation aid to separate the precipitate from the supernatant. The precipitate contains a complex of an enzyme such as glycosidase and calcium. Removing the glycosidase in advance helps to minimize the production of glucose from the starch. Examples of suitable inorganic carriers include bentonite, activated carbon, silica gel, sea sand and the like. By introducing this inorganic carrier, it is possible to almost completely prevent the precipitate from being mixed into the supernatant. When the precipitation aid is not added during centrifugation, an insoluble slurry is present at the top of the precipitate, and the protein synthesis activity of the extract prepared from the S-30 fraction mixed with this is low. Therefore, when collecting the S-30 fraction from the centrifuge tube after centrifugation, great care is required to avoid contamination.
The wheat germ extract can be further purified by gel filtration or the like. Gel filtration can be performed, for example, using a gel filtration device that has been equilibrated in advance with an appropriate solution. The composition and concentration of each component in the gel filtration solution are known per se, and are used for the production of cell germ extract for cell-free protein synthesis (for example, HEPES-KOH, potassium acetate, magnesium acetate, dithiothreitol) Alternatively, a solvent containing an L-type amino acid may be employed.
The germ cell extract thus obtained has extremely reduced RNase activity and phosphatase activity.

ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物あるいは糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあるためこれら微生物などを排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入の可能性のある微生物が除去可能なものであれば特に制限はないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、枯草菌の胞子のサイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔ^ＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、次に混入の可能性のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。 Since the germ extract-containing solution after gel filtration may contain microorganisms or spores such as fungi, it is preferable to exclude these microorganisms. In particular, it is important to prevent the growth of microorganisms during long-term (one day or longer) cell-free protein synthesis reactions. The means for removing microorganisms is not particularly limited, but a filter sterilization filter is preferably used. The pore size of the filter is not particularly limited as long as microorganisms that may be mixed can be removed, but usually 0.1 to 1 micrometer, preferably 0.2 to 0.5 micrometer is appropriate. is there. Incidentally, since the size of Bacillus subtilis spores is 0.5 μm × 1 μm, it is effective to remove the spores by using a 0.20 micrometer filter (for example, Minisart ^™ manufactured by Sartorius). In the filtration, it is preferable to first filter with a large pore size filter, and then filter with a pore size filter that can remove microorganisms that may be mixed.

このようにして得られた細胞抽出液は、原料であるコムギ自身が含有または保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（各種RNA、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質。例えば各種リボヌクレアーゼ、各種プロテアーゼ、トリチン、チオニン等）が、ほぼ完全に取り除かれている。すなわち、これらの阻害物質が局在する胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。胚乳の除去の程度は、コムギ胚芽抽出液中に夾雑するトリチンの活性、すなわちリボソームを脱アデニン化する活性をモニターすることにより評価できる。リボソームが実質的に脱アデニン化されていなければ、胚芽抽出液中に夾雑する胚乳由来成分がない、すなわち胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されていると判断される。リボソームが実質的に脱アデニン化されていない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。 The cell extract thus obtained is a substance that suppresses the protein synthesis function contained or retained by the raw wheat itself (a substance that acts on various RNAs, translated protein factors, ribosomes, etc. and suppresses the function thereof. For example, various ribonucleases, various proteases, tritin, thionine, etc.) are almost completely removed. That is, the endosperm where these inhibitors are localized is almost completely removed and purified. The degree of removal of endosperm can be evaluated by monitoring the activity of tritin contaminated in the wheat germ extract, that is, the activity of deadenating the ribosome. If the ribosome is not substantially deadeninated, it is judged that there is no contaminating endosperm-derived component in the embryo extract, that is, the endosperm is almost completely removed and purified. The extent to which the ribosome is not substantially deadeninated means that the deadenination rate of the ribosome is less than 7%, preferably 1% or less.

