JP2005501217A - Screening based on high throughput screening or capillary biological activity or biological molecules - Google Patents

Screening based on high throughput screening or capillary biological activity or biological molecules Download PDF

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    • C12Q1/6834Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Abstract

生体の混合集団に由来するポリヌクレオチドを含有する試料を、スクリーニングまたは濃縮する方法が提供される。 Samples containing polynucleotides derived from a mixed population of biological, screening or method of concentrating is provided. 本方法は、プローブまたは生体活性基質について検出可能な分子を検出する解析装置の上で、生体の混合集団の複数の核酸配列からDNAライブラリーを作製し、かつ対象となるポリヌクレオチド配列を含むクローンを分離することを含む。 The method on the analyzer for detecting the detectable molecule for the probe or bioactive substrate, clone comprising a polynucleotide sequence from a plurality of nucleic acid sequences of the mixed population of biological prepare a DNA library, and the target the comprises separating. この解析装置は、FACS装置、SQUID装置およびMSC装置を含む。 The analyzer includes a FACS device, SQUID device and MSC device. 次に、分離または濃縮されたライブラリーは、更に、活性に基づくスクリーニングまたは配列に基づくスクリーニングにより処理される。 Then, separated or enriched libraries is further processed by a screening based on screening or sequence based on activity. 加えて濃縮された配列は、データベースと比較し、かつライブラリー内のクローンと相同性を有するデータベース内の配列を確定し、これにより生体の混合集団内の核酸プロフィールを得ることができる。 In addition sequences have been concentrated is compared to the database, and to confirm the sequence in the database with Crohn homology in the library, thereby obtaining a nucleic acid profiles within a mixed population of the organism.

Description

【0001】 [0001]
発明の技術分野本発明は、一般に生物および核酸の混合集団のスクリーニング、より詳細に述べると試料のスクリーニングのためのハイスループットスクリーニングおよびキャピラリーアレイプラットフォームを含む、スクリーニング技術を用いる生体活性分子および生体活性の同定に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention generally screening of mixed population of organisms and nucleic acids, More particularly including high throughput screening and capillary array platform for sample screening, bioactive molecules and biological activity using screening techniques identification on.
【0002】 [0002]
背景化学産業において光学的に純粋な物質の実践的合成のための効果的触媒がかなり必要とされており;酵素は、最適溶液を提供することができる。 Are quite necessary effective catalysts for practical synthesis of optically pure material in background chemical industry; enzyme can provide an optimal solution. 確立されたおよび新興の両方の化学、医薬、織物、食品および飼料、洗剤の市場において利用されるような分子および化合物のあらゆる種類が、厳密な経済基準よび環境基準に合致しなければならない。 Established and both Shinko Chemical, pharmaceutical, textile, food and feed, all types of molecules and compounds as utilized in the detergent market, must meet stringent economic criteria and environmental standards. 高分子、医薬品、天然産物および農薬の合成は、有害な副産物を生成しかつ低いエナンチオ選択性から損なわれるような高価な方法により妨げられることが多い(Faber, 1995;TonkovichおよびGerber、米国エネルギー省の研究、1995年)。 Polymer, pharmaceuticals, synthetic natural products and agrochemicals are often hindered by costly methods such as impaired from generating and low enantioselectivity harmful byproducts (Faber, 1995; Tonkovich and Gerber, U.S. Department of Energy study of, 1995). 酵素は、触媒においてこれらの問題点を克服することができる多くの注目すべき利点を有しており;これらは単独の官能基に作用し、単独の分子上の同様の官能基を識別でき、かつエナンチオマーを識別する。 Enzyme catalyst has many remarkable advantages that can overcome these problems in, they act on the functional group alone, can identify like functional groups on a single molecule, and to identify the enantiomer. 更に、これらは、生分解性でありかつ反応混合物中非常に低いモル分率で機能する。 Moreover, they function in biodegradable and is and the reaction mixture very low mole fraction. それらのケモ特異性、レジオ特異性およびステレオ特異性のために、酵素は、望ましい選択的変換を最適に達成するために独自の機会で存在する。 Their Chemo specificity, for regio specificity and stereo-specific enzymes are present in their own opportunity to optimally achieve the desired selective transformations. これらは特に単工程反応において、化学的に再現することが極めて困難であることが多い。 These in particular single-step reaction, it is often very difficult to chemically reproduced. 保護基に必要な脱離、選択性、単独の反応容器において多工程変換を実行する能力は、環境的負担となる付随物の減少と共に、化学および製薬産業における酵素に関する要求の増大につながっている(Faber、1995)。 Desorption required for protecting groups, selectivity, the ability to perform multi-step conversion in the reaction vessel alone, with decreasing accompaniment to be environmental burden, has led to increasing demand for the enzymes in the chemical and pharmaceutical industry (Faber, 1995). 酵素に基づく過程が、次第に多くの従来の化学に基づく方法に代わりつつある(Wrotnowski、1997)。 Process based on enzymes, is being replaced increasingly many ways based on the conventional chemical (Wrotnowski, 1997). より広範な産業用途に関する現在の制約は、第一に市販されている酵素が比較的少数であることに起因している。 Current constraints on broader industrial applications, are due to enzymes that are commercially available in the first are relatively few. 現在、これまでに説明された3000種を上回る非DNA修飾酵素活性から、わずかに〜300種の酵素(DNA修飾酵素を除く)が市販されている。 Currently, a non-DNA-modifying enzyme activity in excess of 3000 species have been described so far, slightly to 300 enzymes (excluding DNA modifying enzymes) are commercially available.
【0003】 [0003]
技術的な用途のための酵素の使用も、産業条件の要求下の性能を必要としている。 Use of enzymes for technical applications also in need of performance requirements under industrial conditions. これは、環境における活性、または現在公知の酵素の兵器庫(arsenal)が進化的には選択されていないような基質に対する活性を含む。 This includes activity against substrates like activity in the environment or the current arsenal of known enzymes, (arsenal) is not selected in evolutionary. 酵素は、穏やかな温度、pHおよび塩濃度の条件下で、生存している生体の境遇内で非常に特異的な生物学的機能を発揮するための選択圧により進化される。 Enzymes, moderate temperature, under conditions of pH and salt concentration, is evolved by selective pressure to exert a very specific biological functions within circumstances biological alive. ほとんどの場合について、これまで説明されたような(Enzyme Nomenclature、1992)非DNA修飾酵素活性は、中等温度好性の(mesophilic)生体から単離されているが、これは利用可能な系統発生学的多様性の非常に小さい部分でしかない(Amannら、1995)。 For most cases, so far as described (Enzyme Nomenclature, 1992) non-DNA modifying enzyme activity, have been isolated from mesophilic the (mesophilic) biological, which phylogenetically available only a very small part of the diversity (Amann et al., 1995). 生体触媒の動的領域は、極端な環境において成長する微生物から単離された酵素の助けにより、新たな様相を獲得している。 Dynamic region of the biocatalyst, with the help from a microorganism growing the isolated enzyme in extreme environments, have won a new appearance. このような酵素は、陸上の温泉および深海の熱火道(thermal vent)内の約100℃を超える温度で、極地水中0℃以下の温度で、死海の飽和塩環境で、石炭埋蔵物および地熱の硫黄分の多い温泉中pH値約0で、もしくは下水汚泥中pH値11以上で機能しなければならない(AdamsおよびKelly、1995)。 Such enzymes at temperatures above about 100 ° C. in terrestrial hot springs and deep sea thermal conduit (thermal vent), in polar water 0 ℃ temperatures below with Dead Sea saturated salt environment of the coal reserves thereof and geothermal hot spring in pH value from about 0 high sulfur content, or must function in sewage sludge pH value of 11 or more (Adams and Kelly, 1995). これらの酵素は更に以下から入手され得る:地熱および熱水の地域、酸性土壌、スルホタラ(sulfotara)および沸騰している地獄(mud pot)、プール、酵素が中性からアルカリ性である温泉および間欠泉、海生放線菌、後生動物、共生体及び細胞外共生体(ectosymbiont)、熱帯土壌、温帯土壌、乾燥地帯土壌、堆肥積み、糞尿溜め、海中堆積物、淡水堆積物、水中濃縮物、高塩及び超冷海氷、極地ツンドラ、サルガッソー海、オープンオーシャン遠洋(open ocean pelagic)、海雪、微生物マット(ホエールフォールズ(whale falls)、温泉、及び熱水噴出口など)、昆虫及び線虫の腸管細菌叢、内生植物、着生植物の水中試料、工業地及び現場以外の濃厚物。 These enzymes may be obtained further from the following: geothermal and hot water areas, acidic soils, Suruhotara (sulfotara) and boiling is hell (mud pot), hot spring and geyser pool, the enzyme is a neutral to alkaline, marine actinomycetes, metazoan, symbiont and extracellular symbiont (ectosymbiont), tropical soil, temperate soil, arid soil, compost pile, reservoir manure, sea sediments, freshwater sediments, water concentrates, high salt and Chohiyaumikori, Polar tundra, the Sargasso sea, open ocean pelagic (open ocean pelagic), Umiyuki, microbial mat (Whale Falls (whale falls), hot springs, and such as hydrothermal vents), insects and nematodes of intestinal bacteria flora, endogenous plant, water samples of epiphytic plants, industrial areas and concentrate off-site. 加えて、原核生物、真核生物、ミクソ細菌(epothilone)、空気、水、堆積物、土壌又は岩から、酵素を単離することができる。 In addition, prokaryotes, eukaryotes, Mikuso bacteria (epothilone), air, water, sediment, soil or rock, it is possible to isolate the enzyme. これらの好極限性生物から入手された酵素は、生体触媒の新たな分野を開くものである。 Enzymes were obtained from these extremophilic organisms, in which opens a new field of biocatalysis.
【0004】 [0004]
例えば好極限性生物からクローニングされかつ発現されたいくつかのエステラーゼおよびリパーゼは、驚くほど強健であり、広範な温度およびpHを通じて高い活性を示す。 For example, some esterases and lipases from extremophiles organisms are cloned and expressed is surprisingly robust, showing a high activity through a wide temperature and pH. いくつかのこれらのエステラーゼの指紋は、多様な基質スペクトルに加え、至適反応温度における差異を示す。 Some fingerprints of these esterases, in addition to a variety of substrate spectrum, showing the difference in optimum reaction temperature. ある種のエステラーゼは、短鎖の基質のみを認識するが、他のものは、長鎖基質にのみ作用することに加え、至適反応温度での巨大な差異がある。 Certain esterases recognizes only short chain substrates, others, in addition to acting only on the long-chain substrate, there is a huge difference in optimum reaction temperature. これらの結果は、新たな生体触媒の必要性を満たしているより多様な酵素を、生体多様性のスクリーニングにより認めることができることを示唆している。 These results suggest that a variety of enzymes than meets the need for new biocatalyst can be observed by the screening of biological diversity. 酵素が作用する基質は、本明細書においては生体活性基質として定義されている。 Substrate enzyme acts is herein defined as a biological active substance.
【0005】 [0005]
更に、これまで公知の酵素は実質的に全てが、培養した生物、大部分は細菌およびより最近になっては古細菌からのものである(Enzyme Nomenclature、1992)。 Furthermore, the known enzymatic substantially all far cultured organism, the majority is recently than bacteria and are from archaea (Enzyme Nomenclature, 1992). 従来の酵素発見プログラムは、培養した微生物のスクリーニングプログラムにのみ頼っており、従って天然の多様性の小さな部分を評価するのみである。 Conventional enzyme discovery program relies only on screening programs cultured microorganism, thus only evaluates a small portion of natural diversity. いくつかの最近の研究は、天然の環境に存在する生物の低い割合、控えめに言って1%未満のみが培養されていると推定している(表I参照、Amannら、1995、Barnsら、1994、Torvsik、1990)。 Several recent studies, a low percentage of organisms present in the natural environment, only less than 1% to say the least is estimated to be cultured (see Table I, Amann et al., 1995, Barns et al, 1994, Torvsik, 1990). 例えば、Norman Paceの研究室は、最近、1960年代初期から微生物学者により研究されている温泉である、イエローストーン国立公園の「オブシディアンプール(Obsidian Pool)」の水試料および堆積物試料中の強烈な未利用の多様性を報告した(Barns、1994)。 For example, laboratory of Norman Pace is, recently, a hot spring that has been studied by microbiologists from the early 1960s, intense of water samples and sediments in a sample of the "Obsidian Pool (Obsidian Pool)" of Yellowstone National Park It reported the diversity of unused (Barns, 1994). 16S rRNAコード配列の増幅およびクローニングは、それまでにこのプールから培養されている生物の提示をほとんどまたは全く伴わない、大部分が独自の配列を明らかにした。 Amplification and cloning of 16S rRNA encoding sequences, without little or no presentation of organisms that have been cultured from this pool so far, mostly revealed a unique sequence. このことは、産業的過程において有用であり得るそれまで不明の形態学的、生理学的および生化学的特徴を伴う古細菌の実質的多様性を示唆している。 This is so far unknown morphological, which may be useful in industrial processes, suggesting substantial diversity of archaea with physiological and biochemical characteristics. デービッドワード(David Ward)の研究室(Bozmen, モンタナ州)は、イエローストン国立公園のオクトパススプリング(Octopus Spring)のシアノバクテリア集落(mat)に関する同様の研究を行い、かつ同じ結論、すなわち、甚だしい未培養の多様性が存在するという結論に達した(Batesonら、1989)。 David word (David Ward) laboratory (Bozmen, Montana) performs the same research on Yellowstone National Park Octopus spring (Octopus Spring) of cyanobacteria village (mat), and the same conclusion, that is, extreme Not came to the conclusion that there is a diversity of culture (Bateson et al., 1989). ジオバンノーニ(Giovannoni)ら(1990)は、サルガッソー海において収集した細菌プランクトン(bacterioplankton)を用いて同様の結果を報告し、他方トルスビック(Torsvik)ら(1990)は、DNA再結合キネティックにより、土壌試料にかなりの多様性が存在することを示した。 Jioban'noni (Giovannoni) et al. (1990), reported similar results using bacterioplankton collected in the Sargasso Sea (Bacterioplankton), other Torusubikku (Torsvik) et al. (1990), by DNA recombination kinetics, the soil sample It showed that there is considerable diversity. 従って、この微生物の大部分は、新規生体触媒の発見のための未利用の給源を説明している。 Thus, most of the microorganisms describes a source of unutilized for the discovery of new biocatalysts. この可能性のある触媒の多様性に接近するために、組換えスクリーニング法が必要とされる。 To approach the diversity of the potential catalysts, recombinant screening methods are needed.
【0006】 [0006]
酵素以外の新規生体活性分子の発見も、本発明により提供される。 Discovery of novel bioactive molecules other than enzymes are also provided by the present invention. 例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、および調節タンパク質は、本発明を用いて発見することができる。 For example, antibiotics, antivirals, antitumor agents, and regulatory proteins can be found using the present invention.
【0007】 [0007]
細菌および多くの真核生物が、その産物が関連した過程に参加させられるような調節遺伝子の協調機構を有する。 Bacteria and many eukaryotes have a coordinated mechanism for regulating genes such as the product is allowed to participate in the processes associated. これらの遺伝子は、単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称される構造にクラスター化され、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む、単独の調節配列の制御下で共に転写される。 These genes are clustered in a structure called "gene cluster" on a single chromosome, and containing a single promoter which initiates transcription of the entire cluster, it is transferred together under the control of a single regulatory sequence . この遺伝子クラスター、プロモーター、および調節全体に機能する追加配列は「オペロン」と称され、かつ最大30個以上の遺伝子、通常2 〜6個の遺伝子を含むことができる。 The gene cluster, the promoter, and additional sequences that function in the overall regulation is referred to as the "operon" and can include up to 30 or more genes, usually from 2 to 6 genes. 従って遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して、同じまたは関連の、いずれかの隣接遺伝子の群である。 Thus gene cluster, for normal their functions, the same or related, a group of any of the neighboring genes.
【0008】 [0008]
一部の遺伝子ファミリーは、1個以上の同一メンバーからなる。 Part of the gene family consists of one or more of the same members. クラスター化された遺伝子は、必ずしも同じではないが、クラスター化は、遺伝子間の同一性を維持するための前提条件である。 Clustered genes are not necessarily identical, clustering is a prerequisite for maintaining identity between genes. 遺伝子クラスターは、隣接関連遺伝子の重複が作製される極端な状況から、数百個の同一遺伝子が直列アレイ内にあるような場合までの範囲にわたる。 Gene cluster from extreme situations of overlap of adjacent related genes are prepared, ranging up when hundreds of identical genes, such as in the serial array. 場合によっては、特定の遺伝子反復の認識可能性(discernable)が意味がないことがある。 In some cases, it may recognize the possibility of a particular gene repeat (discernable) are meaningless. このことの第一の例は、いくつかの種においては発現された重複インスリン遺伝子であるのに対し、他の哺乳類種においては単独のインスリン遺伝子が相当する。 The first example of that, in some species while a duplicate insulin genes expressed in other mammalian species corresponding the single insulin gene.
【0009】 [0009]
遺伝子クラスター、およびそれから生じるタンパク質の発現に必要なクラスターの完全長の程度を更に研究することは、重要である。 To further study the extent of full-length clusters necessary for gene cluster, and the expression of the protein resulting therefrom is important. 継続的な再構成を受けている遺伝子クラスターおよび、その結果の例えば細菌または他の原核生物給源から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能力は、特に例えば有用な活性の膨大なアレイを有するポリケチドの合成に寄与するポリケチドシンターゼのような酵素を含む、新規タンパク質の給源を決定する上で価値がある。 Gene cluster undergoing continual reconstruction and its ability to produce a heterologous library of results, for example, bacteria or gene cluster from other prokaryotes sources are polyketides particularly with vast array of useful, for example, active including enzymes such as contributing polyketide synthase synthesis, worth in determining the source of new proteins. 指摘したように、例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、およびインスリンのような調節タンパク質を含む、遺伝子クラスターの産物(複数)である他の種類のタンパク質および分子も考案されている。 As indicated, for example, antibiotics, antivirals, antitumor agents, and regulatory proteins such as insulin, other types of proteins and molecules is a product of the gene cluster (s) have also been devised.
【0010】 [0010]
ポリケチドは、生体活性の極めて豊富な給源である分子であり、抗生物質(テトラサイクリンおよびエリスロマイシン)、抗癌剤(ダウノマイシン)、免疫抑制剤(FK506およびラパマイシン)、および獣医学製品(モネンシン)を含む。 Polyketides are quite abundant sources in a molecule of the bioactive, antibiotics (tetracycline and erythromycin), including anticancer agents (daunomycin), immunosuppressants (FK506 and rapamycin), and veterinary products (monensin). 多くのポリケチド(ポリケチドシンターゼにより生成)は、治療物質として価値がある。 Many polyketides (produced by polyketide synthases) are of value as therapeutic agents. ポリケチドシンターゼは、長さ並びに官能性および環化のパターンが異なる非常に多種の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。 Polyketide synthase is a multifunctional enzyme that has a length and functionality and cyclization patterns very catalyze the biosynthesis of various carbon chain different. ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに収まり、かつ少なくとも1種の(I型と称される)ポリケチドシンターゼは、大きいサイズの遺伝子およびコードされた酵素を有し、これらの遺伝子/タンパク質の遺伝子操作およびインビトロ試験を煩雑化している。 Polyketide synthase gene, fit into gene clusters and at least one (I type referred) polyketide synthase has been genetically and code of large size enzymes, genetic manipulation and in vitro of these genes / proteins It has complicated the test. 本発明の方法(複数)は、遺伝子発現ライブラリーにおけるこれらの遺伝子クラスターの迅速な発見を促進するものである。 The method of the present invention (s) is to facilitate rapid discovery of these gene clusters in gene expression library.
【0011】 [0011]
微生物の遺伝子ライブラリーは、薬物活性のある代謝産物および特別な化学物質を作出する生合成経路に関連した遺伝子を同定する目的で調製されている。 Gene library of the microorganism have been prepared for the purpose of identifying genes associated with the biosynthesis pathway for producing metabolites and special chemicals with drug activity. これらの経路は、複数のタンパク質(具体的には、酵素)を必要とし、薬物標的として使用される単独のタンパク質よりもより大きい複雑さを必然的に伴っている。 These pathways, (specifically, an enzyme) more protein require, are inevitably accompanied by greater complexity than single proteins used as drug targets. 例えば、細菌ポリケチドシンターゼ(PKS)の経路をコードしている遺伝子が、生物の遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより同定された(Malpartidaら、Nature、309:462(1984);Donadioら、Science、252:675〜679(1991))。 For example, a gene encoding the pathway of bacterial polyketide synthase (PKS) have been identified by screening for organisms of the gene libraries (Malpartida et al, Nature, 309: 462 (1984); Donadio et al., Science, 252: 675 ~679 (1991)). PKSは、重要な治療用化合物種であるポリケチドの生合成の複数の工程を触媒し、かつ生成されたポリケチドの構造的多様性を制御する。 PKS catalyzes several steps in the biosynthesis of polyketides is an important therapeutic class of compounds, and to control the structural diversity of the generated polyketides. クローン化されたPKS遺伝子の指定された突然変異誘発および発現を可能にする、ストレプトミセス(Streptomyces)内の宿主ベクター系が開発されている(McDanielら、Science、262:1546〜1550(1993);Kaoら、Science、65:509〜512(1994))。 Allowing the specified mutagenesis and expression of the cloned PKS genes, host vector systems in Streptomyces (Streptomyces) has been developed (McDaniel et al., Science, 262: 1546~1550 (1993); Kao et al., Science, 65: 509~512 (1994)). この特異的宿主ベクター系は、ポリケチドを作出するより効率的方法を開発し、かつ新規ポリケチドを合理的に開発するために使用されている(Khoslaら、国際公開公報第95/08548号)。 The specific host vector systems, to develop an efficient method than producing a polyketide, and novel polyketides have been used to rationally develop (Khosla et al., WO 95/08548).
【0012】 [0012]
別の例は、大腸菌(E. coli)宿主における発酵による繊維染料インディゴの生成である。 Another example is the generation of textile dyes indigo by fermentation in E. coli (E. coli) host. 多酵素生合成経路をコードしている遺伝子を含む2個のオペロンが、外来大腸菌宿主によるインディゴの産生を改善するように、遺伝的に操作されている(Ensleyら、Science、222:167〜169(1983);Murdockら、Bio/Technology、11:381〜386(1993))。 Two operon containing a gene encoding the multienzyme biosynthetic pathway, so as to improve the production of indigo by foreign E. coli host, has been genetically engineered (Ensley et al., Science, 222: 167-169 (1983); Murdock et al, Bio / Technology, 11: 381~386 (1993)). 全般的に、代謝経路をコードしている遺伝子の異種発現の通常の試験は、先に特徴付けられた代謝経路に関連していることが公知のタンパク質をコードしている特異的遺伝子の指定されたクローニング、配列解析、デザインされた突然変異誘発、および転位に関連している。 Overall, routine testing of heterologous expression of the gene encoding the metabolic pathway are designated specific genes that are associated with metabolic pathways previously characterized encodes a known protein cloning, sequence analysis, design mutagenesis, and is associated with dislocation.
【0013】 [0013]
疾患の機序および薬物標的の同定を理解する上での多くの利点を考慮し、リード化合物の迅速な同定およびそれらの臨床試験に向けたチャネリング(channering)のための革新的戦略および方法の必要性が増大しつつある。 In view of the many advantages in understanding the mechanisms and identification of drug targets for diseases, the need for innovative strategies and methods for the rapid identification and channeling towards clinical trials of these lead compounds (channering) sex is increasing. 本発明の方法は、遺伝子、遺伝子経路および遺伝子クラスターの発見、特に遺伝子発現ライブラリーからのポリケチドシンターゼ遺伝子、ポリケチドシンターゼ遺伝子経路およびポリケチドの迅速な発見を促進する。 The method of the present invention facilitate gene, gene discovery pathways and gene clusters, in particular polyketide synthase gene from gene expression libraries, rapid discovery of polyketide synthase gene pathway and polyketides.
【0014】 [0014]
特に興味深いのは、「内部」細胞シグナルへさえもシグナル伝達する、「外部」細胞の伝達を媒介するために、ホルモン、増殖因子および神経伝達物質のような様々な生体分子と相互作用する受容体として公知の細胞「スイッチ」である。 Of particular interest are also signaling even to the "internal" cell signaling, to mediate the transfer of the "external" cells, hormones, various biomolecules that interact with receptors, such as growth factors and neurotransmitters is a well-known cell "switch" as. 外部シグナル伝達事象は、リガンドの受容体への結合を含み、かつ内部事象は、細胞の増殖、代謝またはアポトーシスに関連した細胞質または核における経路の変調を含む。 External signaling events include the binding of a ligand to a receptor, and internal events, cell proliferation, modulation of pathways in the cytoplasm or nucleus associated with metabolism or apoptosis. 内部事象は、更に、特定の核酸配列の転写の阻害または活性化を含み、特定の分子(核酸、タンパク質、および/または転写の増加または減少により左右される他の分子など)の産生または存在の増加または減少を生じる。 Internal events further includes the inhibition or activation of transcription of a particular nucleic acid sequence, a specific molecule (nucleic acid, protein, and / or such other molecules depends on the increase or decrease of transcription) production or the presence of increase or results in a decrease. 疾患を治癒またはその症状を緩和するための薬物は、これらの事象のいずれかを活性化または遮断し、所望の薬学的作用を実現することができる。 Drugs for alleviating cure or a symptom thereof a disease, either by activation or blocking of these events, it is possible to achieve the desired pharmacological action.
【0015】 [0015]
シグナル伝達は、特異的生体分子に結合する際に受容体が受けるアロステリック変化について活性化された細胞膜中の伝達タンパク質により達成することができる。 Signaling may be accomplished by transduction protein of the cell membrane in which the receptor has been activated for allosteric change experienced upon binding to specific biomolecules. この「活性(active)」伝達タンパク質は、細胞内のいわゆる「二次メッセンジャー」分子を活性化し、これは次に遺伝子発現を調節または一部の代謝過程を変更している細胞内のある種の調節タンパク質を活性化する。 The "active (active)" transfer protein, a so-called "second messenger" molecule intracellular activation, which in certain intracellular regulate or modify some metabolic processes then gene expression activating the regulatory protein. この事象の「カスケード」のテーマの変種も生じる。 Also arise theme of variants of the "cascade" of this event. 例えば、受容体は、それ自身伝達タンパク質として作用することができるか、もしくは伝達タンパク質は、二次メッセンジャーによる媒介を伴うことなく直接細胞内標的に作用することができる。 For example, receptors, or can act as its own transfer protein, or transfer protein can act directly on an intracellular target without mediation by second messenger.
【0016】 [0016]
シグナル伝達は、生物学における調査の基本的領域である。 Signaling is the fundamental region of research in biology. 例えば、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)により媒介されたリガンド/受容体相互作用および受容体/エフェクター結合は、疾患の研究において興味深いものである。 For example, ligand mediated by a guanine nucleotide binding protein (G protein) / receptor interactions and receptor / effector binding is interesting in the study of disease. 非常に多くのGタンパク質共役受容体が、Gタンパク質のセットを介して、少数の二次メッセンジャー系へと、ホルモン、増殖因子、神経伝達物質、一次感覚刺激、およびその他のシグナルのような多様な細胞外シグナルを送る。 So many G protein-coupled receptor, via a set of G protein, into a small number of second messenger systems, hormones, growth factors, neurotransmitters, primary sensory stimuli, and such diverse as other signals send an extracellular signal. Gタンパク質は、GTPaseサイクルにより取り仕切られた「オン」「オフ」状態の分子スイッチとして作用する。 G protein acts as "on", "off" state molecular switch of which Torishikira by GTPase cycle. Gタンパク質の変異は、発現の突然変異の構成的活性化または喪失のいずれかを生じることがある。 Mutation of the G protein may occur either constitutive activation or loss of mutation of expression.
【0017】 [0017]
多くの受容体が、少なくとも17種の別個の形で単離されているヘテロ三量体Gタンパク質を介してメッセージを運搬している。 Many receptors have been carrying messages via the heterotrimeric G proteins that have been isolated in at least 17 kinds of different forms. 加えて、いくつかの異なるGタンパク質依存型エフェクターが存在する。 In addition, several different G protein-dependent effectors exist. 哺乳類細胞においてヘテロ三量体Gタンパク質を介して伝達されたシグナルは、エフェクター分子の作用を通じて細胞内事象に影響を及ぼす。 Signal transmitted through the heterotrimeric G protein in mammalian cells, it affects the intracellular events through the action of an effector molecule.
【0018】 [0018]
様々な機能がGタンパク質結合シグナル伝達により促進されるならば、Gタンパク質結合経路の異常が、失明、ホルモン抵抗、早熟および新生組織形成のような類似していない症状発現を伴う疾患につながることは驚くべきことではない。 If various functions are facilitated by the G protein coupled signaling, abnormal G protein-coupled pathway, blindness, hormone, it can lead to diseases with dissimilar manifestations such as prematurity and neoplasia not surprising. Gタンパク質共役受容体は、薬物研究の労作にとって極めて重要である。 G protein-coupled receptors is critical to the exertion of the drug studies. 今日の処方薬の最大60%が、Gタンパク質共役受容体との何らかの相互作用により作用すると推定されている。 Up to 60% of today's prescription, it has been estimated to act by some interaction with the G protein-coupled receptors. しかしこれらの薬物は、古典的医薬化学を用い、作用の分子機序に関する知識を伴わずに開発された。 However, these drugs, using classical medicinal chemistry, was developed without knowledge of the molecular mechanisms of action. より効果的薬物の発見プログラムは、効果的療法を開発するための個々の受容体の標的化、並びに遺伝子配列および生物学的機能に関する情報の使用により展開される。 More discovery programs effective drugs, targeting individual receptors for developing effective therapies, as well as expanded by the use of information on gene sequences and biological functions. 本発明は、例えばGタンパク質の受容体との、またはリガンドの受容体との相互作用に影響するような分子の研究を可能にするものである。 The present invention allows for example the receptors for G-protein, or the study of molecules that affect the interaction of the receptor ligand.
【0019】 [0019]
いくつかのグループが、哺乳類Gタンパク質またはそれらのサブユニットを発現する細胞を、これらの分子と相互作用する哺乳類受容体と共に報告している。 Several groups have cells that express a mammalian G protein, or their subunits, it is reported together with the mammalian receptors that interact with these molecules. 例えば国際公開公報第92/05244号(1992年4月2日)は、酵母Gタンパク質□サブユニットを産生することは不可能であるが、哺乳類Gタンパク質□サブユニットおよび該サブユニットと相互作用する哺乳類受容体の両方を産生するように遺伝子操作された、形質転換された酵母細胞を開示している。 For example WO 92/05244 (April 2, 1992), although it is not possible to produce yeast G protein □ subunit, interact with mammalian G protein □ subunits and the subunits genetically engineered to produce both a mammalian receptors, discloses yeast cells that have been transformed. この発明者らは、単離された膜の様々な公知の受容体アゴニストおよびアンタゴニストと適切に相互作用する能力を研究し、特異的哺乳類受容体の変更された変異が細胞膜へ組込まれることを発見した。 The inventors have discovered that by studying the ability to properly interact with a variety of known receptor agonists and antagonists of isolated membranes, the specific mammalian receptor changed mutations are incorporated into the cell membrane did. リガンド結合は、Gタンパク質媒介型シグナル伝達をもたらした。 Ligand binding resulted in G protein-mediated signal transduction.
【0020】 [0020]
別のグループは、酵母における哺乳類アデニル酸シクラーゼの機能的発現、および可能性のある哺乳類アデニル酸シクラーゼのインヒビターまたはアクチベーターの同定における遺伝子操作した酵母細胞の使用を開示した(国際公開公報第95/30012号)。 Another group, the functional expression of mammalian adenylate cyclase in yeast, and possible to disclose the use of genetically engineered yeast cells in the identification of inhibitors or activators of mammalian adenylate cyclase (International Publication No. 95 / No. 30012). アデニル酸シクラーゼは、活性化されたGタンパク質に反応して哺乳類細胞において機能するエフェクター分子の中でも最も良く研究されたものである。 Adenylate cyclase are those that are best studied among effector molecule in response to the G protein activated functional in mammalian cells. アデニル酸シクラーゼの「アクチベーター」は、酵素をより活性化し、酵母細胞のcAMPシグナルを検出可能な程度に上昇する。 "Activators" of the adenylate cyclase enzyme more activating rises to a detectable degree of cAMP signaling yeast cells. 「インヒビター」は、このシクラーゼの活性を低下し、cAMPシグナルを検出可能な程度に低下にする。 "Inhibitor", decreases the activity of the cyclase, is to drop to a detectable degree of cAMP signaling. この方法は、Gタンパク質共役受容体に対する作用により、アデニル酸シクラーゼを活性化または阻害するような薬物のスクリーニングのための、遺伝子操作した酵母細胞の使用を説明している。 This method, by action on G protein-coupled receptor, for screening of drugs that activate or inhibit adenylate cyclase, describes the use of yeast cells genetically engineered.
【0021】 [0021]
核酸ライブラリーの複雑な混合集団から対象となる生体活性をコードしている遺伝子を同定することを試みた場合、発見の律速段階は、DNAのクローニングレベルおよびスクリーニングレベルの両方である。 When trying to identify genes from complex mixed population of nucleic acid libraries encoding a biological activity of interest, the rate-limiting step of the discovery is both cloning levels and screening levels of DNA. 例えば異なる生物を数百種含むような複雑な混合集団のスクリーニングは、このゲノムの多様性をカバーする数百万個のクローンの分析を必要としている。 For example screening of complex mixed population such as those containing several hundred different organisms, it requires analysis of millions of clones covering the diversity of the genome. これらのライブラリーに存在する膨大な数のクローンを取扱うために、極端なハイスループットスクリーニング法が開発されている。 To handle a large number of clones present in these libraries, extreme high throughput screening methods have been developed.
【0022】 [0022]
従来のフローサイトメトリーにおいて、短期間での非常に多数の真核細胞の分析は一般的である。 In conventional flow cytometry analysis of a large number of eukaryotic cells in a short period of time it is common. 新規に開発されたフローサイトメーターは、1秒間に最大20,000個の細胞を分析および選別することができる。 Newly developed flow cytometers can analyze and sort up to 20,000 cells per second. 典型的フローサイトメーターにおいて、個々の粒子は照明帯(illumination zone)および適当な検出器を通過し、電気的にゲート制御され、光散乱の程度を示すパルスの大きさを測定する。 In a typical flow cytometer, individual particles pass through an illumination zone (Illumination zone) and a suitable detector is electrically gated, measures the magnitude of the pulses indicating the degree of light scattering. これらのパルスの大きさは、電気的に「ビン(bin)」または「チャネル」へと選別され、このチャネル数に対してある定量的特性を有する細胞の数のヒストグラムの表示を可能にする(DaveyおよびKell、1996)。 The size of these pulses, electrically sorted into "bins (bin)" or "channel", to allow the display of the number of the histogram of cells with a quantitative characteristic with respect to the channel number ( Davey and Kell, 1996). フローサイトメーター測定値から集められたデータは、通常蛍光細胞選別法として公知の方法である、個別の「バケット(bucket)」への望ましい特性の細胞の選別に電子式細胞選別法を用いるのに十分なほど迅速に(電気的に)分析することができることが早期に認められた(DaveyおよびKell、1996)。 The data collected from the flow cytometer measurements, a process known as ordinary fluorescent cell sorting, for use an electronic cell sorting to sort cells desirable properties to individual "bucket (bucket)" enough fast (electrical) that can be analyzed was observed earlier (Davey and Kell, 1996).
【0023】 [0023]
蛍光細胞選別法は、主にヒトおよび動物の細胞株並びに細胞培養法の制御において使用される。 Fluorescence cell sorting is used mainly in the control of human and animal cell lines and cell culture methods. 細胞の発蛍光団標識および蛍光の測定は、特異的標的分子または細胞下成分およびそれらの細胞集団における分布に関する定量的データを提供することができる。 Measurement of fluorophore labeling and fluorescence of the cells can provide quantitative data on the distribution of specific target molecules or subcellular components and their cell populations. フローサイトメトリーは、蛍光プローブ(または天然の蛍光)が存在する事実上あらゆる細胞に関連した特性または細胞小器官を定量することができる。 Flow cytometry can quantitate virtually properties or organelles associated with any cell fluorescent probe (or fluorescent natural) exists. 測定することができるパラメータは、これまでに動物細胞培養において特に関心が持たれている。 Parameters that can be measured, in particular interest are given in animal cell culture ever.
【0024】 [0024]
フローサイトメトリーは更に、存在する細胞クローンからの変種のクローニングおよび選択にも使用されている。 Flow cytometry is further also used for cloning and selection of variants from existing cell clones. しかしこの選択には、代謝工程または生理的過程に毒性作用またはその他の影響を伴わずに、細胞を受動的、迅速かつ不可逆的に拡散するような菌株が必要である。 However, in this selection, without toxic effects or other effects on metabolic processes or physiological processes, cell passive, it is required strain as diffuse rapidly and irreversibly. 典型的にはフロー選別法は、動物細胞培養の履行、細胞の生理的状態、および細胞周期の試験に使用されているので、細胞選別のひとつの目的は、選別時および選別後に細胞の生存を維持することである。 Typically flow sorting in the fulfillment of the animal cell culture, the physiological state of a cell, and because it is being used for testing the cell cycle, one of the purposes of cell sorting, cell survival after sorting time and sorting it is to maintain.
【0025】 [0025]
現在、単独の細胞の蛍光細胞選別法による大腸菌発現ライブラリーにおける組換え酵素のスクリーニングおよび発見について報告する文献はない。 Currently, there is no literature reports on the screening and discovery of the recombinant enzyme in E. coli expression library by fluorescence cell sorting of single cells. 更に、FACS装置を用い、大腸菌における発現スクリーニングによりスクリーニングされた生体活性をコードしているDNAを回収することは報告されていない。 Further, using FACS device, it has not been reported to recover the DNA encoding the screened bioactivity by expression in E. coli screening. 本発明は、これらの望ましい活性およびこれらの活性をコードしている核酸を回収するための生存または死滅した細胞の極めて迅速なスクリーニングを可能にする方法を提供する。 The present invention provides a method that enables very rapid screening of survival or dead cells for recovering a nucleic acid encoding these desired activity and these activities.
【0026】 [0026]
しかし微生物学の分野におけるフローサイトメトリーの様々な適用および蛍光活性化された微生物の選別を説明している限られた数の論文が公開されている(DaveyおよびKell、1996)。 However Flow cytometry various applications and fluorescence activated number of papers limited describing the selection of microorganisms over in the field of microbiology has been published (Davey and Kell, 1996). 微生物の識別および同定、並びに微生物細胞との薬物および抗生物質との相互作用の分析には、蛍光および他の染色形が使用されている。 Identification and identification of microorganisms, as well as the analysis of the interaction of drugs and antibiotics and microbial cells, fluorescence and other staining type is used. フローサイトメトリーは、水生生物学において使用されており、ここでは、光合成色素の自己蛍光が、藻類の同定に使用されており、もしくはDNA株を用いて、海生集団が定量および計数されている(DaveyおよびKell、1996)。 Flow cytometry is used in aquatic biology, where the autofluorescence of the photosynthetic pigment, have been used to identify algae, or by using a DNA strains, marine population has been quantified and counting (Davey and Kell, 1996). こうして、ディアパー(Diaper)およびエドワーズ(Edwards)は、フローサイトメトリーを使用し、フルオレセイン二酢酸(FDA)誘導体および浮遊液中の生存細菌を検出するための独占的に市販されている染料であるジェムクローム(GemChrome)Bを含む様々な発蛍光性(fluorogenic)エステルでの染色後に生存細菌を検出した(DiaperおよびEdwards、1994)。 Thus, Diapa (Diaper) and Edwards (Edwards) uses a flow cytometry, it is exclusively a dye that is commercially available for the detection of viable bacteria of fluorescein diacetate (FDA) derivatives and suspension in Gem chrome various fluorogenic containing (GemChrome) B (fluorogenic) was detected viable bacteria after staining with ester (Diaper and Edwards, 1994). 標識された抗体およびオリゴヌクレオチドプローブもこれらの目的に使用されている。 Also labeled antibodies and oligonucleotide probes are used for these purposes.
【0027】 [0027]
真核生物において天然または組換えの酵素活性を検出するためのフローサイトメトリーの使用を説明する論文も公開されている。 Paper describes the use of flow cytometry to detect the enzymatic activity of native or recombinant in eukaryotic also been published. ベッズ(Betz)らは、真核生物リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)による、天然(非組換え)リパーゼ産生を、フローサイトメトリーを用いて研究した。 Bezzu (Betz) et al., According to the eukaryotic Rhizopus Arizusu (Rhizopus arrhizus), natural (non-recombinant) lipase production was studied using flow cytometry. 彼らは、かびの胞子浮遊液が、励起光633nmで得られた光散乱データにより判定して不均質であることを発見し、かつ彼らは、マイクロタイタープレートのウェルへ亜集団クローンを選別した。 They spore suspension of fungi, discovered that by determining heterogeneous by light scattering data obtained by the excitation light 633 nm, and they were selected subpopulation cloned into the wells of a microtiter plate. 発芽および増殖後、リパーゼ産生は、マイクロタイタープレートにおいて自動アッセイ(濁度により)し、かつ最も活性のある代表的セットを再度単離し、培養し、かつ常法によりアッセイした(Betzら、1984)。 After germination and growth, the lipase production, and automated assay (turbidity) in a microtiter plate, and the most representative set active with the reisolated, cultured and assayed by conventional methods (Betz et al., 1984) .
【0028】 [0028]
サリエンク(Scrienc)らは、真核生物S. Sarienku (Scrienc) et al., Eukaryotic S. セレビシエ(S. cerevisiae)においてクローニングされたガラクトシダーゼ活性を検出するフローサイトメトリーを報告した。 Reported flow cytometry to detect cloned galactosidase activity in S. cerevisiae (S. cerevisiae). フローサイトメトリーが単独の細胞について測定値を得る能力は、高レベルの発現を伴う個々の細胞が(例えば、遺伝子増幅またはより多いプラスミドコピー数により)検出可能であることを意味する。 Flow cytometry ability cytometry to obtain a measurement value for a single cell, individual cells with a high level of expression (e.g., by gene amplification or more plasmid copy number) means that it is detectable. この報告された方法において、非蛍光化合物であるβ−ナフトール−β−ガラクトピラノシドが、β−ガラクトシダーゼにより切断され、かつ遊離されたナフトールが捕獲され、不溶性の蛍光生成物を形成する。 In this reported method, a non-fluorescent compound β- naphthol -β- galactopyranoside is cleaved by β- galactosidase, and liberated naphthol is captured, to form a fluorescent product insoluble. この蛍光生成物の不溶性は、その細胞からの拡散を防ぐためにここでは非常に重要である。 Insoluble in fluorescence product, wherein in order to prevent the diffusion from the cells is very important. このような拡散は、単に高活性の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の過小評価につながるだけではなく、不活性な細胞または低い活性を持つ細胞での酵素活性の過大評価にもつながり、それは、これらが漏出された蛍光化合物を取り込み、その結果、集団の明らかな異種性を低下するからである。 Such diffusion, not only leads to an underestimation of the β- galactosidase activity in highly active cells, also lead to overestimation of enzymatic activity in cells with inactive cells or less active, it is these uptake leakage fluorescent compounds, with the consequence that lower the apparent heterogeneity of the population.
【0029】 [0029]
あるグループは、原核生物である枯草菌(Bacillus subtilis)における特定の形質導入バクテリオファージから発現された融合タンパク質を検出するアッセイにおけるFACS装置の使用を説明している(Chungら、J. of Bacteriology、1994年4月、1977〜1984ページ;Chungら、Biotechnology and Bioengineering、47:234〜242(1995))。 One group, describes the use of FACS apparatus in an assay for detecting a fusion protein expressed from a particular transducing bacteriophage in B. subtilis (Bacillus subtilis) a prokaryotic (Chung et al., J. Of Bacteriology, In April 1994, 1977-1984 page; Chung et al., Biotechnology and Bioengineering, 47: 234~242 (1995)). このグループは、サチリス(spo)の胞子形成座に融合されたlacZ遺伝子(b−ガラクトシダーゼをコードしている)の発現を追跡した。 This group was followed expression subtilis been lacZ gene fused to sporulation locus (spo) (encoding a b- galactosidase). 単独細胞におけるspo−lacZ融合体からのb−ガラクトシダーゼ発現のモニタリングに使用した技術は、胞子形成培養物からの試料の採取、それらの市販のb−ガラクトシダーゼ発蛍光性基質であるC8−FDQによる染色、およびフローサイトメトリーによる単独細胞内の蛍光の定量分析であった。 Technique used for monitoring b- galactosidase expression from spo-lacZ fusion in single cells, harvested samples from sporulated cultures, staining with C8-FDQ is their commercial b- galactosidase fluorogenic substrates , and flow cytometry was quantitative analysis of fluorescence in single cells by cytometry. この研究において、フローサイトメーターは、細胞の発育(development)時のspo遺伝子の存在のスクリーニングのための検出器として使用した。 In this study, flow cytometer was used as a detector for screening for the presence of spo genes when growth of cells (development). この装置は、発見を目的とした遺伝子発現ライブラリーまたは核酸からの陽性細胞のスクリーニングおよび回収には使用しなかった。 This device was not used for screening and recovery of positive cells from a gene expression library or a nucleic acid for the purpose of finding.
【0030】 [0030]
別のグループは、δプロテオバクテリアであるミクソコッカス・キサントゥス(Myxococcus xanthus)の発育段階の間を識別するためにフローサイトメトリーを使用した(F. RussoMarieら、PNAS、90:8194〜8198(1993年9月))。 Another group was using flow cytometry to identify during the developmental stage of a δ-proteobacteria Myxococcus-Kisantusu (Myxococcus xanthus) (F. RussoMarie et al, PNAS, 90: 8194~8198 (1993 year September)). 先に説明された研究のように、この研究は、FACS装置の様々な発育調節段階において遺伝子型が同じ細胞を検出および識別する能力を使用した。 As in the previously described studies, this study used the ability to detect and identify the same cell genotype at various developmental regulatory step of FACS apparatus. この研究では、酵素活性のスクリーニングを、発育変化の間接的測定値として用いた。 In this study, the screening of enzyme activity, was used as an indirect measure of the developmental change.
【0031】 [0031]
大腸菌由来のlacZ遺伝子は、遺伝子発現調節の研究において、細菌、酵母および動物細胞におけるプロモーター効率、トランス作用因子の作用、および他の調節エレメントの作用を決定するものの様なリポーター遺伝子として使用されることが多い。 lacZ gene from E. coli, in the study of regulatory gene expression, bacterial promoter efficiency in yeast and animal cells, effects of trans-acting factors, and be used as a reporter gene, such as those that determine the effect of other regulatory elements there are many. 発色性の基質、例えばONPG(o−ニトロフェニル−(−D−ガラクトピラノシド)を使用し、細胞培養物における−ガラクトシダーゼの発現を測定することができる;しかし、個々の細胞における発現のモニタリングおよび細胞集団の発現の異種性の分析は不可能である。しかし、発蛍光性基質の使用は、フローサイトメトリーにより、多数の個別の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することを可能にする。この種の測定は、遺伝子発現は、有糸分裂周期の段階または特定の条件下での生存力に相関することができるので、細胞の生理に関してより情報に富んでいる。1994年にプロビンス(Plovins)らは、動物、細菌および酵母細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ検出の基質としてのフルオレセイン−ジ−β−D Chromogenic substrate, for example, ONPG (o-nitrophenyl - (- using D- galactopyranoside), in cell cultures - can measure the expression of galactosidase; however, the monitoring of the expression in individual cells and analysis of heterologous expression of a cell population is not possible. However, the use of fluorogenic substrates, by flow cytometry, which allows to measure the β- galactosidase activity in a number of individual cells. this type of measurement, since the gene expression can be correlated to the viability of the stage or under certain conditions mitotic cycle, is rich in more information about the physiology of cells. 1994 Providence (Plovins ) et al., animal, fluorescein as a substrate for β- galactosidase detection in bacteria and yeast cells - di-beta-D ガラクトピラノシド(FDG)およびC12−FDGの使用を報告した。この研究は、β−ガラクトシダーゼの基質としてのこれらの2種の分子を比較し、かつFDGが、細菌細胞におけるフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼの検出において、より優れた基質であると結論した。この研究において実施されたスクリーニングは、これら2種の基質を比較するためであった。FACS装置の検出能は、生存細菌細胞に関する試験を実施するために使用した。 Reported the use of galactopyranoside (FDG) and C12-FDG. This study compares these two molecules as a substrate for β- galactosidase, and FDG is, beta by flow cytometry in bacterial cells -. in the detection of galactosidase, it was concluded that a better substrate screening this was performed in study, the ability to detect these two .FACS device substrate was to compare the test for viable bacterial cells It was used to carry out.
【0032】 [0032]
発色性または発蛍光性基質により細胞は、各々呈色および蛍光生成物を生じた。 The chromogenic or fluorogenic substrate cells resulted each color and fluorescent product. これまでは、フローサイトメトリー蛍光標示式細胞分取法は、対象となる低分子の酵素活性を細胞内に含む細胞、またはこれに通常生理的に関連している細胞の分析にとってのみ有益であると考えられている。 Previously, flow cytometry fluorescence activated cell sorting Toho includes the enzymatic activity of small molecules of interest is only beneficial for analysis of cells normally physiologically relevant cells or which includes within the cell It is considered. これを基に、細胞に浸潤することができ、その結果細胞毒物の可能性のあるような発蛍光性試薬を使用するのみであった。 Based on this, it can invade cells were only the result using fluorogenic reagent such as a potential cytotoxic agent. 異種細胞の凝集を避けるために、フローサイトメトリーにおいては個別の細胞のみを分析することが望ましく、かつこのことは感度を制限し、その結果探知され得る標的分子の濃度を制限する。 To avoid agglomeration of the heterologous cells, desirable to analyze only the individual cells in flow cytometry, and this limits the sensitivity, to limit the concentration of target molecules that may be the result detected. Weaverとその同僚はMITおよび他の研究施設において、栄養素、分泌産物を取り込みかつコロニー形成まで増殖することができるような(物理的に)1個の細胞を含有するゲル微小液滴(gel microdroplet)を開発した。 Weaver and colleagues at MIT and other research facilities, such as may be grown nutrient, to capture and colonize the secreted products (physical) gel microdroplets containing one cell (gel Microdroplet) It was developed. ゲル微小液滴の拡散特性は、十分な細胞外産物が個別のゲル微小液滴の各々に会合し続けるように作製することができ、その結果各微小液滴内の分泌された分子の濃度を基にしたフローサイトメトリー分析および細胞選別が可能になる。 Diffusion properties of the gel microdroplets can be sufficient extracellular product is prepared to continue to associate with each individual gel microdroplets, the concentration of the resulting secreted molecules in each micro-liquid droplets allowing flow cytometric analysis and cell sorting based on. ビーズも、異なるラットで増殖した変異体を単離し、かつハイブリドーマ細胞による抗体分泌およびハイブリドーマ細胞の栄養感受性を分析するために使用されている。 Beads have also been used for different variants grown in rat isolated and analyzed nutrient sensitive antibody secretion and hybridoma cells by hybridoma cells. このゲル微小液滴法は、更に、マイコバクテリア増殖およびその抗生物質による阻害の迅速な分析にも適用される。 The gel microdroplet methods are further applicable to rapid analysis of inhibition by mycobacterial growth and antibiotics.
【0033】 [0033]
ゲル微小液滴技法は、フローサイトメトリー分析において利用できるシグナルの増幅、およびバイオテクノロジーの菌株改善プログラム(strain improvement program)において微生物株のスクリーニングを可能にする点において重要である。 Gel microdroplet technique, flow cytometry signals available in cytometric analysis amplification, and is important in that it allows the screening of microbial strains in biotechnology strain improvement programs (strain improvement program). Wittrupら(Biotechnolo. Bioeng.、42:351〜356(1993)) は、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)のグルコアミラーゼの増強された分泌に関する10 個以上の酵母細胞の迅速かつ定量的スクリーニングを可能にするマイクロ封入選択法を開発した。 Wittrup et al. (Biotechnolo Bioeng, 42:.. 351~356 (1993)) may allow rapid and quantitative screening of Aspergillus awamori (Aspergillus awamori) 10 6 or more yeast cells for enhanced secretion of glucoamylase We have developed a micro-encapsulated selection method to. この方法は、高分泌変異体の400倍の1回通過による濃縮を提供する。 This method provides a concentration by one pass of 400 times higher secretion mutants.
【0034】 [0034]
ゲル微小液滴法または他の関連技法を、組換えライブラリーのハイスループットスクリーニングにおけるシグナルの局在に加え増幅するために、本発明において使用することができる。 Gel microdroplet method or other related techniques, to amplify in addition to localization of the signal in the high-throughput screening of recombinant libraries, can be used in the present invention. 微小液滴技法により核酸を回収することができるので、スクリーニング時の細胞の生存力は問題または懸念ではない。 It is possible to recover the nucleic acid by microdroplets techniques, cell viability at screening is not a problem or concern.
【0035】 [0035]
様々な種類の封入戦略および化合物またはポリマーを、本発明において使用することができる。 Various types of encapsulation strategies and compounds or polymers can be used in the present invention. 例えば、高温アガロースを、熱安定生体活性のスクリーニング時の全てのバックグラウンド活性を除去するための、細胞の安定した封入工程、それに続く熱殺傷工程を可能にする、高温で安定している微小液滴の製造に使用することができる。 For example, the hot agarose, to remove all of the background activity at screening thermostable bioactive stable encapsulation process of the cells, it allows for heat killing a subsequent step, fine liquid that is stable at high temperatures it can be used for the preparation of drops.
【0036】 [0036]
大腸菌発現の組換え酵素の検出および選別、ならびにコードしている核酸の回収を試みる際に克服しなければならない点が数百ある。 Detection and sorting of the recombinant enzyme of E. coli expression, and that must be overcome is hundreds when attempting to have recovery of a nucleic acid encoding. FACSシステムは、典型的には、真核生物の分離を基本にしており、かつ単独の大腸菌細胞の正確な選別を精密化するものではない;大腸菌のような小さい粒子の低い前向き(low forward)および側面への散乱は、正確に選別する能力を低下し;ウンベリフェリル(umbelifferyl)に基づく基質のような酵素基質が、自動スクリーニング法において典型的に使用され、これは定量に干渉する速度で大腸菌から拡散する。 FACS systems typically eukaryotic separation of biological and the base, and is not intended to refine the precise selection of a single E. coli cell; positive low small particles, such as E. coli (low forward) and scattering to the side, to reduce the ability to sort accurately; umbelliferyl enzyme substrate, such as substrate-based (umbelifferyl) is typically used in automated screening methods, this is a interfere rate quantitatively It diffuses from E. coli. 更に選別された生物から非常に少量のDNAを回収することには問題が多い。 Moreover Very often problems that a small amount of DNA recovered from selected organisms. 本発明の方法は、本明細書に記した新規スクリーニング法により、これらのハードルに対処しかつこれらを克服している。 The method of the present invention, by a novel screening method described in this specification, have overcome by and these addresses these hurdles.
【0037】 [0037]
新規活性を伴う生体活性化合物の必要性は、劇的に増加している。 The need for bioactive compounds with novel activity has increased dramatically. この要求は、主に現在利用できる抗生物質に耐性がある病原体数の明確かつ増加の潮流と組合わせた世界規模の人口統計特性の変化に加え、化合物合成の新規の工業的過程の必要性から生じている。 This request is mainly in addition to changes in the global demographic characteristics in combination with tide of clear and increased pathogen number is currently resistant to antibiotics available, the need for new industrial processes of compound synthesis It's seeing. 例えば、人口が若い新興国においては抗菌剤の要求が急増しているが、米国のような人口が加齢している国は、癌、糖尿病、関節炎および他の衰弱性病態に対する薬物のレパートリーの拡大が求められている。 For example, although in the population young emerging are rapidly increasing demand for antibacterial agents, national population like the US is aging, cancer, diabetes, a repertoire of drugs for arthritis and other debilitating conditions extension is sought. 感染症の死亡率は、1980年から1992年の間に58%増加し、かつ抗生物質耐性菌の出現は、米国単独で医療保障の経費に年間300億ドルを上回る額が追加されていると推定されている(Adamsら、Chemical and Engineering News、1995;Amannら、Microbiological Reviews、59、1995)。 Mortality rate of infection, increased by 58% between 1992 from 1980, and the emergence of antibiotic-resistant bacteria, the United States alone and the amount of more than 30 billion annually to $ cost of health care has been added it has been estimated (Adams et al., Chemical and Engineering News, 1995; Amann et al., Microbiological Reviews, 59,1995). この潮流に対する反応として、製薬会社は、独自の活性または特異性を伴う化合物に関する微生物の多様性のスクリーニングを顕著に増大している。 As a response to this trend, pharmaceutical companies have significantly increased the screening of microbial diversity relates to compounds with a unique activity or specificity.
【0038】 [0038]
現在使用される生体活性化合物の大半は、土壌微生物に由来している。 Most of bioactive compounds currently used is derived from the soil microorganisms. 土壌および他の複雑な生態系群集に居住する多くの微生物は、それらの生存および繁殖能を増大するような様々な化合物を産生する。 Many microorganisms living in soil, and other complex ecosystem crowd produces a variety of compounds to increase their survival and fertility. これらの化合物は、生物の増殖には一般に必須でないと考えられ、かつ中間代謝に関連した遺伝子の助けを借りて合成される。 These compounds are generally considered non-essential for growth of the organism, and are synthesized with the help of genes associated with intermediary metabolism. このような他の生物の増殖または生存に影響を及ぼすような二次代謝産物は、「生体活性」化合物として公知であり、かつ微生物および巨大生物の両方の化学物質防御の兵器庫の重要な成分として利用される。 Such other secondary metabolites that affect growth or survival of the organism, "biological activity" is known as a compound, and important components of the arsenal of both chemical defenses of microorganisms and giant organism It is used as a. 人類は、抗生物質、抗感染症薬および広範な原核および真核病原体に対する活性を伴うその他の生体活性化合物として使用するためにこれらの化合物を活用している(Barnesら、Proc.Nat. Acad. Sci. U.S.A.、91:1994)。 Mankind, antibiotics, and take advantage of these compounds for use as other bioactive compounds with activity against anti-infective agent and a wide range of prokaryotic and eukaryotic pathogens (Barnes et al., Proc.Nat. Acad. . Sci U.S.A., 91: 1994).
【0039】 [0039]
新規生体活性化合物について微生物をスクリーニングするために現在使用される研究方法は、この分野の発端から大きくは変わっていない。 Current research methods used to screen a microorganism for novel bioactive compounds increased from inception of the field has not changed. 土壌環境からの細菌、特にグラム陽性菌の新規単離体が収集され、かつそれらの代謝産物が薬学的活性について試験される。 Bacteria from the soil environment, particularly novel isolates of gram-positive bacteria collected, and their metabolites are tested for pharmacological activity.
【0040】 [0040]
リード化合物の給源として未利用であり続ける甚だしい生体多様性が依然存在している。 Serious biological diversity continue be unused as a source of lead compounds are still present. しかし、リード化合物のスクリーニングおよび製造に現在利用可能な方法は、これらの研究中の資源に効果的には適用することができない。 However, screening and currently available methods for the production of lead compounds can not be applied effectively to the resources in these studies. 例えば、海生細菌種の少なくとも99%は実験室培地においては生存せず、かつ市販の発酵装置はこれらの種が増殖する様な条件下で使用するのには適してはおらず、これによりこれらの生物は、スクリーニングまたは再供給のために培養することが困難または不可能であると推定されている。 For example, at least 99% of marine bacterial species do not survive in the laboratory medium and commercially available fermentors are suited for these species is used under conditions such as growing Orazu, thereby these organisms, be cultured for screening or resupply is estimated to be difficult or impossible. 再収集、増殖、菌株の改善、培地の改善、および薬物産生生物のスケールアップされた作出は、リード化合物の合成および開発に関して時折問題を有することがある。 Recollected, growth, improvement of strains, improvements in media, and drug-produced scaled up production of organisms may have occasional problems with the synthesis and development of lead compounds. 更に、いくつかの化合物を合成するための特異的生体との相互作用の必要性は、発現におけるそれらの使用を極めて困難にしている。 Furthermore, the need for interaction with a specific biological for synthesizing some of the compounds are very difficult to use them in expression. 薬物発見において使用するための遺伝的資源およびこれらの未利用の化合物源の化学多様性を活用する新規方法は、非常に価値がある。 Novel method of utilizing the genetic resources and chemical diversity of the compounds sources for these unused for use in drug discovery, there is great value.
【0041】 [0041]
最新生物学の中心は、遺伝的情報が核酸ゲノムに備わるということ、およびこのようなゲノムに具体化された情報(すなわち遺伝子型)は細胞機能を示しているということである。 The center of the latest biology that genetic information is provided in a nucleic acid genome and embodied information (i.e. genotypes) in such genome is that illustrates a cellular function. これは、生体ゲノムにおける様々な遺伝子の発現およびこのような遺伝子の発現の調節を通して生じる。 This occurs through modulation of the expression of various genes in biological genome and expression of such genes. 細胞または生物における遺伝子発現は、細胞または生物の生理的特徴(すなわちその表現型)を定義する。 Gene expression in a cell or organism, define the physiological characteristics of a cell or organism (i.e. phenotype thereof). これは、遺伝子のタンパク質への翻訳を通じて実現される。 This is achieved through the translation into protein of the gene. 環境試料から得たタンパク質の生物学的活性の決定は、環境におけるタンパク質の役割に関する価値のある情報を提供することができる。 Determination of biological activity of the protein obtained from environmental samples can provide valuable information on the role of the protein in the environment. 加えて、このような情報は、生物学的、診断的、治療的、および産業用途の組成物の開発において一助となることができる。 In addition, such information, biological, diagnostic, therapeutic, and may be an aid in the development of industrial applications of the composition.
【0042】 [0042]
従って、本発明は、複数の試料のハイスループットスクリーニングを利用し、この未利用の生体多様性を入手し、かつ対象となるポリヌクレオチド、タンパク質および低分子に関して容易にスクリーニングする方法および組成物を提供する。 Accordingly, the present invention utilizes a high-throughput screening of multiple samples, obtaining a biological diversity of the unused, and the target polynucleotide, provide easily screened methods and compositions for protein and small molecules to. これらの生体分子は、培養したまたは培養していない生物試料に由来することができる。 These biological molecules can be derived from a biological sample that does not cultured or cultivated. ある態様において、本発明の方法は、未培養の微生物のハイスループット培養法を提供する。 In some embodiments, the method of the present invention provide a high throughput method for culturing uncultured microorganisms.
【0043】 [0043]
米国において、癌は、心臓血管系疾患に次ぐ、第二位の病死の原因であり、かつこれは数年のうちに第一位の死因となると見積もられている。 In the United States, cancer, second only to cardiovascular disease, a cause of illness in the second place, and this is estimated to be the leading cause of death within a few years. 初期段階で発見された癌の最も一般的治療法は、手術および放射線療法を含む(1)。 The most common method of treating cancer found at an early stage, including surgery and radiotherapy (1). これらの方法は、更に進行した段階の癌では成功には遠く及ばない。 These methods are far inferior to the success further cancer advanced stages. 現在の化学療法剤は、有用であるが、それらの効果には限界がある。 Current chemotherapeutic agents are useful, there is a limit to their effectiveness. 有意な結果は、小児癌およびある種の成人悪性腫瘍、例えばリンパ腫および白血病などを含む狭い範囲の癌の化学療法において得られる(2)。 Significant results are obtained in a narrow range cancer chemotherapy, including pediatric cancers and certain adult malignancies, for example lymphomas and leukemias, etc. (2). これらの陽性の結果にもかかわらず、ほとんどの化学療法処置は、治癒的ではなく、主として苦痛の緩和に利用される(1)。 Despite the results of these positive, most chemotherapeutic treatments, curative but is used primarily relief of pain (1). 従って、現在の医学科学は依然、患者に長期生存をもたらしおよびほとんどの癌の治療可能性を提供するはるか以前に留まっていることは明らかである。 Therefore, current medical science is still, it is clear that it remains long before providing the therapeutic potential of lead to long-term survival and most cancer patients. しかし、過去20年にわたる基本的研究は、癌の進行におけるキープレーヤーを限定する膨大な量の科学的情報を提供している。 However, basic research over the past 20 years, has provided the scientific information of the huge amount to limit the key players in the progression of cancer. 分子レベルでの疾患の経過の理解は、最適分子標的を決定する手段および推定される癌性組織の選択的殺傷する手段を提供している。 Understanding the course of the disease at the molecular level provides a means for selectively killing of cancerous tissue to be means and estimating determines the optimum molecular target. 腫瘍の進行において同定される重要な領域の一部は、増殖シグナル伝達、異常な細胞周期調節、アポトーシス、テロメア生物学、遺伝的不安定性および血管新生を含む(3)。 Some of the important regions identified in tumor progression, growth signaling, abnormal cell cycle regulation, including apoptosis, telomere biology, genetic instability and angiogenesis (3). この基本的研究は、現在より効果的な治療への進歩が見られるにつれて効果を挙げ始めている(4,5)。 This basic research is, are beginning to include the effect as the advances to the effective treatment than the current seen (4, 5). これらの確定された領域に対し示された新規化学療法剤は、シグナル伝達に関連したチロシンキナーゼに対する活性が最も期待される物質の一部と共に、臨床試験第I相から第III相にある。 New chemotherapeutic agents have been shown for these the determined region, with a portion of the substance activity against tyrosine kinase related to signal transduction is most promising, from clinical trials Phase I to Phase III. 数個の名前を挙げると、ber−abl、プロテインキナーゼC、VEGE受容体およびEGF受容体の低分子インヒビターが全て臨床試験中である(4)。 Taking several names, a ber-abl, the protein kinase C, small molecule inhibitors of VEGE receptor and EGF receptor are all clinical trials (4). 具体例の一部は、EGF受容体インヒビターであるZD1839およびCP358774を含み、これらは臨床試験第II相にあり、臨床活性の陽性徴候を伴う患者には忍容性が良好であるように見える(6)。 Some specific examples include ZD1839 and CP358774 a EGF receptor inhibitors, these are located in the clinical trial phase II seems well tolerated in patients with positive signs of clinical activity ( 6). 例えこのように進歩したとしても、腫瘍形成性の複雑さは、新規治療物質の進行中の発見および開発のみではなく、該疾患の原因となる機序を解明するための基本的研究も必要としている。 Even advanced thus even, tumorigenic complexity is not only the discovery and development of ongoing new therapeutic agents, also require basic studies to elucidate the mechanisms responsible for the disease there. 現在、少なくとも50種の公知の癌関連標的があり、かつ最大数百種の新規標的が発見されていると推測されている(2)。 Currently, it is estimated that there are at least 50 known cancer-related targets and new targets for up to hundreds of species have been found (2). この殺到する情報を使用するために、可能性のある抗癌薬のウルトラハイスループットスクリーニングの新規方法が開発されなければならない。 To use the information to this rush, novel methods of ultra high-throughput screening of anticancer drugs must be developed that can.
【0044】 [0044]
分子生物学、自動化、縮小化、および情報技術の最近の技術的開発は、様々な給源由来の新規化合物のハイスループットスクリーニングを促進している。 Molecular biology, automation, miniaturization, and recent technological development of information technology has accelerated the high throughput screening of novel compounds from various sources. しかし、増大した処理量にもかかわらず、このような労作からもたらされた新規薬物の数に関して産業界には若干の失望がある(7)。 However, despite the increased amount of processing, the industry there is some disappointment with respect to the number of new drugs resulting from such exercise (7). 重要な挑戦のひとつは、分子標的の活性を発見する機会の増大に必要な構造的多様性を伴う十分数の化合物を発見することである。 One important challenge is to find a sufficient number of compounds with structural diversity required to increase the opportunity to discover the activity of the molecular target. 現在、スクリーニングされた化合物は、化学ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリー、歴史的化合物収集法および天然産物のライブラリーに由来する(8)。 Currently, screened compounds, chemical libraries, and combinatorial libraries, derived from a library of historical compound collection methods and natural products (8). 当然、薬物の最も豊富な給源のひとつは、天然産物のライブラリーからである。 Of course, one of the most abundant source of drugs, is from a library of natural products. クラッグ(Cragg)ら(9)は、1984年から1995年にかけて承認された抗癌剤およびpre−NDAの候補の60%以上が、天然の給源に由来するか、または天然産物から誘導されたことを報告した。 Cragg (Cragg) et (9), reports that more than 60% of the candidates approved anticancer and pre-NDA from 1984 to 1995, derived either from natural sources or from natural products did. 実際、この期間に新たに承認された全520種の薬物の39%が、天然産物から由来または誘導され、抗感染症薬の80%が天然に由来すると推定されている。 In fact, 39% of the total 520-drug newly approved during this period, is derived or derived from natural products, 80% of the anti-infective agent is estimated to be derived from nature. 典型的には、天然産物は、ほとんどのコンビナトリアル法よりも非常に大きい構造多様性を有する低分子である。 Typically, natural product is a small molecule with a very high structural diversity than most combinatorial methods. 低分子は一般に、腫瘍に浸透する能力、吸収される能力、および容易に代謝される能力を伴う性質においてより「薬物様」であるので、薬学産業において好まれる。 Small molecule is generally the ability to penetrate the tumors, absorbed power, and because it is more "drug-like" in the readily nature with the ability to be metabolized, are preferred in the pharmaceutical industry. しかし、天然産物は、多くは給源の再現性、労働主薬的抽出工程、供給品の豊富さおよび生体多様性の秩序(right)に関する懸念に起因する欠点を有している(8)。 However, natural products, reproducibility of many sources, labor agent extraction process has the drawback that due to concerns regarding order of richness and biological diversity of the supplies (right) (8).
【0045】 [0045]
天然の給源由来の治療的物質は、主に植物および微生物を起源としている。 Therapeutic agents derived from natural sources are primarily to originate from plants and microorganisms. これらは、最大の生体多様性が、世界の隅々に実際に住む微生物に存在する。 These are the largest bio-diversity is present in microorganisms that actually live in every corner of the world. 新規生体活性化合物に関する微生物スクリーニングに使用される現在の研究方法は、過去50年間ほとんど変わっていない。 The current method of research that is used in microbial screening for new bioactive compounds, has not changed almost the past 50 years. 微生物学者は、試料を環境から収集し、純粋な培養物を単離し、十分な材料を増殖し、この培養物を抽出し、かつ薬学的活性に関しそれらの代謝産物を試験する。 Microbiologists, a sample collected from the environment, the pure culture was isolated, proliferate sufficient material to extract this culture, and testing their metabolites relates to a pharmaceutical activity. 次にこれらの天然産物の変種が、作出生物の突然変異誘発を通じて、または当初の基本的分子の化学的または生化学的修飾を通じて作製される。 Next variants of these natural products, are produced through mutagenesis production organism, or through chemical or biochemical modifications of the original basic molecule. 天然産物は典型的には多酵素系により作製され、ここでは各酵素は、最終的な低分子生成物、例えば抗生物質の作出に必要な多くの形質転換が行われる。 Natural products are typically produced by a multi-enzyme system, where each enzyme is the final low molecular products, for example, a number of transformation required for the development of antibiotics is performed. これらの生体活性分子は、それらの局所的環境の特異的必要性および挑戦に反応して二次代謝産物を作出する生物の能力から誘導される。 These bioactive molecules are derived from an organism's ability to produce a reaction to secondary metabolites in specific needs and challenges their local environment. これらの酵素をコードしている遺伝子は、天然産物を構築する青写真を含む、いわゆる「生合成オペロン」へとクラスター化されることが多い(10)。 Genes encoding these enzymes include blueprint to build natural products, clustering is often to so-called "biosynthetic operon" (10). この小生体活性分子作製の青写真は、典型的には25,000個を超えるヌクレオチドであり、かつ100,000個より多いヌクレオチドであることができる。 The small bioactive molecules manufactured blueprint is typically nucleotides more than 25,000, and may be a more nucleotides than 100,000. 作出生物からのDNAの連続片としてクローニングされているような低分子、単に数個の名前を挙げると、オキシテトラサイクリン、ジャドマイシン、ダウノルビシンのような低分子の生成をコードしている経路全体の多くの例が存在する(11)。 Low molecule as cloned as a continuous piece of DNA from production organism and simply given several names, oxytetracycline, Judd mycin, many entire path encoding the production of low molecules such as daunorubicin examples of the presence (11). これらの経路の一部(例えば、アクチノロージン、テトラセノマイシン、プロマイシン、ニッコマイシン)は、他の微生物宿主へ導入され、かつ低分子が異種発現される(11)。 Some of these pathways (e.g., actinorhodin, tetracenomycin, puromycin, Nikko mycin) is introduced into other microbial hosts, and small molecules are heterologous expression (11).
【0046】 [0046]
より最近の研究方法は、組換え技術を用いて、先に特徴付けられた経路の遺伝子サブユニットの組合せによりハイブリッド抗生物質経路を合成することである。 More recent research methods, using recombinant technology, is to synthesize a hybrid antibiotic pathway by a combination of genetic subunits routes previously characterized. この研究方法は「コンビナトリアル生合成」と称され、主にポリケチド抗生物質に焦点が当てられており、かつ活性を示する多くの化合物をもたらしている(12,13)。 The study method is referred to as "combinatorial biosynthesis" have resulted primarily focus on polyketide antibiotics and is devoted, and many simply showing the active compound (12, 13). このようなエリトロノリド(erythronolide)生合成オペロンを使用する研究方法のひとつにおいて、酵素ドメインが、該オペロンに追加され(14)かつ再配置され(15)、これによりポリケチド生合成を再度プログラムする。 In one study methods of using such Eritoronorido (Erythronolide) biosynthetic operon enzyme domain is added to the operon (14) and being rearranged (15), thereby programming the polyketide biosynthesis again. しかし、新規抗生活性を伴う化合物はまだ報告されていない:この知見は、この経路サブユニットは先に特徴付けられた化合物をコードしているものに由来するという事実に基づくであろう。 However, compounds with novel antibiotic activity has not yet been reported: This finding this pathway subunit will be based on the fact that from those coding for the compounds previously characterized. 新規生体活性化合物を発見しようとする先行する試みにおいて対処されていないことは、天然の環境の微生物の小さい画分のみが実験室条件下で増殖することができるという比較的最近の知見である。 It has not been addressed in the preceding attempt to try to find new bioactive compounds are relatively recent finding that can only small fraction of microbial natural environment worth to grow in laboratory conditions. 推定したところ、全原核生物の1%よりも遙かに少ない数が実験室の純粋培養において増殖することが可能である。 Was estimated, it is possible that the number much less than 1% of the total prokaryotic organisms grown in pure culture in the laboratory. このことは、生体活性化合物の発見のための培養非依存型(Culture−independent)の方法の必要性を暗示している。 This implies the need for a method of culturing-independent for discovery of bioactive compounds (Culture-independent).
【0047】 [0047]
環境試料由来の標的酵素および他の生体活性分子の両方をコードしている遺伝子を直接クローニングするための培養非依存型の方法は、大腸菌、ストレプトミセス、または他の適当な宿主内で増殖され得るような、クローニングベクター内で保存された、天然の生体の集合的ゲノムを表しているライブラリーの構築を基にしている。 -Independent manner cultures for direct cloning a gene encoding both the target enzyme and other bioactive molecules from environmental samples include E. coli, may be grown in Streptomyces or in other suitable host, such, stored in the cloning vector is based on the construction of a library representing the collective genomes of naturally occurring organism. このクローニングされたDNAは最初に生体の混合集団を含む環境試料から直接抽出されるので、このライブラリーの提示は、純粋培養物中で増殖することができるような原核生物の小さい画分に限定されることはなく、数種の急激に増殖する種に偏ることもない。 This cloned DNA is extracted first directly from environmental samples containing a mixed population of biological, presentation of the library, limited to a small fraction of prokaryotes that can be grown in pure culture is the fact not not be biased to the species rapidly growing of several. 試料は、地熱および熱水噴出口、酸性土壌および沸騰している地獄、汚染された工業地域、海生共生などのような極端な環境を含む、実際に地球上に示された全ての生態系から得ることができる。 Samples geothermal and hot water spout acid soils and boiling is hell, contaminated industrial areas, including extreme environments, such as marine symbiosis, all ecosystems actually shown on the Earth it can be obtained from.
【0048】 [0048]
例えば100種の異なる生体を含む複雑な混合集団のライブラリーのスクリーニングは、ゲノムの多様性をカバーするためには1000万個のクローンの分析を必要としている。 For example complex library Screening of a mixed population comprising 100 different organism, in order to cover the diversity of the genomes is in need of analysis of 10 million clones. 極端なハイスループットスクリーニング法は、これらのライブラリーに存在する膨大な数のクローンを取扱うことが履行されなければならない。 Extreme high throughput screening methods must be implemented to handle a large number of clones present in these libraries. 今日の製薬産業において、ハイスループットスクリーニングは、典型的には1日1回のアッセイにつき万の桁の化合物処理率を有し、一部の実験室では、1日に100,000回のアッセイを作業している。 In today's pharmaceutical industry, high throughput screening, typically have one assay per ten thousand compound treatment rate digit of the day, in some laboratories, the 100,000 assays per day It is working. 該産業における開発の大半は、より大きい密度、より小さい容量のプレートフォーマットへのこれらのスクリーニングの縮小化および自動化に中心を置いている。 Most developments in said product industry, greater density, are centered on the reduction and automation of these screening to plate format smaller capacity. しかし、この戦略は、通常の液体分配技術および現行のマイクロプレート組立て法の実践上の限界に加え、非常に小さいウェル容量の開放型系における蒸発制御における限界に到達するであろう。 However, this strategy, in addition to practicing the limitations of conventional liquid dispensing technology and current microplate assembly method, will reach the limit in the evaporation control in open systems with a very small well volume.
【0049】 [0049]
現在の対象となるミクロスケール粒子のスクリーニングに関するプラットフォームは、小さいウェルまたはスルーホールを備えるように形成されたプレートを含んでいる。 Of screening for micro-scale particles as the current target platform includes a formed to include a small well or through-hole plate. これらのウェルまたはスルーホールは、分析される試料を保持するために使用される。 These well or through-hole is used for holding a sample to be analyzed. この試料は、典型的には対象となる粒子を含んでいる。 The sample is typically contain particles of interest. ウェルが使用される場合、試料をプレート上のウェルに付着し、かつ更なる分析のためにウェルから試料を除去するために、複雑かつ非効率は試料の分配および抽出系を使用しなければならない。 If the well is used to adhere the samples to the wells on the plate, and to remove the sample from the well for further analysis, complex and inefficient must use the distribution and extraction system of the sample . ウェルに基づくプラットフォームは、底を備えており、そのため対象となる粒子を顕在化しもしくは細胞をインキュベートするためのプレート上の試料の懸濁のために主に重力が使用される。 Platform based on the well includes a bottom, mainly gravity is used for suspension of the plate on the sample for incubating therefore manifest the particles of interest or cells.
【0050】 [0050]
別の種類のプラットフォームは、典型的には多くの周知の方法のひとつによりプレートに機械加工されたスルーホールを使用する。 Another type of platform typically use through holes machined in the plate by one of the many well-known methods. スルーホールは、試料のプレートへの導入を毛管力に頼り、かつ試料のスルーホール内での懸濁のためには表面張力を利用する。 Through holes, relying on the introduction into the plate of the sample capillary force, and utilizing the surface tension for suspension in the through holes of the sample. しかし、典型的スルーホールに基づく装置には、比較的小さいアスペクト比、またはホールの長さ対内径の比という限界がある。 However, the devices based on typical through-hole, there is a limitation that a relatively small aspect ratio or length to internal diameter ratio of the holes. 小さいアスペクト比は、ホールに含まれた液体のより大きい蒸発による喪失を招き、このような蒸発は制御困難である。 Small aspect ratio leads to loss due to greater evaporation of the liquid contained in the hole, such evaporation is difficult control. スルーホールは更にそれらの機能性に限界がある。 Through holes are further limited in their functionality. 例えばプレート内のスルーホール形成法は、通常ホールの内側に並べるか、またはホールの外側を覆うための様々な材料の使用ができない。 For example the through hole forming method in the plate are normally either arranged inside the hole, or can not be used for a variety of materials for covering an outside of the hole.
【0051】 [0051]
発明の概要本発明は、対象となる生体分子のハイスループットスクリーニング方法を含む。 The present invention includes a method of high-throughput screening of biological molecules of interest. 本発明においては、液相スクリーニング方法を利用し、対象となる生物活性を混合集団の核酸及び/又は生物に由来する核酸又は核酸ライブラリーから極めて迅速にスクリーニングする。 In the present invention, utilizing a liquid phase screening method, very rapidly screening a nucleic acid or nucleic acid library derived from nucleic acids and / or biological mixtures population bioactivity of interest. これらのライブラリーは、複数の生物、種又は亜種のゲノムに相当し得る。 These libraries, several organisms, may correspond to a species or subspecies of the genome. ある局面において該ライブラリーは、例えば、「バイオパニング」又は活性に基づくスクリーニング方法等のハイブリッド形成法によりスクリーニングされる。 The library In one aspect, for example, is screened by hybridization screening method or the like based on "biopanning" or activity. ハイスループットスクリーニングは、例えば、蛍光細胞選別(FACS)法等の単細胞スクリーニング系の利用により又はキャピラリーアレイに基づく系により実施することができる。 High throughput screening, for example, can be carried out by fluorescence activated cell sorting based systems or capillary array by the use of single cell screening system (FACS) method.
【0052】 [0052]
したがって、1つの態様において本発明は、対象となる特定の活性を有するクローンを同定する方法を提供するものであり、(i)生物の混合集団から単離された核酸に由来する1つ又は複数の遺伝子ライブラリーを作製する段階、及び(ii)該ライブラリーをハイスループット細胞解析装置、例えば、蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置を利用することによりスクリーニングし、該クローンを同定する段階を含む。 Accordingly, the present invention in one aspect, provides a method to identify a clone having a specific activity of interest, one or more from a nucleic acid isolated from a mixed population of (i) the organism step to prepare a gene library, and (ii) the library high-throughput cell analysis apparatus, for example, screening by utilizing fluorescent cell sorter or non-optical cell sorter, the step of identifying the clones including.
【0053】 [0053]
より具体的には、本発明は、(i)1つ又は複数のライブラリー、例えば、生物の混合集団から直接又は間接的に単離した核酸を含むよう作成された発現ライブラリーを作製する段階、(ii)該ライブラリーを特定の基質又は対象となる基質にさらす段階、(iii)さらした当該ライブラリーをハイスループット細胞解析装置、例えば、1つの基質または複数の基質と反応するクローンを同定する蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置を利用し、スクリーニングする段階により対象となる特定の活性を有するクローンを同定する段階を提供する。 Step More particularly, the present invention is to produce a (i) 1 or more libraries, for example, an expression library created to include direct or indirect isolated nucleic acid from a mixed population of organisms , (ii) the step of exposing the library to a substrate made of a particular substrate or target, (iii) high-throughput cell analysis apparatus the library exposed, for example, identify clones that react with one substrate or multiple substrates fluorescence using cell sorter or non-optical cell sorter, provides a step of identifying the clones having the specified activity of interest by the step of screening for.
【0054】 [0054]
また、別の局面において本発明は、(i)生物の混合集団から直接又は間接的に単離した核酸に由来する1つ以上のライブラリーを作製する段階、(ii)さらした当該ライブラリーを、標的の結合現象又は共有結合修飾、及びハイスループット細胞解析装置、例えば、陽性クローンを特定する為の蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置、を必要とするアッセイ法を利用してスクリーニングする段階により、対象となる特定の活性を有するクローンを同定する段階も提供する。 The present invention in another aspect, the step of producing one or more libraries derived from (i) directly or indirectly isolated nucleic acid from a mixed population of organisms, the library was exposed (ii) , binding events or covalent modification of the target, and high-throughput cell analysis apparatus, for example, the step of fluorescence cell sorting apparatus or a non-optical cell sorter for identifying the positive clones, using the assay methods requiring screening by also provides identifying a clone having a specific activity of interest.
【0055】 [0055]
更に、本発明は、標的及び選択可能なマーカーが、組換え細胞において発現された標的タンパク質又は他の細胞構成要素(例えば、核酸)の活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供し、微小環境中に物質と共に標的及び検出可能なマーカーを発現する組換え細胞を封入する段階、及び標的細胞構成要素の活性にかかわる物質の効果を検出する段階によるものである。 Furthermore, the present invention, the target and a selectable marker, the target protein or other cellular components expressed in recombinant cells (e.g., nucleic acid) provides a screening method for a substance that modulates the activity of micro environment in those steps of encapsulating the recombinant cells expressing the target and detectable marker together with substances, and by detecting the effect of a substance involved in the activity of a target cellular component.
【0056】 [0056]
また、別の態様において、本発明は、複数の生物の混合物から得られた標的DNAの混合物と共に検出可能なマーカー及び特定の酵素活性を有する少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも一部のDNA配列を含む混合DNAプローブ及び検出可能なマーカーを封入する段階、相補的配列のハイブリッド形成及び標的DNAのスクリーニングを可能とするような時間及び条件下で同時封入された混合物をインキュベーションする段階によりDNA試料中の、少なくとも1つの特定の活性の少なくとも一部のコード領域を含む標的DNA配列を濃縮する方法を提供する。 Further, in another aspect, the present invention is, at least a portion of the DNA sequence encoding at least one enzyme having a detectable marker and a particular enzymatic activity with a mixture of target DNA obtained from a mixture of a plurality of biological the step of enclosing the mixed DNA probe and detectable marker include, by step of incubating the co-encapsulated mixture for a time and under conditions which allow for the screening of hybridization and the target DNA complementary sequences in a DNA sample provides a method of concentrating a target DNA sequence comprising at least a portion of the coding region of at least one specific activity. 選択的には、本方法は、宿主細胞に回収した標的DNAを導入し、多数のクローンの発現ライブラリーを作成する段階を更に含む。 Optionally, the method includes introducing the target DNA recovered in the host cell, further comprising the step of generating an expression library of a large number of clones.
【0057】 [0057]
更に、本発明は、該物質と共に第1の被験タンパク質及び第2の被験タンパク質を適切な微小環境に同時封入する段階、及び一方のDNA結合部分と連結した第1の被験タンパク質の共有結合により一方の転写活性部分と連結した第2のタンパク質との相互作用を調節する物質の能力を決定する段階により一方のDNA結合部分と連結した第1の被験タンパク質の一方の転写活性部位と連結した第2の被験タンパク質との相互作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供し、該物質が検出可能なタンパク質の発現を増強又は抑制するものである。 Furthermore, the present invention is one by the covalent attachment of a first test protein linked to the first test protein and a second test protein phase simultaneously encapsulated in a suitable microenvironment, and one of the DNA-binding moiety with the substance the second was connected to one transcriptional active site of the first test protein linked with one of the DNA-binding moiety by determining the ability of a substance to modulate the interaction with the second protein linked to a transcription activity portion of provides a screening method for a substance that modulates the interaction of the test proteins, one in which the substance to enhance or inhibit the expression of the detectable protein.
【0058】 [0058]
また、別の局面において本発明は、少なくとも1つの生物、例えば、微生物又は植物組織を含む生物の混合集団等に由来する複数のポリヌクレオチドと少なくとも1つの核酸プローブとを相補的配列を有するポリヌクレオチドへのプローブのハイブリッド形成を可能にする条件下で接触させる段階を含み、該プローブが検出可能な分子(例えば、蛍光性、磁気性等の分子)で標識された液相中のポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。 The present invention in another aspect, at least one organism, for example, a polynucleotide having a complementary sequence and at least one nucleic acid probe and a plurality of polynucleotides derived from a mixed population of organisms, and the like containing microorganisms or plant tissue said method comprising contacting under conditions that allow hybridization of the probe to the identification, the probe is detectable molecules (e.g., fluorescent, molecules of the magnetic properties and the like) polynucleotides in the liquid phase, labeled with to provide a method for. プローブがライブラリー中の標的ポリヌクレオチドと相互作用すると、検出可能分子は変化し、例えば蛍光を発する。 When the probe interacts with the target polynucleotide in a library, the detectable molecule may vary, for example fluoresce. ライブラリーのクローンは検出可能分子における変化、例えば、蛍光、磁場、又は誘電特性等を検出する解析装置により分離される。 Changes in clones detectable molecule libraries, for example, fluorescent, are separated by an analysis device for detecting a magnetic field, or dielectric properties. また、検出可能な当該分子は生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱性分子、又は酵素基質であってもよい。 Moreover, detectable the molecule bioluminescent molecules, chemiluminescent molecules, colorimetric molecules, electromagnetic molecules, isotopes molecules may be febrile molecule, or an enzyme substrate. 分離されたクローンは、例えば、対象となる低分子又は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系により接触することができ、レポーター系の発現又は活性を調節できるクローンが同定され、その結果、対象となるポリヌクレオチドを同定できる。 Isolated clones, for example, the subject small molecules or may be contacted by a reporter system to identify polynucleotides encoding the polypeptide, clones capable of modulating the expression or activity of the reporter system is identified, as a result , it can be identified polynucleotide of interest. 当該態様における液相は溶液中(無細胞)、細胞内又は非固相中を含む。 Liquid phase solution in the embodiment (cell-free), including intracellular or non-solid medium.
【0059】 [0059]
また別の態様において、本発明は、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a method for identifying a polynucleotide encoding a polypeptide of interest. 本方法は微小環境中に生物の混合集団より得られたDNAを含む複数のライブラリークローンと共に検出可能なマーカー及び特定の生物活性を有する対象となるポリペプチドをコードする少なくとも一部のポリヌクレオチド配列を含む混合オリゴヌクレオチドプローブを同時封入する段階を含む。 The method of at least a portion of the polynucleotide sequence encoding a polypeptide of interest having a detectable marker and a particular biological activity with multiple library clones containing DNA obtained from a mixed population of organisms microenvironment comprising the step of simultaneously encapsulating mixed oligonucleotide probes comprising. 封入された該クローンは相補的配列及び検出可能なマーカーを検出する蛍光解析装置又は非光学解析装置によりクローンを分離することにより同定される対象となるポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖を含むクローンとの相互作用を可能とするような時間及び条件下でインキュベーションされる。 Encapsulated the clones complementary strand to an oligonucleotide probe encoding a polypeptide of interest identified by separating the clones by fluorescence analyzer or non-optical analysis system for detecting a complementary sequence and detectable marker It is incubated for a time and under conditions which allow for interaction with clones containing.
【0060】 [0060]
また、別の態様において、本発明は、対象となる分子をコードする対象となるポリヌクレオチドの為のポリヌクレオチドライブラリーのハイスループットスクリーニング方法を提供する。 Further, in another aspect, the present invention provides a method of high-throughput screening of polynucleotide library for polynucleotide of interest encoding a molecule of interest. 該方法は、生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーと検出可能な分子により標識された複数のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる段階であり、検出可能な当該分子はライブラリー中の標的ポリヌクレオチドとプローブが相互作用することにより検出可能となるもの、検出可能なマーカーを検出する解析装置によりクローンを分離する段階、分離したクローンを対象となる分子をコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系に接触させる段階、及びレポーター系の発現又は活性の調節が可能なクローンを同定し、その結果、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階を含む。 The method is a step of contacting a plurality of oligonucleotide probe labeled with a detectable molecule library comprising a plurality of clones containing polynucleotides derived from a mixed population of organisms, detectable the molecule that the target polynucleotide and probes in the library can be detected by interacting, separating the clones by analyzing apparatus for detecting a detectable marker, a polynucleotide encoding the molecule of interest to separate clones the step of contacting the reporter system to identify, and modulation of the expression or activity of the reporter system to identify clones capable, as a result, including the step of identifying a polynucleotide of interest.
【0061】 [0061]
また、別の態様において、本発明は、対象となる活性をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法を提供する。 Further, in another aspect, the present invention provides a method of screening a polynucleotide encoding an activity of interest. 本方法は、(a)生物の混合集団を含む試料よりポリヌクレオチドを得る段階、(b)試料より得られたポリヌクレオチドを規準化する段階、(c)規準化されたポリヌクレオチドよりライブラリーを作成する段階、(d)ライブラリーを検出可能なマーカー及び対象となる配列に対して陽性のライブラリークローンを選択する特定の活性を有する対象となるポリペプチドをコードする少なくとも一部のポリヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる段階、(e)マーカーを検出する解析装置(例えば、蛍光又は非光学解析装置)によりクローンを選択する段階、(f)選択したクローンと対象となる活性をコードするポリヌクレオチドを特定するレポーター系を接触させる段階、及び(g)レポーター系の発 The method comprises obtaining polynucleotide from the sample containing a mixed population of (a) an organism, the step of normalizing a polynucleotide obtained from (b) samples, the libraries from (c) normalized polynucleotide the step of creating, (d) at least a portion of the polynucleotide sequence encoding a polypeptide of interest having a specific activity of selecting positive library clones against detectable marker and subject to sequence libraries the step of contacting a plurality of oligonucleotides probes comprising the steps, activity that clone and the target selected (f) selecting clones the analysis device for detecting (e) marker (e.g., fluorescent or non-optical analysis system) stage contacting a reporter system to identify polynucleotides encoding, and (g) calling the reporter system 又は活性の調節が可能なクローンを同定することにより、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階を含み、当該陽性クローンが生物活性基質に対する触媒となり得る対象となる活性をコードするポリヌクレオチド配列を含む。 Or by modulating the activity to identify clones capable, comprising the step of identifying a polynucleotide of interest, the positive clone comprising a polynucleotide sequence encoding the activity of interest that can be a catalyst for bioactive substrate.
【0062】 [0062]
また、別の態様において、本発明は、対象となる配列に対して陽性のライブラリーポリヌクレオチドを選択する為に、ライブラリーの標的ポリヌクレオチドにプローブが結合した際に検出可能となる検出可能分子により標識ラベルされたプローブオリゴヌクレオチドと生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドのライブラリーが接触する段階、該分子を検出する解析装置により対象となる配列に対して陽性のライブラリー構成物を分離する段階、ポリペプチドを得るために選択されたポリヌクレオチドを発現する段階、該ポリペプチドをレポーター系と接触させる段階、及び、該レポーター系の発現又は活性の調節が可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する段階を含むポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。 Further, in another aspect, the present invention is to select the positive library polynucleotide against the sequence of interest, the detectable molecule probe to the target polynucleotide of a library is detectable upon binding separating the library members of the positive for the sequence of interest by labeling the labeled steps of the library of polynucleotides derived from a mixed population of the probe oligonucleotide and biological contacts, analyzing apparatus for detecting a molecule by step, the step of expressing the selected polynucleotide to obtain a polypeptide, said polypeptide the step of contacting a reporter system, and a polynucleotide encoding the polypeptide capable modulation of the expression or activity of said reporter system It provides a method of screening for a polypeptide comprising the step of identifying.
【0063】 [0063]
別の態様において、本発明は、試料中の生物の混合集団より生物を得る方法を提供する。 In another aspect, the present invention provides a method of obtaining a biological from a mixed population of organisms in the sample. 本方法は、試料より少なくとも1つの生物を微小環境に封入する段階、少なくとも1つの微生物が成長又は増殖できる程度の時間及び条件下でフローサイトメトリーにより封入された生物を選別する段階を含む。 The method includes encapsulating at least one biological than sample microenvironment, including the step of selecting the encapsulated by flow cytometry at a time and under conditions of a degree at least one microorganism can grow or grow the organism.
【0064】 [0064]
別の態様において、本発明は、液相中のポリヌクレオチドを同定する方法を提供し、以下の段階を含む: In another aspect, the present invention provides a method of identifying a polynucleotide of the liquid phase, comprising the steps of:
a)プローブが相補的配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッドを形成することを可能にする条件下において、少なくとも1つの生物に由来する複数のポリヌクレオチドと少なくとも1つの核酸プローブを接触させる段階であり、該プローブが検出可能な分子により標識されている段階、及びb)検出可能な分子を検出する解析装置により対象となるポリヌクレオチドを同定する段階。 Under conditions that a) the probe makes it possible to form a polynucleotide hybridizing with a complementary sequence, a step of contacting at least one nucleic acid probe and a plurality of polynucleotides derived from at least one organism, the identifying a probe stage that is labeled with a detectable molecule, and b) a target by analyzing apparatus for detecting a detectable molecule polynucleotide.
【0065】 [0065]
本発明の別の態様において、試料のスクリーニング装置は、複数のキャピラリーが近接するキャピラリーのアレイを形成しているものを含み、各キャピラリーは試料を保持する為の内腔を定める少なくとも1つの壁を含む。 In another aspect of the present invention, the screening device of the sample include those plurality of capillaries are formed an array of capillaries adjacent, each capillary at least one wall defining a lumen for retaining a sample including. 更に、該装置は、アレイ中で近接するキャピラリー間に廃棄された間隙物質、及び、間隙物質中に形成した1つ以上の参照用指標(reference indicia)を含む。 Furthermore, the apparatus includes a gap material which is discarded between capillaries adjacent in the array, and one or more reference indices formed in the gap material (reference indicia).
【0066】 [0066]
本発明の別の態様においては、試料をスクリーニングする為のキャピラリーは試料を保持する為の内腔を定める第1の壁、及び試料を励起させる為に内腔に供給される励起エネルギーを濾過するためのフィルター素材により形成される第2の壁を含み、該キャピラリーはキャピラリーのアレイ中に固定するのに適合している。 In another aspect of the present invention, the capillary for screening a sample for filtering a first wall, and the excitation energy supplied to the lumen of the sample in order to excite defining a lumen for retaining a sample It includes a second wall formed by the filter material for, the capillary is adapted to be fixed to the array of capillaries.
【0067】 [0067]
また、本発明の別の態様において、生物活性又は対象となる生体分子をインキュベーションする方法は、第1の成分をキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部に導入する段階を含み、該キャピラリーアレイの各キャピラリーは第1の成分を保持し、キャピラリー内の第1の成分の後ろに気泡を導入する為の内腔を定める少なくとも1つの壁を含む。 Further, in another aspect of the present invention, a method of incubating a biological molecule of biological activity or subject, said method comprising the first component is introduced into at least a portion of the capillary of a capillary array, each capillary of the capillary array comprises at least one wall defining a lumen for retaining the first component, introducing air bubbles behind the first component in the capillary. 該方法は、更に、第2の成分をキャピラリー内に導入する段階も含み、第2の成分は気泡により第1の成分と分離している。 The method further a second component also includes the step of introducing into the capillary, the second component is separated from the first component by the bubbles.
【0068】 [0068]
また、本発明の別の態様において、対象となる試料をインキュベーションする方法は、キャピラリーアレイのキャピラリーに検出可能な粒子により標識した第1の液体を導入する段階を含み、該キャピラリーアレイの各キャピラリーは検出可能な粒子及び第1の液体を保持する為の内腔を定める少なくとも1つの壁を含み、少なくとも1つの壁は検出可能な粒子を少なくとも1つの壁に結合する為の結合剤に覆われている。 Further, in another aspect of the present invention, a method of incubating a sample of interest, comprising the step of introducing a first liquid labeled with a detectable particle into a capillary of a capillary array, each capillary of the capillary array comprising at least one wall defining a lumen for retaining the detectable particle and the first liquid, at least one wall is covered with a binder for binding at least one wall of the detectable particles there. 更に、該方法は、キャピラリー管より第1の液体を除去する段階であり、結合した検出可能な粒子はキャピラリー内に保持される段階、及び、該キャピラリー管内に第2の液体を導入する段階を含む。 Furthermore, the method is removing the first liquid from the capillary tube, step detectable particle bound is held in the capillary, and, the step of introducing a second liquid into the capillary tube including.
【0069】 [0069]
本発明の別の態様は、試料スクリーニング系用の回収装置を含み、当該系はアレイを形成した複数のキャピラリーを含む。 Another aspect of the invention includes a collecting device for sample screening system, the system comprises a plurality of capillaries to form the array. 回収装置はキャピラリーアレイの少なくとも1つのキャピラリーに接触し、少なくとも1つのキャピラリーより試料を回収する為に適合した回収ツールを含む。 Recovery device in contact with at least one capillary of a capillary array, including recovery tool adapted to collect a sample from the at least one capillary. 更に、該回収装置は回収ツールから回収した試料を排出する為の回収ツールと接続した排出装置も含む。 Moreover, the recovery device also includes discharging device connected with the recovery tool for discharging the collected sample from the recovery tool.
【0070】 [0070]
発明の詳細な説明本発明は、例えば、環境試料もしくは生物の非培養集団等の、生物の混合集団に由来するライブラリーの迅速な選別およびスクリーニングの方法を提供するものである。 Detailed Description of the Invention The present invention, for example, such as uncultured population of environmental samples or biological, is to provide a method for rapid screening and screening of the library derived from a mixed population of organisms. ある態様においては、遺伝子ライブラリーを作製し、クローンを対象となる単一または複数の基質に対し暴露する、もしくは対象となる配列に対応した配列を有する蛍光標識プローブに対しハイブリダイゼーションを行い、蛍光細胞選別法で陽性クローンを単離・同定する。 In some embodiments, to prepare a gene library, clone exposed to single or multiple substrates of interest for, or subjected to hybridization to fluorescently labeled probes having a sequence corresponding to the sequence of interest, fluorescent isolate and identify the positive clones in cell sorting. 陽性活性をコードする核酸を当技術分野で公知の技術を利用してクローニング・単離することが可能である限りにおいて、この段階もしくはこの段階の最後段階で、細胞は生細胞であっても死細胞であってもよい。 Death as long as the nucleic acid encoding the positive activity which are capable of cloning isolated using techniques known in the art, at this stage or last stage of this phase, also the cell is a living cell a cell may be.
【0071】 [0071]
複数の局面において、本発明は通常行われる蛍光細胞選別法とは異なる。 In several aspects, the present invention is different from the ordinary fluorescent cell sorting to be performed. 従来、真核細胞・原核細胞株の分析、細胞培養過程に関する研究においては、FACS装置が使用されてきた。 Conventionally, analysis of eukaryotic cells, prokaryotic cell line, in the study on cell culture processes, FACS devices have been used. また、例えば、差分的遺伝子発現の研究において、それぞれ真核生物および原核生物における外来遺伝子生産を追跡する際にも、FACSは利用されてきた。 Further, for example, in the study of differential gene expression, even in tracking foreign gene product in eukaryotes and prokaryotes, respectively, FACS has been used. FACSシステムの検出能および算出能は、このような例に応用されてきたのである。 Detection capacity and calculation ability of FACS systems are had been applied to such an example. しかし、原核生物における生物活性のスクリーニングおよび回収を実施する検出段階において、FACSが利用されたことは、かつて一度もない。 However, in the detection step to carry out the screening and recovery of biological activity in prokaryotes, the FACS is utilized, nor ever once. また、新規生物活性もしくは生体分子の同定もしくは発見に、非光学的方法が用いられたこともない。 Further, the identification or discovery of new biologically active or biomolecules, nor non-optical method is used. さらに、本発明では、上記の技術を用いる限り、細胞は生細胞である必要性はない。 Furthermore, in the present invention, as long as using the above technique, the cells do not need a living cell. なぜなら、所望の核酸(組換えクローン)は生細胞からでも死細胞からでも得ることが可能なためである。 This is because, the desired nucleic acid (recombinant clones) is because it is possible to obtain even from dead cells from any living cell. 例えば、検出すべき相補的核酸配列を含む、保持する、もしくは合成するために要する時間においてのみ細胞が生存していれば充分であり、その後はその相補的配列が無傷のまま保持されている限り、細胞は生細胞であっても死細胞であっても構わないのである。 For example, including to be detected complementary nucleic acid sequence, retain, or are sufficient if cells survive only in the time required to synthesize, then as long as its complementary sequence is kept intact , cells are not may be dead cells even living cells. さらに、本発明は、組換え酵素を発現する大腸菌の検出、選別、およびコードする核酸の回収に関連した問題を解決するものである。 Furthermore, the present invention is to solve the detection of E. coli expressing recombinant enzyme, sorting, and code associated with the recovery of nucleic acids problems. 態様の範囲内において、本発明は対象となる生物活性もしくは生体分子の指標となる分子もしくはマーカーを検出する検出器(光学的、および非光学的機器を含む)を含む。 Within aspect, the present invention includes a detector for detecting a molecule or marker is indicative of the biological activity or biological molecule of interest (optical, and including non-optical devices). ある態様においては、その態様の範囲内で、本発明は、生体物質に関する蛍光波長を検出可能な機器をも含むものである。 In some embodiments, within the scope of its aspects, the present invention also includes a detectable devices fluorescence wavelength for biological materials. 本明細書においては、かかる機器を蛍光分析機と呼ぶ(その一例は、FACS装置である)。 In the present specification, such a device is referred to as fluorescence analyzer (an example is a FACS device).
【0072】 [0072]
例えば、生物の混合集団を含む環境試料由来の新規酵素をコードする遺伝子を、直接クローニングするための方法であって、培養を用いない方法を利用することによって、生物の多様性に関していまだ利用されていない資源が利用可能となる。 For example, a gene encoding a novel enzyme derived from environmental samples containing a mixed population of organisms, a method for cloning directly, by utilizing the method not using the culture, yet utilized for biological diversity no resources are made available. ある態様において、本発明の基礎となるものは「混合集団ライブラリー」の構築である。 In some embodiments, the basis for the present invention is the construction of "mixed population library". 「混合集団ライブラリー」とは、適切な原核生物宿主中で増殖可能なクローニングべクターに挿入された天然生物のゲノムの集合を表している。 The "mixed population library" represents a set of genomic insertion natural organism can proliferate cloning base compactors in suitable prokaryotic hosts. クローニングしたDNAはもともと環境試料から直接抽出したものであるため、ライブラリーは純培養で増殖し得る原核生物の一部のみに限定されるものではない。 Because the cloned DNA is that originally extracted directly from environmental samples, the libraries are not limited only to a part of prokaryotic organisms that may grow in axenic. さらに、これら試料中のDNAを標準化することで、もともとの試料に含まれる全種に由来するDNAの、種類に関する均一性をさらに高めることが可能となる。 Furthermore, to standardize the DNA of these samples, the DNA from all species contained in the original sample, it is possible to further enhance the uniformity about the type. これにより、試料中の優性な種と比べて数桁少ない劣勢な構成種に由来する対象となる遺伝子を見出す効率を高めることができる。 Thus, it is possible to increase the efficiency of finding a gene of interest from several orders of magnitude less inferior construction species compared with dominant species in the sample.
【0073】 [0073]
本発明以前は、複雑な混合集団の発現ライブラリーに関する評価の実施が律速段階となっていた。 Prior to the present invention, implementation of the evaluation of an expression library of complex mixed population has been a rate-determining step. 本発明によって、例えば、数千種類の異なる生物に由来する遺伝子を含む複雑な混合集団ライブラリーの迅速スクリーニングが可能となった。 The present invention, for example, rapid screening of complex mixed population library containing genes from thousands of different organisms is made possible. 本発明は、例えば、複雑な混合集団の試料のスクリーニングにおいて、その利点を発揮する。 The present invention is, for example, in screening a sample of complex mixed population, exert their advantages. 複雑な試料のスクリーニングを実施するために、従来は、ゲノムの生物学的多様性を網羅する数百万種類のクローンをスクリーニングするために、極めて骨の折れる方法を用いざるを得なかった。 To perform the screening of complex samples, conventionally, for screening millions types of clones to cover biological diversity of the genome, it was forced using methods very laborious. 本発明は極めて高効率の方法であり、かかる膨大な数にのぼるクローンを容易に扱えるのである。 The present invention is very efficient method is to handle the clone up to such a huge number easily. 本明細書に開示する方法によれば、所望の核酸配列もしくは生理活性を得るために、1時間あたり約30〜200×10 クローン程度のスクリーニングが可能となる。 According to the methods disclosed herein, in order to obtain the desired nucleic acid sequence or bioactive, screening of about 30 to 200 × 10 6 clones per hour it is possible. これにより、新規の生体分子をコードするクローンを取得するために、混合集団ライブラリーを網羅的にスクリーニングすることができる。 Thus, in order to obtain clones encoding the novel biomolecule, it can be comprehensively screen the mixed population library.
【0074】 [0074]
本発明は、試料中のポリヌクレオチド配列に基づいて、生物の混合集団(例えば、混合集団試料中の生物)から、対象となるポリヌクレオチド配列、ポリペプチド、もしくは分子をスクリーニング、選別、もしくは同定するための方法および組成物を提供する。 The present invention is based on the polynucleotide sequence in a sample, a mixed population of organisms (e.g., organisms mixed population sample) from a polynucleotide sequence of interest, the polypeptide or screening molecules, sorting, or identifying It provides methods and compositions for. すなわち、本発明は、所望の生理活性もしくは生物学的配列を得るための生物スクリーニングに有用であり、特異的進化法、分子生物学、バイオテクノロジー、および産業的応用においてさらに利用可能な対象となる配列の取得を支援する方法および組成物を提供する。 That is, the present invention is useful for biological screening to obtain the desired physiological activity or biological sequences, the more available target in the directed evolution method, molecular biology, biotechnology, and industrial applications It provides methods and compositions to assist in the acquisition of sequence. 試料中に存在する核酸配列のスクリーニングおよび同定を行うことによって、本発明は、診断薬、治療薬、もしくは産業的応用可能な分子の開発に利用しうる取得可能な配列のレパートリーを増加させる。 By performing the screening and identification of nucleic acid sequences present in the sample, the present invention is a diagnostic agent, therapeutic agent, or increase the repertoire of acquirable sequences may be utilized in the development of industrial applications possible molecules. 従って、本発明の方法では、所望の生理活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする新規核酸配列を同定することが可能となる。 Accordingly, in the method of the present invention, it is possible to identify novel nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide possessing a desired physiological activity.
【0075】 [0075]
一態様においては、本発明は効率の高い生物培養法を提供する。 In one aspect, the present invention is to provide a highly efficient biological culture method. 一局面においては、この生物は生物の混合集団である。 In one aspect, the organism is a mixed population of organisms. 別の局面においては、この生物は核酸を含むライブラリーの宿主細胞を含む。 In another aspect, the organism comprises a host cell library comprising a nucleic acid. 例えば、このようなライブラリーは、単離した各種の生物から得られる核酸をプールしたもの、単離したライブラリーから得た核酸をプールしたもの、もしくは生物の混合集団から直接的に得た核酸等を含む。 For example, such libraries are those in which the nucleic acids obtained from the isolated various biological pool, those nucleic acids obtained from a library isolated and pooled, or nucleic acids obtained directly from a mixed population of organisms and the like. 通常、本明細書の記載の生物を含む試料は、微小環境を構成する組成物(例えば、ゲル微小液滴もしくはリポゾーム)と混合する。 Usually, a sample comprising biological described herein, is mixed with a composition that constitutes the microenvironment (e.g., gel microdroplets or liposomes). 一局面においては、実施例8の例示にあるように、好ましくは、5種類未満の微生物で封入されるような方法を用いて、微生物の混合集団を封入性の物質と混合する。 In one aspect, as in the exemplary embodiment 8, preferably 5 using methods such as encapsulated with fewer than microorganisms, mixing a mixed population of microorganisms and encapsulating substances. 単一の微生物細胞のみが、各微小環境に封入されることが好ましい。 Only a single microbial cell is preferably sealed in the microenvironment.
【0076】 [0076]
封入後、生物増殖が可能な方法で細胞を培養させる(例えば、ライブラリーの宿主細胞)。 After encapsulation, to culture the cells in an organism growth possible methods (e.g., a library host cell). 例えば、実施例8に示されているのは、増殖のための栄養を供給する増殖培地の流入、および細胞由来の老廃物を除去する流出を可能とするクロマトグラフィー・カラム中での封入生物の増殖である。 For example, what is shown in Example 8, the nutrition supply growth medium for growth influx, and cell-derived waste permit outflow of removing that encapsulation organisms in chromatographic columns a growth. 一定時間(20分から数週間もしくは数ヶ月)後に、好ましくは単一の生物に由来するクローン集団が微小環境中で増殖する。 Predetermined time (several weeks or months to 20 minutes) after, preferably grow in clonal population microenvironment during derived from a single organism.
【0077】 [0077]
必要な時間が過ぎた後、これらの微小環境(例えば、微小液滴)を選別して、「空の」微小環境を取り除き、内容物を有する微小環境を得る。 After passing the required time, these microenvironment (e.g., microdroplets) were sorted to remove the "empty" microenvironment obtain microenvironment with the contents. 仕分けした微小環境中の微生物に由来する核酸を直接調べることができる。 Nucleic acid from a microorganism of the microenvironment that sorting can be examined directly. 例えば、選別直後にPCR混合液と混ぜ、増幅を行うことによってこれを行う。 For example, mixed with PCR mix immediately after sorting, do this by performing an amplification. 本明細書に記載の一実施例においては、個々の細胞に由来する16S rRNA遺伝子を調べ、試料に含まれる生物の系統的多様性を評価した。 In one embodiment described herein, it examined the 16S rRNA genes from individual cells were evaluated systematic diversity of organisms contained in the sample.
【0078】 [0078]
別の局面においては、本発明の高効率の培養方法は、低コピー数の標的遺伝子に対応する生物の培養と濃縮を可能にした。 In another aspect, efficient method of culturing of the present invention has allowed the concentration and organism culture which corresponds to a target gene of low copy number. 例えば、単離した各種の生物から得られる核酸ライブラリーをプールしたもの、単離したライブラリーから得た核酸をプールしたもの、もしくは生物の混合集団から直接的に得た核酸を、例えば、(例えば、微小液滴もしくはその他の微小環境に)封入し、その微小環境中で各生物のクローン増幅が可能な条件下で増殖させる。 For example, those in which the nucleic acid library derived from the isolated various biological pool, those nucleic acids obtained from a library isolated were pooled, or the nucleic acids obtained directly from a mixed population of organisms, for example, ( for example, fine liquid droplets or other microenvironment) enclosed, that in microenvironment grown in clonal amplification possible conditions for each organism. 一つの局面においては、クローン集団の細胞を溶解し、タンパク質分解酵素で処理し、核酸を得る(図X参照)。 In one aspect, the cells were lysed in a clonal population, was treated with proteolytic enzymes, to obtain a nucleic acid (see Figure X). (例えば、ゲル微小液滴をプロテイナーゼ Kを含む溶解液中で37℃、30分間反応させて、微小コロニーの脱タンパク質処理を行う。)微小環境中の核酸の変性および中和を行うため、アルカリ変性溶液(0.5 M NaOH)で変性処理し、中和する(例えば、Tris (pH 8)を用いる)。 (E.g., 37 ° C. The gel microdroplets in lysis solution containing proteinase K, and allowed to react for 30 minutes. Performs deproteinized processing microcolonies) for performing denaturation and neutralization of nucleic acid microenvironment, alkaline in denaturing solution (0.5 M NaOH) and modification treatment, neutralized (e.g., using a Tris (pH 8)). 特定の1つの例においては、微小環境中の核酸を、Dig Easy Hyb (ロシュ(Roche)より入手可能)中でジゴキシゲニン(DIG)標識オリゴヌクレオチド(30−50 塩基)と37℃で一晩ハイブリダイズさせ、所望のストリンジェンシーを達成するために0.3 x SSC 溶液および0.1 x SSC 溶液を用い38〜50℃の温度で洗浄を行う。 In one specific example, the micro nucleic acids in the environment, Dig Easy Hyb digoxigenin (DIG) in (Roche (Roche) available from) labeled oligonucleotide (30-50 bases) and hybridized overnight at 37 ° C. It is allowed by a wash at a temperature of 38 to 50 ° C. using a 0.3 x SSC solution and 0.1 x SSC solution to achieve the desired stringency. これは単に例示であって、本発明を限定するものではないことは、当業者であれば理解しうる。 This is merely illustrative and do not limit the present invention may be understood by those skilled in the art. 例えば、当技術分野で通常用いられる他の標識(例えば、GFP等の蛍光標識、もしくは化学発光標識)は、本発明の方法においても利用することができる。 For example, other labels commonly used in the art (e.g., a fluorescent label such as GFP or chemiluminescent labels) can also be utilized in the methods of the present invention.