このような胚芽抽出液を原料にして、さらに「胚芽組織細胞内因性の解糖系などの代謝経路や翻訳反応制御機構の排除」のために糖、リン酸化糖、糖のリン酸化酵素、糖分解酵素等を低減した無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液調製のための処理を行うこともできる。処理工程の概要は以下である。得られた細胞抽出液、あるいはこの抽出液について、ゲルろ過による溶液の交換あるいは必要成分の添加などにより翻訳反応液としたものを、分子量１０ｋＤａカットで分子量分画し、低分子画分を排除する。あるいは、分子量１０ｋＤａ以上の物質を分子量分画し、回収することも可能である。この分画処理は複数回行い、特に分子量１０ｋＤａ以下の物質を実質的に除去することが好ましい。複数回の具体的回数としては、１〜１０回、好ましくは２〜９回、さらに好ましくは３〜８回、最も好ましいくは４〜７回である。このように調製された細胞抽出液は、実質的に糖、リン酸化糖が1mM以下まで低減されていた（２６０ｎｍにおける吸光度２００ OD/mlの抽出液中のグルコース濃度として）。かくして得られたグルコース濃度が低減された抽出液は、極めて高い無細胞タンパク質合成能を保有する。 Using such an embryo extract as a raw material, sugars, phosphorylated sugars, sugar phosphorylating enzymes, sugars for the purpose of “eliminating metabolic pathways such as endogenous glycolytic pathways and translation reaction control mechanisms” A treatment for preparing a cell extract for cell-free protein synthesis with reduced degrading enzymes and the like can also be performed. The outline of the processing steps is as follows. The obtained cell extract or this extract is used as a translation reaction solution by exchanging the solution by gel filtration or adding necessary components, etc., and molecular weight fractionation is performed at a molecular weight of 10 kDa to eliminate low molecular fractions. . Alternatively, a substance having a molecular weight of 10 kDa or more can be fractionated and recovered. This fractionation treatment is preferably performed a plurality of times, and in particular, it is preferable to substantially remove substances having a molecular weight of 10 kDa or less. The specific number of times is 1 to 10 times, preferably 2 to 9 times, more preferably 3 to 8 times, and most preferably 4 to 7 times. In the cell extract thus prepared, sugar and phosphorylated saccharide were substantially reduced to 1 mM or less (as the glucose concentration in the extract having an absorbance of 200 OD / ml at 260 nm). The extract with a reduced glucose concentration thus obtained possesses a very high cell-free protein synthesis ability.

翻訳反応は、調製して得られた転写溶液をタンパク質合成用細胞抽出液に直接添加し、これに基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、３'，５'−cAMP、葉酸塩、抗菌剤等の、翻訳反応に必要もしくは好適な成分を含有する溶液（「翻訳反応用溶液」ともいう）を添加して、翻訳反応に適した温度で適当な時間インキュベートすることにより行うことができる。基質となるアミノ酸は、通常、タンパク質を構成する２０種類の天然アミノ酸であるが、目的に応じてそのアナログや異性体を用いることもできる。また、エネルギー源としては、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰが挙げられる。各種イオンとしては、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。緩衝液としては、Hepes−KOH、Tris−酢酸等が用いられる。またＡＴＰ再生系としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ、またはクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）とクレアチンキナーゼの組み合わせ等が挙げられる。核酸分解酵素阻害剤としては、リボヌクレアーゼインヒビターや、ヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。このうち、リボヌクレアーゼインヒビターの具体例としては、ヒト胎盤由来のRNase inhibitor（TOYOBO社製等）等が用いられる。ｔＲＮＡは、Moniter, R., et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1 (1960)等に記載の方法により取得することができ、あるいは市販のものを用いることもできる。還元剤としては、ジチオスレイトール等が挙げられる。抗菌剤としては、アジ化ナトリウム、アンピシリン等が挙げられる。これらの添加量は、無細胞タンパク質合成において通常使用され得る範囲で適宜選択することができる。翻訳反応用溶液の添加の態様は、用いる翻訳反応系に応じて適宜選択することができる。本発明の方法に用いられる翻訳反応系は、無細胞タンパク質合成法に適用し得る自体公知のいずれの系であってもよく、例えば、バッチ法（Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds）, IRL Press, Oxford(1984)）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成法（Spirin, A. S. et al., Science, 242, 1162-1164(1988)）、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、WID６）、あるいは重層法（国際公開第０２／２４９３９号パンフレット）等が挙げられる。更には、合成反応系に鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する不連続ゲル濾過法（特開２０００−３３３６７３公報）や、合成反応槽が分子篩可能な担体によって調製され、上記の合成材料等が該担体を移動相として展開され、展開中に合成反応が実行され、結果として合成されたタンパク質を回収し得る方法（特開２０００−３１６５９５公報）等を用いることができる。しかしながら、合成系の構造の単純化、省スペース、低コスト、ハイスループット解析に適用可能な多検体同時合成システムの提供の点から、バッチ法または重層法が好ましく、比較的大量のタンパク質を得ることができる点で重層法が特に好ましい。バッチ法により翻訳反応を行う場合、翻訳反応用溶液を、転写溶液を直接添加したタンパク質合成用細胞抽出液に添加して混合すればよい。あるいは翻訳反応用溶液に含まれる成分を予めタンパク質合成用細胞抽出液と混合した場合には、翻訳反応用溶液の添加を省略することもできる。転写溶液を直接添加したタンパク質合成用細胞抽出液と翻訳反応用溶液とを混合して得られる「翻訳反応液」としては、例えばタンパク質合成用細胞抽出液としてコムギ胚芽抽出液を用いた場合、１０〜５０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、５５〜１２０ｍＭ酢酸カリウム、１〜５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１〜０．６ｍＭスペルミジン、各０．０２５〜１ｍＭＬ−アミノ酸、２０〜７０μＭ、好ましくは３０〜５０μＭのＤＴＴ、１〜１．５ｍＭＡＴＰ、０．２〜０．５ｍＭＧＴＰ、１０〜２０ｍＭクレアチンリン酸、０．５〜１．０units／μｌリボヌクレアーゼインヒビター、０．０１〜１０μＭタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、及び２４〜７５％コムギ胚芽抽出液を含むもの等が用いられる。このような翻訳反応液を用いた場合、プレインキュベーションは約１０〜約４０℃で約５〜約１０分間、本反応（翻訳反応）におけるインキュベーションは同じく約１０〜約４０℃、好ましくは約１８〜約３０℃、さらに好ましくは約２０〜約２６℃で、反応が停止するまで、バッチ法では通常約１０分〜約７時間程度行う。 In the translation reaction, the transcription solution obtained by the preparation is directly added to the cell extract for protein synthesis, and the amino acid, energy source, various ions, buffer solution, ATP regeneration system, nuclease inhibitor, Add a solution (also referred to as a “translation reaction solution”) containing components necessary or suitable for translation reaction such as tRNA, reducing agent, polyethylene glycol, 3 ′, 5′-cAMP, folate, antibacterial agent, etc. It can be carried out by incubating at a temperature suitable for the translation reaction for an appropriate time. The amino acid serving as the substrate is usually 20 kinds of natural amino acids constituting the protein, but analogs and isomers thereof can be used depending on the purpose. Moreover, ATP and / or GTP are mentioned as an energy source. Examples of various ions include acetates such as potassium acetate, magnesium acetate, and ammonium acetate, and glutamates. As the buffer, Hepes-KOH, Tris-acetic acid or the like is used. Examples of the ATP regeneration system include a combination of phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase, or a combination of creatine phosphate (creatine phosphate) and creatine kinase. Examples of the nuclease inhibitor include ribonuclease inhibitors and nuclease inhibitors. Among these, RNase inhibitors derived from human placenta (manufactured by TOYOBO, etc.) are used as specific examples of ribonuclease inhibitors. tRNA can be obtained by the method described in Moniter, R., et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1 (1960) or the like, or a commercially available product can be used. Examples of the reducing agent include dithiothreitol. Antibacterial agents include sodium azide, ampicillin and the like. These addition amounts can be appropriately selected within a range that can be usually used in cell-free protein synthesis. The mode of addition of the translation reaction solution can be appropriately selected according to the translation reaction system to be used. The translation reaction system used in the method of the present invention may be any system known per se that can be applied to a cell-free protein synthesis method. For example, a batch method (Pratt, JM et al., Transcription and Translation, Hames , 179-209, BD & Higgins, SJ, eds), IRL Press, Oxford (1984)), and continuous cell-free protein synthesis (Spirin, AS et. al., Science, 242, 1162-1164 (1988)), dialysis method (Kikawa et al., 21st Japan Molecular Biology Society, WID6), or multi-layer method (International Publication No. 02/24939 pamphlet). Furthermore, a discontinuous gel filtration method (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-333673) for supplying template RNA, amino acid, energy source and the like to the synthesis reaction system when necessary, and discharging the synthesized product and degradation product when necessary, and a synthesis reaction tank Is prepared by a carrier capable of molecular sieving, and the above synthetic material is developed using the carrier as a mobile phase, a synthesis reaction is performed during the development, and the synthesized protein can be recovered as a result (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-316595). Publication) etc. can be used. However, from the viewpoint of simplifying the structure of the synthesis system, saving space, low cost, and providing a multi-sample simultaneous synthesis system applicable to high-throughput analysis, the batch method or the multi-layer method is preferable, and a relatively large amount of protein can be obtained. In particular, the multi-layer method is preferred in that When performing the translation reaction by the batch method, the translation reaction solution may be added to and mixed with the cell extract for protein synthesis to which the transcription solution is directly added. Alternatively, when the components contained in the translation reaction solution are previously mixed with the cell synthesis solution for protein synthesis, the addition of the translation reaction solution can be omitted. As the “translation reaction solution” obtained by mixing the protein synthesis cell extract directly added with the transcription solution and the translation reaction solution, for example, when a wheat germ extract is used as the protein synthesis cell extract, 10 -50 mM HEPES-KOH (pH 7.8), 55-120 mM potassium acetate, 1-5 mM magnesium acetate, 0.1-0.6 mM spermidine, 0.025-1 mM L-amino acid, 20-70 μM, preferably 30- 50 μM DTT, 1-1.5 mM ATP, 0.2-0.5 mM GTP, 10-20 mM creatine phosphate, 0.5-1.0 units / μl ribonuclease inhibitor, 0.01-10 μM protein disulfide isomerase, and 24 Those containing ~ 75% wheat germ extract are used. When such a translation reaction solution is used, the preincubation is about 10 to about 40 ° C. for about 5 to about 10 minutes, and the incubation in this reaction (translation reaction) is also about 10 to about 40 ° C., preferably about 18 to In the batch method, the reaction is usually carried out at about 30 ° C., more preferably about 20 to about 26 ° C., until the reaction is stopped, for about 10 minutes to about 7 hours.