【0079】 [0079]
核酸は、好適に標識したプローブとハイブリッド形成させる。 Nucleic acid, is suitably labeled probe hybridized. シグナルを第2の標識(例えば、蛍光)で増幅し、核酸を蛍光微小環境(例えば、ゲル微小液滴)によって選別することができる。 Signal second label (e.g., fluorescence) was amplified in a nucleic acid fluorescence microenvironment (e.g., gel microdroplets) can be selected by. 蛍光を発する核酸を単離して、さらに調べ、または次段階の操作のために宿主細胞にクローニングすることができる。 The nucleic acid to emit fluorescence can be isolated and further studied, or cloning into a host cell for the operation of the next step. 特定の例においては、モレキュラー プローブ(Molecular Probe)社のチラミドシグナル増幅(Tyramide Signal Amplification)(TSA) キットを利用してシグナルを増幅する。 In a particular example, using a Molecular probes (Molecular Probe) Inc. tyramide signal amplification (Tyramide Signal Amplification) (TSA) kit to amplify the signal. TSAは、蛍光チラミドを沈着させ、インサイチューで標的核酸配列の高密度標識を行うために西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を利用した酵素シグナル増幅法である。 TSA is deposited fluorescent tyramide is an enzyme signal amplification method using a horseradish peroxidase (HRP) in order to perform high density labeling of the target nucleic acid sequence in situ. このシグナル増幅は、HRP1分子あたり複数分子のチラミド基質を利用することによって達成され、これによってシグナル強度が1,000倍以上に増強されることが報告されている。 The signal amplification is achieved by utilizing a tyramide substrate a plurality of molecules per HRP1 molecule, whereby the signal strength is reported to be enhanced more than 1000-fold. 本法は、GMD と抗DIG結合西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体(DIG−HRP抗体)(ロシュ、IN)を混合して3時間室温で反応する。 This method is, GMD and anti-DIG bound horseradish peroxidase antibody (DIG-HRP antibody) (Roche, IN) to react for 3 hours at room temperature by mixing. 次に、チラミド基質溶液を加え、30分間室温で反応する。 Then added tyramide substrate solution and reacted at room temperature for 30 minutes.
【0080】 [0080]
一局面においては、この高効率の培養法を用いた後、選別(例えば、FACS)、スクリーニング(例えば、バイオパニング)を実施することによって、標的遺伝子を同定することができる。 In one aspect, after using the culture method of this high efficiency, sorting (e.g., FACS), screening (e.g., biopanning) by can be performed to identify the target genes. 実際に何らかのタンパク質もしくは生理活性をコードする核酸をスクリーニングする、およびこのような核酸を多様な生物種の試料間で比較する(例えば、混合集団に由来するポリケチド配列を調べる)必要性が生じる場合がある。 Actually screening for nucleic acid encoding any protein or bioactive, and such nucleic acids compared between various species of the sample (e.g., examine the polyketide sequence derived from a mixed population) may need arises is there. 別の局面においては、生物の高効率な培養法で得られた核酸はさらに、研究に利用する、もしくはライブラリーの調製に利用する。 In another aspect, nucleic acid obtained by high efficient culture organisms further used for research, or utilized in the preparation of the library. このような核酸をプールして、ライブラリーを作製することができる。 Such nucleic acid can be pooled and create a library. または、生物のクローニング集団に由来するライブラリーを個々に作製し、より複雑なライブラリーを作製するためにこれらのライブラリーから得た核酸をプールすることもできる。 Or, to prepare individually the library derived from cloned population of organisms, may be pooled nucleic acids obtained from these libraries to generate more complex libraries. 本明細書の記載に従って作製したライブラリーは、生体分子(例えば、核酸もしくは生理活性)の発見、もしくは、本明細書に記載の高効率培養法で同定した核酸分子を進化させるために利用できる。 Library prepared as described herein, the biological molecules (e.g., nucleic acid or bioactive) discovery, or can be used to evolve nucleic acid molecule identified with high efficiency culture methods described herein. かかる進化法は、当技術分野で公知の方法もしくは本明細書に記載の方法である(例えば、シャッフリング法、カセット変異法、リカーシブ・アンサンブル変位誘発法、セクシャルPCR、特異的進化法、エキソヌクレアーゼ媒介再構成法、コドン部位飽和変異法、アミノ酸部位飽和変異法、遺伝子部位飽和変異法、非確率論的ポリヌクレオチド再構成法による変異導入、合成的ライゲーションによるポリヌクレオチド再構成法、遺伝子再構成法、オリゴヌクレオチド特異的飽和変異法、部分的相同性を有するポリヌクレオチド配列のインビボ再集合法、配列の複雑度を低減する自然組換え、およびそれらの組み合わせ)。 Such evolution is a method according to a known method or the specification in the art (e.g., shuffling, cassette mutagenesis, recursive ensemble displacement mutagenesis, sexual PCR, directed evolution methods, exonuclease mediated reconstruction, codon site-saturation mutagenesis, amino acid site-saturation mutagenesis, gene site saturated mutagenesis, mutagenesis by non-stochastic polynucleotide reconstruction method, polynucleotide reconstruction method with synthetic ligation, gene reconstruction method, oligonucleotides specific saturation mutagenesis, in vivo reassortment of polynucleotides sequence having partial homology, natural recombination to reduce the complexity of the sequences, and combinations thereof).
【0081】 [0081]
フローサイトメトリーは、現存する細胞クローンの変異種のクローニングおよび選択に利用されてきた。 Flow cytometry has been utilized in the variant of the cloning and selection of existing cell clones. しかし、この選択を行うには、受動的、迅速かつ不可逆的にまんべんなく細胞を染色することが必要であり、これは毒性効果を与えるもしくは代謝または生理学的過程に影響を与えるものであってはならない。 However, to do this selection, passive, it is necessary to stain rapidly and irreversibly evenly cells, which must not affect or metabolic or physiological process gives toxic effects . 通常、フローサイトメトリーによる選別法は、動物細胞の培養能、細胞の生理学的状態、および細胞周期等の研究に利用されてきた。 Normally, the sorting by flow cytometry, culture ability of animal cells, have been utilized physiological state of the cell, and to study cell cycle or the like. 従って、細胞の選別法では、選別中もしくは選別後に細胞が生きた状態で保たれていることが必要とされてきた。 Thus, the sorting of the cells, it has been required that is kept in a state in which cells alive after sorting in or sorting.
【0082】 [0082]
蛍光(例えば、蛍光による細胞の選別)もしくは非光学的マーカー(例えば、磁場等)を用いた細胞の選別法によって、ライブラリー中のポリヌクレオチド配列をスクリーニングする、もしくは発見することに関する報告は現在のところ存在しない。 Fluorescence (e.g., fluorescence cell sorting by) or non-optical markers (e.g., magnetic fields, etc.) by the sorting of cells with reports on screening polynucleotide sequence in the library, or to discover the current It does not exist place. さらには、FACSもしくは非光学的技術でスクリーニングした生理活性をコードするDNAの回収、および、さらに対象となる生理活性のスクリーニングに関する報告も存在しない。 Furthermore, the recovery of DNA encoding the bioactive screened by FACS or non-optical techniques, and reported not present further relates to the screening of bioactive of interest. 本発明は、所望の活性を回収する、もしくはこれらの活性をコードする核酸を回収するための、生細胞もしくは死細胞の極めて迅速なスクリーニングを可能にする方法を提供するものである。 The present invention is to provide a method that allows a very rapid screening of desired the recovered activity, or for recovering a nucleic acid encoding these activities, live cells or dead cells.
【0083】 [0083]
蛍光およびその他の方法による染色は、微生物を判別する、および同定するために利用されている。 Staining with fluorescent and other methods have been utilized to determine the microorganisms and identified. また、薬剤や抗生物質と微生物細胞との相互作用を分析するために利用されている。 Also it has been used to analyze the interaction of the drug and an antibiotic and the microbial cells. フローサイトメトリーは水生生物学に利用されてきた。 Flow cytometry has been used in aquatic biology. 光合成色素の自家蛍光を用いて藻類の識別を行ったり、DNA染色により海中分布を定量的に調べたりするのである(DaveyおよびKell、1996)。 Or perform identification of algae using autofluorescence photosynthetic pigments, it is to examine or underwater distribution quantitatively by DNA staining (Davey and Kell, 1996). ダイパー(Daiper)とエドワーズ(Edwards)は、フルオレセイン二酢酸(FDA)誘導体、および懸濁液中の生きたバクテリアを検出するための市販の染色剤であるケムクロム(ChemChrome)B、を含む一連の蛍光性エステルで染色した後、バクテリアの生細胞を検出するために、フローサイトメトリーを用いた(DiaperおよびEdwards、1994)。 Daipa (Daiper) and Edwards (Edwards), a series of fluorescence including Kemukuromu (ChemChrome) B, a commercially available stain for detecting live bacteria fluorescein diacetate (FDA) derivatives, and suspension after staining with sex ester, in order to detect the live cells of bacteria, using flow cytometry (Diaper and Edwards, 1994). このような目的のために、標識抗体および核酸プローブを用いることもある。 For such purpose, sometimes using labeled antibodies and nucleic acid probes.
【0084】 [0084]
真核生物の天然および組換え体酵素の活性検出におけるフローサイトメトリーの利用に関して記載のある論文が発表されている。 There papers have been published stated with respect to the use of flow cytometry in the active detection of native and recombinant enzymes eukaryotic. ベッツ(Betz)等は、フローサイトメトリーを用いて、真核生物である クモノスカビ(Rhizopus arrhizus)による天然の(非組換え体)リパーゼ産生について研究した。 Betts (Betz), etc., using flow cytometry, were studied eukaryotes is a Rhizopus (Rhizopus arrhizus) by the natural (non-recombinant) lipase production. 彼らは、633 nmで励起したときに得られる光散乱のデータに基づき、この黴の胞子の懸濁液が不均一であることを発見した。 They are based on the data of light scattering is obtained when excited at 633 nm, and found that the spore suspension of the mold is not uniform. また、一部の集団を構成するクローンをマイクロタイタープレートのウェルに選別した。 Also, it was selected clones constituting a part of the population in the wells of a microtiter plate. 出芽・増殖後、マイクロタイタープレート上でリパーゼの産生を(濁度法により)自動測定した。 After emergence and proliferation, (by the turbidity method) the production of lipase on microtiter plates was automatically measured. さらに、最も活性の高い代表的な組み合わせを再び単離し直して、培養し、通常の方法で測定した(Betzら、1984)。 Moreover, again isolated most active representative recombined, cultured, was measured in the usual way (Betz et al., 1984). 個々の細胞の発現レベルが高い場合には(例えば、遺伝子増幅もしくはコピー数の高いプラスミドによる等の場合)、フローサイトメトリーによって単一細胞の測定が可能である。 If the expression level of the individual cells is high (for example, in the case of such by high gene amplification or copy number plasmid), it is possible to measure the single cell by flow cytometry.
【0085】 [0085]
発色性もしくは蛍光性の基質を有する細胞は、それぞれ有色もしくは蛍光性の産物を産生する。 Chromogenic or cells with fluorescent substrates, respectively to produce a colored or fluorescent product. 従来は、フローサイトメトリーによる蛍光標識した細胞の選別法では、対象となる分子の酵素活性を細胞内に含む細胞、もしくは通常物理的に結合した細胞の分析に関してのみ利点があると考えられてきた。 Conventionally, in the sorting of fluorescently labeled cells by flow cytometry, it has the enzymatic activity of the molecule of interest believed to be an advantage only for analysis of cells cells, or the normal physically bonded include intracellularly . この場合、細胞内に取り込まれ、そのため潜在的に毒性を有する蛍光性試薬のみが利用可能であった。 In this case, it incorporated into the cells, only the fluorescent reagent having therefore potentially toxic were available. さらに、FACSによる選別および培養の際に、ゲル微小液滴(GMD)を利用することができる。 Furthermore, it is possible during the sorting and cultured by FACS, using gel microdroplets (GMD). 栄養分を取り込み、産物を分泌し、増殖してコロニーを形成する(物理的に)単一の細胞を含むGMDの利用は、本発明にとって有用である。 Uptake nutrients, secrete products, proliferate to form a colony (physically) use of GMD containing single cells are useful for the present invention. 細胞外産物が個々のGMDに充分に保持されるというGMDの拡散に関する性質によって、各微小液滴内の分泌分子の濃度に基づいて、サイトメトリーによる分析および細胞の選別が可能となるのである。 The property on the diffusion of the GMD of extracellular product is sufficiently retained in each GMD, based on the concentration of secreted molecules in each micro-liquid droplets, it become possible to analyze and sorting of cells by cytometry. 異なる速度で増殖する変異体を単離する目的、およびハイブリドーマ細胞による抗体分泌の分析の目的においては、ビーズも利用されている。 Purpose of isolating mutants that grow at different rates, and for the purposes of the analysis of antibody secretion by hybridoma cells, the beads have also been utilized.
【0086】 [0086]
サイトメトリーによる分析で得られるシグナルの増幅、また微生物株の改良、単離において、株のスクリーニングおよび選別において、GMD技術は重要な役割を果たしてきた。 The signal obtained by analysis by cytometry amplification, also improved microbial strains, in isolation, in the screening and selection of strains, GMD technology has played an important role. 本発明では、GMDもしくはその他の関連技術を利用して、組換え体ライブラリーの高速、高効率のスクリーニングにおけるシグナルの増幅だけでなく、シグナルの位置の決定や選別を行うことも可能である。 In the present invention, by utilizing GMD or other related technologies, a high speed of recombinant libraries, as well as amplification of the signal at high screening efficiency, it is also possible to perform the determination and selection of the position signal. スクリーニング中に細胞が生存しているか否かは問題でも重要でもない。 It is neither important matter whether the cells are alive during screening. つまり、核酸が微小液滴から回収できればよいのである。 That is, the nucleic acid is to be as long recovered from microdroplets.
【0087】 [0087]
異なる種類の封入法、化合物もしくは高分子重合体を本発明に用いることができる。 Different types of encapsulation methods, the compound or high molecular weight polymer can be used in the present invention. 例えば、高温で安定な微小液滴を作製するために、高温アガロースを利用できる。 For example, in order to produce a stable microdroplet at high temperature, it can be used a high-temperature agarose. これにより、温度耐性の生理活性をスクリーニングする際に、バックグラウンドとなる活性をすべて取り除くための高温処理を施した細胞を、安定に封入することが可能となる。 Thus, in screening bioactive temperature resistant, cells subjected to high temperature treatment to remove all activity that background, it is possible to stably encapsulated. ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、赤血球ゴーストもしくはマクロファージ等の細胞、リポゾーム、またはその他、分子の封入・局在化の手段にいずれを用いることによっても、封入を実施することができる。 Beads, hot agarose, gel microdroplets, cells such as erythrocyte ghosts or macrophages, liposomes, or other, by using either the means of inclusion-localization of the molecule, can be carried encapsulation.
【0088】 [0088]
例えば、種々の分子の封入するためのリポゾームの利用(米国特許第5,595,756号;第5,605,703号;第5,627,159号;第5,652,225号;第5,567,433号;第4,235,871号;第5,227,170号、およびリポゾーム調製法(すなわち、米国特許第5,653,996号; 第5,393,530号および第5,651,981号)については報告がある。細胞内取り込み過程での、タンパク質、ウイルス、細菌およびDNAの赤血球への封入についても報告がある(J. Applied Biochem.、4、418−435 (1982))。低浸透圧溶解もしくは膜の誘電破壊による物質の捕捉に関して、インビトロもしくはインビボ担体として用いる赤血球についても報告がある For example, the use of liposomes for encapsulation of various molecules (U.S. Pat. No. 5,595,756; No. 5,605,703; No. 5,627,159; No. 5,652,225; No. 5 , No. 567,433; No. 4,235,871; No. 5,227,170, and liposome preparation (i.e., U.S. Pat. No. 5,653,996; No. 5,393,530 and EP 5, for No. 651,981) has been reported. in cellular uptake processes, protein, virus, there is also reported entrapment into bacteria and DNA of red blood cells (J. Applied Biochem., 4,418-435 (1982) ). regard trapping substance due to the dielectric breakdown of the low-osmotic lysis or membrane, there is also reported erythrocytes used as an in vitro or in vivo carriers (J. Pharm. Ther. (1983) にIhler、G.Mの総説がある)。これらの技術は、スクリーニングの実施の際に試料封入を行う本発明において有用である。 (J. Pharm. Ther. (1983) in Ihler, there is a review of G.M). These techniques are useful in the present invention for performing a sample sealed in the practice of the screening.
【0089】 [0089]
本明細書において、「微小環境」とは、本発明の方法に必要な相互作用を促進するための適当な環境を提供する任意の分子構造を意味する。 As used herein, "microenvironment" is meant any molecular structure that provides a suitable environment for promoting interactions necessary for the method of the present invention. 分子相互作用の促進にとって好適な環境には、例えば、ゲル微小液滴、細胞ゴースト、マクロファージ、もしくはリポゾームが含まれる。 Suitable environment for the promotion of molecular interactions, for example, gels microdroplets cell ghosts, macrophages, or the liposome. リポゾームは、様々な脂質から調製可能である。 Liposomes can be prepared from a variety of lipids. このような脂質としては、リン脂質、糖脂質、ステロイド、長鎖アルキルエステル(例えば、リン酸アルキル)、脂肪酸エステル(例えば、レクチン)、脂質アミン等を挙げることができる。 Such lipids, phospholipids, glycolipids, steroids, long-chain alkyl esters (e.g., phosphoric acid alkyl), fatty acid esters (e.g., lectins), mention may be made of a lipid amine. 中性ステロイド、荷電を有する両親媒性のもの、およびリン脂質等の組み合わせ等による脂質の混合物を用いることもできる。 Neutral steroids, those amphiphilic having charged, and it is also possible to use mixtures of lipids by a combination of phospholipids, and the like. リン脂質の例としては、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルフォスファチジルコリンが挙げられる。 Examples of phospholipids, lectins, sphingomyelin, and dipalmitoylphosphatidylcholine like. ステロイドの代表例としては、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールが挙げられる。 Representative examples of steroids include cholesterol, cholestanol, and lanosterol can be mentioned. 荷電性両親媒性化合物の代表的なものは、通常12〜30炭素原子を含む。 Representative of charged amphiphilic compounds, usually containing 12 to 30 carbon atoms. モノもしくはジアルキルリン酸エステル、もしくはアルキルアミン(例えば、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウリルリン酸)等。 Mono- or dialkyl phosphate ester or an alkylamine (e.g., dicetyl phosphate, stearylamine, hexadecylamine, dilauryl phosphate), and the like.
【0090】 [0090]
本発明の方法は、試料の保持およびスクリーニングのシステムおよび方法を含む。 The method of the present invention includes a system and method for holding and screening samples. 本発明の一態様に従えば、試料をスクリーニングする装置には、隣接するキャピラリー管の束を形成する複数のキャピラリー管であって、各キャピラリー管が試料を保持する管腔を構成する少なくとも1つの壁含むキャピラリー管が含まれる。 According to one aspect of the present invention, an apparatus for screening a sample, a plurality of capillary tubes to form a bundle of adjacent capillary tubes, at least one of the capillary tube constitutes a lumen for retaining a sample of It includes a capillary tube containing wall. この装置はさらに、キャピラリー管の束中にある隣接するキャピラリー管とキャピラリー管の間に配置された仕切、および仕切中に配置された一つもしくは複数の参照用の目印を含む。 The apparatus further comprises a mark arranged partition, and one or more reference disposed in the partition between the capillary tube and the capillary tube adjacent is in a bundle of capillary tubes. (同時継続出願第09/687,219号および第09/894,956号を参照のこと。本文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。 (See the copending application Ser. No. 09 / 687,219 and No. 09 / 894,956. This document in its entirety is incorporated herein by reference.
)
【0091】 [0091]
本発明の別の態様に従えば、試料のスクリーニングに用いるキャピラリー管は、キャピラリー管を束ねた状態に保持するのに適しているキャピラリー管であって、試料を保持する管腔を構成する第1の壁と、試料を励起するための管腔に与えた励起エネルギーをふるい分けるためのフィルター素材からなる第2の壁を含む。 According to another aspect of the present invention, the capillary tube used for the screening of the sample, a capillary tube suitable for holding the state of a bundle of capillary tubes, the constituting a lumen for retaining a sample 1 including walls and a second wall formed of a filter material for sifting the excitation energy applied to the lumen to excite the sample.
【0092】 [0092]
本発明の別の態様に従えば、対象となる生物活性もしくは生体分子を反応させる方法は、キャピラリー管束中の少なくとも一本のキャピラリー管の一部に第1の成分を導入する段階と、第1の成分の後に気泡をキャピラリー管に導入する段階とを含む。 According to another aspect of the present invention, a method of reacting a biologically active or biomolecule of interest comprises the steps of introducing a first component to a portion of the at least one capillary tube of a capillary tube bundle, first It bubbles after the ingredients and a step of introducing into the capillary tube. ここで、キャピラリー管束中の各キャピラリー管は第1の成分を保持する管腔を構成する少なくとも一つの壁を含むものである。 Wherein each capillary tube in a capillary tube bundle are those containing at least one wall constituting the lumen for retaining the first component. この方法は、さらに第2の成分をキャピラリー管に導入する段階を含む。 The method includes the further step of the second component is introduced into the capillary tube. ここで、第2の成分は第1の成分と気泡で隔てられている。 Here, the second component are separated by the first component and the bubble.
【0093】 [0093]
本発明のさらにまた別の態様においては、対象となる試料を反応させる方法は、検出可能な粒子で標識した第1の液体をキャピラリー管束のキャピラリー管中に導入する段階を含む。 In still yet another aspect of the present invention, a method of reacting a sample of interest, comprises a first liquid labeled with a detectable particle is introduced into a capillary tube of a capillary tube bundle. ここで、キャピラリー管束の各キャピラリー管は、第1の液体と検出可能な粒子を保持する管腔を構成する少なくとも一つの壁を含み、この少なくとも一つの壁は、検出可能な粒子をこの少なくとも一つの壁に結合させるための結合素材で被覆されている。 Wherein each capillary tube of a capillary tube bundle comprises at least one wall constituting the lumen for holding the detectable particle to the first liquid, the at least one wall, the at least one detectable particle One of which is coated with a binding material for binding to the wall. 本法はさらに、結合した検出可能な粒子をキャピラリー管の内部に保持したまま、キャピラリー管から第1の液体を取り出す段階と、第2の液体をキャピラリー管に導入する段階を含む。 The method is further remains detectable particles bound was held inside the capillary tube, comprising the steps of retrieving the first liquid from the capillary tube, the step of the second liquid is introduced into the capillary tube.
【0094】 [0094]
本発明の別の態様には、試料のスクリーニング系を構成する回収装置が含まれる。 To another aspect of the present invention include recovering apparatus constituting the screening system of the sample. ここで、スクリーニング系はキャピラリー管束を形成している複数のキャピラリー管を含む。 Here, the screening system comprises a plurality of capillary tubes forming the capillary tube bundle. 回収装置は、キャピラリー管束少なくとも一本のキャピラリー管を接触させ、少なくとも一本のキャピラリー管から試料を回収するために配置される回収機構を含む。 Collecting apparatus comprises contacting a capillary tube bundle least one capillary tube of, including recovery mechanism arranged to collect a sample from at least one capillary tube. 回収装置は、さらに回収機構に連結した排出器であって回収試料を回収機構から排出するための排出器を含む。 Recovery device further comprises a discharge device for discharging the collected sample to a discharge device which is connected to the recovery mechanism from the recovery mechanism.
【0095】 [0095]
特に明確な記載がない限り、本明細書および請求項に単数形の「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」で記載してあるものについては、複数の場合も含むものとする。 Unless otherwise clearly described, the specification and claims the singular forms "a (a)", for which are described in the "single (an,)" and "the (the)" includes a plurality also intended to include the case of. 従って、例えば、単に「クローン」と記載されていても、複数クローンの場合を含み、また「核酸配列」と記載されているときには、通常一種もしくは複数種の核酸配列および当業者に公知の同等物等を含むものである。 Thus, for example, also be simply described as "clone" includes a case of multiple clones, also when it is described as "nucleic acid sequence" typically one or more kinds of nucleic acid sequences and the known equivalents to those skilled in the art it is intended to include, and the like.
【0096】 [0096]
別の箇所で定義されない限り、本明細書に記載の専門用語、科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野における通常の当業者にとって通常理解しうる意味と同等の意味において用いられるものとする。 Unless defined elsewhere, terminology described herein, scientific terms are all assumed to be used in the sense equivalent means that may be commonly understood to those of ordinary skill in the art to which this invention pertains . 本明細書に記載のものと同等もしくは類似の方法、装置、および材料はいずれも、本発明を実施もしくは試験するために利用することが可能であるが、好適な方法、装置および材料については次に説明する。 Equivalent or similar methods to those described herein, devices, and any material, it is possible to use for the practice or testing of the present invention, the preferred methods, devices and materials following It will be explained.
【0097】 [0097]
本明細書に記載の発明に関連して利用され得る、出版物に記載のデータベース、タンパク質、および方法論を説明し、開示する目的において、本明細書に記載の全出版物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。 May be utilized in connection with the invention described herein, a database according to the publication, proteins, and methodologies described, for the purpose of disclosure, all publications described herein, in its entirety the reference which is incorporated herein by. 上記および本明細書全体を通じて引用される出版物は、本明細書の出願日以前に、それ自体の開示のために提供されたものである。 Publications cited throughout above and herein, prior to the filing date of the present specification, but is provided for its own disclosure. 本明細書のいかなる部分の記載も、本発明が、先行発明によるかかる開示に先立つ権利を保有していないことを、意味するものではない。 Description of any part of the specification, the inventors found that does not possess entitled to antedate such disclosure by by virtue of prior invention does not mean.
【0098】 [0098]
「アミノ酸」は、中央の炭素原子(β炭素原子)に水素原子、カルボン酸基(この炭素原子は、本明細書では、「カルボキシル炭素原子」と呼ぶ)、アミノ基(この窒素原子は、本明細書では、「アミノ窒素原子」と呼ぶ)、および側鎖の基Rが結合した構造を有する分子である。 "Amino acid", the central carbon atom (beta carbon atoms) a hydrogen atom, a carboxylic acid group (the carbon atoms are herein referred to as "carboxyl carbon atom"), an amino group (the nitrogen atom, the the specification referred to as "amino nitrogen atom"), and side chains of the radicals R is a molecule having a structure bonded. ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に組み込まれる場合には、アミノ酸をもう一つのアミノ酸と結合させる脱水反応において、アミノ酸のカルボキシル基から1個もしくは複数の原子を失う。 Peptide, when incorporated into a polypeptide or protein, in the dehydration reaction to bond with another amino acid an amino acid loses one or more atoms from the carboxyl group of the amino acid. その結果、タンパク質に組み込まれている場合には、アミノ酸は「アミノ残基」呼ばれる。 As a result, when incorporated in a protein, the amino acid is referred to "an amino acid residue".
【0099】 [0099]
「タンパク質」もしくは「ポリペプチド」は、2個もしくはそれ以上の個々のアミノ酸(天然のアミノ酸か否かは問わない)からなり、これらがペプチド結合で結合している重合体を意味し、1個のアミノ酸(もしくはアミノ酸残基)のβ炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接したアミノ酸のβ炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合で結合してできる。 "Protein" or "polypeptide" consists of two or more individual amino acids (whether naturally occurring amino acid does not matter), they refer to polymers that are bound by peptide bonds, one amino (or amino acid residue) carboxyl carbon atom bonded to the carboxylic acid group β carbons of, be covalently bound to the amino nitrogen atom of the amino group bonded to the β carbon of the adjacent amino acids. 「タンパク質」なる用語は、その意味において、「ポリペプチド」および「ペプチド」(これらは、本明細書では時に、相互に同等な意味として用いられる)なる用語を含むものとする。 The term "protein", in this sense, "polypeptide" and "peptide" (which, in this specification sometimes used as mutually equivalent sense) is intended to include the term. さらに、複数のポリペプチドサブユニット(例えば、DNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼII)もしくはその他の構成要素(例えば、テロメラーゼ中に存在するようなRNA分子)で構成されるタンパク質もまた、本明細書に記載の「タンパク質」の意味の範疇にあるものとする。 Further, a plurality of polypeptide subunits (e.g., DNA polymerase III, RNA polymerase II) or other components (eg, RNA molecules as present in telomerase) protein composed also described herein It assumed to be of the scope of the meaning of "protein". 同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も本発明の範囲に入るものであり、本明細書では「タンパク質」と記載する。 Similarly, fragments of proteins and polypeptides are also intended to fall within the scope of the present invention, herein referred to as "protein".
【0100】 [0100]
与えられたタンパク質の特定のアミノ酸配列(すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって記載される場合のポリペプチドの「一次構造」)は、mRNAのコード領域の塩基配列で決まり、このmRNAのコード領域の塩基配列はゲノム情報、通常ゲノムDNA(オルガネラのDNA(例えば、ミトコンドリアDNAもしくは葉緑体DNA)を含む)によって規定されている。 Given specific amino acid sequence of the protein (i.e., "primary structure" of a polypeptide when described from amino-terminus to carboxy-terminus) is determined by the nucleotide sequence of the mRNA coding region, the coding region of the mRNA nucleotide sequence genomic information is defined by the normal genomic DNA (organelle DNA (e.g., including mitochondrial DNA or chloroplast DNA)). 従って、遺伝子の配列を決定することによって、対応するポリペプチドの一次構造を推定し、さらには遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドもしくはタンパク質の役割もしくは活性を推定することに役立つ。 Therefore, by determining the sequence of the gene to estimate the primary structure of the corresponding polypeptide, further helps to estimate the role or activity of a gene or polypeptide or a protein polynucleotide sequences encode.
【0101】 [0101]
「単離した」なる用語は、自然の状態から「ヒトの手によって」変化したことを意味する。 The term "isolated" means altered "by the hand of man" from the natural state. すなわち、それが自然界にある場合には、元々の環境から変化し、もしくは取り出されている、またはその両方を意味する。 That is, it is when in nature, varies from the original environment, or has been removed, or both. 例えば、生きた動物、生物試料、もしくは環境試料中にもともと存在する天然のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが自然の状態にあるとき、それは「単離されて」いない。 For example, when a live animal, a naturally-occurring polynucleotide or polypeptide originally present in a biological sample or environmental sample, is in a natural state, it is not "isolated." しかし、同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが自然状態において共存する物質から分離されたものは、本明細書では「単離されて」いると記載する。 However, those same polynucleotide or polypeptide separated from the coexisting materials in the natural state is herein referred to as "isolated." このようなポリヌクレオチドが、培養もしくは生物個体中の宿主細胞に導入された時にも、本明細書では、まだ「単離された」状態であると記載する。 Such polynucleotides, when introduced into a host cell in culture or organism also, in this specification, it is described as being still "isolated" state. なぜなら、これらがもともとの天然状態もしくは環境にはないからである。 This is because they are not in the original natural state or environment. 同様に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが組成物中に存在するときには、媒体として処方されたもの(ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを、例えば細胞に導入するための溶液、もしくは化学反応もしくは酵素反応のための組成物もしくは溶液)等の組成物中に存在していてもよい。 Similarly, when the polynucleotide or polypeptide present in the composition, the composition for those formulated as medium (polynucleotides or polypeptides, for example, solutions for introduction into a cell or chemical reaction or enzymatic reaction, it may be present in the composition of the object or solution) or the like.
【0102】 [0102]
「ポリヌクレオチド」もしくは「核酸配列」とは、ヌクレオチドの重合体を意味する。 "Polynucleotide" or "nucleic acid sequence" refers to a polymer of nucleotides. ポリヌクレオチドは、由来する生物の天然のゲノムにおいて連続している(5'端、3'端それぞれでほかのものと連続する)コード配列のいずれかと連続していない配列を意味する場合もある。 Polynucleotides derived from the natural are contiguous in the genome of an organism (5 'end, 3' contiguous with the others at each end) in some cases means a sequence that is not continuous with any of the coding sequences. それ故、本用語は、例えばベクター、自律複製するプラスミドもしくはウイルス、原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに挿入されている組換えDNA、もしくは他の配列とは独立に分離して存在する(例えば、cDNA)組換えDNAを意味する。 Thus, the term includes, for example vectors, autonomously replicating plasmid or virus, prokaryotic or eukaryotic genomic DNA recombination has been inserted into DNA or of other sequences present in isolated independently (e.g. , cDNA) refers to recombinant DNA. 本発明のヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、もしくはいずれかのヌクレオチドの修飾体であってもよい。 Nucleotide of the present invention may be a modified form of ribonucleotides, deoxynucleotides or either nucleotide. 本明細書に記載のポリヌクレオチドは特に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるRNA、一本鎖、もしくはより一般的には二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるDNAとRNAからなるハイブリッド分子を意味する。 Polynucleotides described herein are particularly single-stranded and double-stranded DNA, DNA that is a mixture consisting of a region consisting of single- and double-stranded, single-stranded and double-stranded RNA, single-stranded and RNA is a mixture consisting of a region consisting of double-stranded hybrid molecules comprising a single-stranded, or more generally a mixture consisting of double-stranded, or consisting of single- and double-stranded regions DNA and RNA It means.
【0103】 [0103]
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドはRNAもしくはDNA、またはRNAおよびDNAの両者からなる三本鎖をも意味する。 Further, polynucleotides described herein also means a three-strand consisting of RNA or DNA or of RNA and DNA both. このような領域における鎖は、同一分子に由来するものであってもよく、また異なる分子に由来するものであってもよい。 The strands in such regions may be from the same molecule, or may be derived from different molecules. このような領域は単一もしくは複数の分子を含んでいてもよいが、より一般的には、複数分子の一部の領域のみを含むものである。 Such regions may include a single or multiple molecules, but more typically, is intended to include only a part of the area of ​​the plurality of molecules. 三重鎖のヘリックス領域からなる分子のうちの一つは、オリゴヌクレオチドである。 One of the molecules comprising a helical region of triplex is an oligonucleotide. ポリヌクレオチドなる用語は、ゲノムDNA、およびcDNAにコードされるmRNAのみならず、ゲノムDNAもしくはRNA(生物種による、すなわちウイルスのRNAゲノム)を含む。 The term polynucleotide includes not genomic DNA, and cDNA to mRNA encoded only comprises (by species, namely the viral RNA genome) genomic DNA or RNA to.
【0104】 [0104]
上記のように、現在、バイオテクノロジーおよび化学的産業においては、生物学的もしくは化学的過程を最適に遂行可能な分子(例えば、酵素)が必要とされている。 As described above, currently, the biotechnology and chemical industries, optimally accomplished molecules capable biological or chemical processes (e.g., enzyme) is required. 混合集団を含む環境試料中の新規酵素を同定することは、この問題に対する解決策の一つである。 Identifying novel enzymes in environmental samples containing a mixed population is one solution to this problem. 対象となる活性を有するポリペプチドおよび対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを迅速に同定することによって、本発明は、生物学的薬剤、診断薬、治療薬、および産業上応用される組成物の開発のための方法、組成物、および供給源を提供する。 By identifying a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a polypeptide and a target having an activity of interest quickly, the present invention is, biological agents, diagnostic agents, therapeutic agents, and industrial applications are compositions the method for the development, to provide a composition, and sources.
【0105】 [0105]
既存のものも、新規のものも、化学、医薬、繊維、食品、飼料、および洗剤等のマーケットにおいて利用される分子および化合物はすべて、経済的および環境上の基準に合致するものでなければならない。 Also existing ones, even a new one, not chemical, pharmaceutical, textile, food, feed, and all the molecules and compounds utilized in the market, such as detergent, as long as they do not meet the criteria of economic and environmental . 重合体、医薬品、天然物、および農薬の合成は、有害な副産物を生じたり、貧弱もしくは非効率的な触媒しかないため、費用のかかる処理段階が、障害となることが多い。 Polymers, pharmaceuticals, natural products, and synthetic pesticides, or produce adverse side-products, because there is only weak or inefficient catalysts, processing steps costly that often becomes an obstacle. 例えば、酵素は触媒に関するこれらの問題を克服しうる顕著な利点を数多く備えている。 For example, the enzyme has a number of significant advantages which can overcome these problems with the catalyst. 酵素は単一の官能基に作用する、単一分子上の類似した官能基を区別する、対掌体を区別する等々である。 Enzyme acts on a single functional group, to distinguish similar functional groups on a single molecule, and so to distinguish enantiomers. さらには、酵素は生体内分解が可能であり、反応混合液中で非常に少ないモル分率で機能する。 Furthermore, the enzyme is capable of biodegradation, functions with very little mole fraction in the reaction mixture. 化学的特異性、部位特異性、立体特異性のおかげで、酵素は所望の選択的変換を最適に達成することができる。 Chemical specificity, site specificity, by virtue of stereospecific, enzyme can be optimally achieve the desired selective transformations. これらを化学的に、特に単一過程の反応で達成することは極端に困難であることが多い。 These chemically, in particular it is often in extremely difficult to achieve in the reaction of a single process. 環境負荷を低減できるだけではなく、保護基の利用が不必要であり、選択性を有し、単一反応容器中で複数段階の変換を実施できることなどから、化学・医薬産業における酵素の需要は高まるばかりである。 Not only can reduce the environmental impact, use of protecting groups is that unnecessary, has selectivity, and the like may be implemented to convert a plurality of stages in a single reaction vessel, the growing demand for the enzyme in the chemical-pharmaceutical industry it is just. 多くの既存の化学的方法が、次第に酵素を用いた処理法に置き換えられつつある。 Many existing chemical methods, is being replaced increasingly processing method using an enzyme. さらに広範な工業的利用に関して、現在直面している問題は、主に市販の酵素の種類が比較的少ないことである。 Moreover, with respect to a wide range of industrial applications, the problem that you are facing today, is mainly that the type of commercially available enzyme is relatively small. 上記のように3000種を越える非DNA修飾酵素の活性のうち、高々約300種類(DNA修飾酵素を除外する)程度の酵素しか現在のところ市販されていない。 Of the active non-DNA modifying enzymes exceeding 3000 or as described above, only at most about 300 types (excluding DNA modifying enzymes) about enzymes are currently commercially available.
【0106】 [0106]
工学的応用での酵素の使用に関しても、必要な工業的条件下での性能が要求されると考えられる。 Even with the use of enzymes in engineering applications, it is considered that the performance under industrial conditions necessary are required. これは、環境における活性、およびある基質に関し現在までに既知の酵素群のいずれもが進化上選択を受けなかったような種類の基質についての活性をも含むのである。 This is the any of the known enzymes activity, and relates certain substrates to date in the environment including the activity of the types of substrates, such as not receiving evolutionary selection. しかしながら、自然環境は、例えば極限的な温度、pH等含め、極限的条件を与えるものである。 However, the natural environment, for example, extreme temperatures, including pH, etc. and gives an extreme condition. 多くの生物が、部分的にはこのような極限に耐えることのできるポリペプチドを選択することによって、このような条件に適応してきた。 Many organisms, in part by selecting a polypeptide capable of withstanding such extreme, has been adapted to these conditions.
【0107】 [0107]
酵素は、生物の体内において、温度、pH、および塩濃度等の条件の下で、非常に特異的な生物学的機能を発揮するように、選択圧により進化を遂げてきた。 Enzymes in the body of an organism, the temperature, pH, and under conditions such as salt concentration, so as to exert a very specific biological functions have been evolved by selective pressure. 上記の非DNA修飾酵素活性の大部分は、現在の系統的多様性のごく一部を占めるにすぎない中温性の生物から単離されたものである。 Most of the non-DNA modifying enzyme activity are those isolated from only not mesophilic organism occupying a small portion of the current systematic diversity. 極限環境で繁栄する微生物から単離した酵素によって、生体触媒の先端分野に新しい次元がもたらされた。 By an enzyme isolated from microorganisms that thrive in extreme environments, new dimension has resulted in advanced fields of biocatalyst. 例えば、このような酵素は、陸地上の熱泉および海底の熱水噴出口等で100℃を超える温度で機能する必要がある。 For example, such enzymes should be functional at temperatures above 100 ° C. with hot fountain and submarine hydrothermal vents, etc. on land. また、北極海においては0℃未満の温度で機能する必要がある。 Further, in the Arctic Ocean it needs to function at temperatures below 0 ° C.. また、塩濃度が飽和状態である死海の環境で機能する必要がある。 Further, it is necessary to work in the Dead Sea environmental salt concentration is saturated. また、石炭堆積鉱床や地熱硫黄泉ではpHが約0で機能することが要求される。 Further, the coal deposition deposits and geothermal sulfur Izumi is required that the pH is functioning at about 0. また、下水スラッジでは、pHが11以上で機能する必要性がある。 Moreover, in the sewage sludge, there is a need to function at a pH of 11 or more. 例えば、生物、ポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド(例えば、酵素)を含む極限環境から得られた環境試料によって、生体触媒に関する新しい分野が開かれるのである。 For example, an organism, a polynucleotide or polypeptide (e.g., an enzyme) the environmental samples obtained from extreme environments including, at the new field of biocatalyst is opened. 対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの迅速スクリーニングによって、本発明は生物学的薬剤、治療薬、および産業上応用される酵素についての原料の供給源を提供するだけではなく、特定の活性もしくは状態へと改変するために、例えば、特異的進化および変異誘発によって分子もしくはポリペプチドをさらに加工するための新規素材を提供する。 The rapid screening of a polynucleotide encoding a polypeptide of interest, the present invention biological agent, therapeutic agent, and not only provide a source of raw material for the enzyme on the application industry, specific activity or in order to modify to state, for example, to provide a novel material for further processing to a molecule or a polypeptide by directed evolution and mutagenesis.
【0108】 [0108]
工業的利用に供する新規の酵素の必要性に加えて、新規の活性を有した生物活性化合物のニーズも劇的に高まっている。 In addition to the need for new enzymes subjected to industrial use, it has increased dramatically the needs of biologically active compounds having a novel activity. 現在入手可能な抗生物質に耐性を示す病原性生物の数が明らかに増加する傾向にあることを示す世界的な人口統計上の変化は、このような需要を高める主な要因である。 Worldwide demographic changes indicating that the number of pathogenic organisms that are resistant to currently available antibiotics tends to increase clearly is a major factor in enhancing such demand. 例えば、若年層の厚い新興国家では抗菌剤に対する需要が突出してきているが、米国のように高年齢層の厚い国々では癌、糖尿病、リュウマチおよびその他の衰弱性病態に対する様々な薬剤の需要が増加している。 For example, although the thick emerging national of younger have been projected demand for antimicrobial agents, cancer thick countries with advanced age as the United States, diabetes, the demand for various drugs for rheumatoid and other debilitating conditions increase doing. 感染性の疾患に関連した死亡率は1980年から1992年の間に58%増加した。 Mortality associated with infectious diseases has increased 58 percent between 1992 from 1980. また抗生物質耐性の微生物の出現によって、米国だけでも1年間にかかる健康管理のコストは300億ドル以上の上乗せが必要となっている(Adamsら、Chemical and Engineering News、1995; Amannら、Microbiological Reviews、59、1995)。 Also with the advent of microbial resistance to antibiotics, health care costs of relating to one year in the United States alone has become necessary plus of more than 300 billion dollars (Adams et al., Chemical and Engineering News, 1995; Amann et al., Microbiological Reviews , 59,1995). このような傾向に呼応して、特徴的活性と特異性を備えた化合物を得るために、製薬企業は多様な微生物のスクリーニングを、かなり大規模に行うようになっている。 In response to this trend, in order to obtain the compound having the characteristic activity and specificity, pharmaceutical companies screening of various microorganisms, and performs quite large. 従って、本発明を利用して、例えば、環境中に存在する感染性微生物(例えば、多様な微生物)からポリヌクレオチドおよび関連した配列特異的な情報を取得・同定することができる。 Thus, by utilizing the present invention, for example, may be obtained and identified infectious microorganisms present in the environment (for example, various microorganisms) polynucleotides and related sequences specific information from.
【0109】 [0109]
別の態様においては、本発明の方法および組成物は、環境試料中のリード薬剤化合物の同定に利用できる。 In another embodiment, the methods and compositions of the present invention can be used to identify lead pharmaceutical compounds in environmental samples. 本発明の方法によって、新規薬剤に関し環境破壊の可能性、もしくは異なる微生物に含まれる関連薬剤の同定の可能性を判定できる。 By the method of the present invention can determine the possibility of identification of relevant drug contained relates to novel pharmaceutical potential environmental damage, or the different microorganisms. リード化合物(薬剤の候補)に共通の供給源として複数のものが挙げられる。 More are mentioned as the common source of the lead compound (drug candidate). すなわち、天然物;合成化学物質;ヌクレオチド、ペプチド、もしくは環境破壊の結果同定されたもしくは発生したその他の重合体分子等の、合成コンビナトーリアル化学ライブラリーである。 That is, natural products; is a nucleotide, peptide or other polymer molecules, which results identified that or generated environmental destruction, synthetic combinatorial chemical libraries; synthetic chemicals. これらの供給源のいずれも、利点と欠点を併せ持っている。 Any of these sources has both advantages and disadvantages. これら候補物質のスクリーニングが成功するか否かは、スクリーニングする化合物の数に大きく依存している。 Whether screening of candidate substances to be successful is largely dependent on the number of compounds screened. 現在、製薬企業はリード化合物の探索において10万種類にのぼる合成・天然化合物をスクリーニングしている。 Currently, pharmaceutical companies are screening the synthetic and natural compounds that up to 100,000 types in the search for lead compounds. 残念なことに、新規化合物の以前に発見された化合物に対する比は、時間と共に減少している。 Unfortunately, the ratio compounds previously discovered novel compounds, decreases with time. 製薬企業が最大限の努力を払っているにもかかわらず、新規のリード化合物の発見速度は需要に追いつかない。 Pharmaceutical companies in spite of the fact that utmost efforts, the discovery rate of new lead compounds do not keep up with the demand. 潜在的な薬剤候補のための新規な供給源を入手する必要性は非常に高いといえる。 The need to obtain a new source for potential drug candidates is very high. 従って、本発明は、新規の薬剤化合物を含みうる環境試料の同定と特徴付けを行う迅速かつ効率のよい方法を提供する。 Accordingly, the present invention provides a rapid and efficient method for conducting the identification and characterization of environmental samples which may include novel drug compounds.
【0110】 [0110]
現在のところ利用されている大部分の生理活性化合物は土壌微生物に由来する。 Bioactive compounds most of which are currently available from the soil microorganisms. 土壌およびその他の複雑な生態系に生息する多くの微生物は、生存・増殖能を高める多様な化合物を生産している。 Many microorganisms inhabiting the soil and other complex ecosystem has produced a variety of compounds to enhance the survival and proliferation ability. 通常、これらの化合物は生物の増殖には必須ではなく、中間代謝に関連した遺伝子によって合成される(従って「二次代謝産物」と呼ばれる)と考えられている。 Usually, these compounds are believed not essential for biological growth are synthesized by a gene associated with intermediary metabolism (thus called "secondary metabolite"). 二次代謝産物は、一般的に複雑な生合成経路の産物であり、また通常共通の細胞内前駆体に由来するものである。 Secondary metabolites is a product of general complex biosynthetic pathway, also derived from the usual common intracellular precursor. 他の生物の増殖もしくは生存に影響を与える二次代謝産物は、「生理活性」化合物として知られ、微生物およびより大型の生物双方に対する化学的防御のための主要な要素として働く。 Other secondary metabolites providing growth or an effect on survival of the organism is known as "bioactive" compounds, act as a key element for chemical defense microorganisms and more to an organism both large. 人間は、これらの化合物を抗生物質、感染防御剤、および様々な病原性原核生物および真核生物に対して活性を示すその他の生理活性化合物として利用する目的で、探索を行ってきた。 Humans, antibiotics these compounds, infection protective agent, and a variety of pathogenic prokaryotes and purpose of use as other bioactive compounds that exhibit activity against eukaryotic organisms have been carried out search. 微生物に由来する約6,000 種の生理活性化合物について特徴付けが行われ、60%超が、ストレプトミセス(Streptomyces)属のグラム陽性土壌細菌によって生産されることが解っている (Bames et al、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、91、1994) 。 Characterization performed for about 6,000 species of bioactive compounds derived from microorganisms, more than 60% has been found to be produced by Streptomyces (Streptomyces) genus of Gram-positive soil bacteria (Barnes et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 91,1994). 現在のところ、これらのうち少なくとも70のものが、生物医学的および農業的に応用されている。 Currently, those of at least 70 of these have been biomedical and agriculturally applications. 生理活性化合物の分類において最大のグループはポリケチドであり、抗生物質、免疫抑制剤、および抗癌剤の多くを含む。 The largest group in the classification of the bioactive compound is a polyketide, including antibiotics, immunosuppressive agents, and a number of anticancer agents. これらの売り上げは、年間合わせて50億ドルにのぼる。 These sales, up $ 5.0 billion to meet year.
【0111】 [0111]
入手可能な生理活性化合物の数は多いように思われる。 Bioactive number of compounds available seems as large. しかしながら、現代の生物医学が直面している最大の課題の1つは、明らかに抗生物質耐性の病原体の増加である。 However, one of the biggest challenges modern biomedical is facing is the increase of pathogens apparently antibiotic resistance. 世代交代が短時間で起こり、容易に遺伝子情報を交換するので、病原微生物は急速に進化を遂げ、実質的に抗生性化合物全般に対しての耐性機構が広がってしまう。 Occur in a short time generation change, so easily to exchange genetic information, pathogenic microorganisms a rapidly evolving, thereby spreading resistance mechanisms against substantially antibiotic compounds in general. 例えば、ヒトに対する病原体であるスタフィロコッカス(Staphylococcus)およびストレプトコッカス(Streptococcus)の病毒株が存在し、現在のところ、これらは唯一の抗生物質であるバンコマイシンでのみ治療可能である。 For example, there is virulent strains of Staphylococcus pathogens to humans (Staphylococcus) and Streptococcus (Streptococcus), at present, they can only be treated with vancomycin is the only antibiotic. また、耐性のエンテロコッカス(Enterococcus)から単一の遺伝子 バン(van)A を移すだけで、この化合物に対する耐性が獲得される(Batesonら、System. Appl. Microbiol、12,1989)。 In addition, from resistant Enterococcus (Enterococcus) only shifts the single gene van (van) A, resistance to this compound is obtained (Bateson et al., System. Appl. Microbiol, 12,1989). 新規の抗細菌化合物の必要性が極めて高いことと、酵素阻害剤、免疫抑制剤および抗癌剤に対して高まる需要とを考え合わせると、製薬企業が生理活性化合物を得るために微生物試料のスクリーニングに力を入れている理由が容易に理解される。 And that the need for novel antibacterial compounds is very high, enzyme inhibitors, Taken together with the growing demand against immunosuppressants and anticancer force for screening microbial sample to pharmaceutical companies to obtain bioactive compounds why have put is easily understood.
【0112】 [0112]
本発明は、既知もしくは未知のいずれかの機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列の同定法を提供する。 The present invention provides a method for identifying a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having any one of the functions known or unknown. 例えば、微生物ゲノムの多様性は主に、微生物ゲノムにおける遺伝子クラスターの再構成に起因する。 For example, the microbial genome diversity is mainly due to the reconstruction of the gene clusters in microbial genomes. これら遺伝子クラスターは、種を越えて存在するし、また系統学的に近縁種の他の生物にも存在しうる。 These gene cluster, to exist across species, also be present in phylogenetically related species of other organisms.
【0113】 [0113]
例えば、細菌および多くの真核生物は、関連する過程含まれる遺伝子産物に対応する遺伝子の制御に関し、協調的機構を有している。 For example, bacteria and many eukaryotes, relates to a control of a gene corresponding to the gene product contained relevant processes have cooperative mechanism. このような遺伝子は、「遺伝子クラスター」と呼ばれる構造で単一染色体上にクラスターを形成し、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む単一の制御配列の制御下に、同時に転写される。 Such gene clusters were formed on a single chromosome in a structure called a "gene cluster", under the control of a single regulatory sequence, including a single promoter which initiates transcription of the entire cluster, it is simultaneously transferred that. この遺伝子クラスター、プロモーター、およびその制御において機能する他の配列をまとめて、「オペロン」と呼び、通常、2〜6遺伝子を含むが、最大20もしくはそれ以上の遺伝子を含むこともある。 The gene cluster, the promoter, and summarizes other sequences that function in a control, referred to as "operon", typically include 2-6 gene, it may also include up to 20 or more genes. このように、遺伝子クラスターとは、通常、機能的に同一もしくは近縁の遺伝子が隣接している遺伝子の群である。 Thus, a gene cluster is a group of genes normally gene functionally identical or closely related are adjacent. 遺伝子クラスターは、一般的に、そのサイズが15kbから120kbを超える。 Gene cluster is generally the size exceeds 120kb from 15 kb.
【0114】 [0114]
同一構成員からなる遺伝子ファミリーも存在する。 Gene family composed of the same members are also present. クラスター化は、遺伝子間の同一性を維持する前提条件である。 Clustering is a prerequisite for maintaining identity between genes. しかし、クラスターを形成している遺伝子が、同一のものである必要性はない。 However, genes which form the cluster, is not necessary is identical. 遺伝子クラスターには様々なものがあり、一回の重複によって隣接した近縁遺伝子が生ずるものから、数百の同一遺伝子がタンデムに並ぶケースまで様々なものがあり得る。 The gene cluster there are various from those closely related gene flanked by duplicated once occurs, the same gene hundreds can There are a variety to case arranged in tandem. 特定の遺伝子が重複していても、それぞれ特に有意な違いがみられない場合がある。 Even if a particular gene is not overlap, there is a case in which the difference especially significant each is not observed. このような代表例として、特定種で発現している重複インシュリン遺伝子が挙げられる。 Such representative examples include duplicate insulin genes expressed in a particular species. ただし、これら以外の哺乳動物種では、単一のインシュリン遺伝子のみが存在する。 However, these non-mammalian species, only a single insulin gene is present.
【0115】 [0115]
さらに、遺伝子クラスターは継続的に再構成を起こすので、例えば、細菌もしくはその他の原核生物供給源に由来する遺伝子クラスターの不均一ライブラリーの作製が可能であることは、特に、例えば、有用な活性を多く含むポリケチドの合成に関与するポリケチド合成酵素等の酵素を含む新規のタンパク質の供給源を調べる上で貴重である。 Further, since the gene clusters undergo continual reconfigured, for example, it is possible to produce heterogeneous libraries of gene clusters from bacteria or other prokaryotes sources, in particular, for example, useful activity it is valuable for studying the sources of novel proteins, including enzymes polyketide synthases like involved in the synthesis of many including polyketides a. 遺伝子クラスターの産物である他の種類のタンパク質もまた、考慮に入れる。 Other types of proteins, the product of gene clusters are also taken into account. このようなものとしては、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、およびインシュリン等の制御タンパク質が含まれる。 These include, for example, antibiotics, antivirals, antitumor agents, and regulatory proteins such as insulin.
【0116】 [0116]
一例として、ポリケチド合成酵素は遺伝子クラスター中に存在する。 As an example, the polyketide synthases present in the gene cluster. ポリケチドは、極めて生理活性に富んだ分子であり、抗生物質(テトラサイクリン、エリスロマイシン等)、抗癌剤(ダウノマイシン)、免疫抑制剤 (FK506およびラパマイシン)および 獣医学的製品(モネシン)が含まれる。 Polyketides are molecules rich in very bioactive, antibiotics (tetracycline, erythromycin, etc.), anticancer agents (daunomycin), include immunosuppressants (FK506 and rapamycin), and veterinary products (Moneshin). 多くのポリケチド(ポリケチド合成酵素によって生産される)は治療薬として貴重である。 Many polyketides (produced by polyketide synthases) are valuable as therapeutic agents. ポリケチド合成酵素は、鎖長さおよび機能と環化のパターンを異にする膨大な種類の炭素鎖の生合成を触媒する多機能性酵素である。 Polyketide synthase is a multifunctional enzyme that catalyzes the biosynthesis of a huge variety of carbon chains differing patterns of chain length and functionality and cyclization. ポリケチド合成酵素遺伝子は遺伝子クラスター中に存在し、少なくとも1種類(1型と呼ばれる)のポリケチド合成酵素とその遺伝子は大型であり、このため、この遺伝子/タンパク質の遺伝子操作およびインビトロでの研究は複雑なものとなる。 Polyketide synthase gene is present in a gene cluster, polyketide synthase and its gene of at least one (referred to as type 1) is large, Therefore, complex research in genetic manipulation and in vitro of this gene / protein become a thing.
【0117】 [0117]
新規のポリケチドを合成し調べる目的で、ポリケチドおよびのポリケチド以降の生合成に関わる遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択し組み合わせることができれば、その重要性は高い。 In order to examine synthesizing novel polyketides, if it is possible to combine and select the desired components from a library of genes involved in the biosynthesis of subsequent polyketides and polyketide, its importance is high. 本発明の方法によって、新規のポリケチド合成酵素のクローニングが促進される。 By the method of the present invention, the cloning of novel polyketide synthases is promoted. なぜなら、(特に、f因子を含むベクターを利用することによって)遺伝子クラスターのクローニングを促進するような長いインサートを含むクローンからなる遺伝子バンクを作製できるからである。 This is because (in particular, by utilizing a vector comprising the f factor) can be produced gene bank of clones containing long insert so as to facilitate cloning of gene clusters.
【0118】 [0118]
NRPS、糖転移酵素、およびp450等を含むその他の生合成酵素遺伝子【0119】 NRPS, other biosynthetic enzyme gene [0119], including the glycosyltransferase, and p450, etc.
例えば、発現制御配列を含むベクターに遺伝子クラスターをつなぐことができる。 For example, it is possible to connect the gene cluster into a vector containing the expression control sequences. この発現制御配列は、連結した遺伝子クラスターに由来するタンパク質もしくは連続した関連タンパク質の検出可能な活性発現のコントロールおよび制御を行うものである。 The expression control sequence is performed detectable control and control of the active expression of the relevant protein protein or continuously from linked gene cluster. このような遺伝子クラスターに関しては、かなり大きな外来性の核酸を挿入しうるベクターの利用が特に好ましく、本明細書に例を挙げて記載する。 For such gene clusters, particularly preferred the use of vectors capable of inserting a sizeable foreign nucleic acid, is described by way of example herein. このようなベクターとしては、人工染色体ベクター、コスミド、および大腸菌のf因子(もしくは稔性因子)が挙げられる。 Such vectors include artificial chromosomes vectors, cosmids, and f factors of E. coli (or fertility factor). 例えば、大腸菌のf因子は、接合中の自分自身の高頻度転移に影響を与え、かつ生物の混合集団試料に由来する遺伝子クラスター等の大型核酸断片の安定増幅にとって理想的なプラスミドである。 For example, f factor of E. coli, affect the high frequency transfer of itself during bonding, and an ideal plasmid for stable amplification of large nucleic acid fragments of the gene cluster, such as derived from a mixed population sample organism.
【0120】 [0120]
これら試料(例えば、微生物の混合集団)から単離したもしくはに由来する核酸は、好ましくは、ポリヌクレオチドのスクリーニング前にベクターもしくはプラスミドに挿入することができる。 These samples (e.g., a mixed population of microorganisms) nucleic acid from or isolated from, preferably, can be inserted into a vector or plasmid before screening polynucleotides. かかるベクターもしくはプラスミドは、通常、エンハンサー等を含む発現制御を有するものである。 Such vector or plasmid is normally have the expression control including enhancers.
【0121】 [0121]
従って、本発明は、対象となるポリヌクレオチド、酵素活性およびインビトロにおける対象となる生理活性に関して、例えば、環境試料に存在する生物の混合集団をクローニングしスクリーニングする新規のシステムを提供する。 Accordingly, the present invention is a polynucleotide of interest, with respect to the physiological activity of interest in the enzyme activity and in vitro, for example, to provide a novel system for screening cloned a mixed population of organisms present in environmental samples. 本発明の方法によって、新規のインビトロ生理活性分子、特に、非培養もしくは培養試料に由来する特定の新規生理活性分子のクローニングおよび発見が可能となる。 By the method of the present invention, novel in vitro bioactive molecules, in particular, the cloning and the discovery of certain novel bioactive molecules derived from uncultured or cultured sample it becomes possible. 本発明の方法を利用して、大型の遺伝子クラスター、遺伝子、遺伝子断片のクローニング、配列決定、スクリーニングが可能である。 Using the method of the present invention, a large gene cluster, the gene, cloning of the gene fragments, sequencing, screening is possible. 従来の方法と異なり、本発明の方法では、広範な混合集団試料に由来するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをインビトロでクローニング、スクリーニング、および同定を行うことができる。 Unlike conventional methods, the method of the present invention, it is possible to perform cloning the polypeptide encoded by the polynucleotide and these polynucleotides derived from a wide range of mixed population sample in vitro screening and identification.
【0122】 [0122]
本発明によって、複雑な混合集団試料に由来するポリヌクレオチド配列のスクリーニングと同定が可能である。 The present invention enables the screening and identification of the polynucleotide sequences derived from complex mixed population sample. これらの試料から得られるDNAライブラリーは、試料が核酸配列を含む限り無細胞系試料より作製することができる。 DNA libraries obtained from these samples can sample is prepared from a cell-free system sample as long as it contains a nucleic acid sequence. また、細胞で構成される生物もしくはウイルス粒子を含む試料から作製することもできる。 It is also possible to prepare from a sample containing organisms or virus particles composed of cells. ライブラリーを調製する生物としては、真性細菌および古細菌等の原核微生物、真菌等の下等真核微生物、藻類および原生動物、また植物、植物胞子および花粉が挙げられる。 The organism to prepare a library, prokaryotic microorganisms, such as Eubacteria and Archaea, lower eukaryotic microorganisms such as fungi, algae and protozoa, also plants, plant spores and pollen. これら生物には、混合集団の環境試料から得られる培養生物でもよく、非培養生物でもよい。 These organisms may be cultured organisms obtained from environmental samples mixed population, or in uncultured organisms. また、これらには、好熱性生物、超好熱性生物、好冷生物および低温発育性生物等の極限環境生物を含む。 Also, These include thermophilic organism, hyperthermophilic organisms, extreme environmental organisms such as cold adapted organisms and low-temperature growth organisms.
【0123】 [0123]
DNAライブラリーの構築に用いる核酸の供給源は、北極地方および南極地方の氷、水;もしくは永久凍土層に由来するもの;火山に由来する材料;土壌由来の材料;もしくは熱帯地域の植物;哺乳動物、無脊椎動物等の各種生物の糞;死骸および腐敗物等から得られる微生物試料等の混合集団試料から得ることができるが、これらのみに限定されるものではない。 Source of the nucleic acid for use in the construction of DNA libraries, Arctic and Antarctic ice, water; or those derived from the permafrost; material derived from volcanic; material from the soil; or tropical regions plants; mammal animals, invertebrate various organisms feces and the like; may be obtained from a mixed population sample of microorganisms sample and the like obtained from carcasses and putrefaction, etc., are not limited only thereto. 従って、例えば、培養もしくは非培養生物から核酸を回収し、適当なDNAライブラリー(例えば、組換え体発現ライブラリー)の作製およびその後の特定ポリヌクレオチド配列の決定、もしくは生理活性に関するスクリーニングに利用することができる。 Thus, for example, the nucleic acid is recovered from the culture or uncultured organisms, suitable DNA libraries (e.g., recombinant expression libraries) utilizing the determination of fabrication and subsequent specific polynucleotide sequence, or in screening for bioactive be able to.
【0124】 [0124]
以下に、生物の混合集団、および培養が可能である生物、もしくは培養のできない生物からライブラリーを作製する一般的な手順の概要を示す。 The following is a summary of the general steps of making a mixed population of organisms, and culture can be a biological or a library from an organism that can not be cultured. このライブラリーは、検索、配列決定、もしくは特定の、所望の、もしくは予想される生物学的活性(例えば、酵素活性もしくは低分子)を有する核酸配列をこのライブラリーから選択するために、スクリーニングを実施することが可能である。 The library search, sequencing, or specific, desired, or anticipated biological activity (e.g., enzymatic activity or small molecules) a nucleic acid sequence having to select from the library screening it is possible to implement.
【0125】 [0125]
本明細書に記載の混合集団試料は、例えば、昆虫の糞、土壌、水等の、任意の数の供給源(上記)から得ることのできる生物もしくはポリヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせを含む任意の試料であってもよい。 Mixed population sample as described herein, for example, insect feces, soil, water, etc., any number source of any containing organism or polynucleotides or combinations thereof, can be obtained from (above) a sample may be. 精製もしくは非精製の核酸供給源のいずれも出発物質として用いることができる。 Any purified or unpurified nucleic acid source may be used as a starting material. 従って、核酸は、ある生物で汚染されている供給源から得ることもできるし、細胞を含む試料から得ることもできる。 Thus, a nucleic acid, can either be obtained from a source that is contaminated with an organism, it can be obtained from a sample containing cells. 混合集団試料は、哺乳動物由来の血液、尿、脊髄液、組織、膣内より綿棒で採取した標本、大便、羊水もしくは頬口腔洗浄液等の身体的試料からの抽出物であってもよい。 Mixed population sample from a mammal blood, urine, spinal fluid, tissue, sample was collected with a cotton swab from the vagina, stool, or may be an extract from physical sample such as amniotic fluid or buccal mouthwash. 哺乳動物以外の生物(例えば、無脊椎動物)に関しては、試料は組織試料、唾液試料、糞便もしくはその生物の消化管内の物質であってもよい。 Other than mammalian organism (e.g., invertebrates) with respect to the sample tissue samples, saliva samples, may be a substance of feces or gastrointestinal tract of the organism. また、環境試料は、例えば、熱硫黄プール、火口、および凍土帯等の極限環境から得られた試料を含む。 The environmental samples include, for example, thermal sulfur pools, craters, and the samples obtained from extreme environments tundra like. さらに、試料は様々な供給源に由来するものであってもよい。 Furthermore, the sample may be derived from a variety of sources. 例えば、園芸学的および農学的試験では、試料は、植物、肥料、土壌、液体もしくはその他の園芸もしくは農業産物であってもよい。 For example, in the horticultural and agricultural testing, samples, plants, fertilizers, soil, or a liquid or other horticultural or agricultural product. 食品試験では、試料は、生鮮食料品もしくは加工食品(例えば、乳児用調製粉乳、海産物、 生鮮食品およびパッケージ食品)であってもよい。 In the food testing, samples, perishable goods or processed foods (e.g., infant formula, seafood, fresh produce and packaged food) may be used. また、環境試験においては、試料は、液体、土壌、下水処理物、泥 および生物もしくはポリヌクレオチドを含む可能性もしくは疑いのある環境中のその他の試料であってもよい。 Moreover, in the environmental test, the sample is a liquid, soil, sewage treatment product, may be other sample in the environment which may or suspected including mud and organisms or polynucleotide.
【0126】 [0126]
試料が混合物(例えば、生物の混合集団)、例えば、血液、土壌、および泥であれば、細胞を溶解させる、および核酸の鎖を露出もしくは分離させる効果のある適当な試薬で処理することができる。 Sample mixture (e.g., a mixed population of organisms), e.g., blood, soil, and if mud to dissolve the cells, and can be treated with a suitable reagent that is effective to expose or separate the strands of the nucleic acid . 混合集団は培養生物のプールもしくは試料からなるものでもよい。 Mixed population may be composed from a pool or a sample of the culture organisms. 特定集団を精製し純粋な試料を得るために、例えば、生物試料は分析前に培養することができる。 To obtain a pure sample was purified specific populations, for example, biological samples can be cultured prior to analysis. 放線菌もしくは粘液細菌等の、対象となる生理活性を産することが知られている生物は、培養によって濃縮することもできる。 Such as actinomycetes or myxobacteria, it is known to produce the physiological activity of interest organisms can be concentrated by culturing. 試料中の生物の培養は、微小液滴中での生物の培養および培養微小液滴をセルソーターで、後にさらに処理可能な複数ウェルよりなる組織培養プレートの個々のウェルに分離することを含む。 Organism culture in a sample includes separating the individual wells of the micro-liquid culture and the culture fine droplets of organisms in droplets cell sorter consists of more processible multi-well after tissue culture plate.
【0127】 [0127]
従って、試料は、例えば、多様な生物の混合集団(例えば、昆虫の消化管内の微生物)に由来する核酸を含む。 Thus, samples include, for example, nucleic acids from a variety of organisms population mixing (e.g., microorganisms in the digestive tract of the insects). 核酸はDNAおよび RNAに関する多くの単離法を用いて試料から単離する。 Nucleic acids isolated from a sample using a number of the isolation method for DNA and RNA. このような核酸単離法は、当技術分野で通常実施されているものである。 Such nucleic acid isolation method in the art is what is commonly practiced. 核酸がRNAであれば、当技術分野で公知のプライマーを利用して、逆転写反応によってRNAをDNAに変換することができる。 If the nucleic acid is an RNA, using a known primer in the art, the RNA by reverse transcription reaction can be converted into DNA. DNAがゲノムDNAであれば、25ゲージの注射針を用いてDNAを切断することができる。 If DNA is a genomic DNA, it is possible to cut the DNA with a needle 25-gauge.
【0128】 [0128]
その後、核酸をベクターにクローニングする。 Thereafter, cloning the nucleic acid into a vector. クローニング技術は、当技術分野で公知である、もしくは当業者が容易に開発することができる。 Cloning techniques may be known in the art, or those skilled in the art will readily be developed. 本発明において利用するベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイル等)、人工染色体、もしくはそれらの一部(例えば、コートタンパク質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質)等が挙げられる。 The vector utilized in the present invention, plasmids, phages, cosmids, phagemids, viruses (e.g., retrovirus, parainfluenza virus, herpes virus, reovirus, Paramikusouiru etc.), artificial chromosome or a part thereof, (e.g. , coat protein, spike glycoprotein, include capsid proteins), and the like. 例えば、コスミドおよびファージミドの場合には、通常、分析するもしくは修飾を施す特異的核酸配列は、サイズが大きいものを用いることが可能である。 For example, in the case of cosmids and phagemids are typically analyzed or subjected to modified specific nucleic acid sequences may be used having a large size. なぜなら、これらのベクターは、大型のポリヌクレオチドを安定に増幅することが可能だからである。 Because these vectors are large polynucleotides because it can be amplified stably.
【0129】 [0129]
次に、プレートに蒔くこと(すなわち、クローン増幅)によって、クローニングしたDNA配列を含むベクターを増幅することができる。 Next, the plated to plates (i.e., clonal amplification), it is possible to amplify a vector containing the cloned DNA sequence. もしくは、ベクター(例えば、大腸菌宿主上のファージ)を用い適当な宿主細胞にトランスフェクトすることによって増幅することができる。 Or it can be amplified by transfecting a suitable host cell using a vector (e.g., phage on E. coli host). 別法として(または増幅後に)、クローニングしたDNA配列を用いて、適当な生物を形質転換することによって、スクリーニングのためのライブラリーを調製する。 Alternatively (or after amplification), using a cloned DNA sequence, by transforming a suitable organism, preparing a library for screening. 形質転換可能な条件下で接種し、標的核酸を含むベクターへ人工導入することにより、当技術分野で公知の宿主を形質転換する。 Inoculated with transformable conditions, by the artificial introduction into the vector containing the target nucleic acid, transforming a known host in the art. 二本鎖環状もしくは直鎖状の核酸で形質転換することが可能であり、また、一本鎖環状もしくは直鎖状の核酸配列で形質転換を行う場合もある。 Duplex is capable of transforming a cyclic or linear nucleic acid, and in some cases of performing transformed with a nucleic acid sequence of a single-stranded circular or linear. 「形質転換する」もしくは「形質転換」の意味は、新たにDNA(すなわち、細胞にとって外来性のDNA)を導入した後、細胞に恒常的もしくは一過的な遺伝的変化を誘起させることである。 The meaning of "transforming" or "transformation", new DNA (i.e., exogenous DNA to cells) after introducing the is to induce constitutive or transient genetic change in a cell . 細胞が哺乳動物の細胞であれば、恒常的な遺伝的変化は、通常、細胞のゲノムにDNAを導入することによって達成される。 If cells of a cell is mammalian, permanent genetic change is generally achieved by introduction of the DNA into the genome of the cell. 形質転換した細胞もしくは宿主細胞は、通常、組換えDNA技術によって、宿主生物には通常存在しないDNA分子が導入されている(もしくは、その前の世代の細胞に導入されている)細胞(例えば、原核もしくは真核細胞)を意味する。 Transformed cells or host cells, typically by recombinant DNA techniques, DNA molecules in the host organism does not normally present have been introduced (or, are introduced on the previous-generation cells) cells (e.g., It means a prokaryotic or eukaryotic cells).
【0130】 [0130]
本発明に利用する特殊なベクターは、f因子の複製起点を含んだものである。 Special vectors utilized in the present invention are those containing a replication origin of f factor. 大腸菌のf因子(もしくは、稔性因子)は、接合中の自身の転移頻度を高めると同時に、細菌の染色体の転移頻度を抑える効果のあるプラスミドである。 f factor of E. coli (or fertility factor) and, at the same time increasing its transposition frequency in the bonding, a plasmid having the effect of suppressing the metastasis frequency bacterial chromosome. 特定の態様においては、「フォスミド」とよばれクローニング・ベクター、もしくは細菌の人工染色体 (BAC) ベクターを使用する。 In a particular embodiment, using the artificial chromosomes (BAC) vector cloning vector called "fosmids" or bacterial. これらは、長いDNA断片を安定に挿入可能な大腸菌のf因子に由来する。 These are derived from f factors stably insertable E.coli long DNA fragment. 非培養混合集団試料に由来のDNAを挿入する場合には、これによって、安定な「混合集団核酸ライブラリー」の形態で大型のゲノム断片を挿入することが可能となる。 When inserting the DNA derived from uncultured mixed population sample, this makes it possible to insert a large genomic fragments in the form of a stable "mixed population nucleic acid library".
【0131】 [0131]
混合集団もしくは試料由来の核酸は、多様な方法によってベクターへ挿入することができる。 Mixed population or nucleic acid from the sample can be inserted into the vector by a variety of methods. 一般的には、当技術分野で公知の方法で核酸配列を適当なエンドヌクレアーゼ部位に挿入する。 In general, inserting a nucleic acid sequence by methods known in the art suitable endonuclease sites. このような方法およびその他の方法は、当業者であれば理解しうる。 Such methods and other methods may be understood by those skilled in the art. 通常のクローニングの手順は、適当なヌクレアーゼ(例えば、マング ビーン ヌクレアーゼ(Mung Bean Nuclease))でDNAを「平滑化」し、メチル化し (例えば、EcoR Iメチラーゼを用いる)、 EcoR I リンカーとライゲーションする。 Procedures for conventional cloning a suitable nuclease (e.g., mung bean nuclease (Mung bean Nuclease)) and "smoothing" the DNA, the methylated (e.g., using a EcoR I methylase) and ligated with EcoR I linker. 次に、リンカーを制限酵素EcoR I で切断し、DNAをサイズ分画する(例えば、ショ糖密度勾配を用いる)。 Next, cut a linker with restriction enzyme EcoR I, size-fractionated for DNA (e.g., using a sucrose density gradient). 次に、サイズ分画によって得られたDNAを適当なベクターにライゲーションし、配列決定、スクリーニングもしくは発現(例えば、λベクターおよびインビトロλパッケージング・抽出を用いてパッケージしたもの)に利用する。 Then ligated DNA obtained by size fractionation on an appropriate vector, sequencing, screening or expression (e.g., those packages with a λ vector and in vitro λ packaging extracts) used for.
【0132】 [0132]
宿主細胞の組換えDNAによる形質転換は、当業者に公知の通常用いられる技術により行う。 Transformation with a recombinant DNA of the host cells is performed by a person skilled in the art known normal to the technology used. 宿主が大腸菌等の原核細胞であれば、対数増殖期以降に細胞を回収し、その後当技術分野で公知の手順により塩化カルシウム法を用いて処理することによって、DNAの取り込みが可能なコンピテント細胞を調製できる。 If the host is prokaryotic, such as E. coli, the cells were harvested after exponential growth phase, followed by treatment with calcium chloride method by procedures known in the art, competent cells capable of DNA uptake the can be prepared. 別法として、塩化マグネシウムもしくは塩化ルビジウムを用いることもできる。 Alternatively, it is also possible to use magnesium chloride or rubidium chloride. 形質転換は、宿主細胞をプロトプラスト化することによって、もしくはエレクトロポレーションによっても可能である。 Transformation by protoplast the host cell, or it is also possible by electroporation. シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)および酵母菌宿主細胞の形質転換は、本明細書に記載の技術を利用してエレクトロポレーションで行うことができる。 Transformation of Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) and yeast host cells can be carried out in electroporation utilizing the techniques described herein.
【0133】 [0133]
宿主が真核生物であれば、DNAのトランスフェクションもしくは形質転換法には、接合法、リン酸カルシウム共沈法、微量注入法等の通常用いられる機械的方法、エレクトロポレーション、プラスミドをリポゾームに封入する方法、もしくはウイルスベクター等、その他当技術分野で公知の方法が挙げられ、これらを利用しうる。 If the host is a eukaryote, the transfection or transformation methods of DNA, encapsulated bonding method, calcium phosphate coprecipitation, usually mechanical methods used such as microinjection, electroporation, the plasmid liposome method, or viral vectors like, other methods known in the art can be mentioned, can utilize them. 真核細胞は、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子等の選択可能なマーカーをコードする第2の外来DNA分子と共にトランスフェクトすることもできる。 Eukaryotic cells can also be transfected with a second foreign DNA molecule encoding a selectable marker thymidine kinase gene and the like herpes simplex. 別法としては、シミアンウイルス40(SV40)もしくはウシ・パピローマウイルス等の真核ウイルスベクターを用いて、一過性に感染させる、もしくは真核細胞を形質転換し、タンパク質を発現させる(Eukaryotic Viral Vectors、Cold Spring Harbor Laboratory、Gluzman編、1982)。 Alternatively, simian virus 40 (SV40) or using a eukaryotic viral vector, such as bovine papilloma virus, to infect transiently, or a eukaryotic cell transformed to express the protein (the Eukaryotic Viral Vectors , Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). 真核細胞は、酵母菌細胞(例えば、サッカロマイセス セレビッシエ(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ(Drosophila sp.))であってもよく、ヒトの細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。 Eukaryotic cells, yeast cells (e.g., Saccharomyces Serebisshie (Saccharomyces cerevisiae)), insect cells (e.g., Drosophila (Drosophila sp.)) May be, may be mammalian cells, including human cells .
【0134】 [0134]
真核細胞のシステム、および哺乳動物細胞の発現システムであれば、発現した哺乳動物タンパク質の翻訳後修飾が可能となる。 If the expression system of eukaryotic systems, and mammalian cells, it is possible to post-translational modifications of expressed mammalian proteins. 一次転写産物のプロセッシング、糖鎖付加、リン酸化、および、有利なものとして、遺伝子産物の分泌等の細胞機構を有する真核細胞を利用すべきである。 Processing of the primary transcript, glycosylation, phosphorylation, and, as being advantageous, should utilize eukaryotic cells which possess the cellular machinery secretion such gene products. このような宿主細胞株としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK−293、WI38等が挙げられるが、これらのみに検定されるものではない。 Such host cell lines, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293, although WI38, and the like, is not intended to be assayed only thereto.
【0135】 [0135]
遺伝子ライブラリー作製後に、発現スクリーニングに先だって、ライブラリーの「バイオパニング」を実施することができる。 After making gene libraries, prior to expression screening can be carried out "biopanning" library. 「バイオパニング」法とは、特定の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列の少なくとも一部からなる少なくとも一つのプローブDNAを用いて、クローンのライブラリーにおける配列の相同性についてスクリーニングをおこない、さらにクローン中の実質的に相補的な配列に対するプローブDNAの相互作用を検出することによって、特定の生物学的活性を有するクローンを同定する方法である。 By "biopanning" technique, using at least one probe DNA comprising at least a portion of the DNA sequence encoding a polypeptide having the specific biological activity, screened for homology sequences in a library of clones done by detecting the interaction of the probe DNA to further substantially complementary sequence in clone is a method to identify a clone with a particular biological activity. 次に、(生存もしくは非生存状態の)クローンを、分析器(例えば、FACS装置もしくは非光学的マーカーを検出する装置)で分離する。 Then separated at (survival or non-viable state) clones analyzer (e.g., a device for detecting a FACS device or non-optical marker).
【0136】 [0136]
生物の混合集団中のポリヌクレオチドから調製したクローンに含まれる対象となる標的DNAを調べるために利用するプローブDNAは、既知の生理活性に対応するDNAのコード領域配列を完全長で含むものであってよく、部分的に含むものであってもよい。 Probe DNA utilized to examine the target DNA of interest contained in the clone prepared from the polynucleotide in a mixed population of organisms, comprise a coding region sequence of DNA corresponding to the known bioactive full-length well Te, or it may be partially contain. プローブ配列は、合成もしくは組換え手段によって作製可能であり、コンピュータ支援による配列決定プログラムもしくはクローンに含まれる生物学的配列に基づくものであってもよい。 Probe sequence is capable produced by synthetic or recombinant means, it may be based on biological sequence contained in sequencing program or clone computer-aided. 所望の活性を有する既知の生理活性をコードするDNA配列の少なくとも一部からなるプローブの混合物を利用して、DNAライブラリーを調べることができる。 Using mixtures of probes comprising at least a portion of the DNA sequence encoding the known physiological activities of the desired activity can be examined DNA library. これらのプローブもしくはプローブ・ライブラリーは、好ましくは一本鎖である。 These probes or probe libraries are preferably single-stranded. 特に好適なプローブは、スクリーニングの対象となる特定の生理活性に類似もしくは同一である活性を有する生理活性をコードするDNAに由来したものである。 Particularly preferred probes are those derived from DNA encoding the physiological activities of a specific bioactivity similar or activity is the same to be screened.
【0137】 [0137]
別の態様においては、ライブラリーを含む宿主細胞を、所望の活性を有する生理活性をコードするDNA配列の全域もしくは一部を含む少なくとも一つの標識核酸配列でトランスフェクトし、光学的もしくは非光学的分析法により所望の配列を含むライブラリークローンを分離することによって、生物の混合集団に由来する核酸ライブラリーを、対象となる配列に関してスクリーニングする。 In another embodiment, a host cell comprising the library were transfected with at least one labeled nucleic acid sequence comprising the whole or part of the DNA sequence encoding the biologically active having the desired activity, optical or non-optical by separating the library clones containing the desired sequence by analysis, a nucleic acid library derived from a mixed population of organisms, screening for the sequence of interest.
【0138】 [0138]
別の態様においては、FACS装置を利用してインビボバイオパニングを実施することができる。 In another embodiment, it may be performed in vivo biopanning using a FACS machine. 転写されたRNAを安定化する要素を含むベクターを用いて、複雑な遺伝子ライブラリーを構築する。 With vectors containing an element to stabilize the transcribed RNA, constructing a complex gene libraries. 例えば、RNAの転写領域を挟むようにデザインしたヘアピン等の二次構造をもたらす配列を含むことによって、安定性を高め、細胞内での半減期を延ばす。 For example, by including sequences that result in secondary structure hairpins or the like designed so as to sandwich the transfer region of the RNA, increase stability, increase the half-life in the cell. バイオパニング処理に用いるプローブ分子は、標的分子にプローブが結合したときにのみ蛍光を発するレポーター分子で標識したオリゴヌクレオチドからなる。 Probe molecules used in the biopanning process, consisting of an oligonucleotide labeled with a reporter molecule that fluoresces only when the probe to the target molecule bound. 当技術分野で公知の各種色素もしくは染色剤、例えば、「実際のフローサイトメトリー(Practical Flow Cytometry)」、1995 Wiley−Liss、Inc. Various known dyes or stains in the art, for example, "Actual flow cytometry (Practical Flow Cytometry)", 1995 Wiley-Liss, Inc. 、ハワード(Howard M.)、シャピロ(Shapiro, M.D.)に記載されているもの等を用いて、オリゴヌクレオチドを「標識」するために核酸にインターカレートもしくは結合させることができる。 Howard (Howard M.), Shapiro (Shapiro, M. D.) using such as those described in, can be intercalated or bound to a nucleic acid to "label" the oligonucleotide. 複数の形質転換法のいずれかを用いて、このようなプローブを、ライブラリーの組換え体細胞に導入する。 Using any of several transformation methods, such probes are introduced into recombinant cells of the library. プローブ分子は、転写された標的 mRNAもしくはDNAと相互作用もしくはハイブリダイズし、DNA/RNAヘテロ二重鎖分子もしくはDNA/DNA二重鎖分子を形成する。 Probe molecules, transcribed by the target mRNA or DNA and interacting or hybridize to form a DNA / RNA heteroduplex molecules or DNA / DNA duplex molecules. 標的へのプローブの結合により、スクリーニング段階において FACS装置で検出・選別される蛍光シグナルを生じる。 Binding of the probe to the target results in a fluorescent signal that is detected and sorted by FACS device in screening phase.
【0139】 [0139]
プローブDNAの長さは、少なくとも約10塩基、好ましくは少なくとも15 塩基必要である。 The length of the probe DNA is at least about 10 bases, preferably have at least 15 bases. プローブDNAについての好ましいサイズ範囲は、少なくとも約15塩基から約100塩基、少なくとも約100塩基から約500塩基、少なくとも約500塩基から約1,000塩基、少なくとも約1,000塩基から約5,000塩基、および少なくとも約5,000塩基から約10,000塩基である。 A preferred size range for the probe DNA is at least about 15 bases to about 100 bases, at least about 100 bases to about 500 bases, at least about 500 bases to about 000 bases, at least about 000 bases to about 5000 bases , and at least about 5,000 bases of about 10,000 bases. ある態様においては、経路の一部の全コード領域をプローブとして用いる。 In some embodiments, using the entire coding region of the part of the path as a probe. プローブがインビトロ系で標的DNAにハイブリダイズするのであれば、少なくとも一つのDNAプローブを用いて標的DNAを選択的に単離できるハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーが、少なくとも約50%の配列同一性、 さらにはストリンジェンシーが少なくとも約70%の配列同一性に相当するように調整する。 If the probe is to hybridize to the target DNA in vitro system, the conditions of hybridization can selectively isolate target DNA using at least one DNA probe, hybridization stringency of at least about 50% sequence identity, more stringency is adjusted to correspond to at least about 70% sequence identity. 微生物のDNAライブラリーを探索し、潜在的に対象となりうる標的DNAを単離するためのハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で公知であり、文献に記載されているいずれの技術も本発明において好適に利用できる。 Explore the DNA library of a microorganism, hybridization techniques for the isolation of potentially target DNA may be subject are known in the art, preferably in any of the technologies present invention described in the literature available. 蛍光選別を行う前に、クローンは生存状態であっても非生存状態であってもよい。 Before performing the fluorescence sorting, clones may be a non-viable state even alive. 例えば、ある態様においては、細胞を選別に先だってパラホルムアルデヒドで固定する。 For example, in certain embodiments, fixed with prior paraformaldehyde sort cells.
【0140】 [0140]
蛍光分析器で、プローブDNAに対し実質的に相補的である配列を含む生存状態もしくは非生存状態のクローンを分離した後、分離クローン中に存在するポリヌクレオチドをさらに操作することができる。 A fluorescent analyzer, after separating the substantially alive or nonviable state clones comprising a sequence that is complementary to the probe DNA, it is possible to operate the polynucleotide present in the separation clones. 単離した標的DNAを増幅することが好ましい場合もある。 If it is preferable to amplify the isolated target DNA also. 本態様では、単離後、プローブDNAから標的DNAを分離する。 In this embodiment, after isolation, separating the target DNA from the probe DNA. ある態様においては、同一クローンからなる集団を増幅するためにクローンを増殖させる。 In some embodiments, growing clones to amplify a population of the same clone. または、宿主細胞を溶解し、標的DNAを増幅する。 Or, lysing the host cell to amplify the target DNA. 次に、新規の宿主への形質転換(例えば、サブクローニング)に使用する前に、これを増幅する。 Then, prior to use in transformation into a new host (e.g., subcloning), and amplifies it. ロングPCR(Bames、W M、Proc. Natl. Acad. Sci、USA、Mar. 15、1994) を用いて、大型のDNA断片(例えば、35kb)を増幅する。 Long PCR (Bames, W M, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Mar. 15,1994) using a large-sized DNA fragments (e.g., 35 kb) to amplify the. 現在では、多数の増幅技術が当技術分野で公知である。 Currently, a number of amplification techniques are known in the art.
【0141】 [0141]
標的DNAをインビトロで同定する場合には、その後の処理に用いるライブラリーを調製するために、選択したDNAを利用し適当な生物を形質転換して、スクリーニングを行う。 When identifying a target DNA in vitro, to prepare a library for use in subsequent processing, a suitable organism using selected DNA was transformed, screened. 宿主、特に、本発明において好ましいものとしては、特に同定されたものは、形質転換可能な条件下で接種し、標的DNAを含むベクターの人工導入することによって形質転換する。 Host, in particular, as preferred in the present invention, particularly those identified, inoculated with transformable conditions, transformed by artificial introduction of the vectors containing the target DNA.
【0142】 [0142]
次に、得られたライブラリー(対象となるポリヌクレオチドが濃縮されている)をスクリーニングして、対象となる活性を示すクローンを得ることができる。 It can then be screened the resulting library (the target polynucleotide is concentrated) to obtain a clone showing activity of interest. クローンは、活性化合物を発現させるために別の宿主に移すこともできるし、本明細書に記載の方法でスクリーニングすることもできる。 Clones, can either be transferred to another host in order to express the active compounds can also be screened by the methods described herein.
【0143】 [0143]
本明細書に記載のハイブリダイゼーション技術により選択的に単離したDNAから複数のクローンを調製し、特異的活性に関し、これらのクローンをスクリーニングし、特定の性質を有するクローンを同定する。 Selectively preparing a plurality of clones from DNA isolated by hybridization techniques described herein relates to specific activity, these clones were screened to identify clones with specific properties.
【0144】 [0144]
活性に関するスクリーニングは、個々の発現クローンについて行うこともできるし、混合物が1種類もしくは複数種の特異的活性を有しているか否かを確かめるために最初に発現クローンの混合物について行うこともできる。 Screening for activity can either be carried out on individual expression clones, the mixture may first be performed on a mixture of expression clones to ascertain whether it has one or more specific activities. この混合物が特異活性を含む場合には、個々のクローンを、この活性に関してもしくはさらに特異的な活性に関して再スクリーニングを行う。 If the mixture containing the specific activity, the individual clones, to re-screened for or more activity specific for this activity.
【0145】 [0145]
上記のインビボ・バイオパニングを行う前、行った後、もしくは本法とは別に、GMD等の封入化技術を用いる。 Before performing the above vivo biopanning, after, or separately from the Act, used encapsulation techniques GMD like. これは、増殖のため、もしくは蛍光分析器(例えば、 FACS)によるスクリーニングを行うために、少なくとも1クローンを一カ所に分離する目的で用いることもできる。 This is because the growth, or fluorescent analyzer (e.g., FACS) in order to perform screening by, may be used for the purpose of separating in one place at least 1 clone. GMDに含まれる少なくとも1クローンの分離したクローンは、次に、培養して増幅する、もしくは上記のようにFACS装置でスクリーニングして対象となる配列を含むクローンを同定する。 Clones were isolated at least 1 clone contained in GMD is then amplified by culturing, or to identify clones containing the sequence of interest was screened by FACS apparatus as described above. これらは、次に、個々のクローンに分離して、FACS装置で再びスクリーニングを行い、個々の陽性クローンを同定する。 These are then separated into individual clones again were screened by FACS machine to identify individual positive clones. FACS装置を用いたこのようなスクリーニング法は、1997年6月16日に出願された米国特許出願第08/876,276号に記載されている。 Such screening method using FACS device is described in U.S. Patent Application Serial No. 08 / 876,276, filed June 16, 1997. 本文献は参照として本明細書に組み入れられる。 This document is incorporated herein by reference. 従って、例えば、あるクローンが所望の活性を有しているなら、個々のクローンを回収し、かかるクローンのうちいずれが所望の特異的活性を有するのかを明らかにするためにFACS装置を用いて再スクリーニングする。 Thus, for example, if there clone has the desired activity, using FACS device to recover the individual clones, which one of such clones to reveal whether having the desired specific activity Re screening.
【0146】 [0146]
さらに、発現ライブラリーの作製前に標準化段階を実施し、次に発現ライブラリーを作製し、作製した発現ライブラリーをバイオパニングし、さらにハイスループットな細胞選別およびスクリーニング機器を用いてバイオパニングした発現ライブラリーをスクリーニングするように、上記の態様のうちの複数もしくは全部を組み合わせることもできる。 Furthermore, implementing a standardized step before preparation of an expression library, then create an expression library, biopanning a expression library prepared, and biopanning further with a high-throughput cell sorting and screening equipment expression to screen a library may be combined more or all of the above aspects. 従って、様々な選択肢がある。 Therefore, there is a variety of choices. 例えば、(1)ライブラリーを調製し、次にこれをスクリーニングする、(2)標的DNAを標準化し、発現ライブラリーを作製してこれをスクリーニングする、(3)標準化し、発現ライブラリーを作製してこれをバイオパニングしスクリーニングする、(4)ライブラリーを作製し、バイオパニングしスクリーニングする。 For example, (1) the library was prepared, then screening this, (2) to standardize the target DNA, screening it to prepare a expression library, (3) normalized, producing an expression library This is biopanning were screened, (4) to generate a library and biopanning screened.
【0147】 [0147]
ライブラリーのスクリーニングを、例えば、特異的酵素活性について実施する。 Screening of the library, for example, be carried out for specific enzyme activity. 例えば、スクリーニングした酵素活性は、6種類のIUB分類のうち1種ないし複数種に属していてもよい。 For example, screening enzyme activity, it may belong to one or more of the six IUB classification. 6種類のIUB分類とは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素である。 Six of the IUB classification, oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, an isomerase and synthetase. 6種類のIUB分類のうち1種ないし複数種のものに関して陽性であることが判明した組換え体酵素については、次に、より特異的な酵素活性に関して再スクリーニングを行う。 Six for one or the recombinant enzyme were found to be more positive for ones of the IUB classification, then to re-screened for a more specific enzyme activity.
【0148】 [0148]
または、より特異的な酵素活性に関してライブラリーをスクリーニングする。 Or, screening the library for a more specific enzyme activity. 例えば、加水分解酵素活性一般についてのスクリーニングを実施する代わりに、より特殊な活性(すなわち、加水分解酵素が作用する結合の種類)に関して、ライブラリーをスクリーニングすることもできる。 For example, instead of carrying out the screening for hydrolase activity general, for a more specialized activity (i.e., binding of the type hydrolase acts), it is also possible to screen libraries. 従って、例えば、ライブラリーをスクリーニングし、1種ないし複数種の、(a)アミド(ペプチド結合)、すなわち、プロテアーゼ、(b)エステル結合、すなわち、エステラーゼおよびリパーゼ、(c)アセタール、すなわち、グリコシダーゼ等の特異的化学官能基に作用する加水分解酵素を確認する。 Thus, for example, to screen the library, the one or more, (a) amide (peptide bonds), i.e., proteases, (b) ester bonds, i.e., esterases and lipases, (c) acetals, i.e., glycosidases It confirms hydrolases acting on specific chemical functional groups and the like.
【0149】 [0149]
上記複数の局面のうち、一つについて記載したように、本発明は、生物の混合集団もしくは1種以上の生物に由来し、選択されたDNAを含むクローンの活性スクリーニングの方法を提供する。 Among the plurality of aspects, one as described for the present invention is derived from a mixed population or one or more biologically organisms, a method for activity screening of clones containing the selected DNA.
【0150】 [0150]
対象となる配列に関して陽性であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドもしくはクローンを選択するための、対象となる配列に関して陽性であるクローンもしくはポリヌクレオチドを分離することによる、蛍光を検出する蛍光分析器を利用した生物の混合集団からのポリヌクレオチドのバイオパニング、および選択したポリヌクレオチドもしくはクローンの特異的生理活性に関するスクリーニング。 For selecting a polynucleotide or clone comprising a polynucleotide which is positive for the sequence of interest, due to isolate clones or polynucleotide positive for sequences of interest, utilizing a fluorescence analyzer for detecting fluorescence biopanning polynucleotides from a mixed population of organisms, and the selected polynucleotides or screening for the specific biological activity of the clone. ある態様においては、所望の活性を含む生理活性をコードするDNA配列の全体もしくは一部である少なくとも一種類のDNA配列に対するハイブリダイゼーションによって選択したDNAである微生物のDNAを回収することによって調製したクローンに、ポリヌクレオチドが含まれている。 In some embodiments, clones prepared by recovering the DNA of the microorganism is DNA were selected by hybridization to at least one DNA sequence which is all or part of the DNA sequence encoding the biologically active containing the desired activity to, contains a polynucleotide.
【0151】 [0151]
別の態様においては、所望の活性を含む活性をコードするDNA配列の全体もしくは一部である1種もしくは複数種のプローブDNA配列にハイブリダイズするDNAを選別するために、微生物由来のDNAライブラリーを、特定の選択方法を利用して処理する。 In another embodiment, in order to select a DNA that hybridizes to one or more of the probe DNA sequence is all or part of the DNA sequence encoding the activity containing the desired activity, DNA library derived from microorganisms and treated by using a particular selection method. これは次のようにする。 This is as follows.
【0152】 [0152]
(a)プローブとDNAライブラリーの構成員が二重鎖複合体を形成できるようなハイブリダイゼーション可能な条件下で、DNAライブラリーを蛍光標識したDNAプローブと接触させる。 (A) hybridization can be conditions, such as members of the probes and DNA libraries can form a double-stranded complex, contacting a DNA library with fluorescent-labeled DNA probes.
【0153】 [0153]
本発明によって、多様な生理活性のスクリーニングが可能となる。 The present invention, screening of various physiological activities becomes possible. 例えば、新規のポリケチドを合成し調べる目的で、ポリケチドおよびのポリケチド以降の生合成に関わる遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択し組み合わせることができれば、その重要性は高い。 For example, for the purpose of examining synthesized novel polyketides, if it is possible to combine and select the desired components from a library of genes involved in the biosynthesis of subsequent polyketides and polyketide, its importance is high. 本発明の方法によって、新規のポリケチド合成酵素遺伝子および/もしくは遺伝子経路、およびその他の適当な経路もしくは商業的に妥当な二次代謝産物をコードする遺伝子のクローニングが促進される。 By the method of the present invention, cloning of the gene encoding a novel polyketide synthase gene and / or gene pathways, and other suitable route or commercially reasonable secondary metabolites is facilitated. なぜなら、(特に、f因子を含むベクター等の、大型インサートを許容しうるベクターを利用することによって)遺伝子クラスターのクローニングを促進するような長いインサートを含むクローンからなる遺伝子バンクを作製できるからである。 This is because (in particular, vectors or the like including a f factor, by utilizing vectors acceptable large insert) a gene bank of clones containing long insert so as to facilitate cloning of gene clusters can be produced .
【0154】 [0154]
上記のバイオパニング法を用いて、与えられたプローブ配列に対し実質的に相同性である配列を有するクローンが濃縮されているライブラリーを作製することができる。 Using biopanning method described above, clones with a sequence that is substantially homologous to a given probe sequence can be produced libraries are enriched. この方法により、最大40kbpもしくはそれより長いクローンを含むライブラリーを、パニングの各回毎に約1,000倍濃縮することができる。 By this method, a library containing a maximum 40kbp or longer clones than can be concentrated about 000-fold each time each of panning. これによって、バイオパニングによる各回の濃縮操作後に、スクリーニングするクローンの数を減少させることができるのである。 Thus, after each round of enrichment operation by biopanning, it is possible to reduce the number of screened clones. この方法を用いて、対象となる生理活性に関連した対象となる配列、例えば、ポリケチド配列を有するクローンを含むライブラリーを作製することができる。 Using this method, the target associated with the physiological activity of interest sequence, for example, it is possible to generate libraries comprising clones with polyketide sequence.
【0155】 [0155]
対応物が知られていない新規の生理活性分子を発見する目的において、対象となる遺伝子を含む経路の相同体を検出する際に、高密度フィルターもしくはバイオパニングを用いたハイブリダイゼーション・スクリーニングが効率のよい方法であることが示されている。 The purpose of discovering new biologically active molecules counterpart is not known, when detecting homologues path comprising a gene of interest, the hybridization screening using high-density filter or biopanning efficiency It has been shown to be a good method. 対象となるポリヌクレオチドをクローンのライブラリー中で濃縮すれば、活性を好適にスクリーニングすることができる。 If concentrated polynucleotide of interest in a library of clones can be suitably screened for activity. 例えば、低分子環状構造もしくは「骨格」の発現に関するスクリーニングを行うことが好ましい。 For example, it is preferable to perform screening for expression of the low molecular cyclic structure or "skeleton". このような多環状構造をコードする遺伝子は大腸菌で発現可能であることが多く、たとえ不活性型のものであってもこのような低分子骨格を作ることができる。 Such polycyclic structure encoding gene is often can be expressed in E. coli, it is also possible to make such small molecule scaffold comprising at if one of the inactive form. 不活性型の構造を改変するもしくは「修飾する」ことのできる糖鎖化およびメチル化遺伝子等、必要な遺伝子を発現する適当な宿主に分子もしくは経路を導入することによって、生理活性を付与する。 Sugar and methylation genes like that can or modifying an inactive form of the structure "modified", by introducing a molecule or pathway to a suitable host expressing the desired gene, confers bioactivity. 従って、たとえ不活性型環状化合物であっても、組換えにより大腸菌で発現するものは検出され、クローンが同定される。 Therefore, even if inactive cyclic compounds, those expressed in E. coli recombinantly is detected, clones are identified. このクローンは、その後、次の段階で生理活性分子の生産を行うためにストレプトミセス (例えば、ストレプトミセス−ダイバーザエ(Streptomyces diversae)またはストレプトミセス−ベネズエラ(Streptomyces venezuelae)等の代謝的に富んだ宿主に移される。大腸菌は活性型低分子を生産できるので必ずしも必要というわけではないが、構造の「修飾」の目的で代謝的に富んだ宿主にクローンを移すことが好ましい場合もあり得ると考えるべきである。ハイスループットなロボット・システムを利用すれば、マイクロタイター・プレート状の多重化アレイで数十万クローンのスクリーニングが可能になる。 This clone is then Streptomyces in order to perform the production of bioactive molecules in the next stage (e.g., Streptomyces - Daibazae (Streptomyces diversae) or Streptomyces - Venezuela (Streptomyces venezuelae) metabolically rich hosts such transferred. coli should although not necessarily so can produce active low-molecular, consider that there may also be preferable to move the clone to the purpose metabolically rich hosts "modification" of the structure by using certain. high throughput robotic system allows the screening hundreds of thousands clones multiplexed arrays of microtiter plates form.
【0156】 [0156]
このような構造を有するクローンを検出および濃縮する方法には、FACSスクリーニングを利用したものがある。 The methods for detecting and concentrating the clones having such a structure, there is one using a FACS screening. その方法の一つが、1997年6月16付けの米国特許出願第08/876,276号に記載例示されている。 One way is illustrated according to June 1997 16 with the U.S. Patent Application Serial No. 08 / 876,276. 多環状化合物は、通常、紫外光で励起したときに特徴的な蛍光スペクトルを発する。 Polycyclic compounds usually emit characteristic fluorescence spectrum when excited by ultraviolet light. 従って、充分高感度な検出方法を用いれば、このような構造物を発現しているクローンは、バックグラウンドから識別することが可能である。 Therefore, by using a sufficiently sensitive detection method, clones expressing such structure, it is possible to distinguish from the background. ハイスループットなFACSスクリーニングを利用して、例えば、大腸菌ライブラリー中の低分子骨格に関するスクリーニングが可能である。 Using high throughput FACS screening, for example, it is possible to screening for small molecule scaffold in E. coli library. 市販のFACS装置により、UVで励起できる分子に関して一秒間に100,000 クローンにのぼる数をスクリーニングできる。 The commercial FACS devices can be screened a number amounting to 100,000 clones per second with respect to molecules that can be excited by UV. これらのクローンを選別してさらにFACSによるスクリーニングを実施することができる。 Further by selecting these clones can be performed screening by FACS. もしくは、内在するプラスミドを抽出して、活性クリーニングを行うためにストレプトミセスに移すことができる。 Or, a plasmid was extracted to the underlying, can be transferred to Streptomyces to perform active cleaning.
【0157】 [0157]
別の態様においては、各種の電磁気を利用した検出器を用いて、生理活性もしくは生体分子もしくは化合物を検出する。 In another embodiment, using a detector using a variety of electromagnetic, for detecting the physiological activity or biological molecule or compound. このような検出器としては、例えば、フローサイトメトリーを伴う光学的、磁気的、温度による検出が挙げられる。 Such a detector, for example, optically involving flow cytometry, magnetic, and detection by temperature.
【0158】 [0158]
フローサイトメーターは、通常、大きな集団内の個々の細胞もしくは粒子を識別するために光学的検出法(蛍光、散乱等)を利用する。 Flow cytometer typically utilizes optical detection method for identifying individual cells or particles in a large population (fluorescence, scattering, etc.). これまでにない識別/スクリーニングを達成可能な、単体もしくは光学的方法と組み合わせて使用する非光学的な方法が、複数存在する。 Achievable unprecedented identification / screening, non-optical method for use in combination with single or optical methods, there exist a plurality.
【0159】 [0159]
磁場の検出は、蛍光法の代替として、もしくは、例えば、蛍光法との組み合わせにおいて利用する技術の一つである。 Detection of the magnetic field, as an alternative to the fluorescence method, or, for example, is one of the techniques utilized in combination with fluorescence. 利用可能なセンサーの一例はホール効果センサーである。 An example of the available sensor is a Hall effect sensor. 超伝導量子干渉装置(SQUIDS)は、磁束および磁場に関し現在までに開発されているもののうち最も感受性の高いセンサーである。 Superconducting quantum interference devices (SQUIDS) is the most sensitive sensors of those that have been developed to date relates flux and magnetic field. SQUIDの感度に関し一般的な基準はエネルギー分解能である。 General criteria relates SQUID sensitivity is an energy resolution. これは、一秒間における(もしくは、1Hzの帯域幅における)SQUIDが検出可能なエネルギーの最小変化と定義される。 This is in one second (or, in the band width of 1 Hz) is SQUID is defined as the smallest change in the detectable energy. 典型的な値は、10 33 J/Hzである。 Typical values are 10 - a 33 J / Hz. グレガイト(gregite)(Fe )のマグネタイト(FE )からなる永久単一磁区粒子の鎖を含むある種の細菌に含まれるマグネトゾーム存在下でSQUIDSを利用することができる。 Guregaito (gregite) (Fe 3 S 4 ) of magnetite (FE 3 O 4) in the magnet transchromosomic presence included in certain bacteria, including a chain of permanent single-domain particles consisting of can utilize SQUIDS. フローサイトメーターにおける流束近傍にSQUIDを設置して、マグネトゾームを含む細胞の磁場(もしくは、残存磁場)を検出する。 By installing a SQUID in flux vicinity of the flow cytometer to detect the magnetic field of cells containing magnetoplumbite transchromosomic (or residual magnetic field). 本法を用いて、細胞、もしくは例えば、磁気プローブを含む細胞を、磁気的性質に基づいて単離できる。 Using this method, cell, or for example, a cell including a magnetic probe, can be isolated based on magnetic properties. 他の例として、マグネトゾーム含有細菌の合成経路における変化を、同様な技術を利用して測定することができる。 As another example, a change in the synthetic pathway of the magneto transchromosomic containing bacteria, can be measured using similar techniques. このような技術を用いて、マグネトゾームの合成経路を修飾する作用因子を同定することができる。 Using such techniques, it is possible to identify an agent that modifies the synthetic route magnetoplumbite transchromosomic.
【0160】 [0160]
動的荷電特性の測定は、例えば、蛍光による方法とは別にもしくは組み合わせて用いることができるもう一つの技術である。 Measurements of the dynamic charging characteristics, for example, is another technique that can be used in combination separately or from the method by fluorescence. 多極子結合分光法(Multipole Coupling Spectroscopy;MCS)では、標識を必要しないシステムの動的荷電特性を直接測定する。 Multipole coupling spectroscopy; In (Multipole Coupling Spectroscopy MCS), measures the dynamic charging characteristics of the system that do not require labeling directly. 分子相互作用による構造変化は、荷電分布に典型的な変化をもたらす。 Structural change due to molecular interactions leads to typical changes in charge distribution. さらに、これは誘電スペクトルもしくは個々の相互作用に関する親和性、特異性および機能性を示す「特徴」を生み出す。 Further, this affinity for dielectric spectrum or individual interaction, produce a "feature" indicating the specificity and functionality. 荷電分布の同様な変化が細胞系でも起こる。 Similar changes of the charge distribution is also occur in the cell system. このような特徴の変化を調べることによって、分子経路および細胞機能の動的性質を、天然条件下で分離できる。 By examining the changes in such features, the dynamic nature of the molecular pathways and cellular functions can be separated under native conditions. MCSでは、フローサイトメーターの流束の近傍に配置した小型のマイクロ波(500MHz〜50GHz)トランシーバを利用する。 In MCS, utilizing flow cytometry small microwave disposed in the vicinity of the flux meter (500MHz~50GHz) transceiver. 測定に要する時間は短いので(例えば、ミリ秒)、フローサイトメーターの流路を流れる個々の細胞の完全なMCS特性が分離され、分析可能となる。 Since the time required for measurement is short (e.g., milliseconds), full MCS characteristic of individual cells passing through the flow path of the flow cytometer are separated, thereby enabling analysis. 次に、スペクトルに関する既知の特徴に基づくか、もしくはその集団からの統計的偏差に基づいて、細胞を選別および/もしくは単離することができる。 Then, either based on the known characteristics relating to the spectrum, or on the basis of the statistical deviation from the population can be screened and / or isolate cells. この技術の利用例としては、発現変異体の選択、低分子の前スクリーニング等が挙げられる。 The use of this technique, the choice of expression variants include prescreening like low molecular.
【0161】 [0161]
あるスクリーニング法では、スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、ミクロコッカス ルテウス(Micrococcus luteus)、大腸菌、もしくはサッカロマイセス セレビッシエ等の被検生物に対し感受性スクリーニングを行い、候補クローン由来の生体分子の生理活性を試験することができる。 In one screening method, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Micrococcus luteus (Micrococcus luteus), perform sensitivity screened against E. coli or test organisms such as Saccharomyces Serebisshie, testing the bioactivity of biomolecules from candidate clones can do. この方法において、被検生物とクローンとを同時封入すれば、FACSスクリーニングを利用することもできる。 In this method, if coentrapped a test organism and clones, it can be utilized FACS screening.
【0162】 [0162]
本発明が提供する上記のスクリーニング法の別法として、「混合抽出物」スクリーニングと呼ぶ方法が挙げられる。 As an alternative to the above screening methods provided by the present invention, a method referred to as "mixed extract" screening. この「混合抽出物」スクリーニング法は、多環状骨格に対する活性を付与するための補助的遺伝子が、ストレプトミセス等の代謝的に富んだ宿主において発現していること、および酵素を抽出し、生理活性化合物をインビトロで産生する大腸菌クローンから抽出した骨格と混合することができる等の利点を有する。 The "mixed extract" screening methods, ancillary gene to confer activity against polycyclic skeleton, that is expressed in metabolically rich hosts such Streptomyces, and extracting the enzyme, bioactive the compounds in vitro has advantages such as it can be mixed with backbone extracted from E. coli clones producing. ストレプトミセス 株等の代謝的に富んだ宿主からの様々な増殖段階における酵素抽出物の調製物は、大腸菌ライブラリーの有機抽出物のプールと混合し、生理活性を調べる。 Preparations of an enzyme extract in various growth stages from metabolically rich hosts such Streptomyces strains, mixed with pooled organic extracts of E. coli libraries examined bioactivity. 大腸菌クローンの活性を検出する別の方法としては、生理活性化合物を異なる種類のものに変換することの可能な遺伝子のスクリーニングが挙げられる。 Another method of detecting the activity of the E. coli clones include screening of possible genes be converted to those of different kinds of physiologically active compounds. 例えば、低価のダウノマイシン(daunomycin)を高価のドクソリビシン(doxorubicin)に変換することのできる組換え体酵素が最近発見された。 For example, recombinant enzyme capable of converting the expensive low valent daunomycin (daunomycin) Dokusoribishin (doxorubicin) was discovered recently. ペニシリンをセファロスポリンに変換する同様な酵素経路の検索が現在進行している。 Find similar enzyme pathway that converts penicillin cephalosporin is currently in progress.
【0163】 [0163]
特異的酵素活性を検出する目的で、当技術分野で公知の方法を用いてスクリーニングを実施することもできる。 The purpose of detecting specific enzymatic activity, it is also possible to carry out screening using methods known in the art. 例えば、6種類のIUB分類のうち一種もしくは複数種について酵素活性をスクリーニングしてもよい。 For example, it may be screened enzymatic activity for one or more of the six IUB classification. 6種類のIUB分類とは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素である。 Six of the IUB classification, oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, an isomerase and synthetase. 6種類のIUB分類のうち1種ないし複数種のものに関して陽性であることが判明した組換え体酵素については、次に、より特異的な酵素活性に関して再スクリーニングを行う。 Six for one or the recombinant enzyme were found to be more positive for ones of the IUB classification, then to re-screened for a more specific enzyme activity. または、より特異的な酵素活性に関してライブラリーをスクリーニングする。 Or, screening the library for a more specific enzyme activity. 例えば、加水分解酵素活性一般についてのスクリーニングを実施する代わりに、より特殊な活性(すなわち、加水分解酵素が作用する結合の種類)に関して、ライブラリーをスクリーニングすることもできる。 For example, instead of carrying out the screening for hydrolase activity general, for a more specialized activity (i.e., binding of the type hydrolase acts), it is also possible to screen libraries. 従って、例えば、ライブラリーをスクリーニングし、1種ないし複数種の、(a)アミド(ペプチド結合)、すなわち、プロテアーゼ、(b)エステル結合、すなわち、エステラーゼおよびリパーゼ、(c)アセタール、すなわち、グリコシダーゼ等の特異的化学官能基に作用する加水分解酵素を確認する。 Thus, for example, to screen the library, the one or more, (a) amide (peptide bonds), i.e., proteases, (b) ester bonds, i.e., esterases and lipases, (c) acetals, i.e., glycosidases It confirms hydrolases acting on specific chemical functional groups and the like.