重層法により翻訳反応を行う場合、転写溶液を直接添加したタンパク質合成用細胞抽出液上に、翻訳反応用溶液を界面を乱さないように重層することによりタンパク質合成を行う。具体的には、例えば、必要に応じて適当時間プレインキュベートしたタンパク質合成用細胞抽出液を翻訳鋳型の沈殿に添加してこれを溶解し、反応相とする。この反応相の上層に翻訳反応用溶液（供給相）を、界面を乱さないように重層して反応を行う。両相の界面は必ずしも重層によって水平面状に形成させる必要はなく、両相を含む混合液を遠心分離することによって、水平面を形成することも可能である。両相の円形界面の直径が７ｍｍの場合、反応相と供給相の容量比は１：４〜１：８が適当であるが、１：５が好適である。両相からなる界面面積は大きいほど拡散による物質交換率が高く、タンパク質合成効率が上昇する。従って、両相の容量比は、両相の界面面積によって変化する。翻訳反応は、例えばコムギ胚芽抽出液を用いた系においては、静置条件下、約１０〜約４０℃、好ましくは約１８〜約３０℃、さらに好ましくは約２０〜約２６℃で、通常約１０〜約２０時間行うことができる。また、大腸菌抽出液を用いる場合、反応温度は約３０℃〜約３７℃が適当である。 When the translation reaction is performed by the multilayer method, the protein synthesis is performed by layering the translation reaction solution on the cell synthesis solution for protein synthesis to which the transcription solution is directly added so as not to disturb the interface. Specifically, for example, a cell extract for protein synthesis that has been pre-incubated for an appropriate period of time as necessary is added to the translation template precipitate to dissolve it to obtain a reaction phase. The reaction is carried out by layering the solution for translation reaction (supply phase) on the upper layer of the reaction phase so as not to disturb the interface. The interface between both phases does not necessarily have to be formed in a horizontal plane by means of multiple layers, and it is also possible to form a horizontal plane by centrifuging the mixed solution containing both phases. When the diameter of the circular interface between the two phases is 7 mm, the volume ratio of the reaction phase to the supply phase is suitably 1: 4 to 1: 8, but 1: 5 is preferred. The larger the interfacial area composed of both phases, the higher the mass exchange rate by diffusion and the higher the protein synthesis efficiency. Accordingly, the capacity ratio of both phases varies depending on the interface area between both phases. For example, in a system using a wheat germ extract, the translation reaction is performed at about 10 to about 40 ° C., preferably about 18 to about 30 ° C., more preferably about 20 to about 26 ° C. It can be performed for 10 to about 20 hours. In addition, when an E. coli extract is used, the reaction temperature is suitably about 30 ° C to about 37 ° C.