【0164】 [0164]
ストレプトミセス等の代謝的に富んだ宿主を含む宿主中でのUV 蛍光分子の発現を検出する目的で、FACSスクリーニングを利用することもできる。 In order to detect the expression of UV fluorescent molecule in a host comprising a metabolically rich hosts Streptomyces such, it can also be utilized FACS screening. 例えば、組換え体オキシテトラサイクリンは、S. For example, recombinant oxytetracycline, S. リビダンス(S. lividans) TK24で異種的に生産されると、特徴的な赤色蛍光を出す。 Once produced heterologously by lividans (S. lividans) TK24, it gives a characteristic red fluorescence. このように、FACSで選別できる経路クローンの、多環状分子に関するスクリーニングをハイスループットに実施できるのである。 Thus, it can be carried out of the path clones can sorted by FACS, screening for polycyclic molecules to high-throughput.
【0165】 [0165]
転写因子とその活性化因子間、もしくは受容体とその標的間のタンパク質−タンパク質もしくはその他の相互作用に対する促進因子および阻害因子を検出可能な「ツーハイブリッド」システムを利用して、組換え体生理活性化合物のインビボ・スクリーニングを行うことも可能できる。 Between transcription factors and their activators, or receptor protein between the target - by using the protein or detectable "two-hybrid" system promoting factors and inhibitors for other interactions, recombinant bioactive by performing the in vivo screening of compounds can be possible. 本態様においては、低分子経路およびレポーター構築物の双方を同時発現させる。 In this embodiment, to co-express both the low molecular pathway and reporter construct. 次に、レポーター発現に変化のあるクローンをFACSで選別し、その経路のクローンを単離して特徴付けを行うことができる。 Then, clones having the changes in reporter expression were sorted by FACS, it is possible to perform the characterization and cloning of the path isolated.
【0166】 [0166]
上記のように、創薬に用いる通常の方法は、疾病標的(疾病の発症に関係した高分子)を、治療活性を試験する潜在的薬剤候補に接触させるスクリーニング法を含む。 As described above, conventional methods used for drug discovery, disease targets (polymer related to the onset of disease), including screening methods of contacting a potential drug candidates for testing the therapeutic activity. 他の方法では、スクリーニングを行う目的で、細菌もしくは腫瘍細胞株等の疾病の原因となる因子の代表となる全細胞もしくは生物を、潜在的候補と接触させる。 In other methods, in order to perform the screening, whole cells or organisms as a representative of the causative agent of disease, such as bacterial or tumor cell lines, is contacted with a potential candidate. いずれの方法も、本発明と共に用いることができる。 Either method can be used with the present invention.
【0167】 [0167]
本発明によって、非培養試料からクローニングした経路を代謝的に富んだ宿主に移し、異種性に発現させ、上記に概説した様々なスクリーニング法を利用して対象となる生理活性化合物の下流をスクリーニングすることもできる。 The present invention, transferred to path cloned from uncultured sample metabolically rich hosts, expressed in heterologous screened downstream bioactive compounds of interest using a variety of screening methods outlined above it is also possible.
【0168】 [0168]
所望の生理活性の回収遺伝子ライブラリー由来の異なる発現クローンを含む生細胞もしくは死細胞をスクリーニングし、陽性クローンを回収した後、当技術分野で公知の技術を利用して、陽性クローンからDNAを単離することができる。 Screened live cells or dead cells comprising the desired biological activity of the recovered gene libraries derived from different expression clones was recovered positive clones, using techniques known in the art, a single DNA from positive clones You can be away. 次に、当技術分野で公知の増幅技術のいずれかを利用して、インビボもしくはインビトロでDNAを増幅することができる。 Next, using any of the known amplification techniques in the art can be used to amplify DNA in vivo or in vitro. インビボ増幅には、クローンもしくはサブクローンの生細胞宿主への形質転換と、次の段階としての宿主の増殖を含む。 In vivo amplification involves the transformation into clone or subclone of viable cell host, growth of a host of the next stage. ポリメラーゼ連鎖反応等の技術を利用して、インビトロ増幅を実施することができる。 Using the technique of polymerase chain reaction or the like, it can be performed in vitro amplification. 増幅後に、同定した配列を「進化」させるもしくは配列決定を行うことができる。 After amplification, the identified sequences can be performed or sequenced to "evolve".
【0169】 [0169]
進化本発明の利点の一つは、同定したポリヌクレオチドを操作して、活性もしくは特異性が変化した変異種を作製・選択できる点である。 One advantage of the evolutionary present invention, by operating the polynucleotides identified is that the variants activity or specificity changes can be made and selection.
【0170】 [0170]
スクリーニングを行い生理活性を有することが判明したクローンに特異的変異誘発を行い、所望の性質を有した新規の生理活性を付与する、または熱もしくは有機溶媒に対する安定性等の、野生型活性に存在しないもしくは乏しいものであって特に所望の性質を有するように改変した生理活性を付与することができる。 Perform mutagenesis that the clones were found to have physiological activity were screened, of stability for the new physiological activity to impart or heat or organic solvents, having the desired properties, present in the wild-type activity be one city or poor can be particularly impart modified bioactive so as to have the desired properties. 既存の特異的変異誘発法は、いずれも本発明に利用可能である。 Existing mutagenesis are all available to the present invention. 例えば、本発明で利用する特に好ましい変異誘発技術としては、後記のものが挙げられる。 For example, particularly preferred mutagenesis techniques utilized in the present invention include hereinafter described.
【0171】 [0171]
または、本明細書に記載の方法で取得、同定、クローニングしたポリヌクレオチド配列を異形化させることが好ましいこともある。 Or, obtained by the methods described herein, identifying, sometimes it is preferable to profile the cloned polynucleotide sequences. コードされているポリペプチドの活性、特異性、親和性、機能等を改変(例えば、増加もしくは減少)する目的の、このような異形化によって、ポリヌクレオチド配列を改変することができる。 Encoded polypeptide activity, specificity, affinity, alter the function or the like (e.g., increase or decrease) the purpose of, by such irregular shape can be modified polynucleotide sequences. かかる進化法は、当技術分野で公知の方法もしくは本明細書に記載の方法であり、以下のようなものが含まれる。 Such evolution method is a method according to a known method or the specification in the art and include those described below. シャッフリング法、カセット変異法、リカーシブ・アンサンブル変位誘発法、セクシャルPCR、特異的進化法、エキソヌクレアーゼ媒介再構成法、コドン部位飽和変異法、アミノ酸部位飽和変異法、遺伝子部位飽和変異法、非確率論的ポリヌクレオチド再構成法による変異導入、合成的ライゲーションによるポリヌクレオチド再構成法、遺伝子再構成法、オリゴヌクレオチド特異的飽和変異法、部分的相同性を有するポリヌクレオチド配列のインビボ再集合法、配列の複雑度を低減する自然組換え、およびそれらの組み合わせ。 Shuffling, cassette mutagenesis, recursive ensemble displacement mutagenesis, sexual PCR, directed evolution methods, exonuclease mediated reconstruction, codon site-saturation mutagenesis, amino acid site-saturation mutagenesis, gene site saturated mutagenesis, non-stochastic polynucleotide mutagenesis by reconstruction method, polynucleotide reconstruction method with synthetic ligation, gene reconstruction method, oligonucleotide-specific saturation mutagenesis, in vivo reassortment of polynucleotides sequence having partial homology, sequences of natural recombination to reduce the complexity, and combinations thereof.
【0172】 [0172]
上記の方法で同定した所望のポリヌクレオチド配列に関して濃縮したクローンの配列を決定し、クローン中のDNA配列を同定することができる。 Sequenced clones enriched for the desired polynucleotide sequences identified by the method described above, it is possible to identify DNA sequences in clone. このような配列情報は、類似配列もしくは機能的な特徴に関してデータベースをスクリーニングする際に利用できる。 Such sequence information can be utilized in screening database for similar sequences or functional characteristics. 従って、本発明に基づいて、以下のものが単離・同定可能である。 Therefore, in accordance with the present invention, the following can be isolated and identified. すなわち、(1)対象となる配列(例えば、特異的酵素活性を有する酵素をコードする配列)を有するDNA、(2)その配列とデータベース中の既知もしくは未知の配列(例えば、活性(そのアミノ酸 配列を含む)を有する酵素に関連したデータベース中の配列)との関係、(3)かかる活性を有する組換え体酵素の生産。 That is, (1) Subject to sequence (e.g., sequences encoding enzymes having the specific enzymatic activity) DNA having, (2) known or unknown sequence in the sequence and a database (e.g., activity (the amino acid sequence relationship between sequences) in the database associated with the enzyme having a containing), production of the recombinant enzyme with a (3) such activity.
【0173】 [0173]
ハイスループットな配列決定技術で、配列決定を行うことができる。 In high-throughput sequencing techniques, it is possible to perform sequencing. 配列決定の詳しい方法は、本発明を限定するものとはならない。 Detailed methods for sequencing is not a limitation of the present invention. クローニングした特定のDNA配列の配列決定において有用な方法は、いずれも利用することができる。 Useful methods in sequencing of a particular DNA sequence cloned can either use. 通常、 配列決定は自然界で起こるDNA複製過程の応用である。 Normally, sequencing is an application of DNA replication processes that occur in nature. それ故、鋳型 (例えば、ベクター)およびプライマー配列を用いる。 Therefore, using a mold (e.g., vector) and primer sequences. 鋳型調製と配列決定の一般的なプロトコールは、細菌コロニーの自動釣り上げから始まる。 General protocol of template preparation and sequencing begins automatic bacterial colonies picked. 細菌コロニーのそれぞれ配列決定反応の鋳型として働く個々のDNAクローンを含む。 It serves as a template for each sequencing reaction of bacterial colonies containing individual DNA clones. 選抜クローンを培地に入れ、一晩培養する。 Put the selected clones to the medium, and cultured overnight. 次に、DNAの鋳型を細胞から精製し、水に懸濁する。 Then, to purify the template DNA from the cells, suspended in water. DNAの定量後、アプライド・バイオシステムズ社のプリズム(Prism)377DNAシーケンサー等のシーケンサーを用いてハイスループットな配列決定を実施する。 After quantification of DNA, to implement high-throughput sequencing using the sequencer, such as Applied Biosystems Prism (Prism) 377 DNA Sequencer. 次に、得られた配列データを、単一もしくは複数の別の方法に利用する。 Then, the sequence data obtained, using a single or multiple different ways.
【0174】 [0174]
データベース検索とアラインメント・アルゴリズム特定のポリヌクレオチド配列にコードされる活性を同定もしくは決定する際に本発明と共に用いることのできる核酸配列および/もしくは推定アミノ酸配列を含むソース・データベースが複数存在する。 Source database containing nucleic acid sequences and / or deduced amino acid sequence may be used with the present invention in identifying or determining the activity encoded in the database search and alignment algorithms specific polynucleotide sequences there are multiple. 試験する全配列もしくはその代表的な部分(例えば、約100クローン)を用いて、配列データベース(例えば、ゲンバンク、PFAMもしくはプロドム(ProDom))を同時または個々に検索する。 All sequence or a representative portion thereof for testing (e.g., about 100 clones) was used to sequence databases (e.g., Genbank, PFAM or Purodomu (ProDom)) looking for the simultaneous or individual. このような配列検索の方法は、複数の異なるものが当技術分野で公知である。 Such a method of sequence search, a plurality of different ones known in the art. 特定の単一の生物もしくは複数の生物の集合に関して特異的なデータベースも存在しうる。 Specific database for a particular set of single organism or more biological may also be present. 例えば、線虫(C. elegans)、シロイヌナズナ(Arabadopsis. sp.)、M. For example, nematodes (C. elegans), Arabidopsis thaliana (Arabadopsis. Sp.), M. ジナスチ(genitalium)、M. Jinasuchi (genitalium), M. ジャナスチ(jannaschii)、大腸菌、 H. Janasuchi (jannaschii), E. coli, H. インフルエンザ(influenzae)、S. Influenza (influenzae), S. セレビッシエ(cerevisiae)等に関するデータベースが存在する。 Database exists on such Serebisshie (cerevisiae). 次に、二種またはそれ以上の配列間の相同性を調べるアルゴリズムを利用して、クローンの配列データを単一もしくは複数のデータベース中の配列と並列さる。 Then, two or more by using an algorithm to examine the homology between the sequences, SEQ parallel monkey in the sequence data clones single or multiple databases.
【0175】 [0175]
このような配列並列法としては、例えば、BLAST (Altschulら、1990)、BLITZ(MPsrch) (SturrockおよびCollins、1993)およびFASTA (PersonおよびLipman、1988)が挙げられる。 Such sequence alignment methods, e.g., BLAST (Altschul et al., 1990), and a BLITZ (MPsrch) (Sturrock and Collins, 1993) and FASTA (Person and Lipman, 1988). プローブ配列(例えば、クローンの配列データ)のサイズは問わない。 Probe sequence (e.g., sequence data clone) size is not limited. また、プローブ配列は、相同性閾値に依存する相同性と認識される。 The probe sequence is recognized that homology dependent on homology threshold. 特に必要はないが、閾値を前もって決定しておいてもよい。 Not particularly necessary, but may have been previously determined threshold. 閾値は、特定のポリヌクレオチド長に依存しうる。 Threshold can depend on the particular polynucleotide length. 配列の並列化に関する方法は、複数の異なるものを利用しうる。 Method for parallelization of sequences can utilize a plurality of different ones. 通常、スミス−ウォーターマン(Smith−Waterman)もしくはニードルマン−ウィンチ(Needleman−Wunsch)アルゴリズムが用いられる。 Normal, Smith - Waterman (Smith-Waterman) or needle Man - winch (Needleman-Wunsch) algorithm is used. しかし、より高速な方法であるとされている、BLAST、FASTA、PSI−BLASTが利用可能である。 However, it is to be a faster method, BLAST, FASTA, PSI-BLAST can be utilized.
【0176】 [0176]
例えば、比較ウインドウの並列を行うための最適な配列アラインメントは以下のような方法で実施することができる。 For example, optimal alignment of sequences for parallel comparison window may be conducted by the following method. すなわち、スミスの局所相同性アルゴリズム (SmithおよびWaterman、Adv Appi Math、1981; SmithおよびWaterman、J Teor Biol、1981; SmithおよびWaterman、J Mol Biol、1981; Smith et al、J Mol Evol、1981);ニードルマンの相同性アラインメント・アルゴリズム (NeedlemanおよびWuncsch、1970); ピアソン(Pearson)の類似性検索法 (PearsonおよびLipman、1988);これらアルゴリズムのコンピュータによる具現化(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA;これらは Wisconsin Genetics Software Package R That is, the local homology algorithm of Smith (Smith and Waterman, Adv Appi Math, 1981; Smith and Waterman, J Teor Biol, 1981; Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981; Smith et al, J Mol Evol, 1981); homology alignment algorithm of Needleman (Needleman and Wuncsch, 1970); the search for similarity method of Pearson (Pearson) (Pearson and Lipman, 1988); embodied by these algorithms computer (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA; these Wisconsin Genetics Software Package R elease 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr. Madison、WI、もしくはSequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、 University of Wisconsin、Madison、WTに含まれる);もしくは目視による。 elease 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI or Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,, University of Wisconsin, Madison, included in the WT); or by visual inspection. 種々の方法で得られた最適アラインメント(すなわち、比較ウインドウで相同性の%が最も高い結果を与えるもの)を選択する。 Optimal alignment obtained by various methods (i.e., those% homology comparison window gives the highest results) selects. 次に、二つの配列(すなわち、プローブ配列およびデータベース配列)の類似性を推定する。 Next, to estimate the similarity between two sequences (i.e., probe sequence and database sequence).
【0177】 [0177]
このようなソフトウエアーでは、種々の欠失、置換、およびその他の修飾に対する相同性の程度を決定することによって類似配列のマッチングを行う。 In such softwares, to match similar sequences by determining various deletions, substitutions, and the degree of homology to other modifications. 2種類またはそれ以上の核酸もしくはポリペプチド配列に関する「相同性」および「同一性」なる用語は、同一である2種類またはそれ以上の配列もしくは部分配列、もしくは比較ウインドウで最適に比較・並列されたとき、もしくは任意の数の配列比較アルゴリズムを利用して、もしくは手作業によるアラインメントおよび目視で調べた特定領域におけるに同一となるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の%で含む2種類またはそれ以上の配列もしくは部分配列を意味している。 Two or more "homology" with respect to nucleic acid or polypeptide sequences and the term "identity" are the same as two or more sequences or subsequences or optimally comparison and parallel comparison window when, or any by using a sequence comparison algorithm number, or two or more sequences including the same become amino acid residues or nucleotides in the specific area was examined in alignment and visual manual in certain% or it means a partial sequence.
【0178】 [0178]
配列比較では、通常、比較をおこなう被検配列に対して、一種類の配列を対照配列とする。 For sequence comparison, typically, with respect to the test sequence for comparing, to the reference sequence one type of sequence. 配列比較アルゴリズムを利用する場合には、被検および対照配列をコンピュータに入力し、必要ならば、部分配列の配置を決め、配列アルゴリズムのプログラム・パラメータを決める。 When using a sequence comparison algorithm, enter the test and control sequences in the computer, if necessary, determine the arrangement of the partial sequence, it determines the program parameters and sequence algorithm. 既定のプログラム・パラメータを利用することもできるし、別にパラメータを設定することもできる。 It is also possible to use the default program parameters, it is also possible to set a separate parameter. 次に、比較のアルゴリズムで、プログラム・パラメータに基づき対照配列に対する被検配列に関する配列同一性の%を計算する。 Next, the algorithm of the comparison, calculates the percent sequence identity with respect to the test sequences relative to the reference sequence, based on the program parameters.
【0179】 [0179]
本明細書に記載の「比較ウインドウ」は、20〜600、通常、約50から約200、より一般的には、約100から約150で構成する群より選択される連続する位置の数うちのいずれか一つの断片に対する参照を含む。 "Comparison window" as described herein, 20 to 600, usually from about 50 to about 200, more generally, of the number of contiguous positions selected from the group composed of about 100 to about 150 It includes reference to any one of the fragments. ここである配列を、二つの配列を最適に並列における同一数の連続位置の対照配列に対して比較する。 The sequence is now compared against a reference sequence of the same number of contiguous positions in optimally aligned two sequences.
【0180】 [0180]
有用なアルゴリズムの一例としては、BLASTとBLAST2.0アルゴリズムが挙げられる。 An example of a useful algorithm include BLAST and BLAST2.0 algorithm. これらは、アルシュール(Altschul)等のNuc. These are, Nuc such as Al Sur (Altschul). Acids Res. Acids Res. 25:3389−3402 (1977)、および アルシュール等のJ. 25: 3389-3402 (1977), and J. such as Al-sur Mol. Mol. Biol. Biol. 215 :403−410 (1990)にそれぞれ記載されている。 215: are described respectively in 403-410 (1990). BLAST解析を行うソフトウエアーは、国立バイオ技術情報センター(National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))で公開されており入手可能である。 Softwares performing BLAST analysis, the National Biotechnology Information Center (National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)) is available have been published in. このアルゴリズムでは、データベース配列における同一長のワードと並列させたときに、正の値となる閾値スコアTにマッチするもしくはこれを満たすクエリー配列における長さWの短いワードを決定することによって、最初に高いスコアを与える配列の組み (HSPs) を決める。 In this algorithm, when brought into parallel with the same length of the word in a database sequence, by determining short words of length W in the query sequence that satisfies this or matches threshold score T comprising a positive value, the first determine the set (HSPs) of the array which give a high score. Tは隣接ワードスコアの閾値と呼ばれる (Altschulら、上記)。 T is referred to as the threshold value of the neighborhood word score (Altschul et al, supra). これら初期隣接ワードのヒットは、これらを含むより長い HSPs の探索を行うためのシーズとなる。 It hits These initial neighborhood word becomes the seeds for performing a search for longer HSPs containing them. 漸増アラインメントのスコアが増加する限り、ワードのヒットをそれぞれの配列方向に伸長させる。 As long as the score increasing alignment increases, extending the word hits in each arrangement direction. ヌクレオチド配列に関しては、パラメータM(マッチした残基の組みに関するリワードスコア; 常に >0)を用いて漸増スコアを計算する。 With respect to nucleotide sequences, the parameters M; computing the incremental score using (reward score for a set of matched residues always> 0). BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXによって、アラインメントの感度とスピードが決まる。 The BLAST algorithm parameters W, T, and the X, determines the alignment of the sensitivity and speed. BLASTNプログラム(ヌクレオチド 配列に関する)では、ワード長(W)=11、期待値(E)=10、M=5,N=−4、および両鎖の比較を既定値として用いる。 The BLASTN program (for the nucleotide sequence), using a word length (W) = 11, expectation (E) = 10, M = 5, N = -4, and a comparison of both strands as default.
【0181】 [0181]
BLASTアルゴリズムでは、2種類の配列間における類似性の統計的分析を行うこともできる(例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)を参照のこと)。 The BLAST algorithm, it is also possible to perform statistical analysis of the similarity between two sequences (see, eg, Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:.... 5873 see (1993)). BLASTアルゴリズムによる類似性の尺度の一つは、2種類のヌクレオチド配列間で偶然にマッチする確率の指標を与える確率の最小和(P(N))である。 One measure of similarity by BLAST algorithm is the smallest sum probability which gives an indication of the probability of match by chance between two nucleotide sequences (P (N)). 例えば、被検核酸の対照核酸に対する比較における確率の最小和が、約0.2よりも小さい、より好ましくは約0.01よりも小さい、最も好ましくは約0.001よりも小さいとき、核酸は対照配列の類似していると見なす。 For example, when the minimum sum of the probabilities in comparison to a control nucleic acid of the test nucleic acid is less than about 0.2, less than and more preferably about 0.01, less than most preferably about 0.001, the nucleic acid considered to be similar to the reference sequence.
【0182】 [0182]
配列の相同性は、比較ウインドウにおいて2種類のポリヌクレオチド配列が相同であることを意味する(すなわち、ヌクレオチド毎に)。 Sequence homology means that two polynucleotide sequences in the comparison window is homologous (i.e., for each nucleotide). 配列の%同一性もしくは相同性の計算は、以下のように行う。 Calculation of percent identity or homology sequence is performed as follows. すなわち、比較ウインドウにおいて最適に並列化した2種類の配列を比較し、双方の配列で同一核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、もしくはI)が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を決め、比較ウインドウにおける位置の総数(すなわち、ウインドウ・サイズ)でマッチする位置の数を除して、その結果に100を掛けて配列の%相同性を得る。 That is, by comparing the two sequences optimally parallelized in the window of comparison, the identical nucleic acid base in both sequences (e.g., A, T, C, G, U, or I,) the number of positions at which there is determined determining the number of positions that match Te, the total number of positions in the comparison window (i.e., the window size) by dividing the number of positions matching to obtain the percent homology of sequence multiplied by 100 results. この実質的な相同性はポリヌクレオチド配列の特徴を示すものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも25〜50ヌクレオチドの比較ウインドウにおける対照配列と比較して、少なくとも60% の配列相同性、通常少なくとも70%の相同性、しばしば80〜90%の配列相同性、最も一般的には少なくとも99%の配列相同性を有する配列からなる。 The substantial homology is intended to indicate a characteristic of a polynucleotide sequence, wherein the polynucleotide comprises a control sequence in the comparison window of at least 25-50 nucleotides, at least 60% sequence homology, typically at least 70% homology, often 80-90% sequence homology, consists most generally at least 99% sequence homology sequence. ここで、配列の%相同性は、比較ウインドウにおいて対照配列のうち合計20%もしくはそれ以下に欠失もしくは付加を含むポリヌクレオチド配列を参照配列と比較することによって計算する。 Here,% homology sequence is calculated by comparing the reference sequence to the polynucleotide sequence comprising a deletion or addition in a total of 20% or less of the reference sequence in the comparison window.
【0183】 [0183]
充分高い相同性を有する配列を、例えば、種および活性に関する情報等のデータベースに含まれる注釈によりさらに同定することができる。 Sequences with sufficiently high homology, for example, can be further identified by an annotation in the database, such as information on the species and activity. 従って、通常の混合集団試料においては、複数の核酸配列の取得、クローニング、配列決定がなされ、データベースから対応する相同配列が同定される。 Therefore, in the conventional mixed population samples, obtaining a plurality of nucleic acid sequences, cloning, sequencing is done, the homologous sequences are identified which correspond from the database. この情報は、データベース情報に基づく配列によってコードされる配列もしくはポリペプチドの由来する生物およびポリペプチドの活性を含み、ポリヌクレオチドに関する1種類もしくは複数種の特徴を含む試料中のポリヌクレオチドのプロファイルを提供する。 This information includes activity from organisms and polypeptide sequences or polypeptide encoded by a sequence based on the database information, providing a profile of the polynucleotide in a sample comprising one or more features relating to polynucleotide to. 本明細書に記載の「フィンガープリント」もしくは「プロファイル」は、各試料が、それの由来する試料および環境に特徴的な一組のポリヌクレオチドに関係することを意味している。 "Fingerprint" or "profile" as described herein, each sample, which means that relate to the characteristic set of polynucleotides that of derived sample and environment. このようなプロファイルには、試料中の配列の量および種類、ポリヌクレオチドがコードする潜在的活性およびポリヌクレオチドが由来する 生物に関する情報が含まれる。 Such profiles, the amount and type of sequences in a sample, potential activity and polynucleotides polynucleotide code includes information regarding origin organism. このような特徴のパターンは、各試料のプロファイルもしくはフィンガープリントである。 Pattern of such features is a profile or fingerprint of each sample.
【0184】 [0184]
特定のクローニングしたポリヌクレオチドに関して、それがいかなるものか、もしくはその活性が判明した、もしくはそれがいかなるものかについての示唆もしくは推定される活性が判明した場合、そのポリヌクレオチド配列を発現させることが好ましい場合もある。 With respect to certain of the cloned polynucleotide, if it or any thing or its activity has been found, or it is active to be suggested or estimated on either anything is found, it is preferable to express the polynucleotide sequences In some cases. このような場合、所望のクローンは、未だ発現ベクターへクローニングされていなくければ、制御要素(例えば、プロモーターもしくはエンハンサー)の下流につなぎ、適当な宿主細胞に導入する。 In such cases, the desired clone, if Kere not be cloned into yet expression vector, connecting the downstream control elements (e.g., promoter or enhancer), is introduced into a suitable host cell. 本発明に利用する発現ベクターは対応する宿主細胞と共に市販されている。 Expression vectors used in the present invention are commercially available with the corresponding host cell.
【0185】 [0185]
ここで利用できる発現ベクターの代表的な例としては、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、 細菌の人工染色体、ウイルスの核酸(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびSV40の派生体)、P1人工染色体、酵母プラスミド、 酵母人工染色体、および対象となる特定宿主(枯草菌、アスペルギルス、酵母等)に特異的なその他のベクターが挙げられる。 Representative examples of expression vectors which can be utilized herein, viral particles, baculovirus, phage, plasmids, phagemids, cosmids, fosmids, bacterial artificial chromosomes, viral nucleic acid (e.g., vaccinia, adenovirus, foul pox virus, derived forms of the pseudorabies virus and SV40), P1 artificial chromosomes, yeast plasmids, yeast artificial chromosomes, and the particular host (Bacillus subtilis of interest, Aspergillus, and other vectors specific for yeast, etc.) and the like. 従って、例えば、ポリペプチドを発現させるための様々な発現ベクターのいずれか1つに、そのDNAを挿入する。 Thus, for example, any one of a variety of expression vectors for expressing a polypeptide, inserting the DNA. このようなベクターには、染色体型、非染色体型および合成DNA配列が含まれる。 Such vectors include chromosome type, included unstained type and synthetic DNA sequences. 当業者に公知の好適なベクターは数多くあり、市販されている。 There are many known suitable vector to those skilled in the art and are commercially available. 以下のようなベクターを例として示す:ZAP Express、λ ZAP(登録商標)− CMV、λ ZAP(登録商標)II、λ(登録商標)gt10、λ gtl1、pMyr、pSos、pCMV−Script、pCMV−Script XR、pBK ファージミド、pBK−CMV、pBK−RSV、pBluescript II ファージミド、pBluescript II KS+、pBluescript II SK+、pBluescript II SK−、λ FIX II、λ DASH II、λ EMBL3 およびEMBL4、EMBL3、EMBL4、SuperCos I および pWE15、pWE15、SuperCos I、pPCR−Script Amp、pPCR−Script Cam、pCMV−Script、 Vectors such as shown below as an example: ZAP Express, λ ZAP (TM) - CMV, λ ZAP (TM) II, lambda (registered trademark) gt10, λ gtl1, pMyr, pSos, pCMV-Script, pCMV- Script XR, pBK phagemid, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II phagemid, pBluescript II KS +, pBluescript II SK +, pBluescript II SK-, λ FIX II, λ DASH II, λ EMBL3 and EMBL4, EMBL3, EMBL4, SuperCos I and pWE15, pWE15, SuperCos I, pPCR-Script Amp, pPCR-Script Cam, pCMV-Script, BC KS+、pBC KS−、pBC SK+、 pBC SK−、psiX174、pNH8A、pNH16a、pNHl8A、pNH46A (Stratagene); pT7BLUE、pSTBlue、 pCITE、pET、 ptriEx、 pForce (Novagen); pIND−E、pIND ベクター、pIND/Hygro、pIND(SPl)/Hygro、pIND/GFP、pIND(SPl)/GFP、pIND/V5−His およびpIND(SPl)/V5−His Tag、pIND TOPO TA、pShooter(商標)ターゲティング・ベクター、pTracer(商標)GFP レポーターベクター、pcDNA(著作権)ベクター、EBV ベクター、Voyager(商標)VP22 ベクター、 BC KS +, pBC KS-, pBC SK +, pBC SK-, psiX174, pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH46A (Stratagene); pT7BLUE, pSTBlue, pCITE, pET, ptriEx, pForce (Novagen); pIND-E, pIND vector, pIND / Hygro, pIND (SPl) / Hygro, pIND / GFP, pIND (SPl) / GFP, pIND / V5-His and pIND (SPl) / V5-His Tag, pIND TOPO TA, pShooter (TM) targeting vector, pTracer (TM) GFP reporter vector, pcDNA (copyright) vector, EBV vector, Voyager (TM) VP22 vector, VAXI−DNA ワクチンベクター、pcDNA4/His−Max、pBCl マウス ミルク システム(Mouse Milk System)(Invitrogen); pQE70、pQE60、pQE−9、pQE−16、pQE−30/pQE −80、pQE 31/ pQE 81、pQE −32/pQE 82、pQE − 40、pQE−100 二重タグ(Double Tag)(Qiagen); pTRC99a、pKK223−3、pKK233−3、 pDR540、 pRIT5、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG (Stratagene) 、pSVK3、 pBPV、pMSG、 pSVL (Pharmacia)。 VAXI-DNA vaccine vector, pcDNA4 / His-Max, pBCl Mouse Milk system (Mouse Milk System) (Invitrogen); pQE70, pQE60, pQE-9, pQE-16, pQE-30 / pQE -80, pQE 31 / pQE 81 , pQE -32 / pQE 82, pQE - 40, pQE-100 dual tag (double tag) (Qiagen); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG ( Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). しかし、宿主中において複製可能でありかつ生存可能であれば、任意のその他のプラスミドもしくはベクターを用いることもできる。 However, it is possible replication in a host and survival if, it is also possible to use any other plasmid or vector.
【0186】 [0186]
発現ベクター中の核酸配列は、mRNA合成を指令する適当な発現制御配列(プロモーター)と制御可能な形式で連結する。 Nucleic acid sequence in the expression vector, which is linked with suitable expression control sequences that direct mRNA synthesis (promoter) and controllable form. 特に既知の細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、SP6、trp、lacUV5、 PBAD、araBAD、araB、trc、proU、p−D−HSP、 HSP、GAL4 UAS/Elb、TK、GAL1、CMV/TetO Hybrid、EF−la CMV、EF−la CMV、EF−la CMV、 EF、EF−la、ユビキチン C、 rsv−ltr、rsv、b−ラクタマーゼ(lactamase)、nmt1および gal10が挙げられる。 Particularly known bacterial promoters, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR, PL, SP6, trp, lacUV5, PBAD, araBAD, araB, trc, proU, p-D-HSP, HSP, GAL4 UAS / Elb , TK, GAL1, CMV / TetO 2 Hybrid, EF-la CMV, EF-la CMV, EF-la CMV, EF, EF-la, ubiquitin C, rsv-ltr, rsv, b- lactamase (lactamase), nmt1 and gal10 and the like. 真核プロモーターとしては、 CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTR、およびマウスのメタロチオナインIが挙げられる。 Eukaryotic promoter, CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, include retroviral LTR, and metallo thio Nine I mouse. 適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者であればなし得る。 Selection of the appropriate vector and promoter be made by those skilled in the art. また、発現ベクターは翻訳開始のためのリボゾーム結合部位および転写終結部位を含む。 The expression vector comprises a ribosome binding site and transcription termination site for translation initiation. また、ベクターは発現を増幅する適当な配列を含むこともできる。 Further, the vector may also include appropriate sequences for amplifying expression. プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコル転移酵素) ベクターもしくは選択マーカーを有するその他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することができる。 Promoter regions using other vectors with CAT (chloramphenicol transferase) vectors or selection marker can be selected from the desired gene.
【0187】 [0187]
さらに、真核細胞の培養に関してジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性等、もしくは大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性等の形質転換宿主細胞の選択に関わる形質を与えるために、発現ベクターは、好ましくは一種類またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む。 Furthermore, in order to give a trait relating to the selection of transformed host cells of the tetracycline or ampicillin resistance and the like in dihydrofolate reductase or neomycin resistance or the like, or E. coli respect culture of eukaryotic cells, expression vectors, preferably one type or including more selectable marker gene.
【0188】 [0188]
上記のように選択、クローニング、配列決定した核酸配列は、さらに、所望の酵素活性に関してクリーニングを行うライブラリーを調製する目的で、適当な宿主に導入することができる。 Selected as above, cloning, sequencing and nucleic acid sequence further, for the purpose of preparing a library for cleaning for the desired enzymatic activity, can be introduced into an appropriate host. 所望の活性を検出するために、選択した核酸は、適当な制御配列を含み、従って酵素をコードする選択した核酸を発現するベクターにすでに挿入されていることが好ましい。 In order to detect the desired activity, nucleic acids selected includes appropriate control sequences, therefore it is preferable that already has been inserted into vectors expressing a selected nucleic acid encoding an enzyme. 宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等真核細胞でもよく、また酵母細胞等の下等真核細胞でもよい。 Host cells may be a higher eukaryotic cell such as a mammalian cell, or may be a lower eukaryotic cells such as yeast cells. また、宿主細胞は細菌の細胞等の原核細胞であってもよい。 Further, host cells may be prokaryotic cells such as bacteria. 適当な宿主の選択は、当業者であれば本明細書に記載の内容をもとに行いうると考えられる。 Selection of an appropriate host is considered to be carried out based on the teachings contained herein one skilled in the art.
【0189】 [0189]
試料もしくは単離されている特定のクローン中の核酸配列を増幅することが好ましい場合もある。 It may be preferable to amplify the nucleic acid sequence in a particular clone are separated samples or single. 本態様において、PCR反応もしくは当業者に公知の同様の反応により、核酸配列を増幅する。 In the present embodiment, by a known similar reaction in a PCR reaction or the skilled person, amplifying nucleic acid sequences. このような増幅反応を実施するために市販の増幅キットが入手可能である。 Commercially available amplification kit for carrying out such amplification reactions are available.
【0190】 [0190]
さらに、アラインメント・アルゴリズムおよび検索可能なデータベースはコンピュータのハードウエアー、ソフトウエアーもしくはそれらの組み合わせにより実施可能であることを認識するのは大切である。 Furthermore, it is important to recognize that the alignment algorithm and a searchable database can be implemented by hardware Wear, softwares or combinations thereof of the computer. 従って、核酸配列およびこれらの配列にコードされる対応するポリペプチドの単離、加工、および同定は、自動システムで実行が可能である。 Thus, isolation of the corresponding polypeptide encoded by a nucleic acid sequence and these sequences, processing, and identification can be run in an automated system.
【0191】 [0191]
キャピラリー管によるスクリーニング法図6Aは、管腔(40)を構成する少なくとも一つの外壁(30)を有する複数の個々のキャピラリー管(20)を含むキャピラリー管束(10)を示している。 Screening method diagram in accordance with capillary tube 6A shows the lumen plurality of individual capillary tubes having at least one outer wall (30) constituting the (40) (20) a capillary tube bundle (10) including. キャピラリー管(20)の外壁(30)は、互いに融合した一つまたはそれ以上の壁であってもよい。 The outer wall of the capillary tube (20) (30) may be one or more walls fused together. 同様に、管腔を形成する壁が液体もしくは試料を保持する限り、壁は、円筒状、正方形、六角形、もしくはその他の幾何学的形態からなる管腔(40)を構成することができる。 Similarly, as long as the wall forming the lumen to hold the liquid or sample, wall, cylindrical, may be configured square, hexagonal, or other consisting geometry lumen (40). キャピラリー管束(10)のキャピラリー管(20) を集めて平面構造を形成する。 Collect capillary tube of a capillary tube bundle (10) and (20) to form a planar structure. キャピラリー管(20)は、側面と側面を、融かすことによって(例えば、キャピラリー管がガラス製の場合)、接着剤で接着することによって、接合することによって、もしくは留めることによって一緒にまとめることができる。 Capillary tube (20), a side surface and a side surface, by dissolving (for example, if the capillary tube is made of glass), by bonding with an adhesive, be grouped together by by bonding or fastening it can. キャピラリー管束(10)を、任意の数の個々のキャピラリー管(20)で構成することができる。 The capillary tube bundle (10), can be made up of individual capillary tubes of any number (20). ある態様においては、キャピラリー管束は、100 〜4,000,000 本のキャピラリー管(20)を含む。 In some embodiments, the capillary tube bundle comprises 100 ~4,000,000 present capillary tube (20). ある態様においては、キャピラリー管束は、100〜500,000,000 本のキャピラリー管(20)を含む。 In some embodiments, the capillary tube bundle comprises 100~500,000,000 present capillary tube (20). ある態様においては、キャピラリー管束は、100,000 本のキャピラリー管(20)を含む。 In some embodiments, the capillary tube bundle includes 100,000 capillaries tubes (20). ある特定の態様においては、キャピラリー管束(10)は、マイクロタイター・プレートの形(すなわち、127.76 mm ×85.47 mmであるが公差は許容される)に一致させることができる。 In certain embodiments, the capillary tube bundle (10) is in the form of a microtiter plate (i.e., 127.76 mm × 85.47 is a mm tolerance acceptable) can be matched to. キャピラリー管束(10)は、1cm2あたり500から1,000本以上の キャピラリー管(20)、もしくは1mm2あたり約5本のキャピラリー管の密度を有することができる。 Capillary tube bundle (10) may have a density of from around 500 1 cm @ 2 1,000 or more capillary tubes (20), or about five capillary tubes per 1 mm @ 2. 例えば、マイクロタイター・プレートのサイズの3umのキャピラリー管の束は、約5億本キャピラリー管を含む。 For example, a bundle of capillary tubes 3um size of the microtiter plate contain about 500 million capillary tube.
【0192】 [0192]
キャピラリー管(20)は、軸比が50:1であることが好ましい。 Capillary tube (20), the axial ratio of 50: 1. ある態様においては、個々のキャピラリー管(20)は、長さが約10mmで、管腔(40)の内径が約200μmである。 In some embodiments, each capillary tube (20) is a about 10mm in length, an inner diameter of about 200μm lumen (40). しかし、これ以外の軸比も可能であり、その範囲は、10:1から1000:1をかなり越える。 However, other an axial ratio of possible, the range is 10: 1 to 1000: more than 1 considerably. 従って、キャピラリー管束の厚みは、0.5mmから10cm超まで変わりうる。 Accordingly, the thickness of the capillary tube bundle, may vary from 0.5mm to 10cm greater. 個々のキャピラリー管(20)は、3−500μmおよび0−500μmの範囲の内径を有する。 Individual capillary tube (20) has an inner diameter in the range of 3-500μm and 0-500Myuemu. 内径 200μmおよび長さ1cmのキャピラリー管(20)の容積は、約0.3μlである。 The volume of the capillary tube having an inner diameter of 200μm and a length of 1 cm (20) is about 0.3 Pl. 個々のキャピラリー管(20)の長さと幅は、所望の容量と、後により詳細に説明するキャピラリー管からの液体蒸発速度等、ほかの性質にも依存する。 The length and width of the individual capillary tubes (20) has a desired volume, the liquid evaporation rate and the like from the capillary tube to be described in more detail below, but also on the other properties. 本発明のキャピラリー管はウェルあたり250ナノリッター程度の小容量であってもよい。 Capillary tube of the present invention may be a small capacity of about 250 nanoliters per well.
【0193】 [0193]
本発明の一態様に従えば、スクリーニングを行うために1粒子もしくはそれ以上の数の粒子を各キャピラリー管(20)に導入する。 According to one aspect of the present invention, a particle or more number of particles in order to perform the screening is introduced into each capillary tube (20). 適当な粒子としては、 細胞、細胞クローン、およびその他の生物学的な物質、化学的ビーズ、もしくはその他の微粒子が挙げられる。 Suitable particles, cells, cell clones, and other biological materials, chemical beads, or other fine particles. 対象となる粒子を含むキャピラリー管(20)には、対象となる活性を生じさせる各種の物質をともに導入することができる。 The capillary tube containing particles of interest (20), can be both introducing various substances causing activity of interest. 導入物質としては、例えば、細胞増殖を助ける、および酵素を産生させる、補助剤もしくは養分を有する液体が挙げられる。 The introduction substance, for example, help the cell proliferation, and enzyme to produce, include liquid with an auxiliary agent or nutrients. もしくは、新しい粒子を含む化学溶液によって、1本もしくは複数本のキャピラリー管(20)にすでに導入されている他の化学的ビーズとともに、複合的な事象を生起させてもよい。 Or by chemical solution containing new particles, already with other chemical beads which are introduced into one or a plurality of capillary tubes (20), may be rise to complex events. 粒子と生じた対象となる活性とを、本発明に従ってキャピラリー管束(10)を用い、スクリーニングおよび分析する。 An active of interest caused the particles, using a capillary tube bundle (10) according to the present invention, screening and analysis. ある態様においては、この活性は、キャピラリー管(20)内の粒子の光学的性質等、キャピラリー管(20)内の物質の性質に変化を生じる。 In some embodiments, this activity is the optical properties of the particles in the capillary tube (20) or the like, resulting in a change in the material properties of the capillary tube (20). 各キャピラリー管は、検出可能な光エネルギーもしくは性質変化を分析器へ導くための導波として働くことができる。 Each capillary tube can act as a waveguide for guiding detectable light energy or property change to the analyzer.
【0194】 [0194]
各種生産技術に従って、キャピラリー管(20)を作製することができる。 According to various production technologies, it can be produced capillary tube (20). さらに特定の態様においては、中空伸展技術によってキャピラリー管(20)を作製する。 In a more particular embodiment, to produce a capillary tube (20) by a hollow extension techniques. 既知の技術に従い、円筒形、もしくはその他の中空形態のガラスを、連続的により長く引き伸ばす。 According to the known art, cylindrical, or a glass of other hollow form, continuously stretching longer. このガラスは、多層状であることが好ましい。 The glass is preferably a multi-layered. 次に、引き伸ばしたガラスを特定の長さに切断して、比較的大きなキャピラリー管を作る。 Then cut the stretched glass to a specific length, making a relatively large capillary tube. これらのキャピラリー管を次に束ねて比較的おおきなキャピラリー管の束を作る。 These capillary tube and then bundled together to make a bunch of relatively large capillary tube. 次に再び引き伸ばして、その直径を次第に狭いものにする。 Then stretched again to its diameter gradually narrow. 引き伸ばし段階、もしくはキャピラリー管が所望の幅になった段階で、加熱して、隣接したキャピラリー管の側部領域を融かして接着することができる。 In stage stretching step, or capillary tube becomes a desired width, heated, can be bonded melt the side region of the adjacent capillary tube.
【0195】 [0195]
別の態様においては、ガラスエッチング段階を利用する。 In another embodiment, utilizing a glass etching step. 好ましくは、中実ガラス棒を特定幅に至るまで引き伸ばし、特定の長さに切断して、再び引き伸ばす。 Preferably, stretching up to a solid glass rod to a specific width, it was cut to a specific length, stretching again. 次に、個々の中実棒を酸もしくはその他のエッチング剤で中心部にエッチングを施し、中空キャピラリー管を作製する。 Next, etching the central portion of the solid bar of the individual with acid or other etching agents, to produce a hollow capillary tube. この管は、エッチング段階前もしくは後に、接合もしくは融かして束ねることができる。 This tube, prior to the etching step or after, can be bundled and joined or melted.
【0196】 [0196]
図6Bに示すように、複数のキャピラリー管束(10)をまとめて束(12)の束にすることもできる。 As shown in FIG. 6B, it may be a bunch of beams (12) together multiple capillaries tube bundle (10). キャピラリー管束(10)を接着剤で接着してまとめることができる。 Capillary tube bundle (10) can be summarized by bonding with an adhesive. または、キャピラリー管束(10)を融かしてまとめることもできる。 Or, it can also be summarized by dissolving the capillary tube bundle (10). この技術に従って、束(12)の束を、任意の数の高精度キャピラリー管束(10)からなる所望のサイズもしくは形態のものにすることができる。 According to this technique, a bundle of bundle (12), can be of a desired size or form of any number of high-precision capillary tube bundle (10).
【0197】 [0197]
本発明に従い、用いる製造技術に従って、キャピラリー管束を作製する際に好適に用いることのできる材料は多種あり、ガラス、金属、シリコン等のセミコンダクター、水晶、セラミック、もしくは特に、ポリエチレン、ポリスチレン、およびポリプロピレンを含む様々なポリマーが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。 In accordance with the present invention, according to the manufacturing technique used, materials that can be suitably used in making the capillary tube bundle is large, glass, metal, Semiconductor such as silicon, quartz, ceramics, or especially, polyethylene, polystyrene, and polypropylene It includes various polymers including, but not limited thereto. キャピラリー管束の内壁、もしくはその一部は、表面の性質を改変するために被覆もしくはシラン処理を施すこともできる。 The inner wall of the capillary tube bundle or a part thereof, can also be subjected to coating or silane treatment to modify the surface properties. 例えば、親水性もしくは疎水性を変化させて、吸上もしくはキャピラリー管作用をそれぞれ促進もしくは低下させることができる。 For example, by changing the hydrophilic or hydrophobic, wicking or a capillary tube action can be accelerated or decreased, respectively. 被覆の材料としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、抗原、および特異的結合親和性を有する、もしくは熱もしくは化学的滅菌法に耐えうるその他の分子等のリガンドが挙げられる。 The material of the coating, for example, avidin, streptavidin, antibodies, antigens, and having specific binding affinity, or other ligand molecules, and the like can withstand thermal or chemical sterilization.
【0198】 [0198]
上記の製造技術と材料により、ミクロサイズの高精度キャピラリー管およびキャピラリー管束が得られるが、束に含まれるキャピラリー管のサイズ、スペーシングおよびアラインメントは均一である必要はない。 The above manufacturing techniques and materials, the high-precision capillary tube and capillary tube bundle of micro-sized is obtained, the size of the capillary tube contained in flux, spacing and alignment need not be uniform. 例えば、第1のキャピラリー管束のキャピラリー管から第2のキャピラリー管束のキャピラリー管へと液体を移動させる目的で、2本のキャピラリー管束が可能な限り緊密に接触して並列させることが好ましい場合もある。 For example, from a capillary tube of the first capillary tube bundle for the purpose of moving the liquid into the capillary tube of the second capillary tube bundle, if the capillary tube bundle two be as long as to parallel in intimate contact that can preferably be . 本発明のキャピラリー管束を1本、その厚みに沿って水平に切断し、二つのキャピラリー管束に分けることもできる。 One capillary tube bundle of the present invention may be cut horizontally along its thickness, divided into two capillary tube bundle. 得られたこの2つのキャピラリー管束は、それぞれ、サイズ、スペーシング、およびアラインメントが実質的に同一であり、得られた一方のキャピラリー管束から他方へ液体を移動する目的で接触させるために好都合であるキャピラリー管開口部を有する少なくとも一つの表面を含む。 This resulting two capillary tube bundle, respectively, the size, spacing, and alignment are substantially identical, it is advantageous to contact in order to move the liquid from one of the capillary tube bundle obtained to the other comprising at least one surface having a capillary tube opening.
【0199】 [0199]
図7には、キャピラリー管(20)の束の一部を水平に切断したときの切断面を示す。 Figure 7 shows a cut surface when the part of the bundle of capillary tubes (20) was cut horizontally. キャピラリー管(20) が、第1の円筒形壁(30)、管腔 (40)、第2の外壁(50)および束(10)のキャピラリー管を隔てている介在物質(60)を伴っていることが分かる。 Capillary tube (20), a first cylindrical wall (30), the lumen (40), a second outer wall (50) and bundle (10) with an intervening substance separating the capillary tubes (60) it can be seen that there. 本態様において、円筒形壁(30)筒状ガラスせいであるが、隣接したキャピラリー管(20)との間で相互の迷光をできるだけ低く抑えるように、外壁(50)の素材は壁外吸収(EMA)ガラスである。 In the present embodiment, although due cylindrical wall (30) cylindrical glass, so as to suppress as much as possible the mutual stray between adjacent capillary tubes (20) low material Kabegai absorption of the outer wall (50) ( EMA) is a glass.
【0200】 [0200]
キャピラリー管束は、位置もしくは並列の参照用として選択的に参照マーク(22)を含む。 Capillary tube bundle includes a selectively reference marks for the position or the parallel reference (22). 参照マーク(22)は、キャピラリー管束の表面から伸びたガラス・パッドでできていてもよく、介在物質(60)に埋め込まれていてもよい。 Reference marks (22) may be made of glass pad extending from the surface of the capillary tube bundle, it may be embedded in the mediator (60). ある態様においては、参照マーク(22)は、 キャピラリー管束で形成されるマイクロタイター・プレートの一カ所またはそれ以上の角部に着けてもよい。 In some embodiments, the reference mark (22) can be put in one place or more corners of the microtiter plate which is formed by the capillary tube bundle. このような態様では、プレートもしくはキャピラリー管セットの一カ所の角部を除去して、参照マーク(22)で置き換えてもよい。 In such embodiments, removing the one position of the corner portion of the plate or capillary tubing set may be replaced by a reference mark (22). キャピラリー管(20)のサブセットも目印として、参照マーク(22)を、キャピラリー管束に沿った空間的間隙に設置してもよい。 As also mark a subset of the capillary tube (20), the reference marks (22) may be placed in spatial gaps along the capillary tube bundle.
【0201】 [0201]
図8に、本発明のキャピラリー管に関する垂直断の断面図を示す。 Figure 8 shows a cross-sectional view of a vertical cross-sectional regarding capillary tube of the present invention. キャピラリー管(20)は、管腔(40)を構成する第1の壁(30)、および第1の壁 (30)を取り囲む第2の壁(50)を含む。 Capillary tube (20) includes a lumen first wall constituting the (40) (30), and the first wall (30) a surrounding second wall (50). ある態様においては、第2の壁(50)の屈折率は、第1の壁 (30)のものよりも低い。 In some embodiments, the refractive index of the second wall (50) is lower than that of the first wall (30). ある態様においては、第1の壁 (30)は、励起した蛍光体の放つ光が通る導波部を形成する高屈折率の筒状ガラスである。 In some embodiments, the first wall (30) is a high refractive index of the cylindrical glass forming the waveguide through which light emitting of the excited phosphor. この例示的な態様においては、キャピラリー管(20)内の全内部屈折に関し、光が屈折して第1の壁 (30)に沿う方向に向かうその第1の壁(30)を被覆するように、第2の壁(50)は、低屈折率の黒色EMAガラスでできている。 In this exemplary embodiment, it relates to total internal refraction of the capillary tube (20), such that the light covers the first wall toward the direction along the first wall to refraction (30) (30) , the second wall (50) is made of a black EMA glass of low refractive index. このように、第2の壁(50)は、隣接キャピラリー管の間での「クロストーク」もしくは光の拡散を低減するような素材で作られるものであってもよい。 Thus, the second wall (50), or may be made of a material that reduces the diffusion of the "cross-talk" or light between adjacent capillary tube. または、第1の壁 (30)の内部表面は、管腔(40)内に鏡面反射を起こさせる目的で鏡もしくは鏡様の構造を形成する反射性の物質で被覆されていてもよい。 Or, the inner surface of the first wall (30) may be coated with a reflective material forming the structure of the mirror or mirror-like in order to cause specular reflection into the lumen (40).
【0202】 [0202]
目的に合わせて異なる反射率にするために、第1および第2の壁の構成において、利用できる素材には多くの種類がある。 To different reflectance in accordance with the purpose, in the configuration of the first and second walls, the available materials there are many types. 図9に示す管腔(40)へのおよび管腔(40)からにエネルギーのフィルタリングを行うために、管腔(40) の周りにフィルタリング素材を配置することもできる。 In order to perform filtering of energy from the lumen (40) and lumen (40) to shown in FIG. 9, it is also possible to arrange the filtering material around the lumen (40). ある態様においては、束の、もしくは束の一部の各キャピラリー管における第1の壁 (30)の内壁が、フィルタリング素材で被覆される。 In some embodiments, the inner wall of the bundle, or the first wall at a portion each capillary tube bundle (30) is coated with filter material. 別の態様においては、第2の壁(50)はフィルタリング素材を含む。 In another embodiment, the second wall (50) comprises a filtering material. 例えば、第2の壁(50)は、例えばガラス・フィルター等のフィルタリング素材でできていてもよく、またある態様の例においては、 第2の壁(50)は、適当な量のフィルタリング素材を添加したEMAガラスである。 For example, the second wall (50), for example may be made of filter material such as glass filter, also in the example of an embodiment, the second wall (50), an appropriate amount of filtering material it is the addition of the EMA glass. フィルタリング素材の色は、黒色以外のものであって、所望の励起/発光フィルタリング特性にあわせたものである。 Color filtering material, it is other than black, in which fit the desired excitation / emission filter characteristics.
【0203】 [0203]
フィルタリング素材によって、管腔(40)への励起エネルギー伝達が可能となり、キャピラリー管(20)のいずれかの端における一箇所もしくは複数箇所の開口部からものを除き、管腔(40)からの発光エネルギーをブロックする。 The filtering material enables excitation energy transfer to the lumen (40), except for the ones from one place or the opening of a plurality of locations at either end of the capillary tube (20), light emission from the lumen (40) to block the energy. 図9では、励起エネルギーを実線で表し、発光エネルギーを破線で表す。 9 represents the excitation energy in the solid line represents the emission energy in broken lines. 図9に示すフィルタリング素材で第2の壁(50)ができている場合、励起エネルギーに対応する特定の光の波長が管腔(40)を通ることができ、第1の壁 (30)内およびこれに沿う方向のものを除き、発光エネルギーに対応する他の光の波長は励起しないようにブロックされる。 If the filtering material 9 are second can wall (50), the wavelength of a particular light corresponding to the excitation energy can pass through the lumen (40), first wall (30) and except for those in a direction along with this, the wavelength of the other light corresponding to the emission energy is blocked so as not to excite. 励起および検出の過程で光の異なる帯域をふるい分けるために、キャピラリー管束全体もしくはその一部を、特定の個々の波長もしくは一群の波長に合わせることもできる。 To sieved to different bands of light in the course of the excitation and detection, the whole or a part of a capillary tube bundle, it may be tailored to a particular individual wavelength or group of wavelengths.
【0204】 [0204]
粒子(70)は、管腔(40)内に描かれている。 Particles (70) is drawn into the lumen (40). 実施中には、励起光は粒子(70)を含む管腔(40)に向かい、放出光を出すレポーター蛍光物質を励起する。 During implementation, the excitation light toward the lumen (40) containing particles (70) to excite the reporter fluorescent substance issuing emitted light. 放出光は、検出器に到達するまでキャピラリー管の長さに相当する行程を移動する。 Emitted light moves the stroke corresponding to the length of the capillary tube until it reaches the detector. 第2の壁(50)が黒色EMAガラスである本発明の態様における利点のひとつは、放出光がキャピラリー管束中の隣接するキャピラリー管の間で混合し得ないことである。 One advantage the second wall (50) is in the embodiment of the present invention which is a black EMA glass is that the emitted light can not be mixed between the capillary tube adjacent in the capillary tube bundle. さらに、黒色EMAガラスは放出光を屈折させ、キャピラリー管のいずれかの端の方向を向かせるので、光学検出器(例えば、CCDカメラ等)で検出するシグナルを増加させる。 Furthermore, black EMA glass refract the emitted light, since the unsuitable direction of either end of the capillary tube, optical detector (eg, CCD camera, etc.) increase the signal detected by.
【0205】 [0205]
本発明のキャピラリー管束を用いた検出段階では、光学検出システムをアレイ状に並べ、次に「陽性」を表す蛍光もしくは発光を示す一個またはそれ以上の輝点について走査を行う。 In the detection step with a capillary tube bundle of the present invention, arranging an optical detection system in an array, to scan for one or more bright spots shows the following fluorescent or luminescent represents a "positive". 「陽性」なる用語は、対象となる活性の存在を意味する。 The term "positive" refers to the presence of the activity of interest. また、活性は、化学的な事象であっても、生物学的な事象であってもよい。 The active may be a chemical event, it may be a biological event.
【0206】 [0206]
図10には、本発明のキャピラリー管束(10)を用いた、試料のスクリーニングに関する一般的方法を示す。 10 was used for capillary tube bundle (10) of the present invention, illustrating a general method for screening of a sample. この図では、キャピラリー管束(10) が、対象となる粒子を含む容器(100)に浸せきもしくは接触している。 In this figure, capillary tube bundle (10) are immersed or in contact with the container (100) containing the particles of interest. 粒子は、液体に懸濁した細胞、クローン、分子もしくは化合物でもよい。 Particles, cells suspended in a liquid, clones may be molecules or compounds. 液体は、キャピラリー管現象でキャピラリー管に吸い上げられる。 The liquid is sucked up into the capillary tube by capillary tube phenomenon. キャピラリー吸引力の結果として起こる自然の吸い上げでは、ポンプ装置および分注器が不要である。 The natural wicking occurs as a result of capillary suction force, the pump device and dispensing device is not required. 生物学的活性(例えば酵素活性)を測定するための基質は、キャピラリー管束中のキャピラリー管へ粒子を導入する前もしくは導入した後に、粒子と接触させることができる。 Substrate for measuring biological activity (e.g., enzymatic activity), after prior or introducing introducing particles into the capillary tube in a capillary tube bundle can be contacted with the particles. 例えば、基質は対象となる細胞クローンを含むことができる。 For example, the substrate may comprise a cell clone of interest. キャピラリー管の開口端を、粒子を含む液体と基質の混合物を含む容器(100)内に設置することによって、基質を同時にキャピラリー管に導入することができる。 The open end of the capillary tube, by placing in the container (100) comprising a mixture of liquid and substrate containing the particles can be introduced substrate simultaneously into the capillary tube. いくつかの態様においては、対象となる粒子をある特定の濃度にすることが目標である。 In some embodiments, the goal is to the particular concentration with the particles of interest. 粒子の特定濃度は、希釈することによっても達成できることがある。 Specific concentration of particles can be achieved by dilution. 図13A−Cは、後に説明する段階に関する内容を示すものである。 Figure 13A-C shows the contents related to steps which will be described later. または、粒子を含む液体は、キャピラリー管の流路に一部へ吸い上げられ、その後基質がキャピラリー管の残りの流路部分へ吸い上げられる。 Or a liquid containing the particles are sucked into the part the flow path of the capillary tube is then sucked up substrate to the rest of the channel portion of the capillary tube.
【0207】 [0207]
次に、所望の活性を得る目的で、キャピラリー管内の混合物を反応させることができる。 Next, in order to obtain the desired activity may be reacted mixture of the capillary tube. 反応は、特定時間、例えば、細胞増殖に適した温度で行ってもよく、または、基質が細胞膜を透過して光学的に検出可能なシグナルを生じる温度で行ってもよく、もしくは一定時間、酵素活性の至適温度で行ってもよい。 The reaction is specific time, for example, may be performed at a temperature suitable for cell growth, or may be performed at a temperature that produces a detectable signal optically substrate is transmitted through the cell membrane, or a predetermined time, the enzyme it may be carried out in the optimum temperature of activity. 例えば、キャピラリー管束を加湿した恒温槽もしくはキャピラリー管における蒸発を防ぐことのできる水分供給源を含む装置内に設置することによって、反応を行うことができる。 For example, by installing in the apparatus comprising a water supply source which can prevent evaporation in a constant temperature bath or capillary tube humidified capillary tube bundle, the reaction can be carried out. 相対湿度を増すことによって (例えば、毛細束を加湿箱内に設置することによって)蒸発によるロスを防ぐことができる。 By increasing the relative humidity (e.g., by placing the capillary bundle in a humidified box) can be prevented loss due to evaporation. オイル、ワックス、膜等でキャピラリー管に封をすることによって、蒸発速度を低下させることもできる。 By oil, wax, seal the capillary tube film or the like, it can also reduce the rate of evaporation. または、蒸発を抑えるために、各種アルコール等の高分子の液体、もしくは単分子膜、二重膜、もしくはその他の薄膜(例えば、脂肪酸)を形成する分子、もしくは各種オイル(例えば、ミネラルオイル)を利用することができる。 Or, in order to suppress evaporation, liquid polymers such as various alcohols, or monolayer, bilayer, or other thin film (e.g., fatty acid) molecule to form a, or various oils (e.g., mineral oil) a it can be used.
【0208】 [0208]
図11は、対象となる細胞を含む基質溶液の反応法を示すものである。 Figure 11 shows a reaction method of a substrate solution containing cells of interest. 単純化のために、図11では、キャピラリー管(20)を一本のみを示すが、複数のキャピラリー管(20)からなるキャピラリー管束にもこの反応法が適用できる。 For simplicity, in FIG. 11, a capillary tube (20) showing only one may apply the reaction method capillary tube bundle comprising a plurality of capillary tubes (20). ある態様においては、上記の方法に従って、第1の液体をキャピラリー管(20)に吸い上げる。 In some embodiments, according to the method described above, it sucks up a first liquid into a capillary tube (20). 次に、基質溶液と細胞(32)を含むキャピラリー管(20)を、第2の液体(72)を含む液体浴(70)に導入する。 Then introduced capillary tube containing the substrate solution and cells (32) to (20), a liquid bath containing a second liquid (72) (70). 第2の液体は第1のものと同一であってもなくてもよい。 The second liquid may or may not be identical to the first one. 例えば、第1の液体は、スクリーニングを行う活性が由来する粒子(32)を含んでいてもよい。 For example, the first liquid may contain particles (32) derived from the active to perform screening. 粒子(32)は、管腔(40)内の液体中に懸濁し、蒸発によって次第にキャピラリー管(20)を通る液体の流れ方向に管腔(40)の上部に向かって移動する。 Particles (32) are suspended in a liquid in the lumen (40), moves towards the top of the lumen (40) in the direction of flow of liquid through progressively capillary tube (20) by evaporation. 液体混合物の蒸発量と速度を制御するため、キャピラリー管(20)の開口端における管腔(40)の幅は、管腔(40)の最上部の液体の表面積が特定の値となるように設定する。 To control the evaporation amount and velocity of the liquid mixture, the width of the lumen (40) at the open end of the capillary tube (20), as the surface area of ​​the top of the liquid lumen (40) becomes a specific value set to. キャピラリー管(20)の液体に浸っていない側の末端近傍の環境(68)を制御するために、キャピラリー管(20)内の第1の液体を蒸発させ、液体浴(70)から第2の液体(72)によって補給する。 In order to control the environment (68) Not side end neighborhood immersed in the liquid of the capillary tube (20), the first liquid in the capillary tube (20) is evaporated, the liquid bath from (70) second replenished by liquid (72).
【0209】 [0209]
蒸発量は、キャピラリー管(20)の内容物の液体(72)への拡散に対して、およびキャピラリー管内容物と液体(72)の振動および圧変化による機械的混合に対してバランスを保っている。 Evaporation is kept to diffusion into the liquid (72) of the contents of the capillary tube (20), and the balance to mechanical mixing by vibration and pressure changes of the capillary tube contents and the liquid (72) there. 管腔(40)の幅が増せば、機械的混合の量は増える。 If Maze the width of the lumen (40), the amount of mechanical mixing is increased. それ故、周囲の環境における温度および湿度のレベルを調整して、所望の蒸発サイクルとなるようにし、管腔(40)の幅を調節して、所望の蒸発速度となるようにするとともに機械的混合を最小限に抑える。 Therefore, by adjusting the levels of temperature and humidity in the surrounding environment, so that a desired evaporation cycles, by adjusting the width of the lumen (40), mechanical as well as to be a desired evaporation rate mixing to minimize. キャピラリー管(20)の液体に浸っていない側の開口端に封をすることによって、キャピラリー管内のキャピラリー管内容物を保持するような真空を創りだし、機械的混合と液体(72)内の内容物の拡散を最小化することもできる。 By the sealed open end on the side not immersed in the liquid of the capillary tube (20), out creating a vacuum to hold the capillary tube contents of the capillary tube, the contents in the mechanical mixing with the liquid (72) it is also possible to minimize the spread of the object. しかし、 キャピラリー管(20)に封をすれば、蒸発は起きない。 However, if the sealed capillary tube (20), the evaporation does not occur.
【0210】 [0210]
粒子(32)の活性率もしくは割合を高めるように、養分(74)を液体(72)に補給することもできる。 So as to increase the activity rate or percentage of the particles (32), it is also possible to replenish nutrients (74) to the liquid (72). 例えば、細胞を栄養する、もしくは細胞の恒温環境を最適化するように、酸素を液体に添加することもできる。 For example, cells are nutrients, or to optimize the constant temperature of the cell, oxygen can be added to the liquid. 他の例においては、液体(72)は、基質もしくは組換え体クローン、または粒子(32)の補助剤を含むこともできる。 In another example, the liquid (72) can also include adjuvants substrates or recombinant clones or particles, (32). 蒸発量と速度を制御することのよって、細胞を最適に培養することができる。 Depending of controlling the evaporation amount and speed can be optimally cultured cells. 例えば、環境(68)の相対湿度を減らすことによって、管腔(40)からの蒸発を増加させ、これによりキャピラリー管(20)を通る液体(72)の流速を増加させる。 For example, by reducing the relative humidity of the environment (68), it increases the evaporation from the lumen (40), thereby increasing the flow velocity of the liquid (72) through a capillary tube (20). 本法の他の利点は、他の方法では不可能なキャピラリー管(20)および環境 (68)内の条件の制御が、可能なことである。 Another advantage of the present method is non-capillary tube in the other way (20) and controlling the conditions in the environment (68) is that it allows.
【0211】 [0211]
環境の湿度が比較的高いレベルであれば、蒸発速度は低下し、キャピラリー管(20)内の液体量がより多い状態に保たれる。 If relatively high levels humidity environment, the evaporation rate decreases, the amount of liquid in the capillary tube (20) is kept higher state. しかし、キャピラリー管束(10)とその環境間で温度が異なれば、キャピラリー管束の緊密に充填されたキャピラリー管の末端もしくはその近傍で濃縮が起こりうる。 However, different temperature between the capillary tube bundle (10) and its environment, are concentrated at the end or near the capillary tube that is tightly packed in the capillary tube bundle can occur. 複数のキャピラリー管壁(30)の外端表面に濃縮ビーズ(80)形成し、隣接するキャピラリー管(20)の間で物質の相互「混入」が起こる潜在的な導管もしくは橋ができる状況を図示するために、図12Aには、本発明のキャピラリー管束(10)の一部を示した。 Concentrated beads (80) formed on the outer end surfaces of the plurality of capillaries wall (30), illustrates the situation that may potentially conduit or bridge mutual substance "contaminating" occurs between adjacent capillary tubes (20) to, in FIG. 12A, showing a portion of a capillary tube bundle (10) of the present invention. キャピラリー管壁(30)の外端表面は、好ましくは平面からなる表面である。 The outer end surface of the capillary wall (30) is a surface which is preferably made of a plane. キャピラリー管(20)の壁(30)がガラスである態様においては、キャピラリー管壁(30)の外端表面は、光沢ガラスであってもよい。 In the embodiment the wall (30) is a glass capillary tube (20), the outer end surface of the capillary wall (30) may be a glossy glass.
【0212】 [0212]
このような濃縮の効果をできるだけ抑えるために、図12Bに示すように、キャピラリー管壁(30)の外端表面に疎水性被覆(35)を施す。 In order to suppress as much as possible the effects of such a concentration, as shown in FIG. 12B, it applied hydrophobic coating (35) on the outer end surface of the capillary wall (30). 被覆(35)によって、水もしくはその他の液体のキャピラリー管壁(30)の外端表面付近への蓄積を抑える。 The coating (35), suppressing the accumulation of the vicinity of the outer end surface of the water or other capillary tube wall of the liquid (30). 濃縮によって、小型ビーズ(82)が形成して、キャピラリー管束の表面から撥水消退するか、もしくは管腔(40)の開口部全域にこれが形成する。 Concentration to form small beads (82), or water-repellent withdrawal from the surface of the capillary tube bundle, or this opening entire area of ​​the lumen (40) is formed. 後者の場合、濃縮ビーズ(80)は、キャピラリー管(20) に閉塞を生じうる。 In the latter case, it concentrated beads (80) can cause blockages in the capillary tube (20). ある態様においては、疎水性被覆(35)はテフロンである。 In some embodiments, the hydrophobic coating (35) is Teflon. ある形態においては、キャピラリー管壁(30)の外端表面のみが被覆(35)で覆われる。 In some configurations, only the outer end surface of the capillary wall (30) is covered with a coating (35). 他の形態においては、介在物質(60)およびキャピラリー管壁(30)の外端表面の双方を被覆(35)で覆うことができる。 In another embodiment, it is possible to cover both of the outer end surface of the mediators (60) and capillary tube wall (30) with a coating (35). キャピラリー管の外端表面を覆う疎水性被覆(35)の他の利点としては、吸上の初期過程で、 液滴状の液性物質が、液体が導入される表面に付着する傾向があることである。 Other advantages of the hydrophobic coating covering the outer end surface of the capillary tube (35), in the initial process of wicking, the droplets of the liquid material, there is a tendency to adhere to the surface of the liquid is introduced it is. それ故、被覆(35) は、キャピラリー管束(10)の表面に形成する外来性液状形態を最小限に抑え、外来性液体を表面から振盪もしくは払い落とす必要性がなくなる。 Therefore, the coating (35) minimizes the exogenous liquid form to be formed on the surface of the capillary tube bundle (10), eliminates the need to drop shaking or pay foreign liquids from the surface.
【0213】 [0213]
希釈もしくは混合によって後に混ぜ合わせることのできる予め混合していない二種類以上の成分をキャピラリー管中に含むことが必要な場合もある。 If two or more components that are not mixed in advance, which can be combined later by dilution or mixing required to include in the capillary tube is also. 図13A−Cには、粒子の特定濃度を達成するために用いる希釈段階を示す。 FIG 13A-C, showing the stage of dilution used to achieve a particular concentration of particles. ある態様においては、希釈して、キャピラリー管現象により大量の第1の成分(82)を、キャピラリー管(20)の一部にのみ充填が起こるまで、キャピラリー管(20)に吸い上げる。 In some embodiments, diluted, a large amount of the first component by capillary tube phenomenon (82), to fill only a portion of the capillary tube (20) takes place by drawing up the capillary tube (20). ある特定の態様においては、キャピラリー管(20)の一方の端を加圧して、第1の成分がキャピラリー管(20)全体に吸い上げられるのを防ぐ。 In one particular embodiment, pressurizes one end of the capillary tube (20), the first component is prevented from wick across the capillary tube (20). 加圧するために、キャピラリー管の末端(21)は、完全に、もしくは部分的に封をする。 To pressurize, end of the capillary tube (21) is completely or partially sealed.
【0214】 [0214]
次に、一定量の空気(84)をキャピラリー管内に第1の成分に隣接して導入する。 Next, it introduced a certain amount of air (84) adjacent to the first component in the capillary tube. 空気(84)は、任意の数の段階で導入することができる。 Air (84) can be introduced at any number of stages. そのような段階の一つには、適当な量の空気(84)を第1の成分(82)の後に導入するまで、キャピラリー管内の一方向に第1の成分(82)を移動させることを含む。 One of such stage, an appropriate amount of air (84) to be introduced after the first component (82), the first component in one direction of the capillary tube to move the (82) including. 陰圧および/もしくは陽圧にして第1の成分(82)をさらに移動させると、第1の成分(82)がピストン様の作用を空気に及ぼす。 When the first component (82) further moving the in the negative pressure and / or positive pressure, the first component (82) exerts the effect of the piston-like into the air.
【0215】 [0215]
次に、キャピラリー管(20)もしくはキャピラリー管束に、第2の成分(86)を接触させる。 Then, the capillary tube (20) or the capillary tube bundle is contacted second component (86). 好ましくは、第1の成分(82)の移動によるピストン様の作用で、キャピラリー管内に適当な量の第2の成分(86)が入るまで、第2の成分(86)をキャピラリー管(20)引き込み、空気(84)で第1の成分と隔てる。 Preferably, in the mobile piston-like action of the first component (82), to a second component of the appropriate amount in a capillary tube (86) enters, a second component (86) capillary tube (20) pull separates the first component in the air (84). 第1もしくは第2の成分のいずれかが、1個またはそれ以上の対象となる粒子を含み、それら成分の他方が、対象となる活性を得るための粒子の補助剤であってもよい。 Either the first or second component comprises particles comprising one or more of the subject, the other components thereof may be a supplement of particles to obtain an activity of interest. 次に、キャピラリー管もしくはキャピラリー管束を、一定時間恒温にして、第1および第2の成分が最適温度になるようにする、もしくは例えば、細胞増殖が可能な充分な時間恒温にすることもできる。 Then, the capillary tube or capillary tube bundle, in the fixed time constant temperature, the first and second component is made to be the optimum temperature, or for example, may be a sufficient time constant temperature capable of cell proliferation. 2種類の成分を混合し、所望の活性を誘起するために、2種類の成分を隔てる気泡を壊すことができる。 The two components are mixed, in order to induce the desired activity, it is possible to break the bubbles separating the two components. 加圧して気泡を消失させることもできる。 Pressurized and it is also possible to eliminate the bubbles. 一例では、第1と第2の成分の混合物によって酵素活性の発現が開始され、多成分測定が可能となる。 In one example, the expression of the enzyme activity is initiated by a mixture of first and second components, thereby enabling multi-component measurement.
【0216】 [0216]
気泡を壊す、および/もしくはキャピラリー管(20)もしくはキャピラリー管束(10)の内容物を混合する目的で、キャピラリー管(20)に含まれる常磁性体ビーズを利用するこができる。 Breaking bubbles, and / or capillary tube (20) or for the purpose of mixing the contents of the capillary tube bundle (10), it is this which utilize a paramagnetic beads contained in the capillary tube (20). 例えば、図14Aおよび9Bには、常磁性体ビーズが、磁場によりある位置から別の位置に移動する本発明の態様を示す。 For example, FIG. 14A and 9B, paramagnetic beads, illustrating aspects of the present invention to be moved from one location to another by a magnetic field. 常磁性体ビーズは、キャピラリー管もしくはキャピラリー管束に近接して負荷した磁場に引き寄せられる。 Paramagnetic beads are attracted to a magnetic field loaded in proximity to the capillary tube or capillary tube bundle. 各キャピラリー管に関する磁場の位置を変化させるもしくは調整することによって、常磁性体ビーズは、そこにある液体を混合するように各キャピラリー管内で動く。 By or adjusted to vary the position of the magnetic field for each capillary tube, paramagnetic beads, run on each capillary tube to mix liquid located there. 液体の混合により細胞への通気を増すことによって、細胞増殖の改善が可能となる。 By increasing the air flow to the cells by mixing the liquid, it is possible to improve cell growth. また、この方法によって、 キャピラリー管の間での液体試料の均一性と検出能が向上する。 Further, by this method, it improves the uniformity and detectability of liquid sample between the capillary tube.
【0217】 [0217]
別の態様においては、多成分測定を構成する方法は、第1の成分内にある第2の成分を含む1個またはそれ以上の封入体を提供する段階を含む。 In another aspect, a method of constructing the multi-component measurement includes the step of providing one or more of the inclusion bodies containing the second component is within the first component. 第2の成分の封入体は、予め決められた温度で融解もしくは溶解する物質からなる外層を有し、これにより第2の成分を第1の成分へ放出し、成分間で粒子を混合する。 Inclusion of the second component has an outer layer made of a material that melts or dissolves at a predetermined temperature, thereby the second component released into the first component, mixing the particles between the components. 熱により活性化する酵素を利用して、外層物質を溶解させることもできる。 Using the enzyme activated by heat, it is also possible to dissolve the outer layer material. または、予め決められた事象もしくは条件によって、第2の成分を放出するように設定した「指令による放出(release on command)」機構を利用することもできる。 Or, it can be utilized in advance by-determined event or condition, "release by command (release on command)" was set to emit a second component mechanisms.
【0218】 [0218]
別の態様においては、レポーター構築物もしくは基質を含む組換え体クローンを、キャピラリー管束のキャピラリー管へ吸い上げる。 In another embodiment, a recombinant clone containing a reporter construct or substrate, sucking capillary tube bundle into the capillary tube. 本態様においては、クローンに含まれるレポーター構築物もしくは基質は、当技術分野で公知の技術を利用して容易に検出できるので、基質を添加する必要はない。 In this embodiment, the reporter construct or substrate contained in the clones, it is possible to readily detected using techniques known in the art, it is not necessary to add the substrate. 例えば、緑色蛍光タンパク質等のレポーター構築物を含むクローンは、クローンもしくはクローン内の基質を、蛍光を誘導する光の波長に暴露することによって検出できる。 For example, clones containing reporter construct such as green fluorescent protein, a substrate for clone or the clone can be detected by exposure to wavelengths of light to induce fluorescence. 様々な培養条件に応じて、もしくは様々な物理的刺激(光および熱を含む)に暴露することによって、このようなレポーター構築物は実際に用いられる。 Depending on various culture conditions, or by exposure to a variety of physical stimuli (including light and heat), such reporter constructs used in practice. さらに、同様の技術を利用して、試料中の多様な化合物をスクリーニングできる。 Furthermore, by utilizing the same techniques can be screened for various compounds in the sample. 例えば、蛍光分子で検出可能に標識されている化合物は、キャピラリー管束のキャピラリー管内で容易に検出できる。 For example, compounds that are detectably labeled with a fluorescent molecule, can be readily detected in a capillary tube of a capillary tube bundle.
【0219】 [0219]
さらに別の態様においては、希釈の代わりに、蛍光セルソーター (FACS)を用い、キャピラリー管束へ送達する目的で、クローンを分離および単離する。 In yet another embodiment, instead of dilution, using a fluorescent cell sorter (FACS), for the purpose of delivering the capillary tube bundle, clones separated and isolated. 本態様では、キャピラリー管あたり1種類またはそれ以上のクローンを正確に分離できる。 In this manner, it can accurately separate the one or more clones per capillary tube. さらに別の態様においては、キャピラリー管内の細胞は、溶解段階を受容する。 In yet another embodiment, the cells of the capillary tube is to receive the dissolution step. 成分のうちの一方に化学薬品を入れて、実施する。 Put one to chemicals of the components is carried out.
【0220】 [0220]
キャピラリー管内の媒体の交換が必要な測定もある。 Exchange of the medium of the capillary tube is also required measurements. 媒体交換の段階で、粒子を含む第1の液体をキャピラリー管に吸い上げる。 At the stage of medium exchange, sucking a first liquid containing particles into the capillary tube. 第1の液体を除去し、粒子がキャピラリー管内に懸濁したまま、第2の液体と交換する。 The first liquid is removed, while the particles are suspended in a capillary tube, and replaced with a second liquid. 第2の液体のキャピラリー管への添加、および粒子との接触させ、例えば、測定等の目的で、活性を誘起できる。 Added to the second capillary tube liquid, and is contacted with the particles, for example, for purposes of measurement, etc., it can induce active. 媒体交換の段階は、第1の液体を除去しながらキャピラリー管内の粒子を物理的にキャピラリー管内に保持する機構を含む。 Stage of medium exchange, includes a mechanism for holding the physical capillary tube the particles of the capillary tube while removing the first liquid. ある態様おいては、キャピラリー管束の内壁を、細胞が結合する抗体でコートする。 Keep some embodiments, the inner wall of the capillary tube bundle is coated with antibody that cells bind. 次に、細胞が抗体に結合したまま第1の液体を除去し、第2の液体をキャピラリー管に吸い上げる。 Next, the cells were removed first liquid remains bound to the antibody, suck up a second liquid in the capillary tube. 必要ならば、第2の液体が細胞の結合を解離させるようにしてもよい。 If necessary, the second liquid may be caused to dissociate the binding of the cells. 別の態様においては、キャピラリー管の1方向またはそれ以上の壁を磁化することができる。 In another embodiment, it is possible to magnetize one direction or more walls of the capillary tube. 粒子も磁化されて、壁に引き寄せられる。 Particles be magnetized, they are attracted to the wall. さらに別の態様においては、磁化粒子は、キャピラリー管の一方の側に与えられた磁場によって、そちら側に引き寄せられて保持される。 In yet another embodiment, the magnetization particles, by one magnetic field applied to the side of the capillary tube, is held attracted to that side.
【0221】 [0221]
キャピラリー管束を分析し、例えば、光の発生もしくは伝達における変化を検出することのできる検出器によって、光学シグナル(例えば、蛍光)等の検出可能なシグナルを有するキャピラリー管を検出する。 Analyzing the capillary tube bundle, for example, by a detector capable of detecting a change in occurrence or transmission of light, the optical signal (e.g., fluorescence) is detected capillary tube having a detectable signal, such as. 束の各キャピラリー管において蛍光の励起を与える光源および蛍光励起の結果生じた発光を検出する分光検出器を利用して検出を行う。 To detect by using a spectroscopic detector for detecting luminescence generated as a result of the light source and the fluorescence excitation gives excitation of fluorescence in the capillary tubes of the bundle. 好適な光源としては、レーザー、白熱電球、発光ダイオード(LED)、アーク放電、もしくは光電子増倍管等が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。 Suitable light sources, lasers, incandescent light bulbs, light-emitting diode (LED), arc discharge, or it photomultiplier and the like, but the invention is not limited thereto. 好適な分光器としては、光ダイオード・アレイ、電荷結合素子(CCD)、もしくは電荷放出素子(CID)が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。 Suitable spectrometers, photodiode arrays, charge-coupled device (CCD), or charge-emitting device (CID) including without being limited only thereto.
【0222】 [0222]
図15を参照とする、ある態様においては、検出システムは、レーザー・ビーム(84)を生じるレーザー光源(82)含む。 And 15, in certain embodiments, the detection system includes a laser light source (82) to produce a laser beam (84). キャピラリー管(20)の束における励起を目的として、より拡散したもしくは集光したビーム(86)を生じるように配置したビーム・エクスパンダー(85)の方向にレーザー・ビーム(84)を向ける。 For the purpose of excitation in flux of the capillary tube (20), directing a laser beam (84) in the direction of a more diffuse or condensed arranged to produce a beam (86) beam-expander (85). 好適なレーザー光源としては、アルゴンもしくはイオン・レーザーが挙げられる。 Suitable laser sources include argon or ion laser. この態様では、冷却CCDを用いることができる。 In this manner, it is possible to use a cooling CCD.
【0223】 [0223]
例えば、蛍光基質の酵素的活性化によって生成した光は、本発明の機器に隣接して配置した単一もしくは複数の適当な光検出器で検出する。 For example, light generated by the enzymatic activation of fluorescent substrate is detected by a single or more suitable optical detectors disposed adjacent the apparatus of the present invention. 光検出器としては、例えば、フィルム、光電子増倍管、光ダイオード、雪崩光ダイオード、CCD、もしくはその他の光検出器、もしくはカメラが挙げられる。 The photodetector, for example, a film, a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, CCD, or other optical detector, or a camera and the like. 光検出器は、走査レーザー等の連続発光を検出する単一の検出器でもよく、光検出器は、放出光の単波長もしくは多波長における同時発光を検出し空間的に分解する複数の個別の検出器を含むものであってもよい。 The photodetector may be a single detector for detecting a continuous emission of such scanning laser, the optical detector detects the simultaneous emission of a single wavelength or multi wavelength of the emitted light spatially multiple decompose individual it may include a detector. 放出され検出された光は、可視的光であってもよく、赤外光もしくは紫外光等の不可視光として放出されたものであってもよい。 Light detected is released may be a visible light, or may be released as invisible light such as infrared light or ultraviolet light. 熱検出器を利用して、赤外光の放出を検出することもできる。 Utilizing the heat detector, it is also possible to detect the emission of infrared light. 単一もしくは複数の検出器は、据え付けられていても可動性であってもよい。 Single or multiple detectors, also be mounted may be mobile.
【0224】 [0224]
キャピラリー管束の少なくとも一つの表面に接して、もしくは隣接して設置されたレンズ、鏡、および光ファイバー光導体もしくは光導管(単一、複数、固定、もしくは可動)によって、束内の対象となる粒子に光源からの光をあてる。 In contact with at least one surface of the capillary tube bundle, or adjacent to the installed lens, mirrors, and fiber-optic light conductors or optical conduit by (single, multiple, fixed or movable), the particles of interest in the bundle It sheds light from a light source. 同様な機構を用いて、単一もしくは複数の検出器に、放出光もしくはその他の輻射等の検出可能なシグナルを導くこともできる。 Using a similar mechanism, in single or multiple detectors may also be derived a detectable signal, such as the emitted light or other radiation.
【0225】 [0225]
好ましくは、分光器は、CCD、CIDもしくは光ダイオード要素からなるアレイを含む。 Preferably, the spectrometer, CCD, including an array of CID or a photodiode element. 従って、光学的シグナルを含む単一もしくは複数のキャピラリー管位置の検出は、各要素からの光学的入力に基づいて行うことができる。 Thus, detection of a single or a plurality of capillary tubes position including an optical signal can be performed based on the optical input from each element. または、共焦点走査もしくは位相差蛍光顕微鏡等でこのアレイを走査する。 Or, scanning the array with a confocal scanning or phase fluorescence microscope. ここで、アレイは、例えば、光学シグナルを検出するキャピラリー管束位置を決定するためのビームで、キャピラリー管束内のキャピラリー管を、順次並列させるためにXY平面で動く可動ステージ上に設置される。 Here, the array may be, for example, a beam for determining the capillary tube bundle position detecting an optical signal, a capillary tube in a capillary tube bundle is installed on a movable stage that moves in the XY plane in order to sequentially parallel. 顕微鏡とともにCCDカメラ等を利用することもできる。 It is also possible to use a CCD camera or the like with a microscope. この検出システムは、好ましくは、迅速なスクリーニングと回収が可能なようにコンピュータで自動化される。 The detection system is preferably automated by a computer so as to allow recovery and rapid screening. 好ましい態様においては、このシステムは検出にテレセントリック・レンズを利用する。 In a preferred embodiment, the system utilizes a telecentric lens to detect. キャピラリー管束内のキャピラリー管のサブセットに焦点を当てるようにレンズの拡大率を調節することができる。 It is possible to adjust the magnification of the lens to focus on a subset of the capillary tube in a capillary tube bundle. ある極端な場合には、例えば、画素:キャピラリー管の相関が1:1である検出システムも存在しうる。 In some cases extreme, for example, pixel: Correlation of capillary tubes 1: may also be present 1 a is detection system. シグナルの検出に関しては、シグナルの他の性質を調べるために焦点を調節することができる。 For the detection of the signal, it is possible to adjust the focus to examine the other properties of the signals. キャピラリー管あたりの画素数がより多いときには、後にシグナルを画像処理できる。 When the number of pixels per capillary tube is more large, the signal can image after.
【0226】 [0226]
色原体基質が使用される場合、分光光度計または同様のものを使用することなどにより、吸光スペクトルの変化を測定できる。 If chromogenic substrate is used, such as by use a spectrophotometer or the like, can measure a change in absorption spectrum. そのような測定は、低容量の液体を扱う場合は、光路長が短いために通常困難である。 Such measurements, when dealing with low volume liquid is usually difficult for the optical path length is short. しかし、本発明のキャピラリーを用いたアプローチでは、少ない容量の液体に長い光路長をもたせ(例えば、キャピラリー管の縦方向に沿って)、それによって、従来法を用いた吸光度の変化の測定を可能にする。 However, the approach using capillary of the present invention, remembering long optical path length in the liquid of small capacity (for example, along the longitudinal direction of the capillary tube), thereby allowing measurement of absorbance change using the conventional method to.
【0227】 [0227]
キャピラリー内の流体は通常、各末端においてメニスカスを形成する。 Fluid in the capillary is usually forms a meniscus at each end. キャピラリーに入射するいかなる光も、その中央においてメニスカス湾曲に入射する近軸光線を除いて、壁面に向かって偏向される。 Any light incident on the capillary may, except for paraxial rays incident on the meniscus curvature at the center, is deflected towards the wall. 近軸光線はキャピラリーの中央部において小さな輝点を生じ、少量の光が透過することを表す。 Paraxial ray causes a small bright spot in the center of the capillary, indicating that a small amount of light is transmitted. 輝点の測定により、通過の際にどれほどの光が吸収されるかを測定する機会が提供される。 By measurement of the bright spot, chance of how much light during passage to measure either absorbed it is provided. 好ましい態様においては、検出系は2つの異なる波長の使用を含む。 In a preferred embodiment, detection system includes the use of two different wavelengths. 第一および第二の波長の比率はどれほどの光がキャピラリーにおいて吸収されるかを示す。 The ratio of the first and second wavelength indicates how much light is absorbed in the capillaries. または、キャピラリーの2つの像を取ることができ、それらの間の差異は、キャピラリー中のある化学物質の示差的な吸光度を確認するために用いることができる。 Or, it is possible to take two images of the capillary, the difference between them, can be used to confirm the differential absorbance of chemicals that in the capillary.
【0228】 [0228]
吸光度検出においては、穴の中央における光のみがキャピラリーを通って移動できる。 In photometric detection, only the light in the center of the hole can move through the capillary. しかし、少なくとも1つのメニスカスが平坦化された場合、光効率は上昇する。 However, if at least one meniscus is flattened, light efficiency is increased. 図11に関して上記に議論された、気化の連続したサイクル中のような多くの状況下において、メニスカスは平らに維持できる。 Discussed above with respect to FIG. 11, in many situations, such as during consecutive cycles of vaporization, the meniscus can be maintained flat. そのような態様においては、透明な、光を通過する容器に流体槽を含み得、光源は流体槽を通してキャピラリーに向けることができる。 In such embodiments, a clear, include a fluid reservoir in a container passes through the light, the light source can be directed to the capillary through the fluid reservoir.
【0229】 [0229]
その他の態様においては、例えば光学的検出、磁気検出および熱検出を含む、様々な電磁気検出装置を使用することにより、生体活性または生体分子または化合物が検出される。 In other embodiments, for example, optical detection, including magnetic detection and thermal detection, by using a variety of electromagnetic detection device, the biological activity or biological molecule or compound is detected. さらに他の態様においては、当技術分野において既知の検出法を用いて、キャピラリー管内において放射能を検出できる。 In still another embodiment, using known detection methods in the art, it can detect radioactivity in a capillary tube. キャピラリー管のいずれかの末端において放射を検出できる。 It can detect radiation at either end of the capillary tube.
【0230】 [0230]
その他の検出法は、限定しないが、ルミネセンス、蛍光偏光、時間分解型蛍光を含む。 Other detection methods include, but are not limited to, luminescence, fluorescence polarization, time resolved fluorescence. ルミネセンスの検出は、試料の分子または細胞に関連した化学的過程または生理学的過程によって生産された放出光の検出段階を含む。 Luminescence detection include detection step of the emitted light produced by chemical processes or physiological processes associated with molecular or cell sample. 蛍光偏光の検出は、穴の内容物の、偏光を用いた励起を含む。 Detection of fluorescence polarization includes excitation with the contents of the hole, the polarized light. そのような環境下においては、蛍光団は特定の分子について偏光を放出する。 In such an environment, the fluorophore emits polarized light for a particular molecule. しかし、放出分子は、移動しその配向角度を変化させる可能性があり、偏光放出は無作為となり得る。 However, release molecules are likely to move to change its angle of orientation, polarization release may be random.
【0231】 [0231]
時間分解型蛍光法には、励起後の予め決定した時間において蛍光を読み取る段階が含まれる。 The time-resolved fluorescence methods include the step of reading the fluorescence in a pre-determined time after excitation. 比較的長寿命の蛍光団については、分子に励起エネルギーを浴びせ、蛍光団および基質内の他の粒子から放出を生じる。 The fluorophore relatively long life, peppered excitation energy to the molecule, resulting in release from the other particles of fluorophores and the substrate. 他の粒子からの放出は、バックグラウンド蛍光を生み出す。 Release from the other particles, produce a background fluorescence. 蛍光団からの長寿命の放出に比較して、バックグラウンド蛍光は通常短寿命をもつ。 Compared to the release of life from the fluorophore, background fluorescence with normal short life. 励起が完了した後、全てのバックグラウンド蛍光が通常短寿命をもつ時点において、および長寿命の蛍光団が蛍光を発し続ける時間中において、放出を読み取る。 After the excitation has been completed, at the time that all the background fluorescence of ordinary short-lived, and during the time the fluorophore continues to fluoresce long life, reads the release. ゆえに時間分解型蛍光法はバックグラウンド蛍光活性を抑える技術である。 Thus time-resolved fluorescence technique is a technique to suppress the background fluorescence activity.
【0232】 [0232]
推定ヒット(検出可能なまたは光学的なシグナルを生産する細胞またはクローン)の回収は、回収装置(例えば針のピペット先端またはキャピラリー管)の配置を自動化するための検出系からの位置フィードバックを使用することにより促進できる。 Recovery putative hits (detectable or optical cells or clones to produce a signal) uses the position feedback from the detection system to automate the placement of the collecting device (e.g., a needle pipette tip or the capillary tube) It can be promoted by. 図16は、本発明の回収系(100)の実施例を示す。 Figure 16 shows an embodiment of a recovery system (100) of the present invention. この実施例においては、針105が選択され、回収機械装置(106)に連結される。 In this embodiment, the needle 105 is selected and connected to the collecting machine (106). 支持台(102)はキャピラリーアレイ(10)および光源(104)を支持する。 Support base (102) supports the capillary array (10) and the light source (104). 光源は、回収機械装置(106)に連結された針(105)のX、YおよびZ の座標位置を見出すために、カメラ集合体(110)と共に使用される。 The light source, X collection machinery (106) to the coupled needle (105), to find the coordinate position of the Y and Z, it is used in conjunction with the camera assembly (110). キャピラリーアレイ(10)が「ヒット」を含む位置で、キャピラリーアレイ(10)を針(105)の下に配置するため、支持台をX軸およびY軸においてキャピラリーアレイに相対的に移動させる。 In position capillary array (10) comprises a "hit", for placing the capillary array (10) below the needle (105), causes the support base is moved relative to the capillary array in the X-axis and Y-axis. 様々な態様に従って、回収系の各部分は移動または固定できる。 In accordance with various aspects, each part of the recovery system can be mobile or fixed.
【0233】 [0233]
回収機械装置(106)はその後、Z方向において、針の先端がキャピラリー開口部に到達するまで針(105)の先端を「ヒット」を含むキャピラリーと重ねることによって、針(105)を「ヒット」を含むキャピラリーに提供する。 Collecting machine (106) is then in the Z direction, by overlapping the tip of the needle (105) and a capillary containing "hits" until the tip of the needle reaches the capillary opening, the needle (105) "hit" to provide the capillary, including. キャピラリー自体の損傷を避けるため、針はばねに装着できる、または彎曲する材料からなることが可能である。 To avoid damage to the capillary itself, the needle can be made of can be attached to a spring or curved material. 一旦キャピラリーの開口部に接触すれば、試料を吸い取ることができる、またはキャピラリーから取り除くことができる。 Once the contact with the opening of the capillary, it is possible to soak up the sample, or can be removed from the capillary. または、キャピラリーアレイは固定した針(105)に相対して移動できる、もしくは双方を移動できる。 Or, capillary array can be moved relative to the fixed needle (105), or can be moved both.
【0234】 [0234]
回収技術の特定の典型的態様においては、Z面において、針の先端のような回収器の位置の決定のために単独のカメラを使用する。 In certain exemplary embodiments of the recovery techniques, in the Z plane, using a single camera for determining the positions of such collector as a needle tip. Z面の決定は、自動焦点アルゴリズム、またはカメラに連結して使用する近接センサーを用いて行うことができる。 The determination of Z plane can be performed using the proximity sensor to be used connected to an automatic focusing algorithm or camera. Zにおける回収器の近接位置が一旦分かれば、XおよびYにおける回収器の正確な位置を決定するために、画像情報処理機能を実行できる。 Knowing the close position of the recovery device in the Z once, in order to determine the exact position of the collector in the X and Y, you can perform image processing functions. ある態様においては、画像情報処理を補助するために、回収器は背後から照らされる。 In some embodiments, to aid in image processing, collector is illuminated from behind. XおよびYの座標位置が一旦分かれば、標的キャピラリーと組み合わせるためにZ軸に沿って移動できる回収器の正確な位置に相対して、キャピラリーアレイをXおよびYにおいて移動できる。 Knowing the coordinate position of the X and Y once, relative to the exact position of the collector that can be moved along the Z axis for combination with the targeted capillaries, the capillary array can be moved in X and Y.
【0235】 [0235]
回収技術のその他の特定の態様においては、回収器の位置を決定するために、2つまたはそれ以上のカメラが使用される。 In other specific aspects of the recovery techniques, to determine the position of the collector, two or more cameras are used. 例えば、第一のカメラは、針先端のX、Z位置のような、回収器のXおよびZ の座標位置を決定できる。 For example, the first camera, the needle tip of X, such as Z position, the coordinate position of the X and Z of collector can be determined. 第二のカメラは、回収器のYおよびZの座標位置を決定できる。 The second camera can determine the coordinate position of the collector of Y and Z. 座標の2つの組はその後、完全なX、Y、Zの座標位置のために重ね合わせることができる。 Two sets of coordinates may then complete X, Y, can be superimposed for a coordinate position of Z. 次に、回収器に相対したキャピラリーアレイの移動を実質的に上記の如く実行できる。 Then, it executes as substantially above the relative movement of the capillary array collector.
【0236】 [0236]
試料は、例えば不活性ガスまたは流体のキャピラリーへの一気の注入、およびキャピラリーの反対側の末端の収集装置における排出された試料の収集により、取り除くことができる。 Samples are for example one-stroke injection to the inert gas or fluid capillary, and by the collection of the discharged sample in opposite ends collecting device of the capillary, can be removed. 収集装置の直径はキャピラリーの直径より大きい、またはそれに等しいものが可能である。 The diameter of the collecting device is capable of equal larger than the diameter of the capillary, or to it. 収集された試料はその後、例えばポリヌクレオチドやタンパク質を抽出すること、または培養においてクローンを成長させることにより、さらに処理される。 Then the collected sample, for example by extracting the polynucleotide or protein, or by growing the clones in culture for further processing.
【0237】 [0237]
その他の態様においては、試料は真空吸引を用いて吸い取らせる。 In other embodiments, the sample is allowed blotted using vacuum suction. この態様においては、針はキャピラリー開口部に接触、またはほぼ接触し、試料はキャピラリー管から収集装置へ「真空吸引される」、または吸い取られる。 In this embodiment, needle contacts the capillary opening, or near contact, the samples "are vacuum" to the collecting device from the capillary tube, or blotted. 収集装置は、図17A〜Dにて図示されるように、針の開口部に近接に配置された微量遠心管またはフィルターが可能である。 Collection device, as illustrated in FIG 17A~D, it is possible to microcentrifuge tubes or filter positioned proximate to the opening of the needle. 図17Dは、試料のキャピラリーからの吸い取りに続く、フィルター上に収集された試料のさらなる処理段階を示す。 Figure 17D is followed by blotting from the capillary the sample, indicating a further processing step of the sample collected on the filter. 試料は、フィルター上に存在する場合、収集装置に送達できる、細胞、タンパク質、または核酸のような粒子を含む。 Sample, if present on the filter can be delivered to the collection device, including cells, proteins or particles such as nucleic acids. 適した収集装置には、微量遠心管、キャピラリー管、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、および同様のものが含まれる。 Suitable collection device, microcentrifuge tubes, capillary tubes, microtiter plates, including those cell culture plates, and the like. 試料の送達は、その他の媒体、空気または他の流体をフィルターに逆方向に強制的に通すことによって達成できる。 Delivery of the sample, other media, air or other fluid can be achieved by forcing through it in the opposite direction to the filter.
【0238】 [0238]
試料はまた、試料排出装置によってキャピラリーから排出することもできる。 Samples can also be discharged from the capillary by the sample discharge device. ある態様においては、排出装置は、キャピラリー管の一端において試料流体を高温に供し、キャピラリー管のもう一端における流体の排出を引き起こす噴流系(jet system)である。 In some embodiments, the discharge device, subjecting the sample fluid to a high temperature at one end of the capillary tube, a jet system which causes the discharge of the fluid in the other end of the capillary tube (jet system). 加熱されたプローブを直接キャピラリー管の一端内に当てることにより、流体の加熱は機械的に達成できる。 By applying a heated probe directly into one end of the capillary tube, the heating of the fluid is mechanically be achieved. 加熱されたプローブは、好ましくは一端を密閉し、プローブに接触する流体を加熱し、キャピラリー管のもう一端から流体を追い出す。 The heated probe is preferably sealed at one end, to heat the fluid in contact with the probe, expel fluid from the other end of the capillary tube. 加熱および排出はまた、電子工学的にも達成できる。 Heating and discharging may also be achieved in electronic engineering. 例えば、噴流系のある態様においては、キャピラリー管の少なくとも1つの壁面を金属化する。 For example, in some embodiments of the jet system, metallizing at least one wall of the capillary tube. 加熱素子を壁面の一端に直接接触するように配置する。 A heating element arranged in direct contact with one end of the wall. 加熱素子は完全に一端をふさぐ、または、部分的にふさぐことが可能である。 Heating element completely closes one end, or can obstruct partially. 加熱素子は金属化した壁面を帯電させ、流体内に熱を生み出す。 The heating element is charged wall surfaces metallized, produce heat in the fluid. 加熱素子は、電圧源または電流源のような電気供給源が可能である。 Heating element is capable of electric source such as a voltage or current source. 噴流系のさらに他の態様においては、キャピラリー管の一端においてレーザーにより流体に熱パルスを作用させる。 In yet another embodiment of the jet type, the action of heat pulses to the fluid by the laser at one end of the capillary tube.
【0239】 [0239]
本発明のキャピラリー管から流体を追い出す他の系は可能である。 Other systems that expel the fluid from the capillary tube of the present invention are possible. 流体中または流体の近くに電場を作り、電気泳動反応を生じさせ、電場によって生じた起電力に従った流体の移動を引き起こすことができる。 Creating an electric field in the vicinity of the fluid or fluid, causing electrophoresis reaction, can cause movement of the fluid in accordance with the electromotive force generated by an electric field. 電磁場もまた使用できる。 Electromagnetic field can also be used. ある態様においては、1つまたはそれ以上のキャピラリーが、流体に加えて、キャピラリーアレイからの流体または磁化した粒子の移動を促進するために、磁気作用によって帯電した粒子を含む。 In some embodiments, one or more capillaries, in addition to the fluid, in order to facilitate the transfer of fluid or magnetized particles from capillary array, containing charged particles by a magnetic action.
【0240】 [0240]
キャピラリーアレイの各キャピラリーは各々処理可能である、即ち、各ウェルの含有量はスクリーニング中に確認できる。 Each capillary of the capillary array are each capable of processing, i.e., the content of each well can be verified during the screening. ある態様においては、量子ドット標識したマイクロビーズ法および装置が使用される。 In some embodiments, the micro-beads method and apparatus quantum dot label is used. そのような方法および装置においては、何万という特有の蛍光コードが生じ得る。 Such a method and apparatus, can occur fluorescent codes peculiar tens of thousands. 対象となるアッセイ物はコード化ビーズに付着され、アッセイ物およびビーズ/コードの両方を同時に測定するために多重スペクトル画像処理が使用される。 Assays product of interest is attached to an encoded bead, multispectral image processing is used to measure both assays compounds and beads / code at the same time. 通常、多数のビーズを含むいくつかのキャピラリー、および何も含まないいくつかのキャピラリーが存在する。 Usually, several capillaries that do not contain some of the capillary, and nothing containing multiple beads are present.
【0241】 [0241]
約100,000個のキャピラリーを含むアレイについて、あるアプローチでは、アレイの100,000個のキャピラリーを、10,000個の異なるコード化ビーズの10コピー(または20,000コードの5コピー)を含む溶液で満たす。 For arrays containing about 100,000 capillaries, in one approach, 100,000 capillaries of the array, including (5 copies or 20,000 codes) 10 copies of 10,000 different encoded bead filled with solution. 正常な条件下においては、どのウェルが単一ビーズを有するかを、および、ことによっては各ウェルの含有量をも決定するために、単純統計的解析が使用できる。 In normal conditions, what wells has a single bead, and, in order also to determine the content of each well by a simple statistical analysis can be used. 任意の1つのキャピラリーアレイプラットホーム上のあるウェルにおいて、任意の2つのビーズが共に5回以上含まれる可能性は無視できるほど小さい。 In a top any one capillary array platform wells, small enough possibility that any two beads include both 5 times or more can be ignored.
【0242】 [0242]
量子ドット法の利点は、1つの励起帯のみを必要とすることである。 An advantage of quantum dots method is that it requires only one excitation band. これによりアッセイ法には多くの融通性が与えられる(即ち、異なる励起帯を使用できる)。 Thus given a number of flexibility in assay (i.e., use different excitation band). アッセイ検出にさらなる特性を加えるため、磁気コード化ビーズもまた使用できる。 To add additional properties to the assay detection, magnetic encoded beads may also be used. 多重スペクトル画像処理系をその後使用できる。 Then use the multispectral image processing system. または、スペクトル分解について、神経回路網アプリケーションを利用できる。 Or for spectral decomposition, available neural network applications.
【0243】 [0243]
この惑星に生息する無数の微生物は、薬学的応用、農学的応用、工業的応用および化学的応用のための生体分子の莫大な宝庫である。 Countless microorganisms inhabiting this planet, pharmaceutical applications, agricultural applications, is a vast repository of biomolecules for industrial applications and chemical applications. これらの微生物の大多数、およそ99.5%と見積もられるものが、主に極端なまたは異常な生息場所において遭遇する複合的化学作用および環境的変数のために、現代の微生物学的方法によっては未開拓のままである。 The majority of these microorganisms, those estimated to be approximately 99.5%, primarily due to extreme or unusual complex chemistry and environmental variables encountered in habitat, some modern microbiological process it remains untapped. 極端な環境下において機能するように進化させた、新奇の経路において化学反応を触媒する酵素を利用することは、産業上著しい重要性がある。 Evolved to function in extreme environments, utilizing enzymes that catalyze chemical reactions in the pathway of the novel, there is the significant importance industry. 本発明は、自然界に存在する生物多様性を利用することによる新奇の酵素および生合成経路の発見のための、培養非依存的な組換えアプローチの範囲内における、この強大な触媒多様性を抽出、最大限に利用および商品化する技術を提供する。 The present invention, for the discovery of novel enzymes and biosynthetic pathways by utilizing biodiversity existing in nature, within the scope of the culture-independent recombinant approach, extract this powerful catalysts diversity , to provide a technique for use and commercialization to the maximum. 世界中の選択された微小生息区からDNAを直接的に単離することにより、大規模の、複雑な(>109要素)遺伝子ライブラリを構築する。 By directly isolating the DNA from the selected micro-habitat District around the world, to build a large-scale, complex (> 109 element) gene library. これらのライブラリをその後、様々な宿主系において発現させ、対象となる活性について特異的なハイスループットスクリーニングに供する。 Then these libraries were expressed in a variety of host systems, subject to specific high-throughput screening for activity of interest. 単一DNAライブラリに5000個を超える異なる微生物ゲノムが存在する可能性があるため、この多様性のスクリーニングを有効に行うためには超ハイスループット法が必要とされ、それはこの培養非依存的な組換え法を成功させるためには必須である。 There is a possibility that different microbial genomes than 5000 into a single DNA library exists, in order to effectively perform the screening of this diversity is required ultra high-throughput methods, it is the culture-independent set it is essential to the success of the modified method.
【0244】 [0244]
従来のスクリーニング法には、液相、マイクロタイタープレートに基づくアッセイ法が含まれる。 Conventional screening methods, liquid phase include assays based on microtiter plates. 液相アッセイ法のための形式は、しばしば機械的に96、384、または1536ウェルのマイクロタイタープレートに操作されている。 Format for the liquid phase assay, are frequently mechanically operated 96,384 or 1536 well microtiter plates. これらのマイクロタイタープレートに基づくスクリーニング技術は都合よく用いられてはいるが、限界はある。 Screening technology based on these microtiter plates but are used conveniently, the limit is. 主な限界は、これらの技術では一般に、器械当たり1日に約105〜106クローンしかスクリーニングできないという処理量である。 The main limitation is the amount of processing that generally these techniques, approximately 105-106 clones per day per instrument can only screening. 例えば、マイクロタイターに基づくHTSシステムにおける、100,000ウェルの典型的なスクリーニングでは、261,384ウェルマイクロタイタープレートおよび24時間以上の準備時間が必要となる。 For example, in HTS systems based on microtiter, a typical screening of 100,000 wells, it is necessary to 261,384 well microtiter plates and 24 hours or more preparation time. しかし、1536ウェルまたはそれ以上のプレート形式が普及しつつある一方で、本技術が信頼性があり標準化されているため、HTSに関わる多数の会社が384ウェルプレートを使用し続けている。 However, while the 1536 wells or more plate format is spreading, the technique since they are standardized reliable, numerous companies involved in HTS continues using 384-well plates. 単離物および複雑性の低いライブラリのスクリーニングのためにはこれらの処理量は十分以上であり得るが、1つの複雑な遺伝子ライブラリを完全にスクリーニングするためには1年以上かかる可能性がある。 These processes amounts for screening isolates and low complexity library may be more than sufficient, but in order to fully screen the single complex genetic libraries could take more than a year. 明らかに、処理量がより大きなスクリーニング技術が必要である。 Obviously, the amount of processing is required a larger screening techniques.
【0245】 [0245]
その他のスクリーニング法は、成長選択法(Snustadら、1988;Lundbergら、1993;Yanoら、1998)、微生物コロニーまたはファージプラークの比色スクリーニング(Kuritz、1999)、インビトロ発現クローニング(Kingら、1997)および細胞表面またはファージディスプレイ(Benhar、2001)を含む。 Other screening methods, growth selection method (Snustad et al, 1988; Lundberg et al., 1993; Yano et al, 1998), microbial colonies or phage plaques colorimetric screening (Kuritz, 1999), in vitro expression cloning (King et al., 1997) and a cell surface or phage display (Benhar, 2001). これらの系の各々には限界がある。 To each of these systems is limited. コロニーまたはプラークの固相比色プレートスクリーニングは、比較的低い処理量によって限られる。 Solid colorimetric plate screening of colonies or plaques are limited by the relatively low throughput. マイクロコロニー/プラークおよび自動化画像処理およびクローン回収の使用によってでさえも、複雑なライブラリの完全なスクリーニングは非現実的である。 Even the use of micro-colonies / plaques and automated image processing and clones recovered even complete screening of complex libraries impractical. 細胞表面および/またはファージディスプレイ技術ではディスプレイされる分子の構造的な限界がある。 The cell surface and / or phage display techniques have structural limitations of the molecule to be displayed. しばしばディスプレイされる分子のサイズおよび/または形状は、ディスプレイ技術によって制限される。 Often the size and / or shape of the molecule to be displayed is limited by the display technology. 最上のハイスループットスクリーニング法の1つである、成長選択法もまた、その有用性の範囲において制限される。 Is one of the uppermost high-throughput screening methods, growth selection method is also limited in the scope of its utility. アッセイ条件、温度およびpHは、宿主系の成長パラメータによって限られる。 Assay conditions, temperature and pH are limited by the growth parameters of the host system. 基質は細胞内酵素に提示されなければならないため、分子の相互作用はしばしば、宿主の細胞膜および/または細胞壁により抑制される。 Since the substrate must be presented to the intracellular enzymes, the interaction of the molecule is often inhibited by the host cell membrane and / or cell wall. さらに、「偽陽性」または高レベルの「バックグラウンド」は、多くの選択アッセイ法において共通に生じるものである。 Furthermore, "background" of the "false positive" or high level are those that occur in common in many selection assay. GSSMライブラリまたはジーンリアセンブリ(GeneReassembly)ライブラリにおける、改良した変異体についてのスクリーニングに関して、成長選択法はほとんど量的ではない。 In GSSM library or gene reassembly (GeneReassembly) library, with respect to screening for improved variants, growth selection method is of little quantitative.
【0246】 [0246]
本発明は、蛍光細胞選別(FACS)に関するスクリーニングプラットホームおよび使用法を提供する。 The present invention provides screening platform and uses for fluorescent cell sorting (FACS). FACS法においては、細胞は基質と混合され、その後、陽性分子イベントについてスクリーニングするために、検出器を通過して流される。 In FACS method, cells are mixed with the substrate, then, in order to screen for positive molecular events flowed past the detector. このシグナルは、酵素基質の分断または特異的な結合イベントから生じた蛍光シグナルが可能である。 This signal can be a fluorescent signal generated from the separated or specific binding event of an enzyme substrate. FACS機器を使用することの最大の利点は処理量である;1日当たり109クローンまでスクリーニングできる。 The biggest advantage of using a FACS machine is processing amount; be screened until 1 day 109 clone. あいにく、FACSに基づくスクリーニングにも、酵素および基質/産物の細胞壁の透過性、およびインキュベーション時間および温度を含む限界がある。 Unfortunately, even in the screening based on FACS, there are limitations include permeability of the cell wall of enzyme and substrate / product, and incubation times and temperatures. さらに、ソーティング後の宿主細胞の生存率および各個別の細胞についての単一データポイントへの依存性は、さらにそのような技術を制限する。 Furthermore, dependence on a single data point for survival and each individual cell of the host cells after sorting further limit such techniques.