本発明の無細胞タンパク質合成手段によって調製した特定タンパク質のスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
１）所望の候補遺伝子の選択された領域である候補特定タンパク質及び蛍光標識タンパク質をコードする遺伝子を調製する工程
ゲノム情報に基き候補特定タンパク質を選択する。ここで、本発明のコムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成系では、合成すべき融合タンパク質をコードする遺伝子のＡＴ含有量がタンパク質合成に影響を与えないので、選択された候補遺伝子がＡＴリッチなものも対象となる。
２）で調製した遺伝子からｍＲＮＡを合成する工程
転写は、従来既知の方法で可能である。
３）２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として無細胞タンパク質合成手段で翻訳する工程
２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型としてコムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成手段で翻訳し、融合タンパク質を合成する。コムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を容器に添加する。続いて、融合タンパク質の合成に必要な物質、翻訳鋳型若しくは転写鋳型及び安定化剤を含む溶液を添加して、融合タンパク質を合成する。合成は、ピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに細胞抽出液を分注することにより行うこともできる。この場合、コムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成用細胞抽出液をウェルの容量に適した量で添加し、続いて融合タンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型若しくは転写鋳型及び安定化剤を含む溶液をピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより各ウェルに必要量添加して、融合タンパク質を合成する。なお、各ウェルに異なる種類の融合タンパク質を発現する翻訳鋳型を添加することにより、１回の翻訳工程で複数の融合タンパク質を発現することができる。
４）３）で合成され融合タンパク質を精製することなく、試験検体と接触させ、抗体反応を検出する工程
３）で合成された未精製の融合タンパク質を含む合成液が含まれる各ウェルに、希釈液を添加する。その後に、試験検体を該各ウェルに添加（接触）する。融合タンパク質と試験検体中の抗体との反応性の確認方法は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを用いて簡便に測定できる。以上により、本発明のスクリーニング方法は、融合タンパク質を未精製のままに試験検体と接触させること及びＦＣＳ、ＦＩＤＡを用いて簡便に抗体検出測定ができるので、従来のスクリーニング系とは異なり、多検体を簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。 The screening method for a specific protein prepared by the cell-free protein synthesis means of the present invention includes the following steps.
1) A step of preparing a candidate specific protein that is a selected region of a desired candidate gene and a gene encoding a fluorescently labeled protein. A candidate specific protein is selected based on genomic information. Here, in the cell-free protein synthesis system using the wheat germ extract of the present invention, since the AT content of the gene encoding the fusion protein to be synthesized does not affect protein synthesis, the selected candidate gene is AT-rich. Things are also covered.
Step of synthesizing mRNA from the gene prepared in 2) Transcription can be performed by a conventionally known method.
3) Step of translating the mRNA synthesized in 2) with a cell-free protein synthesis means using a translation template as a translation template Using the cell-free protein synthesis means with wheat germ extract as a translation template, the mRNA synthesized in 2) is translated, Synthesize. A cell extract for cell-free protein synthesis using a wheat germ extract is added to the container. Subsequently, a solution containing a substance necessary for the synthesis of the fusion protein, a translation template or a transcription template, and a stabilizer is added to synthesize the fusion protein. The synthesis can also be performed by dispensing the cell extract into different wells of a container partitioned into a plurality of regions by a pipetteman or the like and / or a channel pipettor of an automatic dispenser. In this case, a cell extract for cell-free protein synthesis using wheat germ extract is added in an amount appropriate for the volume of the well, and then a solution containing a substance necessary for synthesis of the fusion protein, a translation template or a transcription template and a stabilizer. Is added to each well by a pipetman or the like and / or a channel pipettor of an automatic dispenser to synthesize a fusion protein. A plurality of fusion proteins can be expressed in one translation step by adding a translation template that expresses different types of fusion proteins to each well.
4) Step of detecting the antibody reaction by contacting the test sample without purifying the fusion protein synthesized in 3) and diluting each well containing the synthetic solution containing the unpurified fusion protein synthesized in 3) Add liquid. Thereafter, a test specimen is added (contacted) to each well. The method for confirming the reactivity between the fusion protein and the antibody in the test sample can be easily measured using FCS or FIDA. As described above, the screening method of the present invention allows the fusion protein to be brought into contact with a test sample in an unpurified state, and allows simple antibody detection measurement using FCS and FIDA. Can be screened easily and rapidly.

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, the scope of the present invention is not limited by these Examples.

実施例１
融合タンパク質（ＧＦＰ−ＦＴ、ＧＦＰ-ＥＢＮＡ１）の転写鋳型の作製
翻訳鋳型となるｍＲＮＡは、ＧＦＰ遺伝子ＤＮＡ（Chiu, W. –L.,et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)）及びシロイヌナズナの花成誘導因子（ＦＴ）遺伝子ＤＮＡ（Kobayashi, Y., Kaya, H., Goto, K., Iwabuchi, M. & Araki, T. Science 286,1960-1962 (1999)）が挿入されたｐＥＵ−ＧＦＰ−ＦＴベクター〔Sawasaki, T. et al.,PNAS, 99 (23), 14652-7（2002）と同様に調製〕、又はＧＦＰ遺伝子ＤＮＡ及びEpstein-Barr virus（EBV）特異的核内抗原 EBNA1遺伝子（Lindahl, T., Klein, G., Reedman, B.M., Johansson, B. & Singh, S.Int J Cancer. 13, 764-72 (1974)）が挿入されたｐＥＵ−ＧＦＰ−ＥＢＮＡ１ベクターを基に、タバコモザイクウィルス（TMV）のΩ配列部分を含む環状プラスミドＤＮＡを鋳型として、転写反応溶液〔最終濃度、８０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．８、１６ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン、２．５ｍＭ４ＮＴＰｓ（４種類のヌクレオチド三リン酸）、０．８Ｕ／μｌＲＮａｓｅ阻害剤、０．１μｇ／μｌＤＮＡ〔プラスミドＧＦＰ（Green fluorescent protein）〕、１．６Ｕ／μｌＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ〕を調製し、３７℃で３時間反応させた。得られたRNAをフェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column（Amersham Pharmacia Biotech社製）により精製して用いた。
なお、コントロールとしてのＧＦＰの転写鋳型も上記同様に作製した。 Example 1
Preparation of transcription template of fusion protein (GFP-FT, GFP-EBNA1) mRNA serving as a translation template is GFP gene DNA (Chiu, W. – L., et al., Curr. Biol. 6, 325- 330 (1996)) and Arabidopsis flower induction factor (FT) gene DNA (Kobayashi, Y., Kaya, H., Goto, K., Iwabuchi, M. & Araki, T. Science 286, 1960-1962 (1999) PEU-GFP-FT vector (prepared in the same manner as Sawasaki, T. et al., PNAS, 99 (23), 14652-7 (2002)), or GFP gene DNA and Epstein-Barr virus ( EBV) specific nuclear antigen EBNA1 gene (Lindahl, T., Klein, G., Reedman, BM, Johansson, B. & Singh, S. Int J Cancer. 13, 764-72 (1974)) was inserted Based on the pEU-GFP-EBNA1 vector, a transcription reaction solution [final concentration, 80 mM HEPE] was prepared using a circular plasmid DNA containing the Ω sequence portion of tobacco mosaic virus (TMV) as a template. -KOH pH 7.8, 16 mM magnesium acetate, 10 mM dithiothreitol, 2 mM spermidine, 2.5 mM 4NTPs (4 types of nucleotide triphosphates), 0.8 U / μl RNase inhibitor, 0.1 μg / μl DNA [plasmid GFP (Green fluorescent protein)], 1.6 U / μl SP6 RNA polymerase] was prepared and reacted at 37 ° C. for 3 hours. The obtained RNA was extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol, and then purified with a Nick Column (Amersham Pharmacia Biotech) and used.
A GFP transcription template as a control was prepared in the same manner as described above.