【0247】 [0247]
キャピラリーアレイの開発により、これらの欠点の多くは克服される。 The development of capillary array, many of these disadvantages are overcome. マイクロタイターおよび固相スクリーニングのように、それは、天然タンパク質のコンホメーション(立体構造)が保持されていることを、クローン増幅においてシグナル強度が増大することと関連づけている。 As microtiter and solid phase screening, which, that conformation of the native protein (conformation) is maintained, the signal strength is associated with increasing the clonal amplification. しかし、処理量は選択的アッセイ法およびFACSに基づくアッセイ法のものに近づく。 However, throughput approaches that of selective assays and assays based on FACS. さらに、アレイプレートは再利用できるため、生み出されるプラスチックごみの量は著しく低減される。 Furthermore, since the array plate can be reused, the amount of plastic waste that is produced is significantly reduced. 96ウェル形式での1日当たり100,000ウェルのスクリーニングにおいては年間約24トンのプラスチックごみ(推定84 g/プレート×1000プレート/日×260 日/年)が生じる。 96 per day 100,000 well plastic waste annually about 24 tons in screening for well format (estimated 84 g / plate × 1000 plates / day × 260 days / year) occurs. さらに、機械的ハイスループットスクリーニング系における100,000ウェルの典型的なスクリーニングは、261,384ウェルマイクロタイタープレート、および、単一プレートを処理するための10分未満に対して24時間以上の準備時間を必要とする。 Furthermore, the mechanical high-throughput screening typical screening 100,000 wells of the system, 261,384-well microtiter plates, and preparation time of 24 hours or more with respect to less than 10 minutes to process a single plate It requires. この技術のプレート当たり100万ウェル密度までの増強は、マイクロタイターに基づくスクリーニングの利点を保つ一方で、選択的アッセイ法およびFACSに基づくアッセイ法の処理量に近づけることを意図する。 Enhancement of up to 1,000,000 wale density per plate of this technology, while keeping the benefits of screening based on a microtiter intended to approximate the throughput of selective assays and assays based on FACS.
【0248】 [0248]
第一世代のキャピラリーアレイプレートは、元来繊維光学業界のために発達した製造技術を用いて製造することができ、現在、SBS(生体分子スクリーニング学会(Society for Biomolecular Screening))の標準96ウェルマイクロタイタープレートのサイズである、3.3”×5”の再利用できるプレートに含まれる、100,000個の円筒形区画またはウェルからなる。 Capillary array plates of the first generation, originally can be manufactured by the techniques developed for fiber optical industry, currently, SBS standard 96-well micro (biomolecular screening Society (Society for Biomolecular Screening)) the size of the microtiter plate, included in the plate that can be reused for 3.3 "× 5", consisting of 100,000 cylindrical compartments or wells. これらのウェルは直径200μm(およそヒトの毛髪の直径)であり、単離されたクローンを成長およびスクリーニングできる、個別の250 nl容量の微小生息区としての役割を担う。 These wells have a diameter 200 [mu] m (diameter of approximately human hair), the isolated clones can be grown and screened, serves as a microhabitat ku separate 250 nl volume.
【0249】 [0249]
アレイスクリーニングに関わる過程は、マイクロタイタープレートスクリーニングのものにほぼ匹敵するが、必要とされる器械使用の著しい単純化、および必要とされるプレートの収容量および試薬コストにおける減少がなされている。 Processes involved in array screening is almost comparable to that of a microtiter plate screening, significant simplification of the instrumentation required, and the required reduction in storage capacity and reagents cost of plates which are have been made. 手短に言えば、プレートは、表面張力によってクローンおよび試薬(例えば蛍光基質、成長培地等)に満たされ、複雑なディスペンサー装置を必要とせずに、100,000ウェル全てを数秒内に同時に満たす。 Briefly, plates, clones and reagents (e.g. fluorescent substrate, the growth medium or the like) by surface tension filled, without requiring a complicated dispenser device, simultaneously satisfies all 100,000 well in a few seconds. ウェル当たりのクローン数、典型的には1〜10が、細胞培養の希釈によって調整される。 Clones per well, typically 1 to 10, is adjusted by dilution of the cell culture. 一旦満たされれば、プレートをその後、湿度を調整した環境において24〜48時間インキュベートし、クローンの増幅および酵素の代謝回転の両方を行わせる。 Once satisfied, then the plates, humidity and 24-48 hours incubation in the adjustment environment and to perform both the amplification and enzyme turnover clones.
【0250】 [0250]
加湿室におけるインキュベーション後、生体活性分子の発現を検出するために蛍光画像処理が使用される検出兼回収所に、プレートを移動する。 After incubation in a humidified chamber, the detection and recovery plant fluorescence imaging is used to detect the expression of bioactive molecule, to move the plate. 自動化した検出兼回収系は、画像機器および画像情報処理技術の使用によって、蛍光画像処理および精密動作制御技術を組み合わせる。 Automated detection and recovery systems, the use of imaging equipment and image processing technology, combining the fluorescent image processing and precision motion control technology. 像は広帯域光源(例えばハロゲン化金属アークランプ)からの光を、一連の蛍光励起フィルターを通してプレート上に集中させることによって生じる。 Image occurs by concentrating the light from the broadband light source (e.g., metal halide arc lamp), the plate through a series of fluorescence excitation filter. その結果生じる蛍光放出はフィルターにかけられ、その後遠隔中央レンズによって、エピフルオレッセント機器構成体における高解像力冷却CCDカメラ上に写し出される。 The resulting fluorescence emission being filtered, followed by remote central lens, is projected to a high resolution on a cooled CCD camera in the epi Fluorescent device structure. プレートをスキャンし、約1分以内に総計56の若干重複する像を生じさせる。 Plates scans, causing a slight overlapping images of total 56 within about 1 minute. 陽性ウェルまたは推定ヒットの検出および位置決めを行うために、像はデジタル化され、直ちに処理される。 To perform detection and positioning of the positive wells or estimated hit, the image is digitized and processed immediately. 推定ヒット(基質を蛍光産物に転換されたクローン)は、暗いバックグランド上の輝点として現れる。 Estimation hits (clone the substrate was converted to a fluorescent product) appears as bright spots on a dark background. それらは、形状、サイズ、および強度プロフィールのような様々な特徴の測定に基づき、バックグラウンド蛍光および外来シグナル(典型的には汚れおよびほこりによる)から区別される。 They shapes, sizes, and based on the measurement of various characteristics, such as strength profiles, is distinguished from background fluorescence and foreign signals (typically due to contamination and dust).
【0251】 [0251]
検出および位置決めがなされれば、アレイプレートから推定ヒットが回収され、確認および二次スクリーニングのために標準マイクロタイタープレートに移動される。 If made detection and positioning, the estimated hit from the array plate is collected and moved to a standard microtiter plates for confirmation and secondary screening. 回収過程は以下からなる;1)無菌回収針(典型的には、小規模表面に装着する電子構成要素を装着するために、接着剤のディスペンスのために一般に使用される標準鈍端ステンレス針)の装着段階および位置決め段階、2)回収針を推定ヒットを含むウェルに対し整列する段階、3)ウェルの内容物を針(上流の汚染および試料の遊離を避けるために0.22ミクロンのフィルターに付着された)に吸い取る段階、4)ウェルの内容物を、適した培地を含む標準マイクロタイタープレートに流す段階、および最後に5)次の回収に備えて回収針を取り除く段階。 Recovery process consists of the following: 1) a sterile collection needle (typically for mounting the electronic components to be mounted on small surfaces, standard blunt stainless needles commonly used for dispensing the adhesive) mounting step and positioning step of, 2) the step of aligning the collection needle to wells containing putative hit, 3) the contents of the wells needles (0.22 micron filter to avoid upstream of contamination and free samples step blotting in the deposited), 4) the contents of the wells, the step of passing the standard microtiter plates containing a suitable medium, and finally 5) the step of removing the collecting needle for the next collection. 像に基づくフィードバックを用いた閉じたループの位置決めは、隣接したウェルからの汚染なく各々のウェルを吸い取らせるのに必要な位置の正確さを提供する。 Positioning a closed loop using a feedback based on an image provides the accuracy of position required to absorbed contamination without each well from the adjacent wells. 最終的に、対象となるクローンを回収した後に、使用されたプレートを洗浄、消毒し、再利用に備える。 Finally, after recovering the clones of interest, the plate used cleaned, disinfected, ready for reuse. 本発明に従ったアレイプラットホームは、商品の発見および開発を加速し、かつ、さもなければ入手不可能な製品の開発を可能にする。 Array platform in accordance with the present invention is to accelerate the discovery and development of products, and otherwise enable the development of unavailable products.
【0252】 [0252]
本発明は蛍光細胞選別(FACS)を用いた使用のために構成される。 The present invention is configured for use with fluorescent cell sorting (FACS). FACS法においては、細胞は基質と混合され、その後陽性分子イベントのスクリーニングのために検出器を通過して流される。 In FACS method, cells are mixed with the substrate, then flowed through the detector to screen positive molecular events. このシグナルは、酵素基質の分断または特異的な結合イベントから生じた蛍光シグナルが可能である。 This signal can be a fluorescent signal generated from the separated or specific binding event of an enzyme substrate. FACS機器の使用の最大の利点は処理量である;1日当たり109クローンまでスクリーニングできる。 The greatest advantage of the use of FACS equipment is throughput; can be screened until 1 day 109 clone. あいにく、FACSに基づくスクリーニングにも、酵素および基質/産物の細胞壁の透過性、およびインキュベーション時間および温度を含む限界がある。 Unfortunately, even in the screening based on FACS, there are limitations include permeability of the cell wall of enzyme and substrate / product, and incubation times and temperatures. さらに、ソーティング後の宿主細胞の生存率および各個別の細胞についての単一データポイントへの依存性は、さらにそのような技術を制限する。 Furthermore, dependence on a single data point for survival and each individual cell of the host cells after sorting further limit such techniques.
【0253】 [0253]
ウェルの直径、プレートの厚さ(ウェルの深さ)、および材料の光学的特性は、新しい1,000,000ウェル密度のマトリクスの作製に先立って特定化される。 Diameter wells, the optical properties of the plate thickness (depth of the well), and materials are specialized prior to preparation of the matrix of new 1,000,000 wale density. 一旦これらのパラメータが特定化されれば、高密度のマトリクスが約1平方cmの長方形片に作製される。 Once it particularized these parameters, density matrix is ​​fabricated into rectangular pieces about 1 square cm. この過程は、100,000ウェルプレートを作製するために使用される同じ基礎的な製造技術への低リスクの改変を伴う。 This process involves the modification of low risk to the same basic fabrication techniques used to make 100,000 well plate. アレイ密度は以下の公式を用いて計算できる: Array density may be calculated using the following formula:
【0254】 [0254]
この計算は、標準の3.3”×5”マイクロタイタープレート形式において1,000,000ウェルを達成するためには、新しいウェルは25μmの隔壁を伴い約70μmの直径を有する必要があることを表す。 That this calculation, in order to achieve 1,000,000 wells in a standard 3.3 "× 5" microtiter plate format, new wells which should have a diameter of about 70μm with a 25μm partition wall represent. このサイズ/密度の構造体、およびより小さい(6μmまでに縮小)構造体は、増感CCDカメラのためのマイクロチャネルフェースプレート、X線シンチレーションプレート、光学的コリメーター、および単純流体フィルターを含む、非生物学的使用のために一般に製造される。 Structure of this size / density, and a smaller (reduced by 6 [mu] m) structure includes microchannel faceplate for intensified CCD camera, X-rays scintillation plate, optical collimator, and a simple fluid filter, generally manufactured for non-biological uses.
【0255】 [0255]
製造過程の性質により、ウェルの深さにはいくらかの限界がある。 Due to the nature of the manufacturing process, the depth of the well there is some limit. 現在の100,000ウェルプレートは深さ8 mmのウェルを有する。 Current 100,000 well plate has wells depth 8 mm. 同様のサイズの構造体を用いた本発明者らの経験に基づき、70μmのウェルの深さは5 mmから8 mmの間であると評価される。 Based on the present inventors' experience with structures of similar size, the depth of 70μm wells are evaluated to be between 8 mm from 5 mm. これにより、約25 nl〜30 nl、または200μm直径のウェルのものの約10分の1のウェル容量が生じる。 Thus, the resulting first well volume of about 10 minutes of those wells about 25 nl~30 nl or 200μm diameter. 気化率は、総容量よりもむしろ表面積に対する容量の割合の関数である。 Evaporation rate is a function of the ratio of capacity to the rather surface area than the total capacity. このため、より好都合な直径に対する長さ(表面積に対する容量)の比率によって、70μmのウェルが(より少なくない場合)200μmのウェルと同等の気化を経験することが予測される。 Therefore, the ratio of length to more favorable diameter (volume to the surface area), 70 [mu] m wells it is expected to experience the same vaporization and (more if not less) 200 [mu] m wells. 現在のところ、直径200μmのウェルについては気化は問題ではない。 Currently, vaporization for wells with a diameter of 200μm is not a problem.
【0256】 [0256]
照射効率、ウェルからウェルへの光学的クロストーク、表面処理効果、およびバックグラウンド蛍光を評価するために、試料は透明および不透明な材料の両方から構築される。 Irradiation efficiency, optical crosstalk to the wells from the well, the surface treatment effect, and in order to evaluate the background fluorescence, the sample is constructed from both the transparent and opaque materials. 現在の100,000ウェルプレートは不透明な材料を用いている。 Current 100,000 well plate uses a non-transparent material. 透明な材料の使用により、ウェルからウェルへの光学的クロストークの増加と引き換えに、蛍光励起収率が改善される。 The use of transparent material, to increase the exchange of optical crosstalk to the wells from the well, fluorescence excitation yield is improved. 適中率の低いアッセイ法については、検出感度を上げるのと引き換えに、透明な材料を使用する方が都合よい可能性がある。 The predictive value of a low assay, in exchange for increasing the detection sensitivity, better to use a transparent material is convenient possibilities. 本発明者らは、特定化および製造過程が2ヶ月間かかると見積もっている。 The present inventors have estimated that the specific and manufacturing process takes 2 months. マトリクスをキャピラリーアレイ機器に適応させるため、特殊なホルダー(容器)もまた製造される。 For the matrix adapted to the capillary array instrument, a special holder (container) is also produced. 一旦特定化されたマトリクスが製造されれば、それらは以下に詳細を述べる光学的および力学的特性の各々について試験される: Once been matrix produced specialized, they are tested for each of the optical and mechanical properties described in detail below:
【0257】 [0257]
バックグラウンド蛍光マトリクスが広範囲の励起波長について低いバックグラウンド蛍光を有することは、多様な基質の使用を可能にし、画像処理および加工の観点からは役立つが、決定的なことではない。 The background fluorescence matrix has a low background fluorescence for a wide range of excitation wavelengths allows the use of a variety of substrates, helps in terms of image processing and processing, not that critical. この要件を満たすために200μmプレートにおいて使用される材料を試験し選択した。 Tested materials used in 200μm plates were selected to meet this requirement. 透明および不透明な70μmのマトリクスの両方を作製するために異なる材料を使用しなければならないような、可能性の低いイベントにおいては、製造に先立ってその蛍光特性について試験する。 That must use different materials to produce both the transparent and opaque 70μm matrix, in the unlikely event are tested for their fluorescence properties prior to production. これらの試験は、励起波長の範囲における、参照基準に対する材料の蛍光の測定および比較によって行われる。 These tests in the range of excitation wavelengths is effected by measurement and comparison of the fluorescence of the material relative to the reference standard.
【0258】 [0258]
光効率一般に、100,000ウェルプレートは、概ね平行化された光線によってプレート表面を直接照射される。 The light efficiency generally, 100,000-well plates directly irradiated the plate surface by a generally collimated light beam. 光はウェルの周囲の壁面によって形成された開口を通って各ウェルに入射する。 Light is incident through the opening formed by the surrounding walls of the well to each well. 現在の照射系では、ウェルを隔てる壁面を通して付加的な励起エネルギーを伝送することにより、透明な材料は不透明な材料よりも照射が有利であることが予測される。 The current illumination system, by transmitting the additional excitation energy through the wall separating the wells, it is predicted irradiation is more advantageous than the transparent material is an opaque material. 1,000,000ウェル密度のマトリクスの光効率は、フルオレセイン溶液の検出可能な濃度を決定することにより評価される。 1,000,000 wale density matrix of light efficiency is evaluated by determining the detectable concentration of fluorescein solution. 典型的に、液相酵素探索アッセイ法では10〜100μMの濃度の蛍光基質を使用する。 Typically, the liquid phase enzyme search assay using a fluorescent substrate concentration 10~100MyuM. 現在の検出系では、200μmウェルにおいて約10 nMのフルオレセインを検出できる。 In the current detection system can detect fluorescein approximately 10 nM in 200μm well. 同等のLB(本発明者らの代表的な細胞成長培地)の蛍光では約25 nMである。 The fluorescence of equal LB (representative cell growth medium of the present inventors) is approximately 25 nM. 目的3において説明される機器の改良は、新しいマトリクスについて検出可能なレベルが10μM未満であるような、可能性の低い事象において必要とされ得る。 Improvement of apparatus described in the object 3, detectable levels for the new matrix such as less than 10 [mu] M, may be required in low event likely.
【0259】 [0259]
光学的クロストーク上記に説明されるように、透明な材料の使用が蛍光励起収率を改善し得る一方、その引き換えにウェルからウェルへの光学的クロストークの増加が生じる。 As explained optical crosstalk above, while the use of a transparent material may improve the fluorescence excitation yields, results increased optical cross talk from the exchange to the well to the well. この光学的クロストークは、1つのウェルからその隣接するウェルに漏れる蛍光放出によるものである。 The optical crosstalk is by fluorescence emission leaking from one well to the adjacent well. 蛍光団をマトリクス上にスポットし、その後、シグナル強度に対する蛍光団を満たしたウェルからの距離を測定することにより、これは容易に定量化される。 It was spotted fluorophore in a matrix, then, by measuring the distance from the well filled with fluorophore on signal strength, which is easily quantifiable. クロストークは、弱い陽性ウェルのシグナルを潜在的に隠し、その結果偽陰性となる、または偽陽性として検出される可能性がある。 Crosstalk hides signals for weakly positive wells potentially result becomes false negative, or may be detected as a false positive. 予測される適中率が低い適用(一般に環境ライブラリからの酵素の探索についての場合)においては、これが起こる可能性は一般に小さい。 In applications expected predictive value is low (generally in the case of the search of the enzyme from the environment library), which is generally less likely to occur. しかし、クロストークは自動的に推定ヒットの位置決めを行うために必要とされる画像情報処理を複雑化し得るため、評価を行わなければならない。 However, since cross-talk that may complicate the image processing that is required for positioning the estimated automatically hit, must be assessed.
【0260】 [0260]
表面張力/灯心(wicking)特性プレート表面をアッセイ溶液と接触するように配置することにより、プレートを満たす。 By arranging a surface tension / wick the (wicking) characteristics plate surface in contact with the assay solution, it satisfies the plate. 液体/プレート界面の表面張力は、アッセイ成分の全てのウェルへの引き出しまたは灯心を同時に引き起こす。 The surface tension of the liquid / plate interface causes the drawer or wick into all wells of assay components simultaneously. プレートの表面仕上げは、基質の灯心特性に重大な影響を及ぼす可能性がある。 The surface finish of the plate, there is a significant impact on the wick properties of the substrate. 表面研磨技法の中には、プレートのガラス面を疎水性にし、従って、プレート充填を妨げるか、またはかなり遅くすることが分かっているものもある。 Some surface polishing technique, the glass surface of the plate to hydrophobic, therefore, some are known to either prevent the plate packing, or rather slow. 最初に、現在100,000ウェルプレートに使用されている同じ表面仕上げが試験される。 First, the same surface finish currently being used for 100,000-well plate to be tested. 必要に応じて、様々な表面仕上げを有する基質を細胞/培地混合物と接触するように配置し、その灯心特性を、充填過程のタイミングを合わせ、充填の前後に基質を秤量することによって定量する。 If necessary, place the substrates with a different surface finish in contact with the cells / media mixture, the wick properties, timed filling process is quantified by weighing the substrate before and after filling. 利用可能な表面仕上げおよび表面処理を試験した後、プレート充填が依然として不適切である場合、充填を改善するために界面活性剤を添加してもよい。 After testing the available surface finishes and surface treatment, if the plate packing is still inadequate, the surfactant may be added to improve the filling.
【0261】 [0261]
洗浄および滅菌に対する抵抗性1,000,000ウェルプレートは再利用できることが望ましい。 Resistant 1,000,000 well plate for cleaning and sterilization, it is desirable to be reused. この要件を実証するために、複数の厳しい洗浄プロトコールおよび滅菌プロトコールにより基質を処理する。 To demonstrate this requirement, it processes a substrate by a plurality of stringent wash protocol and sterilization protocol. 現在、洗浄プロトコールおよび滅菌プロトコールには両方ともかなりの自由がある。 Currently, both the wash protocol and sterilization protocols have considerable freedom. 洗浄は、水、溶媒、および/または石けん中でのフラッシング、浸漬、および/または超音波処理の組み合わせから成ってもよい。 Washing, water, solvents, and / or flushing in soap, dipping, and / or it may be comprised of a combination of sonication. 同様に、滅菌は、使用される材料の本来備わっている耐久性のためにオートクレーブ、漂白、エタノール、および/または酸洗浄によって達成されてもよい。 Similarly, sterilization, autoclave for durability that are inherent in the material used, the bleaching may be effected by ethanol and / or acid cleaning. 清浄度は、複数の励起波長での材料の蛍光画像処理によって確認される。 Cleanliness is confirmed by fluorescence imaging of the material at multiple excitation wavelengths. 滅菌は、滅菌増殖培地を充填した基質の一晩インキュベーションを行い、その後、内容物を寒天上にプレーティングし、コロニー形成を探すことによって確認される。 Sterilization was carried out overnight incubation of the substrate filled with sterile growth medium, after which the contents were plated on agar, it is confirmed by looking for colony formation.
【0262】 [0262]
1,000,000ウェル密度基質について、検出系ハードウェアには最低限の変更しか必要とされない。 About 1,000,000 wale density matrix is ​​not required minimal changes in the detection system hardware. ウェルの大きさが小さいため、スクリーニングの成否(feasibility)を決定する適切なレベルまで倍率を調節するために、光学系に小さな変更を加える必要があり得る。 Since the size of the well is small, in order to adjust the magnification to an appropriate level for determining the success or failure of the screening (feasibility), it may be necessary to make minor changes in the optical system. 光学系は、自動ヒット回収を可能にするために、第II相で提案されたように、さらなる変更を必要とする可能性が高い。 Optics, in order to enable automatic hit collection, as proposed in phase II, is likely to require additional changes. 市販の2×増量剤を、現行の100,000ウェルプレートに使用されている既存のテレセントリック画像処理レンズに付け加えることができる。 Commercially available 2 × bulking agent, can be added to an existing telecentric imaging lens used in the current 100,000-well plate. この変更は、(カメラに対する)各ウェルの最終的な画像サイズを現行サイズの約70%にする。 This change is about 70% of the current size of the final image size of each well (relative to the camera). 本発明者らの経験に基づいて、これは、成否を決定するための陽性ウェルを視覚化するのに非常に適しているはずである。 Based on our experience, which should be very well suited for visualizing positive wells to determine the success or failure.
【0263】 [0263]
前記で述べたように、新たな基質の検出感度は、(特に、不透明な基質については)現行の検出系ハードウェアを使用する現行のプレートより低いと予想される。 As noted above, the detection sensitivity of the new substrates, (especially for an opaque substrate) is expected to be lower than the current plate using a current detection system hardware. 透明な基質の使用に加えて、高感度冷却CCDカメラ;レーザーベース照明または他の高出力密度光源;ならびにファスター(Faster)(おそらく、非テレセントリックの)画像処理光学系を含む、多数のハードウェアの強化が感度を著しく改善し得る。 In addition to the use of a transparent substrate, a high sensitive cooled CCD camera; laser-based lighting or other high power density light sources; and Faster (Faster) (presumably non-telecentric) including image processing optical system, a number of hardware reinforcement can significantly improve the sensitivity.
【0264】 [0264]
1,000,000ウェルプレートにより提供される処理量を十分に利用するためには、多数の独特のクローンを作成しなければならない。 To fully utilize the processing amount provided by the 1,000,000-well plates must create many unique clones. 1日当たり多数(107〜109個)のスクリーニング用クローンを調製する2つの代替法が、100,000ウェルプレートと共に使用することができる。 1 day number two alternative methods for preparing the screening clones (107-109 cells) can be used with 100,000 well plate. これらは両方とも1,000,000ウェル密度基質との使用のために試験され、以下で説明される。 These are both tested for use with 1,000,000 wale density substrates, are described below. ある作業では、アッセイ法開発および成否スクリーニングの両方に、蛍光基質としてレゾルフィン(Resorufin)β−D−ガラクトピラノシド(Molecular Probes #R−1159)および陽性β−ガラクトシダーゼ対照クローン(535−GL2)が使用される。 In some operations, both assays development and success screening, resorufin as a fluorescent substrate (Resorufin) β-D- galactopyranoside (Molecular Probes # R-1159) and positive β- galactosidase control clone (535-GL2) is used. この基質および陽性クローンは、100,000ウェルプラットフォームの開発間に十分に特徴付けられ、実証された。 The substrate and positive clones, well characterized among developing 100,000 wells platform was demonstrated.
【0265】 [0265]
方法1:酵素活性についてλファージライブラリーをスクリーニングする最初に、標準的な技法に従って適切な大腸菌宿主株の存在下で希釈液を軟寒天上にプレーティングすることによって、λに基づくベクターにクローニングされた遺伝子ライブラリーの力価が測定される。 Method 1: First screening a λ phage libraries for enzyme activity by plating dilutions on soft agar in the presence of a suitable E. coli host strain according to standard techniques, cloned into vectors based on λ the titer of the gene library is measured. この力価情報を用いて、適量のλライブラリーを宿主に吸着させる。 Using this titer information, to adsorb appropriate amounts of λ library into a host. 次いで、15分後、以下の特徴:[1]十分な増殖および有効な感染多重度の両方を可能にする宿主細胞の密度、[2]酵素活性を検出するための蛍光基質の最適濃度、ならびに[3] 1,000,000ウェル密度基質にロードされた場合に各ウェルが平均1〜4個のライブラリークローンを含むようなファージ粒子の密度、を有する最終懸濁液を生成するように、増殖培地および蛍光基質の混合物を添加する(最初の細かい点が解決されたらウェル1個当たり5〜10個のクローンの密度を試みる)。 Then, after 15 minutes, following characteristics: [1] the density of the host cell that allows both sufficient proliferation and effective multiplicity of infection, [2] The optimum concentration of fluorescent substrates for detecting enzyme activity, and [3] as 1,000,000 each well when loaded into the well density substrate to produce a final suspension having a density of phage particles that comprise an average 1-4 library clones, adding a mixture of growth media and fluorescent substrate (tries a density of 5-10 per well After point first fine is resolved clones). ライブラリークローンの平均播種密度(共存力価(concomitant titer))を調べるために、この懸濁液の試料を軟寒天上にプレーティングする。 To investigate the average seeding density (co titer (concomitant titer)) of the library clones are plated Samples of this suspension soft agar. 残りの懸濁液を使用して、基質のウェルにロードする。 Using the remaining suspension is loaded into the substrate well. 検出および回収の前にウェル内でバクテリオファージを溶菌増殖させるために、プレートを37℃で16〜24時間インキュベートする(光および蒸発による損失から保護する;以下のインキュベーションについての留意点を参照のこと)。 For lytic grow bacteriophage prior to detection and recovery in a well, protected from losses due to the plate to 16-24 h at 37 ° C. (light and evaporation; see Notes for the following incubation ).
【0266】 [0266]
方法2:酵素活性についてファージミドおよび他のコロニーに基づくライブラリーをスクリーニングするインビボ切除過程(Shortら、1988)を使用して、ファージミドライブラリーをバクテリオファージ親ライブラリーから作成する。 Method 2: In vivo excision process of screening a library-based phagemid and the other colonies for enzymatic activity (Short et al., 1988) is used to create a phagemid library from bacteriophage parent library. 最初の力価測定の後、これらのライブラリーを使用して、適切な大腸菌宿主株に感染させる。 After the first titration, with these libraries, to infect suitable E. coli host strain. 15分の吸着期間の後、細胞に少量の培地を加え、ファージミドに存在する抗生物質耐性遺伝子を発現させるために抗生物質選択なしで30℃で45分間増殖させる。 After the adsorption period 15 minutes, a small amount of medium is added to the cells are grown for 45 minutes at 30 ° C. without antibiotic selection in order to express the antibiotic resistance gene present in the phagemid. 次いで、懸濁液を、抗生物質を含む固形プレート上にプレーティングし、30℃で一晩増殖させる。 The suspension is then plated on solid plates containing antibiotics, and grown overnight at 30 ° C.. 結果として生じた抗生物質耐性コロニーから増幅クローンを収集して、プールされた懸濁液に入れる。 The resulting collects amplified clones from antibiotic resistant colonies are placed in a pooled suspension. 次いで、高密度基質にロードするために使用する(前記の[2]および[3]に似た特徴を有する)最終懸濁液を生成するように、抗生物質、蛍光基質、および増殖培地の混合物を添加する。 Then, a high-density substrate is used to load the (with characteristics similar to the above [2] and [3]) to produce a final suspension, antibiotics, fluorescent substrate, and a mixture of growth medium It is added. ライブラリークローンの平均播種密度(共存力価)を調べるために、この懸濁液の試料もまた抗生物質を含む固形寒天プレート上にプレーティングする。 To investigate the average seeding density of library clones (coexistence titer), a sample of the suspension is also plated on solid agar plates containing antibiotic. 次いで、検出および回収の前にウェル内でファージミド含有宿主細胞が増殖するように、基質を30〜37℃で1〜2日間インキュベートする(光および蒸発による損失から保護する;以下のインキュベーションについての留意点を参照のこと)。 Then, detection and as phagemid containing host cells in the well prior to collection to grow, the substrate is incubated at 30 to 37 ° C. 1 to 2 days (to protect against loss by light and evaporation; note of the following incubation that the point of reference).
【0267】 [0267]
他のベクター(例えば、コスミド、フォスミド、PAC、YAC、BACなど)に作成されたライブラリーもまたこのプラットフォームを用いてスクリーニングされる。 Other vectors (e.g., cosmids, fosmid, PAC, YAC, etc. BAC) library was created is also screened using this platform. 特定のライブラリーベクターをこの技術に適応させる場合、増殖の必要条件、形質転換の形式、および形質転換の効率などの要因を考慮しなければならない。 If adapt a particular library vector in this technology, the requirements of the growth must be considered such factors as efficiency of format transformation, and transformation. 様々なライブラリーおよびベクタータイプの使用により、新規の酵素に加えて低分子およびタンパク質治療薬のスクリーニングが可能になる。 The use of various libraries and vectors type, comprising in addition to the new enzyme to allow screening of small molecule and protein therapeutics.
【0268】 [0268]
アレイプレートは、一般的に、加湿インキュベーター内で90%相対湿度で24〜48時間インキュベートされる。 Array plate is generally incubated for 24-48 hours at 90% relative humidity in a humidified incubator. プレートは積み重ね可能であり、各プレートが上下のプレートによって湿度および温度が安定した環境に閉じ込められるように設計される。 Plates are stackable, each plate humidity and temperature are designed to be trapped in a stable environment by the upper and lower plates. 端のプレートを密封するために、それぞれの積み重なりの上部および下部に、蓋または水を充填した余分なプレートを使用する。 To seal the plate edge, the top and bottom of each pile, using extra plates filled with lid or water. インキュベーション過程は、細胞増殖、蒸発、および凝結の実証を必要とする。 Incubation process, cell growth, and requires evaporation, and the demonstration of condensation.
【0269】 [0269]
酵素スクリーニング宿主として使用される大腸菌の増殖は、100,000ウェルアレイプレートにおいてはっきりと証明されている。 Growth of E. coli is used as the enzyme screening hosts are clearly demonstrated in 100,000 wells array plate. ストレプトミセス、哺乳動物(ジャーカットヒト白血病T細胞)、およびλファージを含む他のタイプの細胞もまた、この形式で増殖することが示されている。 Streptomyces, mammalian (Jurkat human leukemia T cells), and other types of cells, including λ phage have also been shown to grow in this format.
【0270】 [0270]
1,000,000ウェル密度基質における細胞増殖は、100,000ウェルプレートで用いられる同じ手順によって確認される。 Cell proliferation in 1,000,000 wale density substrates is confirmed by the same procedure used in 100,000 wells plates. (1〜10コロニー/ウェルに希釈された)初回細胞溶液をプレーティングすることにより形成されたコロニーの数が、インキュベーション後の基質から吸引された同量の培養物と比較される。 The number of colonies formed by plating (diluted 1 to 10 colonies / well) Initial cell solution is compared with the same amount of the culture that is drawn from the substrate after incubation. 細胞増殖の困難は予想されないが、これらの困難を緩和する代替法がある。 The difficulties of cell growth is not expected, there are alternative methods to alleviate these difficulties. 1,000,000ウェル密度基質の表面積:体積比は、アッセイ溶液への酸素拡散には100,000ウェル形式の比より好ましくない。 The surface area of ​​1,000,000 wale density Substrate: volume ratio is not preferable from the ratio of 100,000 well format to oxygen diffusion into the assay solution. 酸素拡散が細胞増殖を制限しているように見える場合、本発明者らは酸素供給を増大させる方法を評価する。 If the oxygen diffusion appears to limit cell growth, we evaluate a method of increasing the oxygen supply. 予備実験では、変動磁場における常磁性ビーズを用いた、および音パルスでの攪拌による200μm直径ウェル内での流体混合が首尾よく証明されている。 In preliminary experiments, using paramagnetic beads in varying magnetic field, and by agitation of the sound pulse is fluid mixing within 200μm diameter wells have been successfully demonstrated. 磁気混合は、100,000ウェル形式におけるストレプトミセス属の増殖をかなり改善することが示されている。 Magnetic mixing has been shown to significantly improve the growth of Streptomyces in 100,000-well format.
【0271】 [0271]
必要に応じて、酸素拡散および細胞増殖を改善するために、これらの混合法を使用することができる。 If necessary, in order to improve the oxygen diffusion and cell proliferation can be used a mixture of these methods. 他の方法として、プレート充填前のアッセイ溶液の酸素飽和、高酸素環境でのインキュベーション、および徐放酸素発生化合物(例えば、過炭酸ナトリウム)の添加が挙げられる。 Alternatively, the plate filling the oxygen saturation of the previous assay solution, incubation at high oxygen environment, and sustained release oxygen generating compounds (e.g., sodium percarbonate) addition of the like.
【0272】 [0272]
約30nlの総アッセイ量では、1,000,000ウェルプレートからの蒸発の管理が重要である。 The total assay volume of about 30 nl, is critical control of the evaporation from 1,000,000 well plate. しかしながら、前記で述べたように、表面:体積比は蒸発の最小化に有利である。 However, as noted above, surface: volume ratio is advantageous to minimize evaporation. 100,000ウェルプレートで行われた蒸発実験から、培地体積が24時間にわたって10%損失することが分かっている。 From the evaporation experiments conducted at 100,000-well plate, the medium volume is found to 10% loss over 24 hours. この損失は、10%グリセロール添加によって5%まで減少する。 This loss is reduced to 5% with 10% glycerol added. 1,000,000ウェルプレートの表面積:体積比は、(好ましくないが)100,000ウェルプレートの比とほぼ同じであるので、高密度基質における蒸発は、プレートに一般的なアッセイ培地を充填し、96時間にわたっていくつかの時点でプレートを秤量することにより測定される。 1,000,000 well plate surface area: volume ratio, because (not preferred) is substantially the same as the ratio of 100,000-well plate, evaporated in a high density substrate, filling a typical assay medium to the plate It is measured by weighing the plate at some point over 96 hours. より厳密な蒸発管理が必要とされる場合、グリセロールを添加してもよい。 If more stringent vaporization administration is required, it may be added glycerol.
【0273】 [0273]
基質表面に及ぼす凝結/水分の影響もまた考慮される。 Influence of condensation / moisture on the substrate surface are also taken into account. 基質は高湿度環境でインキュベートされるので、充填後に残っているか、またはインキュベーション間に凝結する基質外面上の小滴は蒸発しない可能性があり、ウェル間の相互汚染を引き起こす可能性がある。 Since the substrate is incubated in a high humidity environment, a droplet on the substrate outer surface that condenses between either remaining after filling, or incubation may not evaporate, it may cause cross contamination between wells. これらの小滴は、真の陽性に隣接するウェルでの偽陽性の検出につながり、ならびに弱い陽性を不明瞭にする、しみのような外観をプレート表面上にもたらす可能性がある。 These droplets can lead to detection of false positives in the well adjacent to true positive, and obscures the weakly positive, can result in the appearance such as spots on the plate surface. 100,000ウェルプレートに充填した後に残っている表面小滴に関するこのような問題は、表面水分が全て蒸発するまでプレートを室温で放置することによって回避される。 Such issues surface droplets remaining after filling into 100,000 well plates, surface moisture is avoided by leaving the plate to be completely evaporated at room temperature. インキュベーション間の凝結の回避は、温度および湿度の厳密な管理を用いることによって達成される。 Avoiding condensation between the incubation is accomplished by the use of strict management of temperature and humidity. この問題は、充填されたプレートを、低い湿度から始めて、プレートがチャンバー温度まで温まった後にだけ所望のインキュベーション湿度に上げる設定可能な加湿チャンバーに配置することによって対処される。 This problem, the filled plate, starting from a low humidity, the plate is addressed by placing the settable humidified chamber to raise the desired incubation humidity only after warmed up chamber temperature. 温まったら、積み重ねられたプレートは、チャンバー内の小さな温度変動に影響されない比較的安定した熱塊を形成する。 When warm, the stacked plates to form a relatively stable thermal mass that is not affected by small temperature variations in the chamber. 表面水分管理の問題は、より高い密度のプレートでも同様である。 Surface moisture management problem is the same in the higher density plates. これらの方法が表面水分を首尾よく管理するかどうかを確かめるために基質が試験される。 Substrate is tested to these methods ascertain whether managing successfully surface moisture.
【0274】 [0274]
規定された頻度で陽性β−galクローンが混入された陰性ライブラリーが成否スクリーニングの最初の対象である。 Negative library positive beta-gal clones defined frequency is mixed is the first object of the success or failure screening. 比較のために従来のマイクロタイター形式において同じスクリーニングが同時に行われる。 The same screening is carried out simultaneously in conventional microtiter form for comparison. これが証明されたら、スクリーニングは、(再度、マイクロタイター形式と同時に)陽性クローンを含むことが分かっているライブラリーに進む。 After this is proved, screening, (again, microtiter format at the same time), the process goes to the library known to contain positive clones. この目的のために、100,000ウェルプラットフォーム開発間に混合集団ライブラリーが実証された。 For this purpose, mixed population libraries was demonstrated between 100,000 wells platform development. この混合集団ライブラリーは1,000,000ウェル成否スクリーニングに使用される。 The mixed population library used 1,000,000 wells success screening. クローン増幅速度、従って、シグナル強度がバクテリオファージアッセイ法と全細胞アッセイ法の間で異なる可能性があるので、これらの実験はλに基づくライブラリースクリーニングおよびファージミドに基づくライブラリースクリーニングの両方に対して行われる。 Clonal amplification rate, therefore, since signal intensity may differ between the bacteriophage assay and whole cell assay, these experiments for both library screening based on library screening and phagemids based on λ It takes place.
【0275】 [0275]
成否スクリーニングの実証は、1,000,000ウェル基質の蛍光イメージにおける陽性ウェルの数と、同一のアッセイ溶液で充填された100,000ウェルアレイプレートの蛍光イメージにおける陽性ウェルの数を単に比較することにより行うことができる。 Demonstration of success screening, simply compares the number of positive wells in fluorescent image of 1,000,000 wells substrate, the number of positive wells in fluorescent images of 100,000 well array plate filled with the same assay solution it can be carried out by.
【0276】 [0276]
さらなる確認が標準的なマイクロタイター形式において行われる。 Further confirmation is performed in a standard microtiter format. 陽性ウェルの数は、初回アッセイ溶液における陽性クローンの濃度およびウェル体積の関数である。 The number of positive wells is a function of the concentration and the well volume of positive clones in the first assay solution. 1,000,000ウェル基質のウェル体積が100,000ウェルプレートの約1/10であるので、同じ初回アッセイ溶液を充填した場合、陽性ウェルの予想数もまた約1/10になるはずである。 Since the well volume of 1,000,000 well substrate is about 1/10 of the 100,000-well plate, when filled with the same initial assay solutions should be expected number also about one tenth of the positive wells .
【0277】 [0277]
キャピラリーアレイはマイクロタイタープレートの設置面積に合うように並べることができ、設置面積の一標準は3.3”×5”の設置面積である。 Capillary array can be arranged to match the footprint of a microtiter plate, one standard footprint is footprint of 3.3 "× 5". この設置面積内で、1,000,000までの、またはそれ以上のキャピラリーまたはウェルをアレイに設けることができる。 Within this footprint can be provided up to 1,000,000, or more capillaries or wells in an array. 生物の混合集団からの遺伝子ライブラリーを新規の酵素活性についてスクリーニングする1,000,000ウェルプラットフォームにより、標準的なマイクロタイタープレートの3.3”×5”設置面積における超ハイスループットスクリーニングプラットフォームが得られる。 The 1,000,000-well platform for screening a gene library from a mixed population of organisms for new enzymatic activity, resulting ultra high throughput screening platform for 3.3 "× 5" footprint of a standard microtiter plate It is. この形式において、各ウェルは、250nl入る直径200μmのキャピラリーを備える。 In this format, each well is provided with a capillary of 250nl entering diameter 200 [mu] m. このアレイプラットフォームは遺伝子および遺伝子経路の迅速なスクリーニングを可能にし、産物(例えば、新規の酵素、タンパク質治療薬、化合物、および低分子薬物)に対する発見および遺伝子最適化プログラムの生産性を高める。 The array platform allows for rapid screening of the gene and gene pathways, products (e.g., novel enzymes, protein therapeutics, compounds, and small molecule drugs) enhance the productivity of the discovery and genetic optimization program for. このアレイプラットフォームを用いて、様々な触媒クラス(例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、第2アミダーゼ(secondary amidase))の任意の数の新規酵素を発見することができる。 Using this array platform, various catalysts classes (e.g., amylase, protease, second amidase (secondary amidase)) can be found any number of new enzymes. 同じ特許権を有する費用対効果の大きい100,000ウェルプレート製造過程を使用して、より小さな非生物学的用途の1,000,000ウェルプレートを製造することができる。 Use large 100,000-well plate manufacturing process cost effective with the same patent, it is possible to manufacture a 1,000,000-well plates small non-biological applications.
【0278】 [0278]
アレイスクリーニングプラットフォームは、新たな産物を発見するためにスクリーニングすることができる分子多様性の量を大いに増やす。 Array screening platform, greatly increasing the amount of molecular diversity that can be screened to discover new products. 1平方センチメートル当たり12,000を超えるウェルを使用する1,000,000ウェルプレートを用いれば、標準的な液相蛍光アッセイ法を用いて1日当たり10億を超えるクローンをスクリーニングすると同時に、生物学的試料の大規模並列分配および読み取りによって装置およびオペレータの時間を減らすことができる。 Using the 1,000,000-well plate using a well in excess of 1 per square centimeter 12,000, and at the same time clones screened more than 1 day 1000000000 using standard liquid phase fluorescence assay, the biological sample it is possible to reduce the time of the apparatus and the operator by massively parallel distributed and read. さらに、(ウェルがそれぞれヒト毛髪の直径の約半分である)1,000,000ウェルプレートは再利用可能であり、極めてわずかな量の試薬しか必要としない。 Moreover, (the well is about half the diameter of a human hair, respectively) 1,000,000 well plates are reusable, requiring only a very small amount of reagent. このために、1,000,000ウェルプレートは非常に費用対効果が大きく、環境上の義務を果たし得る。 Therefore, 1,000,000 well plate is very large cost-effective, may play a duty on the environment.
【0279】 [0279]
マイクロタイタープレート設置面積当たり100,000ウェルから1,000,000ウェルへの液相スクリーニング密度の増加は10倍の密度増加に相当し、これは、進化技術によって作成された非常に多数の抗体およびタンパク質変種の迅速なスクリーニングを必要とする市販用製品(例えば、抗体およびタンパク質治療薬プログラム)の発見および開発の促進に寄与する。 Increase in the liquid phase screening density from the microtiter plate footprint per 100,000 wells to 1,000,000 wells corresponds to a density increase of 10 times, this is a very large number of antibodies made by evolution techniques and commercial products that require rapid screening of protein variants (e.g., antibody and protein therapeutics program) contribute to the promotion of the discovery and development of. 本発明は、マイクロタイタープレート標準サイズのアレイに拡張することができる過程を用いた1,000,000ウェル/プレート密度(すなわち、12,000ウェル/cm )を有する1平方cm基質の設計および組み立てを含む。 The present invention is 1,000,000 wells / plate density using a process which can be extended to an array of microtiter plate standard size (i.e., 12,000 wells / cm 2) 1 square cm substrate designs with and including the assembly.
【0280】 [0280]
1,000,000ウェル形式における新規の液相ニトリラーゼアッセイ法、ならびにキラル治療化合物の化学中間体の製造に使用するキラルニトリラーゼについての生物の混合集団からの遺伝子ライブラリーのスクリーニングを開発するために、前記のプラットフォームを使用することができる。 To develop novel liquid phase nitrilase assays, as well as screening of the gene libraries from organisms mixed population of about chiral nitrilase used in the production of chemical intermediates chiral therapeutic compound in 1,000,000 well format, it can be used the platform.
【0281】 [0281]
裸のバイオパニング(naked biopanning)は、環境ゲノムDNAからの遺伝子または遺伝子クラスターの直接的なスクリーニングまたは濃縮を伴う。 Naked biopanning (naked biopanning) involves the direct screening or enrichment of a gene or gene cluster from the environment genomic DNA. 所望のゲノムDNAの濃縮または単離は、任意のクローニング、遺伝子特異的PCR、または毒性もしくは他の問題のために下流処理および下流用途に影響を及ぼす不要な偏りを導入する可能性のある他の任意の手順の前に行われる。 Concentration or isolation of the desired genomic DNA, any cloning, gene-specific PCR or toxicity or other potentially other introducing unwanted bias affect downstream processing and downstream applications due to problems, It is performed prior to any procedure. このタイプの配列に基づく発見のために、いくつかの方法を説明することができる。 For discovery based on the sequence of this type, several methods can be described. これらの方法は、一般的に、標的配列と部分的または完全に相同な1種類またはそれ以上の種類の核酸プローブの使用と、固相支持体へのプローブ標的複合体の結合を含む。 These methods generally include the binding of the target sequence and partial or the use of completely homologous one or more types of nucleic acid probes, probe-target complexes to the solid support. プローブはポリヌクレオチドでも修飾核酸(例えば、ペプチド核酸(PNA))でもよく、標的DNA捕獲において他の容易にする要素(例えば、タンパク質またはさらなる核酸)と共に使用されてもよい。 Probes modified nucleic acid in a polynucleotide (e.g., peptide nucleic acids (PNA)) may also, elements that other readily in the target DNA capture (e.g., a protein or further nucleic acid) may be used together with. 下流用途に十分な収量を確かなものにするために、配列の偏りを導入しない増幅段階を使用することができる。 To a sufficient yield to ensure its downstream applications, it can be used amplification step without introducing bias in sequence.
【0282】 [0282]
裸のバイオパニングアプローチの一例は、対象となる標的ゲノムDNAへのRecAタンパク質および相補鎖安定化Dループ(complement−stabilized D−loop)(csDループ)構造(JayasenaおよびJohnston、1993;SenaおよびZarling、1993)の使用において見つけることができる。 An example of a bare biopanning approach is, RecA protein and the complementary strand stabilization D loop to the target genomic DNA of interest (complement-stabilized D-loop) (csD loop) structures (Jayasena and Johnston, 1993; Sena and Zarling, can be found in the use of 1993). これは標的DNAの完全な変性を必要とせず、従って、大きなゲノムフラグメントを捕獲しようとしている場合、特に関心があるものである。 This does not require a complete denaturation of the target DNA, therefore, if you are trying to capture the large genomic fragments, are of particular interest. 以下の方法は、内部標的配列を含むゲノムDNAを捕獲するのに用いられる安定構造であるcsDループ形成を利用するために、ClonCapture(商標)cDNA選択法(CLONTECH Laboratories,Inc.)を若干変更を加えて取り入れている。 The following methods, in order to use the csD loop forming a stable structure which is used to capture the genomic DNA containing an internal target sequence, ClonCapture (TM) cDNA selection method (CLONTECH Laboratories, Inc.) A slightly changed in addition, it is incorporating.
【0283】 [0283]
機械的剪断または制限消化を用いて、環境ゲノムDNAをフラグメントに切断する(フラグメントサイズは、標的のタイプおよび前濃縮ライブラリーを作成するのであれば所望の下流インサートサイズによって決まる)。 Using mechanical shearing or restriction digestion, it cuts the environmental genomic DNA fragment (fragment size is determined by the desired downstream insert size as long as to create a type and pre-enriched library of the target). フラグメントを所望の長さに従ってサイズ選択し、精製する。 The fragment size selected according to the desired length, purified. 標的内の保存領域の既存の知識に基づいて、ビオチン化dsDNAプローブを陽性クローンからのPCRまたは合成手段によって作成する。 Based on the existing knowledge of conserved regions in the target, the biotinylated dsDNA probe made by PCR or synthetic means from the positive clones. プローブの内部をビオチン標識してもよく(例えば、ビオチン21−dCTPの取り込み)、プローブの末端をビオチン標識してもよい。 The interior of the probe may be biotin-labeled (e.g., incorporation of biotin-21-dCTP), the end of the probe may be biotin-labeled. 取り込まれなかったビオチンを全て除去するために、プローブは精製しなければならない。 To remove any unincorporated biotin probe must be purified. プローブを熱変性し(5分、95℃)、直ちに氷上に置く。 The probe was heat denatured (5 min, 95 ° C.), immediately placed on ice. 次いで、変性プローブと、RecAならびにATPおよび非加水分解類似体を含むATPミックスを反応させる(15分、37℃)。 Then, a modified probe, reacting ATP mix containing RecA and ATP and non-hydrolyzable analogs (15 min, 37 ° C.). 標的DNAを添加し、csDループ構造を形成するようにRecA/ビオチン化プローブヌクレオフィラメントとインキュベートさせる(20分、37℃)。 Was added target DNA, it is incubated with RecA / biotinylated probe nucleosome filaments to form a csD loop structure (20 min, 37 ° C.). 次いで、プロテイナーゼKおよびSDSでの処理によってRecAを除去する。 Then removed RecA by treatment with proteinase K and SDS. PMSFでプロテイナーゼKを失活させた後、洗浄および(超音波処理サケ精子DNAで)ブロックされたストレプトアビジン常磁性ビーズを反応物に移し、csDループ複合体を支持体に結合させるようにインキュベートする(室温で30分間回転させる)。 After proteinase K was inactivated by PMSF, transferred washing and (sonicated salmon sperm DNA) blocked streptavidin paramagnetic beads to the reaction and incubated to couple csD loop complex to the support (rotated 30 minutes at room temperature). 非結合DNAを除去し、別のプローブ用の標的として使用するために取っておいてもよい。 Unbound DNA was removed, it can be set aside for use as a target for another probe. ビーズを十分に洗浄し、アルカリ緩衝液を用いて濃縮集団を溶出させ、取り出す。 The beads were washed thoroughly and was eluted with enriched population with an alkaline buffer, it is taken out. 次いで、濃縮DNAはエタノール沈殿され、連結および前濃縮ライブラリー作成に使用することができる。 Then, concentrated DNA is ethanol precipitated, can be used for connecting and create preconcentration library.
【0284】 [0284]
ゲノムDNAの捕獲のために、RecA/csDループ構造の代わりに他の安定複合体を使用してもよい。 For capture of genomic DNA, it may use other stable complex in place of RecA / CSD loop structure. 例えば、PNAは、プローブをdsDNAに挿入させる「オープナー」として使用してもよく(Bukanovら、1998)、それ自身直列プローブ(tandem probe)として使用してもよい(Lohse、1999)。 For example, PNA may be used as a "opener" to insert the probe into dsDNA (Bukanov et al., 1998), may be used as its own series probe (tandem probe) (Lohse, 1999). 前者の場合、PNAは、互いに極めて近い距離にあるホモプリンの2本の短い道(short track)に結合する。 In the former case, PNA binds to two short road homopurine (short track) in very close distance from each other. これらはP−ループ構造を形成し、非結合鎖を移動させ、プローブによる結合に可能なようにする。 They form a P- loop structure, it moves the unbound strand, to allow the binding by the probe. 次いで、固相を伴うアフィニティ捕獲法を用いて標的を捕獲するために、プローブを使用することができる。 Then, in order to capture the target with an affinity capture method with solid phase can be used a probe. 同様に、安定複合体を形成し、標的回収を可能にする「二重重複逆位(double−duplex invasion)」において、PNAを使用することができる。 Similarly, to form a stable complex allows for target recovery in "dual overlapping inversions (double-duplex invasion)", it can be used PNA.
【0285】 [0285]
環境ゲノムDNAからの標的の回収において、DNAフラグメントの完全な変性を伴う、より簡単な方法を使用することができる。 In the recovery of the target from the environment genomic DNA, with complete denaturation of DNA fragments can be used a simpler way. 機械的剪断または制限酵素の使用によってゲノムDNAを所望の長さのフラグメントに切断した後、直接的なハイブリダイゼーションアフィニティ捕獲法を用いて標的DNAを固相に結合させることができる。 After genomic DNA was cleaved into fragments of desired length by the use of mechanical shear or restriction enzymes can be bound to the target DNA to a solid phase using a direct hybridization affinity capture method. 核酸プローブをガラススライド、常磁性ビーズ、またはカラムに含まれる任意のタイプの基質のような固相に共有結合させ、変性した標的DNAをそれにハイブリダイズさせる。 The nucleic acid probes of glass slides, paramagnetic beads or covalently bound to a solid phase, such as any type of substrate included in the column, the modified target DNA is hybridized to it. 非結合画分を収集し、より完全な回収を確実なものにするために同じプローブに再度ハイブリダイズさせてもよく、カスケードシナリオ(scenario)の一部として異なるプローブの宿主に再度ハイブリダイズさせてもよく、環境ゲノムDNAの集団は、多数の異なる遺伝子または遺伝子クラスターに後で選り分けられる。 Collect non-bound fraction may be the same probe hybridized again In order to ensure a more complete recovery, and hybridized again host different probes as part of a cascade scenario (scenario) At best, the population of environmental genomic DNA is panned later to many different genes or gene clusters.
【0286】 [0286]
(ゲノムDNAの切断に用いられる方法に応じて)付着末端連結または平滑末端連結を用いて、制限部位および共通プライマー用の部位を含むリンカーをゲノムフラグメントの末端に付加することができる。 (Depending on the method used to cut genomic DNA) using a sticky end ligation or blunt end ligation, a linker containing a site for restriction sites and the common primer can be added to the ends of the genomic fragment. これらのリンカーによって、サイズ選択された挿入フラグメント集団を有意な配列の偏りなくPCRで増幅することができる。 These linkers can amplify the inserted fragment populations selected size without bias PCR of significant sequence. 従って、単離または濃縮の前記の技法のいずれかを使用した後に、下流処理に適した回収を確実にするのに役立つかもしれない。 Therefore, after using any of the techniques of isolation or enrichment, it may help to ensure recovery suitable for downstream processing. さらに、回収された集団は、どんな時でも、切断および適切なベクターへの連結ならびに配列決定用のプライミング部位の含有に使用することができる。 Furthermore, the recovered population at any given time, can be used for containing the priming sites for linking and sequencing of cutting and into a suitable vector.
【0287】 [0287]
前記の方法の変形は、ポリヌクレオチドタグのコンビナトリアル合成からのタグ(Brennerら、1999)を、ゲノムフラグメントの末端に結合されるリンカー内に含めることを含む。 Deformation of the method, the tag (Brenner et al., 1999) from the combinatorial synthesis of a polynucleotide tag includes a included within a linker which is bonded to the terminal of genomic fragments. これにより、出発集団内の各フラグメントが固有のタグを有することが可能になる。 Thus, each fragment in the starting population is possible to have a unique tag. 従って、これらの固有にタグ化されたフラグメントはどれも、共通プライマーを用いて増幅されると多数のインビトロクローンを生じ、次いで、これらのインビトロクローンは何百万ものコピーの相補的共有結合アンチタグを含む常磁性ビーズに結合される。 Therefore, none have been fragments tagged to these specific, occur a number of in vitro cloning the amplified using the common primers, then the complementary covalent antitag of these in vitro clone also copy millions It is coupled to a paramagnetic bead comprising. その後、蛍光標識された標的特異的プローブを標的含有ビーズにハイブリダイズさせることができる。 Then, the target-specific probe fluorescently labeled can be hybridized to a target containing beads. ビーズはFACSを用いて選別することができる。 Beads can be sorted using a FACS. ここで、陽性であったものを直接ビーズから配列決定してもよく、インサートを切り出し、さらなる処理のために所望のベクターに連結してもよい。 Here, it may be sequenced directly from the beads as were positive, cut the insert may be ligated to the desired vector for further processing. 陰性集団を他のプローブとハイブリダイズさせ、前記のカスケードシナリオの一部として再選別してもよい。 The negative population hybridized with other probe may be re-screened as part of the cascade scenario.
【0288】 [0288]
トランスポゾン技術は、毒性遺伝子の発現から生じる偏りを避けるトランスポソーム(GoryshinおよびReznikoff、1998)を用いて環境ゲノムDNAを宿主ゲノムに挿入することができる。 Transposon technology can environmental genomic DNA inserted into the host genome using the transposon inflammasome (Goryshin and Reznikoff, 1998) to avoid bias resulting from expression of the toxic gene. 次いで宿主細胞を培養し、発見、単離、および下流の過程のためにより多くのコピーの標的DNAを得る。 Then culturing the host cell to obtain discovery, isolation, and many copies of target DNA by for downstream processes.