実施例２
融合タンパク質（ＧＦＰ−ＦＴ、ＧＦＰ-ＥＢＮＡ１）の翻訳
調製したコムギ胚芽抽出物含有液５．８μlを含む蛋白質合成用反応液（それぞれ最終濃度で、２９ｍＭ HEPES−KOH（ｐＨ７．８）、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．２３ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、２．９ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭＧＴＰ（和光純薬社製）、１５ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、０．９Ｕ／μl Rnase inhibiter（TAKARA社製）、５０ｎｇ／μl tRNA（Moniter, R.,et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1-(1960)）、０．４６μｇ／l クレアチンキナーゼ（Roche社製））２５μlを作製した。この反応液に実施例１で作製した翻訳鋳型ｍＲＮＡ（ＧＦＰ−ＦＴ、ＧＦＰ-ＥＢＮＡ１、ＧＦＰ（コントロール用））を８μｇ／μl加え、２６℃でインキュベートした。反応開始後、４８時間までの反応液各１μlをプローブとした（未精製の合成液）。 Example 2
Translation of fusion protein (GFP-FT, GFP-EBNA1) A reaction solution for protein synthesis containing 5.8 μl of a prepared wheat germ extract-containing solution (each at a final concentration of 29 mM HEPES-KOH (pH 7.8), 95 mM potassium acetate) 2.7 mM magnesium acetate, 0.4 mM spermidine (manufactured by Nacalai Tectonics), 20 types of 0.23 mM L-type amino acids, 2.9 mM dithiothreitol, 1.2 mM ATP (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.25 mM GTP (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 15 mM creatine phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.9 U / μl Rnase inhibiter (manufactured by TAKARA), 50 ng / μl tRNA (Moniter, R., et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1- (1960)), 0.46 μg / l creatine kinase (Roche)) 25 μl was prepared. 8 μg / μl of the translation template mRNA (GFP-FT, GFP-EBNA1, GFP (for control)) prepared in Example 1 was added to this reaction solution and incubated at 26 ° C. After starting the reaction, 1 μl of each reaction solution up to 48 hours was used as a probe (unpurified synthetic solution).

実験例１
シロイヌナズナの花成誘導因子（FT）とマウス抗FT抗血清との抗原抗体反応の検出
実験材料は、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で作製したFTを精製後、マウスに免疫してえられた抗血清、実施例２で作製したGFP（Green Fluorescent Protein）融合FT（GFP-FT）を含む合成液、0.1% PBST（0.1% Tween20, 137mM NaCl, 8.1mM Na₂HPO₄, 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄）を希釈液とした。測定方法は、蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）と蛍光強度分散分析法（FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis）を使った。
１）FCS測定による抗原抗体反応の検出（FTとマウス抗FT血清）
コムギ無細胞系で合成した未精製GFP-FTを含む合成液を0.1%PBSTで35-40マイクロリットルになるように希釈し、マウス抗FT血清と反応させた後FCS測定すると、GFP単独では並進拡散時間（Diffusion time）に変化はないが、GFP-FTでは抗血清の添加量に依存して並進拡散時間が上昇した。（図１）
２）FIDA測定による抗原抗体反応の検出（FTとマウス抗FT血清）
コムギ無細胞系で合成した未精製GFP-FTを含む合成液を0.1%PBSTで35-40マイクロリットルになるように希釈し、マウス抗FT血清と反応させた後FIDA測定すると、GFP-FTでは抗血清の添加量に依存して蛍光強度（Countrate / particle）が上昇し、更に蛍光粒子数（Particle numbers）が減少した。一方GFP単独では蛍光強度、蛍光粒子数はともに変化しなかった。（図２） Experimental example 1
Detection of antigen-antibody reaction between Arabidopsis flower induction factor (FT) and mouse anti-FT antiserum The experimental material was obtained by purifying FT prepared by wheat germ cell-free protein synthesis system and then immunizing mice. Serum, synthetic solution containing GFP (Green Fluorescent Protein) fusion FT (GFP-FT) prepared in Example 2, 0.1% PBST (0.1% Tween20, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 2.68 mM KCl, 1.47 mM) KH ₂ PO ₄ ) was used as a diluent. The measurement method used was fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and fluorescence intensity distribution analysis (FIDA).
1) Detection of antigen-antibody reaction by FCS measurement (FT and mouse anti-FT serum)
A synthetic solution containing unpurified GFP-FT synthesized in a cell-free system of wheat was diluted to 35-40 microliters with 0.1% PBST, reacted with mouse anti-FT serum, and FCS measurement. Diffusion time did not change, but GFP-FT increased translational diffusion time depending on the amount of antiserum added. (Figure 1)
2) Detection of antigen-antibody reaction by FIDA measurement (FT and mouse anti-FT serum)
A synthetic solution containing unpurified GFP-FT synthesized in a cell-free system of wheat was diluted with 0.1% PBST to 35-40 microliters, reacted with mouse anti-FT serum, and then measured for FIDA. Depending on the amount of antiserum added, the fluorescence intensity (Countrate / particle) increased and the number of fluorescent particles (Particle numbers) decreased. On the other hand, neither fluorescence intensity nor the number of fluorescent particles changed with GFP alone. (Figure 2)

この結果より、コムギ無細胞タンパク質合成系で調製した、GFPを融合させたタンパク質を指標に、精製ステップを経ることなく溶液中でマウス血清中物質との反応をFCS測定により検出することができた。これは従来の方法より，迅速，簡便かつ少量の溶液を用いてマウスやウサギのような抗体産生動物等の血清中で行われる抗原抗体反応を検出できることが示された。このことは、一般家畜動物等の血清中の抗原および抗体にも応用可能であることも示された。本方法の要素技術は、一般家畜動物のワクチンや診断薬等の創薬開発に向けた、ハイスループットな抗原・抗体スクリーニングに利用できるものである。 From this result, it was possible to detect the reaction with substances in mouse serum by FCS measurement in solution without using the purification step, using the protein fused with GFP prepared in the wheat cell-free protein synthesis system as an index. . This indicates that the antigen-antibody reaction performed in the serum of antibody-producing animals such as mice and rabbits can be detected more quickly, conveniently and using a small amount of solution than conventional methods. This has also been shown to be applicable to antigens and antibodies in the serum of general livestock animals. The elemental technology of this method can be used for high-throughput antigen / antibody screening for the development of drug discovery such as vaccines and diagnostic agents for general livestock animals.

実験例２
Epstein-Barr virus（EBV）特異的核内抗原 EBNA1とヒト血清中の抗EBNA1抗体との抗原抗体反応の検出
実験材料は、ヒト血清（コスモ・バイオ株式会社、Human serum pool、 KOJ 12181201）、実施例２で作製したGFP融合EBNA1（GFP-EBNA1）を含む合成液、希釈液に0.1% PBST（0.1% Tween20, 137mM NaCl, 8.1mM Na₂HPO₄, 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄）を使った。
測定方法は、蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）を使った。
１）FCS測定による抗原抗体反応の検出（EBNA1とヒト血清）
コムギ無細胞系で合成した未精製GFP-EBNA1を含む合成液を0.1%PBSTで35-40マイクロリットルになるように希釈し、ヒト血清と反応させた後FCS測定すると、GFP単独では並進拡散時間（Diffusion time）に変化はないが、GFP-EBNA1ではヒト血清の添加量に依存して並進拡散時間が上昇した。更に、GFPで蛍光標識されていないEBNA1も添加して競合実験を行うと、GFP-EBNA1ではその添加量に依存して並進拡散時間が減少した。このような変化はGFP単独では見られなかった。（図３） Experimental example 2
Detection of antigen-antibody reaction between Epstein-Barr virus (EBV) -specific nuclear antigen EBNA1 and anti-EBNA1 antibody in human serum Experimental material is human serum (Cosmo Bio Inc., Human serum pool, KOJ 12181201) 0.1% PBST (0.1% Tween20, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH ₂ PO ₄ ) in the synthetic solution and diluted solution containing GFP-fused EBNA1 (GFP-EBNA1) prepared in Example 2 Was used.
The measurement method used was fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
1) Detection of antigen-antibody reaction by FCS measurement (EBNA1 and human serum)
A synthetic solution containing unpurified GFP-EBNA1 synthesized in a cell-free system of wheat was diluted with 0.1% PBST to 35-40 microliters, reacted with human serum, and measured by FCS. Although there was no change in (Diffusion time), the translational diffusion time increased with GFP-EBNA1 depending on the amount of human serum added. Furthermore, when EBNA1 that was not fluorescently labeled with GFP was also added and a competitive experiment was performed, the translational diffusion time decreased for GFP-EBNA1 depending on the amount added. Such changes were not seen with GFP alone. (Figure 3)

この結果により、コムギ無細胞タンパク質合成系で調製した、GFPを融合させたタンパク質を指標に、精製ステップを経ることなく溶液中でヒト血清中物質との反応をFCS測定により検出することができた。これは従来の方法より，迅速，簡便かつ少量の溶液を用いてヒト血清中で行われる抗原抗体反応を検出できることが示された。このことは、ヒト血清中の抗原および抗体にも応用可能であり、競合実験等を行うことで抗原抗体反応が特異的であるかどうかを簡便に調べることができることも示された。本方法の要素技術は、ヒトのワクチンや診断薬等の創薬開発に向けた、ハイスループットな抗原・抗体スクリーニングに利用できるものと思われる。 Based on this result, using GFP-fused protein prepared in a wheat cell-free protein synthesis system as an index, we were able to detect reaction with substances in human serum by FCS measurement without going through a purification step. . This indicates that the antigen-antibody reaction performed in human serum can be detected more quickly, conveniently and using a small amount of solution than the conventional method. This was also applicable to antigens and antibodies in human serum, and it was shown that whether or not an antigen-antibody reaction is specific can be easily examined by conducting a competition experiment or the like. The elemental technology of this method is expected to be applicable to high-throughput antigen / antibody screening for drug discovery development such as human vaccines and diagnostic agents.

FCS測定による抗原抗体反応の検出（FTとマウス抗FT血清）Detection of antigen-antibody reaction by FCS measurement (FT and mouse anti-FT serum) FIDA測定による抗原抗体反応の検出（FTとマウス抗FT血清）Detection of antigen-antibody reaction by FIDA measurement (FT and mouse anti-FT serum) FCS測定による抗原抗体反応の検出（EBNA1とヒト血清）Detection of antigen-antibody reaction by FCS measurement (EBNA1 and human serum)

Claims

An antibody detection method comprising preparing a fusion protein of a fluorescence-labeled protein and a specific protein by a cell-free protein synthesis means, contacting a test sample with a synthetic solution containing the fusion protein as a probe, and detecting an antibody in the test sample .

The method of claim 1, wherein the fusion protein is contacted with the test sample without purification.

The method according to claim 1 or 2, wherein the fusion protein is prepared by means of cell-free protein synthesis using a wheat germ extract.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the wheat germ extract is a wheat germ extract from which the endosperm components and the low molecular protein synthesis inhibitor to be mixed are substantially removed.

The method according to claim 4, wherein a sugar phosphorylation system is controlled from wheat germ extract via ATP selected from any one of the following.
1) removal of monosaccharides,
2) removal of phosphorylated sugar,
3) control of the production of monosaccharides from polysaccharides,
4) Control of production of phosphorylated saccharide from monosaccharides.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the specific protein is an antigenic substance.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the specific protein is a phosphorylated protein.

The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the detection method is selected from any one of the following.
1) Fluorescence correlation analysis method, 2) Fluorescence intensity distribution analysis method

The method according to claim 6, wherein the antigenic substance is hepatitis virus.

The method according to claim 6, wherein the antigenic substance is a plant flowering inducer.

The method according to claim 6, wherein the antigenic substance is Epstein-Barr virus (EBV).

The method according to claim 7, wherein the phosphorylated protein is protein kinase.

The detection kit used for the method as described in any one of Claims 1-12.

A detection reagent or reagent kit comprising the fusion protein obtained by the method according to any one of claims 1 to 12.

A screening method for a specific protein prepared by a cell-free protein synthesis means comprising the following steps.
1) Step of preparing a candidate specific protein that is a selected region of a desired candidate gene and a gene encoding a fluorescently labeled protein (protein encoding a fusion protein) 2) Step of synthesizing mRNA from the gene prepared in 1) 3) A step of translating the mRNA synthesized in 2) by a cell-free protein synthesis means using a translation template as a translation template 4) A step of detecting an antibody reaction by contacting the test sample without purifying the fusion protein synthesized in 3)