【0289】 [0289]
さらなる説明がなくとも、前記の説明を用いて当業者は本発明を完全に利用することができると考えられる。 Without further description, those skilled in the art using the description is considered to be able to fully utilize the present invention. 以下の実施例は例示であるとみなされ、従って、本開示の以降はどのようにも制限されない。 The following examples be considered as illustrative, and therefore, since the present disclosure is not limited in any way.
【0290】 [0290]
実施例1 Example 1
DNA の単離及びライブラリーの構築 Construction of isolation and library of DNA
以下に、生物の混合集団に由来する遺伝子ライブラリーを作製するために用いた方法を概説する。 The following outlines the method used to prepare a gene library derived from a mixed population of organisms.
【0291】 [0291]
DNA の単離 DNAは、製造者の使用説明書によりイソクイック法(IsoQuick Procedure)(Orca, Reserch Inc. Bothell, WA)を用いて単離する。 The isolated DNA of DNA, iso quick method by using the manufacturer's instructions (IsoQuick Procedure) (Orca, Reserch Inc. Bothell, WA) isolated using. DNAは下記の実施例2によって標準化してもよい。 DNA may be standardized by Example 2 below. 単離の際、DNAは25Gのダブル−ハブニードル(25G double−hub needle)と1−ccのシリンジにより、DNAを約500回押し出したり、吸引することによって分けられる。 Upon isolation, DNA is double 25G - with a hub needle (25G double-hub needle) and 1-cc syringe, or extrusion of DNA about 500 times, divided by aspirating. 少量を0.8%アガロースゲルにかけて、所望の大きさの範囲内(約3〜6kb)にある主要なDNAを確実にする。 A small amount toward 0.8% agarose gel to ensure major DNA that are within the scope of the desired size (about 3~6kb).
【0292】 [0292]
平滑末端の DNA DNAは、10×ヤナエリ緩衝液(Mung Bean Buffer)、2.0ulのヤナエリヌクレアーゼ(150u/ul)、および最終容量が405ulになるように水を混合して平滑末端化する。 DNA DNA blunt end, 10 × Yanaeri buffer (Mung Bean Buffer), 2.0ul of Jana collar nuclease (150u / ul), and the final volume is blunted by mixing water to a 405Ul. この混合液を37℃で15分間インキュベートする。 The mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C.. 混合液をフェノール/クロロホルム抽出し、続いてさらにクロロホルムで抽出する。 The mixture was phenol / chloroform extraction, followed further extracted with chloroform. 1mlの氷冷エタノールを最終抽出物に添加してDNAを沈殿させる。 Ice cold ethanol 1ml was added to the final extract to precipitate the DNA. DNAは、氷上で10分間かけて沈殿させる。 DNA is precipitated over ice for 10 minutes. DNAをミクロ遠心分離装置で30分間遠心分離することによって回収する。 DNA is collected by centrifugation for 30 min on a micro centrifuge. ペレットを1mlの70%エタノールで洗浄し、ミクロ遠心分離して再びペレット化する。 The pellet was washed with 70% ethanol 1 ml, again pelleted by micro centrifugation. 遠心分離を行った後、DNAを乾燥して26ulのTE緩衝液にゆっくりと再懸濁する。 After centrifugation, slowly resuspended in TE buffer 26ul was dried DNA.
【0293】 [0293]
DNA のメチル化 DNAは、4ulの10×EcoRIメチラーゼ緩衝液、0.5ulのSAM(32mM)、5.0ulのEcoRIメチラーゼ(40u/ul)を混合し、そして37℃で1時間、インキュベートすることでメチル化する。 Methylated DNA of DNA, 10 × EcoRI methylase buffer 4 ul, the 0.5ul of SAM (32 mM), were mixed EcoRI methylase (40u / ul) of 5.0Ul, and 1 hour at 37 ° C., incubated in methylated. 平滑末端を保証するために、メチル化反応液、即ち5.0ulの100mMのMgCl 、8.0ulのdNTP混合物(それぞれ2.5mMのdGTP、dATP、dTTP、dCTP)、4.0ulのクレノウ(Klenow)(5u/ul)に添加し、12℃で30分間インキュベートする。 To ensure blunt ends, methylation reaction, i.e. 100mM of MgCl 2 in 5.0Ul, dNTPs mixture 8.0Ul (dGTP of 2.5mM each, dATP, dTTP, dCTP), the 4.0ul Klenow ( It was added to Klenow) (5u / ul), and incubated at 12 ° C. 30 min.
【0294】 [0294]
30分後に450ulの1×STEを添加する。 Adding 1 × STE of 450ul after 30 minutes. 混合液をフェノール/クロロホルムで一度抽出し、続いて別のクロロホルムで抽出する。 The mixture was extracted once with phenol / chloroform, followed by extraction with another chloroform. 1mlの氷冷エタノールを最終抽出物に添加することによってDNAを沈殿させる。 Precipitating the DNA by addition of ice-cold ethanol 1ml final extract. DNAは氷上で10分間かけて沈殿する。 DNA is precipitated over ice for 10 minutes. DNAをミクロ遠心分離装置で遠心分離することによって回収する。 DNA is collected by centrifugation on a micro centrifuge. ペレットを1mlの70%エタノールで洗浄し、ミクロ遠心分離器で再ペレット化してから10分間乾燥させる。 The pellet was washed with 70% ethanol 1 ml, and then re-pelleted and dried 10 minutes at a micro centrifuge.
【0295】 [0295]
連結反応 DNAは、8ulのEcoRIアダプター(ストララジーン(Stratagene's)のcDNA合成キット由来)、1.0ulの10×連結反応緩衝液、1.0ulの10mM rATP、1.0ulのT4 DNAリガーゼ(4Wu/ul)中でDNAを穏やかに混合し、4℃で2日間インキュベートすることによって連結させる。 Ligation DNA is (derived cDNA synthesis kit Sutorarajin (Stratagene's)) EcoRI adapter 8 uL, 10 × ligation buffer 1.0ul, 1.0ul of 10 mM rATP, T4 DNA ligase 1.0ul (4Wu / ul) DNA were mixed gently in, linking by incubating for 2 days at 4 ° C.. 連結反応は、30分間70℃で加熱することによって終結させる。 Coupling reaction is terminated by heating for 30 minutes at 70 ° C..
【0296】 [0296]
アダプターのリン酸化アダプターの末端は、連結反応液を1.0ulの10×連結反応緩衝液、2.0ulの10mM rATP、6.0ulのH O、1.0ulのポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)と混合し、37℃で30分間インキュベートすることによってリン酸化させる。 Terminal phosphorylation adapter adapter, 10 × ligation buffer 1.0Ul the ligation reaction, 2.0Ul of 10mM rATP, H 2 O of 6.0Ul, a polynucleotide kinase 1.0ul (PNK) mixing, it is phosphorylated by incubation at 37 ° C. 30 min. 30分後、反応液に、31ulのH Oと5mlの10×STEを添加し、試料をセファクリルS−500スピンカラムでサイズ分画化する。 After 30 minutes, the reaction solution was added 10 × STE of between H 2 O and 5ml of 31Ul, size-fractionated samples with Sephacryl S-500 spin columns. 集めた画分(1−3)をフェノール/クロロホルムで1度抽出し、続いて別のクロロホルムで抽出する。 The collected fractions (1-3) was extracted once with phenol / chloroform, followed by extraction with another chloroform. DNAに氷冷エタノールを添加し、氷上で10分間沈殿させる。 Was added to ice-cold ethanol to DNA, it precipitated on ice for 10 minutes. 沈殿物を、高速で30分間、ミクロ遠心分離装置で遠心分離することでペレット化する。 The precipitate, high speed for 30 minutes, pelleted by centrifugation at micro centrifuge. 得られたペレットは、1mlの70%のエタノールを用いて洗浄し、遠心分離して再懸濁してから10分間乾燥させる。 The resulting pellet was washed with 70% ethanol 1 ml, dried 10 minutes and resuspended and centrifuged. 試料は10.5ulのTE緩衝液に再懸濁する。 Samples are resuspended in TE buffer 10.5Ul. ペレット化はさせない。 Pelletizing is not. 代わりに、2.5ulのDNAを用い、水を用いないこと以外は上記のとおりにラムダアームに直接的に連結させる。 Alternatively, using the DNA of 2.5 ul, except that no water is used to directly coupled to the lambda arms as described above.
【0297】 [0297]
ショ糖勾配 (2.2ml) サイズ分画化試料を、65℃で10分間加熱することによって連結反応を停止させる。 Sucrose gradient (2.2 ml) Size fractionation sample to stop the coupling reaction by heating at 65 ° C. 10 min. 2.2mlのショ糖勾配上に試料を穏やかに載せて、45K、20℃で4時間、ミニ−限外遠心分離装置で遠心分離させる(抑制なし)。 Gently placing the sample on a sucrose gradient of 2.2 ml, 4 hours at 45K, 20 ° C., mini - is centrifuged at ultra centrifuge (no inhibition). 20Gのニードルを用いて勾配チューブの底部を穿孔し、そのニードルを通してショ糖を流れさせることによって画分を集める。 Puncturing the bottom of the gradient tube using a 20G needle, collected fractions by creating flows of sucrose through the needle. ファルコン(Falcon)2059チューブに最初の20滴を集め、続いて10個分の1滴画分を回収する(1−10とラベルした)。 Falcon (Falcon) were collected the first 20 drops in 2059 tubes, (and 1-10 labeled) followed by recovering a drop fraction 10 min. それぞれの液滴は容量が約60ulである。 Each of the droplets capacity is about 60ul. 0.8%のアガロースゲル上で各画分の5ulを泳動し、大きさを調べる。 Electrophoresed 5ul of each fraction on a 0.8% agarose gel, examine the size. 画分1−4(約10−1.5kb)を回収し、別個のチューブに画分5−7(約5−0.5kb)を回収する。 Fractions were collected 1-4 (about 10-1.5kb), recovering the fractions 5-7 (about 5-0.5Kb) into separate tubes. 沈殿させるために1mlの氷冷エタノールを添加し、10分間氷上で放置する。 To precipitate were added ice-cold ethanol 1 ml, allowed to stand on ice for 10 minutes. 沈殿物をミクロ遠心分離装置で30分間、高速で遠心分離することによってペレットにする。 30 minutes the precipitate with a micro centrifuge, pelleted by centrifugation at high speed. 1mlの70%エタノールにそれらを再懸濁することによってペレットを洗浄し、ミクロ遠心分離装置で10分間、高速で遠心分離して、再ペレット化し、乾燥させる。 The pellet was washed by resuspending them in 70% ethanol for 1 ml, 10 min on a micro centrifuge, and centrifuged at high speed, re-pelleted and dried. それぞれのペレットを10ulのTE緩衝液に再び懸濁する。 Again suspended each pellet in TE buffer 10 ul.
【0298】 [0298]
ラムダアームへの連結反応試験適切な濃度を得るために、標準物質(既知の濃度のDNA試料)とともに臭化エチジウムを含むアガロース上に0.5ulの試料をスポットしてプレートアッセイ法を行う。 To obtain a coupling reaction test suitable concentration to lambda arms, performs plate assay by spotting a sample of 0.5ul on agarose containing ethidium bromide along with standards (DNA samples of known concentration). UV光を用いてその試料を可視化し、標準物質に比較して濃度を評価する。 The samples were visualized using UV light, to assess the concentration compared to the standards. 画分1−4=>1.0ug/ulである。 The fraction 1-4 => 1.0ug / ul. 画分5−7=500ng/ulである。 The fraction 5-7 = 500ng / ul.
以下の連結反応液(5ul反応液)を調製し、4℃で一晩インキュベートする。 Prepared following ligation reaction of the (5ul reaction), and incubated overnight at 4 ° C..
【0299】 [0299]
試験用パッケージ及びプレート製造者のプロトコールに従って連結反応をパッケージする。 Packaging ligation according to protocols of the test package and the plate manufacturer. 500ulのSM緩衝液を用いてパッケージング反応を停止させ、同じ連結反応から得られたパッケージングをプールする。 Stopping the packaging reaction using SM buffer 500 ul, pooling the packaging obtained from the same ligation. それぞれのプールした反応液の1.0ulを適切な宿主上で力価測定する(OD 600 =1.0)[XLI−Blue MRF]。 The 1.0ul of each pooled reaction is titrated on an appropriate host (OD 600 = 1.0) [XLI -Blue MRF]. 200ulの宿主(mMのMgSO 中)をファルコン2059チューブに添加し、1ulのパッケージしたファージとともにインキュベートし、37℃で15分間インキュベートする。 200ul of the host (the in MgSO 4 in mM) were added to Falcon 2059 tubes, incubated with packaged phage IuI, incubated for 15 minutes at 37 ° C.. 約3mlのトップアガー[150ulのIPTG(0.5M)と300ulのX−GAL(350mg/ml)を含む50mlのストック]を48℃で添加し、100mmのプレートに載せる。 About 3ml of top agar to [150 ul of IPTG (0.5M) and 300ul of X-GAL (350mg / ml) 50ml stock containing] was added at 48 ° C., placed on 100mm plates. プレートを37℃で一晩インキュベートする。 The plates are incubated overnight at 37 ° C..
【0300】 [0300]
ライブラリーの増幅 各ライブラリー由来の 5.0 × 10 組換え体 3.0mlの宿主細胞(OD 600 =1.0)を50mlの円錐型チューブ二本に加え、一本の円錐型チューブ当たり2.5×10 pfuファージとともにインキュベートする。 In addition amplification of the library (5.0 × 10 5 recombinants from each library) host cell (OD 600 = 1.0) of 3.0ml to conical tubes two of 50 ml, one-conical It is incubated with 2.5 × 10 5 pfu phages per tube. 37℃で20分間インキュベートする。 Incubate at 37 ° C. 20 min. トップアガーをそれぞれのチューブに加えて最終容量を45mlにする。 Adding top agar to each tube to a final volume of 45ml with. 5枚の150mmプレートに一括して各チューブをプレーティングする。 Collectively to five 150mm plate plated each tube. 37℃で6〜8時間、プラークがほぼピンの頭程度の大きさになるまでプレートをインキュベートする。 6-8 hours at 37 ° C., the plate is incubated until plaques is approximately of the order of pin head size. 8〜10mlのSM緩衝液を用いてプレートに重層し、4℃で一晩放置する(可能であれば穏やかに振盪する)。 It was layered plates with SM buffer 8~10ml, (gentle shaking if possible) to stand overnight at 4 ° C..
【0301】 [0301]
ファージの回収 SM緩衝液を除いたそれぞれのプレートを50−mlの円錐型チューブに注入することによってファージの懸濁液を回復させる。 Recovering the suspension of phage by injecting each plate recovered SM buffer excluding the phage to conical tubes 50-ml. 3mlのクロロホルムを添加し、激しく攪拌し、室温で15分間インキュベートする。 It was added 3ml of chloroform, vigorously stirred, incubated for 15 minutes at room temperature. そのチューブを2K rpmで10分間遠心分離して細胞の破片を除去する。 The tubes were centrifuged for 10 minutes at 2K rpm to remove cell debris. 上清を滅菌フラスコに注入し、500ulのクロロホルムを添加した後、4℃で保存する。 Injecting the supernatant into a sterile flask and after addition of chloroform 500 ul, and stored at 4 ° C..
【0302】 [0302]
力価増幅ライブラリー収穫したファージの一連の希釈液を作製する(例えば、1mlのSM緩衝液に入れた10 −5 =1ulの増幅ファージ、1mlのSM緩衝液に入れた10 −3希釈液の10 −6 =1ul)。 Making serial dilutions of the titer amplified library harvested phage (e.g., amplified phage 10 -5 = IuI taking into SM buffer 1ml, 10 -3 dilutions were placed in SM buffer 1ml 10 -6 = 1ul). 200ulの宿主(10mMのMaSO 中)を二本のチューブに添加する。 200ul of the host to (Maso 4 in 10 mM) is added to the two tubes. 一本のチューブは10ulの10 −6希釈液(10 −5 )とともにインキュベートする。 One tube are incubated with 10 -6 dilution (10 -5) of 10 ul. もう一方のチューブは1ulの10 −6希釈液(10 −6 )とともにインキュベートする。 The other tube is incubated with 10 -6 dilution of IuI (10-6). 37℃で15分間インキュベートする。 Incubate 15 min at 37 ° C.. 約3mlの48℃のトップアガー[150ulのIPTG(0.5M)と375ulのX−GAL(350mg/ml)を含む50mlのストック]をそれぞれのチューブに添加し、100mmのプレート上にプレーティングする。 Was added approximately 3ml of 48 ° C. Top agar [150 ul of IPTG (0.5M) and 375ul of X-GAL stock 50ml containing (350mg / ml)] to each tube and plated onto 100mm plates . プレートを37℃で一晩インキュベートする。 The plates are incubated overnight at 37 ° C.. 製造者のプロトコール(Stratagene)にしたがってpBLUESCRIPTライブラリーを作製するためにZAP IIライブラリーを摘出する。 According to the manufacturer's protocol (Stratagene) to remove the ZAP II library to produce a pBLUESCRIPT library.
【0303】 [0303]
実施例2 Example 2
安定性の大きな挿入物のピコプランクトンゲノムDNAライブラリーの構築 Construction of picoplankton genomic DNA library of large inserts of stability
細胞の採集及び DNA の調製濃縮したピコプランクトン細胞を含むアガロースプラグは、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルへの海洋学上の巡航で集めた試料から調製した。 Agarose plugs containing collection and picoplankton cells were prepared concentration of DNA in the cells were prepared from samples collected in oceanography on cruise from Newport to Honolulu, Hawaii. 海水(30リットル)をニスキンボトル(Niskin bottles)に集め、10mのニテックス(Nitex)を通してスクリーニングし、それから30,000MWのカットオフ値を有するポリフルホンフィルターを通過させる有孔ファイバー濾過(アミコン(Amnicon)DC10)を行って濃縮した。 Collected seawater (30 liters) in a two skin bottle (Niskin bottles), screened through 10m of Nitekkusu (Nitex), perforated fiber filtration which then passes the polyfurfuryl phone filter with a cut-off of 30,000 MW (Amicon (Amnicon ) DC10) was concentrated carried out. 濃縮したバクテリオプランクトン細胞を0.22m、47mmのデュラポール(Durapore)フィルター上に集め、1mlの2×STE緩衝液(1MのNaCl、0.1MのEDTA、10mMのトリス、pH8.0)に再懸濁して1ml当たりの細胞が約1×10 10個となる最終密度にした。 0.22m The concentrated bacteriophage plankton cells collected on Dura pole (Durapore) filters 47 mm, 2 × STE buffer 1 ml (1M in NaCl, 0.1 M of EDTA, 10 mM Tris, pH 8.0) to re cells per 1ml suspension to have a final density of about 1 × 10 10 pieces. この細胞懸濁液を、40℃に冷却した1%モルテンのシープラークLMPアガロース(FMC)のある容量と混合し、続いて1mlのシリンジに直接吸引した。 The cell suspension was mixed with volume of 1% molten Sea Plaque LMP agarose cooled to 40 ° C. (FMC), followed by suction directly 1ml syringe. このシリンジをパラフィンで密封し、10分間氷上に放置し、細胞を含むアガロースプラグを10mlの溶解緩衝液(10mMのトリス、pH8.0、50mMのNaCl、0.1MのEDTA、1%のサルコシル(Sarkosyl)、0.2%のコール酸ナトリウム、1mg/mlのリゾチーム)に押し出し、37℃で1時間インキュベートした。 The syringe was sealed with parafilm and left in ice for 10 minutes, lysis buffer agarose plugs 10ml comprising cells (10 mM Tris, NaCl of pH 8.0, 50 mM, of 0.1 M EDTA, 1% sarcosyl ( Sarkosyl), sodium 0.2% cholic acid, extruded lysozyme) of 1 mg / ml, and incubated for 1 hour at 37 ° C.. 続いてアガロースプラグを40mlのESP緩衝液(0.5MのEDTAに入れた1%のサルコシル、1mg/mlのプロテナーゼK)に移し、55℃で16時間インキュベートした。 Subsequently ESP buffer agarose plugs 40 ml (1%, taking into 0.5M of EDTA sarcosyl, proteinase K in 1 mg / ml) were transferred to and incubated for 16 hours at 55 ° C.. この溶液をデカントし、新しいESP緩衝液と置き換えた後、55℃でさらに1時間インキュベートした。 The solution was decanted, then replaced with a new ESP Buffer, and incubated for an additional hour at 55 ° C.. それからアガロースプラグを50mMのEDTAに置き、海洋巡航する間は船上で4℃にて保存した。 Then the agarose plugs placed 50mM of EDTA, while ocean cruise were stored at 4 ° C. on board.
【0304】 [0304]
オレゴンの沿岸を離れて集めた試料から調製したアガロースプラグ(72 1)の一スライスを、2mLのミクロ遠心分離用チューブ中で、1mLの緩衝液A(100mMのNaCl、10mMのバストリスプロパン−HCl(Bus Tris Propane−HCl)、100g/mlのアセチル化BSA、pH7.0、25C)に対して4℃で一晩透析した。 One slice of Oregon agarose plugs was prepared from the collected samples apart coast (72 1), in microcentrifuge in separation tube of 2 mL, buffer A (100 mM of NaCl, 1 mL, 10 mM bust squirrel propane -HCl (Bus Tris Propane-HCl), 100g / ml of acetylated BSA, and dialyzed overnight at 4 ° C. against pH7.0,25C). この溶液を、10mMのMgCl、及び1mh4 DTTを含む250lの新しい緩衝液Aで置き換え、室温で1時間、揺れ動く台上でインキュベートした。 The solution was replaced with fresh buffer A of 250l containing 10mM of MgCl, and 1Mh4 DTT, and incubated on 1 hour, wavering stand at room temperature. 続いてこの溶液を4UのSau3Al(NEB)を含む同じ緩衝液に換え、水浴中で37℃に平衡化し、続いて37℃で45分間、インキュベーターの揺れ動く台上でインキュベートした。 Then place the solution in the same buffer containing Sau3Al (NEB) of 4U, equilibrated to 37 ° C. in a water bath, followed by 45 minutes at 37 ° C., and incubated on the platform swinging the incubator. このプラグを1.5mlのミクロ遠心分離用チューブに移し、68℃で30分間インキュベートすることによって酵素を不活性化し、アガロースを溶解した。 Transfer the plug into micro centrifuge tubes 1.5 ml, the enzyme was inactivated by incubating 68 ° C. for 30 minutes to dissolve the agarose. このアガロースを消化してからDNAを、製造者の推奨にしたがってゲレース(Gelase)とHK−ホスファターゼ(エピセンター(Epicentre))をそれぞれ用いて脱リン酸化した。 The DNA from the digestion of the agarose according to the manufacturer's recommendations Geresu and (Gelase) hk- phosphatase (Epicenter (Epicenter)) dephosphorylated using respectively. タンパク質を緩和なフェノール/クロロホルム抽出によって除去し、DNAをエタノール沈殿させてからペレット化し、続いて70%のエタノールを用いて洗浄した。 Protein was removed by mild phenol / chloroform extraction, DNA was pelleted from ethanol precipitated, washed with subsequently 70% ethanol. この部分的に切断したDNAを滅菌したH Oに再懸濁し、pFOS1ベクターに連結させるための2.5ng/lの濃度にした。 The partially cut DNA was resuspended in sterile H 2 O, to a concentration of 2.5 ng / l for coupling to the pFOS1 vector.
【0305】 [0305]
数個のアガロースプラグからPCR増幅した結果(データは示されていない)は、有意量の原始的DNAが存在することを示した。 As a result of PCR amplification of several agarose plugs (data not shown) showed that primitive DNA significant amount is present. オレゴン沿岸を離れた200mの深さで採集した一試料から抽出されるrRNAを用いた定量的なハイブリダイゼーション実験は、この集団におけるプランクトンの原始物が、全ピコプランクトンの生物集合の4.7%を含むことを示している。 Quantitative hybridization experiments using rRNA extracted from one sample, collected at a depth of distant 200m Oregon coast, primitive of plankton in this population, 4.7% of the biological set of all picoplankton It is shown to contain. この試料は、参照として本明細書に組み入れられるDeLongら(DeLong, 1994)の表1における「PAC1」−200mに対応する。 This sample corresponds to "PAC1" -200m in Table 1 of DeLong et al., Incorporated herein (DeLong, 1994) as a reference. アガロースプラグ溶解産物上で行った原始物−偏向性のrDNA PCR増幅から得られる結果によって、この試料に比較的大量の原始的DNAが存在することが確認される。 Primitive was performed on agarose plug lysates - by the results obtained from the deflection of the rDNA PCR amplification, a relatively large amount of primitive DNA in this sample is present is confirmed. このピコプランクトン試料から調製したアガロースプラグは、続くホスミドライブラリーを調製するために選択した。 Agarose plugs prepared from this picoplankton sample were chosen to prepare the subsequent Hosumi drive rally. この部位から得られた1mlのアガロースプラグはそれぞれ約7.5×10 個の細胞を含んでおり、したがって約5.4×10 個の細胞が、部分的に消化されたDNAの調製の際に用いた72 lスライスに存在していた。 Agarose plugs 1ml obtained from this site contains respectively about 7.5 × 10 5 cells, therefore approximately 5.4 × 10 5 cells are partially digested DNA Preparation It was present in 72 l slice used in.
【0306】 [0306]
ベクターアームはKimら(Kim, 1992)によって記載されたpFOS1から調製した。 Vector arms were prepared from pFOS1 as described by Kim et al. (Kim, 1992). 簡単に言うと、プラスミドは、AstIIを用いて完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化した後、BamHIを用いて消化して、二本のアームが、即ちそのそれぞれが35〜45kbpの間の連結したDNAをクローニングしかつパッケージングするための適当な配向性を持ったcos部位を含むようなアームが生成できる。 Briefly, the plasmid was digested to completion with AstII, was dephosphorylated with HK phosphatase, and digested with BamHI, two arms, i.e. each of which between 35~45kbp arms such as those containing ligated DNA with suitable orientation for cloning vital packaging cos site can be generated. この部分的に消化したピコプランクトンDNAを、25ngのそれぞれのベクターと挿入物、及び1UのT4 DNAリガーゼ(Boehringer−Mannheim)を含む15 lの連結反応液中でPFOS 1アームに一晩連結させた。 The partially digested picoplankton DNA, and insert each of the vector 25 ng, and ligated overnight PFOS 1 arm ligation reaction in 15 l containing T4 DNA ligase (Boehringer-Mannheim) of 1U . この反応の4マイクロリットルに含まれる連結させたDNAを、ギガパック(Gigapack)XLパッケージングシステム(Stratagene)を用いてインビトロでパッケージングし、そのホスミド粒子を大腸菌株 DH10B(BRL)にトランスフェクトしてから細胞をLB cm15プレートに広げた。 The DNA was ligated contained in 4 microliters of this reaction was packaged in vitro using Gigapack (Gigapack) XL packaging system (Stratagene), transfected its Hosumido particles into E. coli strain DH10B (BRL) the cells were spread on LB cm15 plates from. 得られたホスミドクローンを、7%のグリセロールを添加したLB cm15を含む96−ウェルのマイクロリットルディッシュに分け入れた。 The resulting phosphonium bromide clones were dispensed into a microliter dish 96 wells containing LB CM15 supplemented with 7% glycerol. 組換えホスミドはそれぞれ約40kbのピコプランクトンDNA挿入物を含んでいて、約1.4×10 塩基対のクローンDNAを含む3.552ホスミドクローンのライブラリーが得られた。 Recombinant Hosumido each comprise picoplankton DNA insert of about 40 kb, a library of 3.552 phosphonium bromide clone containing about 1.4 × 10 8 base pairs of cloned DNA was obtained. 調べたクローンは全て、38〜42kbpの範囲内の挿入物を含んでいた。 All examined clones contained an insert in the range of 38~42Kbp. このライブラリーは後の分析用に−80℃で凍結して保存した。 This library was stored frozen at -80 ° C. for later analysis.
【0307】 [0307]
本発明について非常に多くの修飾及び変形を行うことが上記の技術に照らして可能であり、したがって特許請求の範囲内で、本発明は特定して記載したのとは別様に実施することができる。 It is possible to carry out a great variety of modifications and variations for the present invention in light of the above teachings and, therefore within the scope of the claims, that the invention is otherwise implementation as described with particular it can.
【0308】 [0308]
実施例3 Example 3
CsC1−ビスベンズイミド勾配UVによる勾配の可視化: Visualization of the gradient by CsC1- bisBenzimide gradient UV:
暗室でUVハンドランプを用いて勾配を可視化し、またGC含有量の上限と低限を示すことのできる標準物質のバンドを形成してマークする。 Visualized gradient using UV hand lamp in a dark room, also marks to form a band of standard that can show the upper and lower limit of the GC content.
【0309】 [0309]
勾配の回収: The recovery of the gradient:
1. 1. ファルマシア(Pharmacia)−ポンプLKB P1を画分コレクター(BIO−RADモデル2128)と接続する。 Pharmacia (Pharmacia) - connecting the pump LKB P1 fraction and collector (BIO-RAD Model 2128).
2. 2. プログラムをセットする。 To set the program. :3、5滴(約100ul)を処理する、全ての試料。 : 3,5 drops (approximately 100 ul) to process all samples.
3.3マイクロタイター−ディッシュ(Costar、96ウェル細胞培養クラスター)を利用する。 3.3 Microtiter - utilizing dishes (Costar, 96-well cell culture clusters).
4. 4. 遠心分離用チューブの底部に黄色の針を押す。 Pressing the yellow needle in the bottom of the centrifuge tube.
5. 5. プログラムをスタートし、勾配を回収する。 Start the program, to recover the gradient. 最初と使用者のマーカーに依存する可能性のある最後の1〜2mlは回収しない。 Last 1~2ml that may depend on the marker in the first and the user is not recovered.
【0310】 [0310]
透析: Dialysis:
1. 1. ミクロ透析装置の説明マニュアルに従い、Spectra/Pro CEメンブランMWCO 25,000(使用する前にddH20を用いて膜を洗浄する)を用いる。 As described Manual of the microdialysis device, using a Spectra / Pro CE membrane MWCO 25,000 (membrane washing the with ddH20 before use).
2. 2. ミクロ透析装置(Spectra/Pro, MicroDialyzer)に、マルチピペットを用いてマイクロタイターディッシュから得られる試料を移す。 Microdialysis device (Spectra / Pro, MicroDialyzer) to transfer the sample obtained from a microtiter dish using a multi-pipette.
3. 3. (TEで完全に透析装置を満たし、空気泡を除き、新しく空気泡が入るのを避けるために極めて速く試料を移す)。 (Meet completely the dialysis machine in the TE, except for the air bubbles, move very fast sample in order to avoid new air bubbles from entering).
4. 4. プレート攪拌器上で1時間、TEに対して透析する。 1 hour on a plate stirrer, dialyzed against TE.
【0311】 [0311]
PICOGREENを用いるDNAの予測: Prediction of DNA using PICOGREEN:
1. 1. 試料(透析後の容量は1.5〜2倍に増加しているはずである)を、マイクロタイターディッシュにマルチピペットで移して戻す。 Samples (volume after dialysis should have increased to 1.5 to 2 times), back transferred by multi-pipetted into microtitre dishes.
2. 2. 試料の100ulをポリテクトロニックス(Polytektronix)プレートに移す。 The 100ul of sample transferred to the Polytechnic Toro Knicks (Polytektronix) plate.
3.100ulのピコグリーン溶液(5ulのピコグリーン−ストック溶液+995ulのTE緩衝液)をそれぞれの試料に添加する。 3.100ul Pico Green solution - is added (5ul of PicoGreen stock solution + 995Ul of TE buffer) to each sample.
4. 4. WPR−プレート−読みとり器を用いる。 WPR- plate - using a reader.
5. 5. DNA濃度を予測する。 To predict the DNA concentration.
【0312】 [0312]
実施例4 Example 4
ゲノムDNAのビス−ベンズイミド分離ウェルチ菌(Clostridium perfringens)(27% G+C)、大腸菌(Escherichia coli)(49% WC)及びミクロコッカス−リゾジクチウム(Micrococcus lysodictium)(72% G+C)から得たゲノムDNAから構成される試料は、塩化セシウム勾配で精製した。 Genomic DNA bis - consists Rizojikuchiumu (Micrococcus lysodictium) (72% G + C) Genomic DNA from - benzimide separation Welch bacteria (Clostridium perfringens) (27% G + C), Escherichia coli (Escherichia coli) (49% WC) and Micrococcus samples to be was purified by cesium chloride gradient. この塩化セシウム(Rf=1.3980)溶液は0.2mフィルターを通して濾過し、15mlを、35mlのオピシール(OpiSeal)チューブ(Beckman)に入れた。 The cesium chloride (Rf = 1.3980) solution was filtered through a 0.2m filter, a 15 ml, were placed in 35ml of Opishiru (OpiSeal) tube (Beckman). DNAを添加して入念に混合した。 It was mixed thoroughly with the addition of DNA. 10マイクログラムのビス−ベンズイミド(Sigma; Hoechst 33258)を添加して完全に混合した。 10 micrograms of bis - benzimide (Sigma; Hoechst 33258) were thoroughly mixed and added. それからそのチューブを濾過した塩化セシウム溶液で満たし、ベックマン(Beckman)L8−70限外遠心分離装置のVTi5Oローターにおいて33,000rpmで72時間回転した。 Then filled with cesium chloride solution was filtered and the tube was rotated at 33,000 rpm 72 hours at VTi5O rotor Beckman (Beckman) L8-70 ultra centrifuge. 遠心分離を行った後、シリンジポンプと分画装置(Brandel Model 186)を用いることによって、280nmにISCO UA−5 UV吸収検出器をセットすることで勾配を形成できる。 After centrifugation, by using a syringe pump and fractionator (Brandel Model 186), to form a gradient by setting the ISCO UA-5 UV absorbance detector to 280 nm. 三つの微生物由来のDNAを表す三つのピークが得られた。 Three peaks representing the DNA from three of microorganisms was obtained. 大腸菌ピークの10倍希釈液からDNAをコードするrRNAをPCR増幅させる場合は、真性細菌の配列を増幅させるための以下のプライマーを用いて行なわれた。 The rRNA encoding DNA from 10-fold dilutions of E. coli peak case of PCR amplifications were performed using the following primers to amplify the sequence of eubacteria.
【0313】 [0313]
実施例5 Example 5
FACS/ バイオパニング (Biopanning) FACS / biopanning (Biopanning)
Exp503 大腸菌株へのライブラリー溶解産物の感染 25mlのLB+Exp503のTet培養物を37℃で一晩培養した。 The library dissolution Tet culture of LB + Exp503 infection 25ml of product into Exp503 E. coli strain was cultured overnight at 37 ° C.. 翌日その培養物を4000rpmで10分間遠心分離し、その上清をデカントした。 The culture was then centrifuged for 10 min at 4000 rpm, was decanted and the supernatant following day. 10mMのMgSO を20mlを添加し、OD 600を確認した。 The MgSO 4 of 10mM was added 20 ml, was confirmed OD 600. OD 1.0まで希釈する。 Diluted to OD 1.0.
【0314】 [0314]
良い表示のライブラリーを得るために、少なくとも2−倍(また好ましくは5倍)のライブラリー溶解産物力価を用いた。 To obtain a library of good display, using at least 2-fold (and preferably 5-fold) library lysate titer. 例えば、ライブラリー溶解産物の力価は2×10 cfu/mlである。 For example, the titer of the library lysate is 2 × 10 6 cfu / ml. 少なくとも4×10 cfuが必要とされる。 At least 4 × 10 6 cfu are needed. 約500,000ミクロコロニー/150mmのLB−Kanプレートにプレーティングできる。 Playable coating on LB-Kan plates about 500,000 microcolonies / 150 mm. 8プレートが必要とされる。 8 plate is required. 1mlの反応液/プレートをプレーティングすればよく、即ち8mlの細胞+溶解産物が必要とされる。 It may be plated and the reaction solution / plate 1 ml, i.e. cells plus lysates 8ml are needed.
【0315】 [0315]
2倍(例えば2ml)のライブラリー溶解産物を適当量(例えば6ml)のOD1.0 Exp503と混合した。 Doubling the library lysate (e.g. 2ml) was mixed with OD 1.0 Exp503 appropriate amount (e.g., 6 ml). この試料を37℃で少なくとも1時間インキュベートした。 The sample was incubated for at least 1 hour at 37 ° C.. 150mmのLB−Kanプレートに1mlの反応液をプレーティングし、それを8プレートに行い、30℃で一晩インキュベートした。 The reaction solution 1ml of LB-Kan plates 150mm plated, it performs the 8 plates and incubated overnight at 30 ° C..
【0316】 [0316]
Exp503 細胞の、回収、誘導、及びライブラリーの固定プレートから得られる全ての細胞を、ゴム製ポリスマン(rubber policeman)を用いて20mlのLBに削り入れる。 Of Exp503 cells, harvested, induced, and all cells obtained from a fixed plate of the library, placing cutting the LB of 20ml using a rubber policeman (rubber policeman). 細胞を約1:100(200ulの細胞/20mlのLB)に希釈し、培養物がOD 0.3になるまで37℃でインキュベートする。 Cells from about 1: 100 diluted (LB of 200ul of cells / 20 ml), the culture is incubated at 37 ° C. until OD 0.3. 20%の滅菌グルコースの1:50の希釈液を添加し、培養物がOD 1.0になるまで37℃でインキュベートする。 Was added a 1:50 dilution of 20% sterile glucose, cultures incubated at 37 ° C. until OD 1.0. 1MのMgSO の1:100希釈液を添加する。 1 of 1M MgSO 4 of: adding 100 dilution. 5mlの培養物を新しいチューブに移し、残りの培養物は望ましい場合には誘導しない対照として用いてもよいし、または廃棄してもよい。 The 5ml cultures were transferred to a new tube, may be used as a control does not induce in the case the remaining cultures desired, or may be discarded. CE5バクテリオファージのMOI 5を残っている5mlの培養物に添加する。 CE5 added to cultures of 5ml remaining the MOI 5 of bacteriophage. (CE6はT7 RNAポリメラーゼをコードする)(例えば、OD1=8×10 個の細胞/ml×5ml=4×10 個の細胞×MOI 5=2×10 10個のバクテリオファージが必要とされる)。 (CE6 encodes the T7 RNA polymerase) (e.g., is required OD1 = 8 × 10 8 cells / ml × 5ml = 4 × 10 9 cells × MOI 5 = 2 × 10 10 pieces of bacteriophage that). 培養物+CE6を37℃で2時間インキュベートする。 Cultures + CE6 incubated for 2 hours at 37 ° C.. 氷上で冷却し、細胞を4000rpmで10分間遠心分離する。 Cooled on ice, cells are centrifuged for 10 minutes at 4000 rpm. 10mlのPBSで洗浄する。 Washed with 10ml of PBS. 600ulのPBS+1.8mlの新しい濾過済みの4%のパラホルムアルデヒドで細胞を固定化する。 Immobilizing the cells with 4% paraformaldehyde for new filtered in PBS + 1.8 ml of 600 ul. 氷上で2時間インキュベートする。 Incubate on ice for 2 hours. (4%のパラホルムアルデヒド:フラスコ中で8.25mlのPBSを65℃で加熱する。100ulの1M NaOHと0.5gのパラホルムアルデヒド(4℃で保存されている)を添加する。溶解するまで混合する。4.15mlのPBSを添加する。0℃に冷却する。0.5MのNaH PO を用いてpHを7.2に調節する。0℃に冷却する。フィルターを洗浄する。24時間以内用いる)。 (4% paraformaldehyde:. Adding 1M NaOH and 0.5g of paraformaldehyde .100ul heating at 65 ° C. of PBS 8.25ml in a flask (stored at 4 ° C.) and mixed until dissolved .24 hours to clean the. filter with NaH 2 PO 4 in .0.5M cooling to addition to .0 ° C. of PBS .4.15ml to cool to modulate .0 ° C. to pH 7.2 use within). 固定化後、10分間、4000rpmで遠心分離する。 After immobilization, 10 minutes, centrifuged at 4000 rpm. 1.8mlのPBSと200ulの0.1%のNP40に再懸濁する。 Resuspended in NP40 PBS and 0.1% of 200ul of 1.8 ml. 4℃で一晩保存する。 Stored overnight at 4 ℃.
【0317】 [0317]
固定化細胞のハイブリダイゼーション固定化細胞を4000rpmで10分間遠心分離する。 Hybridization immobilized cells of fixed cells are centrifuged 10 minutes at 4000 rpm. 1mlの40mMトリス pH7.6/0.2%のNP40に再懸濁する。 Resuspended in 40mM Tris pH 7.6 / 0.2% of NP40 of 1 ml. 100ulの固定化細胞をエッペンドルフ管に移す。 Transfer the immobilized cells of 100ul into Eppendorf tubes. 1分間遠心分離し、上清を除去する。 Centrifuged for 1 minute and remove the supernatant. 各反応液を50ulのハイブリダイゼーション緩衝液(0.9MのNaCl、20mMのトリス PH7.4、0.01%のSDS、25%のホルムアミド、予め作製しておくことができ、−20℃で保存可能である)に再懸濁する。 Hybridization buffer of each reaction 50 ul (0.9 M of NaCl, 20 mM Tris PH7.4,0.01% of SDS, 25% formamide, can be prepared in advance, stored at -20 ° C. resuspended in possible is). 0.5nmolのフルオレセイン標識プライマーを適切な反応に添加する。 The fluorescein-labeled primers 0.5nmol added to the appropriate reaction. 46℃で2時間、振盪しながらインキュベートする。 2 hours at 46 ° C., incubated with shaking. (ハイブリダイゼーションの温度はプライマーの配列と鋳型に依存すると思われる。) 1mlの洗浄用緩衝液をそれぞれの反応液に添加し、簡単にすすいでから1分間遠心分離する。 (Temperature of hybridization will depend on the sequence and the template of the primer.) Was added washing buffer 1ml to each reaction solution, centrifuged 1 minute from at easily rinsed. 上清を除去する。 And the supernatant is removed. (洗浄用緩衝液:0.9MのNaCl、20mMのトリス pH7.4、0.01%のSDS)。 (Wash buffer: 0.9 M of NaCl, 20 mM Tris PH7.4,0.01% of SDS). 別の1mlの洗浄用緩衝液をそれぞれの反応液に添加し、振盪しながら30分間、48℃でインキュベートする。 It added another 1ml washing buffer of each of the reaction solution, shaking for 30 min, incubated at 48 ° C.. 遠心分離して上清を除去する。 The supernatant removed and centrifuged. WIBフィルターを用いる顕微鏡に下で細胞を可視化する。 To visualize cells under a microscope using WIB filter.
【0318】 [0318]
FACS 選別細胞を1mlのPBSに入れて希釈する。 The FACS sorted cells are diluted into the PBS of 1 ml. 細胞が凝集している場合には、1.5パワーで20秒間、超音波をあてる。 If the cells are aggregated, 20 seconds at 1.5 power, applying ultrasound. 最も蛍光の強い単細胞をFAC選別し、0.5mlのPCRストリップチューブに集める(およそ1枚の96−ウェルプレート/ライブラリー)。 Most fluorescence of a strong single cell was FAC sorted, collected in a PCR strip tubes 0.5 ml (approximately one 96-well plate / library). それぞれの細胞で挿入物を増幅させるために、ベクター特異的プライマーを用いて単細胞をPCRにかける。 To amplify the inserts in each cell, applying a single cell in PCR using a vector specific primer. アガロースゲル上で全ての試料を電気泳動させ、単一の挿入物を用いて試料を選別する。 All samples on an agarose gel was electrophoresed, selecting a sample with a single insert. これらはビオチン標識プライマーでもう一度増幅するとよく、挿入物特異的プライマーにハイブリダイズしてからELISAアッセイ法で調べることができる。 These may Amplifying again with biotin-labeled primers can be examined from the hybridized to the insert-specific primers in ELISA assay. 続いて陽性のクローンを配列決定できる。 Followed by the positive clones can be sequenced. また選択した試料を、種々の組み合わせの挿入物特異的プライマーを用いて再増幅しても良いし、あるいは直接的に配列決定してもよい。 The selected samples may be re-amplified using insert-specific primers of the various combinations, or may be directly sequenced.
【0319】 [0319]
実施例6 Example 6
ラージ挿入物のFACSバイオパニングプロトコール1.1バイアルの3%ホームメードシープラーク(SeaPlaque)ゲルを封入する。 Encapsulating the 3% homemade Sea Plaque (SeaPlaque) gel FACS biopanning protocol 1.1 vials large insert. 各バイアルのゲルは10 のGMDを作製できる。 Each vial gel can produce GMD of 10 6. 100ulの融解した凍結ホスミドpMF21/DH10Bライブラリーを得て、封入化するためにOD 600 =0.4にしてから遠心分離して10ulとする。 To give a molten freeze Hosumido pMF21 / DH10B library 100 ul, and 10ul by centrifugation after the OD 600 = 0.4 to encapsulation. アガロースゲルを溶解し、100ulのFBS(胎児ウシ血清)を添加してからボルテックスする。 Dissolving agarose gel and vortexed after addition of 100ul of FBS (fetal bovine serum). ビーカーに入れた50℃の水に入れる。 Placed in 50 ℃ of water in a beaker. 10ulの培養物を添加し、ボルテックスし、17mlのミネラルオイルに添加する。 Adding a culture of 10 ul, vortexed and added to mineral oil of 17 ml. 約30回振盪し、ワンセルマシン(One Cell machine)に置く。 And shaken for about 30 times, put in the one-cell machine (One Cell machine). 室温で1分間2600rpm、および氷上で9分間2600rpmで混合する。 Mixed for 1 minute 2600 rpm, and on ice for 9 min 2600 rpm at room temperature. PBSを用いて二度洗浄する。 Wash twice with PBS. 10mlのLB+Apr 50に再懸濁し、230rpmで4時間、37℃にて振盪する。 Resuspended in LB + Apr 50 in 10 ml, 4 h at 230 rpm, shaken at 37 ° C.. ミクロコロニーの増殖と大きさを見るべく顕微鏡で確認する。 It is confirmed by a microscope to see the growth and size of microcolonies.
【0320】 [0320]
2.1500rpmで6分間、遠心分離する。 6 minutes 2.1500Rpm, centrifuged. GMDを5mlの2×SSCに再懸濁する。 The GMD resuspended in 2 × SSC for 5 ml. 4℃で数日間保存可能である。 Several days at 4 ℃ can be stored. それぞれの反応に対して2×SSC中に200ulのGMDをあてる。 Devote GMD of 200ul in 2 × SSC for each reaction.
【0321】 [0321]
3.10mlの2×SSC/5%のSDSに再懸濁する。 Resuspended in 2 × SSC / 5% of SDS in 3.10 ml. 振盪または回転しつつ室温で10分間インキュベートする。 Shaking or rotating incubated at room temperature for 10 minutes. 遠心分離する。 Centrifuged.
【0322】 [0322]
4. 4. プロティナーゼKを含む溶解溶液、5mlに再懸濁する。 Lysis solution containing proteinase K, and resuspended in 5 ml. 振盪または回転しつつ37℃で30分間インキュベートする。 Incubate shaking or rotating while 37 ° C. for 30 minutes. 遠心分離する。 Centrifuged.
溶解溶液 Lysis solution:
50mMのトリス、pH8; 0.75mlの1Mトリス50mMのEDTA; 1.5mlの0.5M EDTA 50mM Tris, pH 8; of 1M Tris 50mM of 0.75 ml EDTA; 1.5 ml of 0.5M EDTA
100mMのNaCl; 300ulの5M NaCl 5M NaCl of 300ul; 100mM of NaCl
1%のサルコシル; 0.75mlの20%サルコシル250ug/mlのプロティナーゼK; 375ulのプロティナーゼKストック(10mg/ml)、11.325mlのdH 1% sarkosyl; 20% 0.75ml sarkosyl 250 ug / ml of proteinase K; 375Ul of Proteinase K stock (10mg / ml), dH 2 O for 11.325ml
【0323】 [0323]
5.5mlの変性溶液に再懸濁する。 Resuspended in a denaturing solution of 5.5 ml. 室温で振盪するか回転して30分間インキュベートする。 Incubate either rotated for 30 minutes shaking at room temperature. 1500rpmで5分間遠心分離する。 Centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm.
変性溶液: Denaturing solution:
0.5MのNaOH/1.5MのNaCl NaCl of 0.5M of NaOH / 1.5M
【0324】 [0324]
6.5mlの変性溶液に再懸濁する。 Resuspended in a denaturing solution of 6.5 ml. 室温で振盪するか回転して30分間インキュベートする。 Incubate either rotated for 30 minutes shaking at room temperature. 遠心分離する。 Centrifuged.
変性溶液: Denaturing solution:
0.5Mのトリス pH8/1.5MのNaCl NaCl Tris pH8 / 1.5M of 0.5M
【0325】 [0325]
7.2×SSCで簡単に洗浄する。 7.2 to easily washed with × SSC.
【0326】 [0326]
8. 8. ミクロ遠心分離用チューブに200ul/RxNを等分し、ミクロ遠心分離を行って2×SSCを回収する。 Microcentrifuge for aliquoted 200 ul / RxN the tube, to recover the 2 × SSC performed microcentrifuge. 37℃で45分間プレハイブリダイズするために130ulの「DIG EASY HYB」を添加する。 To prehybridized for 45 minutes at 37 ° C. is added to "DIG EASY HYB" of 130 uL. パーソナルハイブリダイゼーションオーブンでプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行う。 Perform the pre-hybridization and hybridization in personal hybridization oven.
【0327】 [0327]
9. 9. オリゴプローブを等分し、85℃で5分間変性して直ちに氷上に置く。 The oligo probe was aliquoted, placed on ice immediately and denatured for 5 minutes at 85 ° C.. 適当量のプローブ(0.5−1nmol/RXN)を添加し、一晩回転しているハイブリダイゼーションオーブンに戻す。 Was added an appropriate amount of probe (0.5-1nmol / RXN), returned to the hybridization oven rotating overnight.
【0328】 [0328]
10. 10. PBSに入れた1%の遮断試薬溶液を調製する。 To prepare 1% blocking reagent solution was placed in PBS. 使用時まで4℃で保存する。 Until the time of use and stored at 4 ℃.
【0329】 [0329]
11. 11. GMDを、0.8mlの2×SSC/0.1%のSDSを用い、室温にて15分間、回転して洗浄する。 The GMD, with 2 × SSC / 0.1% of SDS at 0.8 ml, 15 minutes at room temperature, washed by rotating. 中間時点で次の洗浄溶液を予め温める。 Warm next washing solution in advance at an intermediate point.
【0330】 [0330]
12. 12. GMDを、0.8mlの0.5×SSC/0.1%のSDSを用い、適切な温度にて2×15分間、回転して洗浄する。 The GMD, using 0.5 × SSC / 0.1% of SDS at 0.8 ml, 2 × 15 minutes at a suitable temperature, washed by rotating. より高いストリンジェンシーが要求される場合には、2回目の洗浄を0.1×SSC/0.1%のSDSで行うとよい。 If the higher stringency is required, the second wash may be performed in 0.1 × SSC / 0.1% of SDS.
【0331】 [0331]
13.0.8ml/RXN 2×SSCを用いて簡単に洗浄する。 Briefly washed with 13.0.8ml / RXN 2 × SSC.
【0332】 [0332]
14. 14. 反応を、w/130ulの1%遮断試薬をPBS中で30分間、室温にて遮断する。 The reaction for 30 min with 1% blocking reagent w / 130 uL in PBS, blocking at room temperature.
【0333】 [0333]
15.1.4ulの抗DIG−PODを添加し(1:100)、3時間室温でインキュベートする。 It was added anti-DIG-POD of 15.1.4ul (1: 100), incubated for 3 hours at room temperature.
【0334】 [0334]
16. 16. GMD w/0.8mlのPBS/RNを3×7分間、37℃で洗浄する。 The PBS / RN of GMD w / 0.8ml 3 × 7 min, washed with 37 ° C..
【0335】 [0335]
17. 17. チラミド(tyramide)ストック溶液を、増幅緩衝液/0.0015%のH に1:85に希釈することによってチラミド作用溶液を調製する。 Tyramide the (a tyramide) stock solution, to prepare a tyramide working solution by diluting H 2 O 2 in one eighty-five amplification buffer /0.0015Pasento. 130ulのチラミド作用溶液を室温で用い、室温で暗所で30分間インキュベートする。 Used at room temperature tyramide working solution of 130 uL, and incubated for 30 minutes at room temperature in the dark.
【0336】 [0336]
18.0.8mlのPBS緩衝液中、37℃で7分間、3回洗浄する。 PBS buffer at 18.0.8ml, 7 min at 37 ° C., washed 3 times.
【0337】 [0337]
19. 19. 顕微鏡によって可視化し、FACS選別を行う。 Visualized by microscopy, performing FACS sorting.
【0338】 [0338]
実施例7 Example 7
バイオパニングプロトコールラムダDNAに由来する挿入物DNAを調製するPCRによって、ベクター特異的プライマーであるCA98及びCA103を用いて挿入物を増幅させる。 By PCR to prepare an insert DNA derived from the biopanning protocol lambda DNA, to amplify the insert with CA98 and CA103 is a vector specific primer.
CA98:ACTTCCGGCTCGTATATTGTGTGG CA98: ACTTCCGGCTCGTATATTGTGTGG
CA103:ACGACTCACTATAGGGCGAATTGGG CA103: ACGACTCACTATAGGGCGAATTGGG
これらのプライマーは、ラムダZAP発現クローン(pBKCMV)に好適に適合する。 These primers are compatible suitably lambda ZAP expression clone (pBKCMV).
【0339】 [0339]
試薬:ラムダDNAはパニングすべきライブラリーから調製した(ライブラリアン(Librarians)) Reagents: lambda DNA was prepared from the library should be panning (librarian (Librarians))
ロシュ拡張長鎖鋳型PCRシステム番号1−759−060(Roche Expand Long Templete PCR System #1−759−060) Roche extended long chain template PCR system number 1-759-060 (Roche Expand Long Templete PCR System # 1-759-060)
ファルマシアdNTP混合物番号27−2094−01、またはロシュPCRヌクレオチド混合物(10mM)番号1−581−295、またはロシュdNTP's−PCRグレード番号1−969−064 Pharmacia dNTP mix No. 27-2094-01 or Roche PCR nucleotide mix, (10 mM) No. 1-581-295 or Roche DNTP's-PCR grade number, 1-969-064
【0340】 [0340]
1. 1. 挿入物増幅混合物を作製する: Making an insert amplification mixture:
XμlのdH O(最終的には50μl) DH 2 O of Xμl (eventually 50μl)
5μlの10×拡張緩衝液番号2(22.5mMのMgCl 5μl a 10 × extension buffer number 2 (MgCl 2 in 22.5 mM)
0.5または0.625μlのdNTP混合物(20mMの各dNTP) 0.5 or 0.625μl of dNTP mix (each of dNTP 20 mM)
1ライブラリーにつき10ng(約)のラムダDNA(通常は1μlまたは1μl 1:10希釈) Lambda DNA of 1 library per 10 ng (approximately) (typically 1 [mu] l or 1 [mu] l 1:10 dilution)
1〜2μlのCA98(100ng/μl、即ち15μM) CA98 of 1~2μl (100ng / μl, that is 15μM)
1〜2μlのCA103(100ng/μl、即ち15μM) CA103 of 1~2μl (100ng / μl, that is 15μM)
0.5μlの拡張長鎖ポリメラーゼ混合物【0341】 Extended long-chain polymerase mixture of 0.5μl [0341]
2. 2. PCR増幅: PCR amplification:
ロボサイクラー(Robocycler) Robosaikura (Robocycler)
【0342】 [0342]
3.5μlの反応生成物をゲル上で分析する: The reaction product of 3.5μl analyzed on the gel:
注:この反応生成物は、通常0.5〜5kbの範囲内で1.5〜2kb当たりに中心がある生成物からなる濃い塗末標本でなくてはならない。 Note: The reaction product must be dark smears made from the product centered per 1.5~2kb within the normal 0.5~5Kb.
【0343】 [0343]
ビオチン化フックの調製試薬:PCR試薬ビオチン−14−dCTP(BRL番号19518−018) Preparation Reagents Biotinylated hook: PCR Reagents Biotin -14-dCTP (BRL No. 19518-018)
個々のdNTPストック溶液(ロシュdNTPの番号1−969−064) Individual of dNTP stock solution (number of Roche dNTP 1-969-064)
遺伝子特異性鋳型及びプライマーPCR精製キット(ロシュ番号1732668、またはキアゲンキアクイック(Qiagen Qiaquick)番号28106) Gene-specific template and primer PCR purification kit (Roche No. 1732668 or Qiagen QIAquick, (Qiagen Qiaquick) No. 28106)
【0344】 [0344]
1.10×ビオチンdNTP混合物を作製する: 1.10 × producing biotin dNTP mix:
150μlのビオチン−14−dCTP 150μl of biotin -14-dCTP
3μlの100mM dATP 3μl of 100mM dATP
3μlの100mM dGTP 3μl of 100mM dGTP
3μlの100mM dTTP 3μl of 100mM dTTP
1.5μlの100mM dCTP 100mM dCTP of 1.5μl
【0345】 [0345]
2. 2. PCR混合物を作製する: Making PCR mixture:
74μlの水10μlの10×拡張緩衝液番号1 74μl water 10μl a 10 × extension buffer number 1
10μlの10×ビオチンdNTP混合物(工程番号1) 10 × biotin dNTP mix 10 [mu] l (step number 1)
2μlのプライマー番号1(100ng/μl) 2μl of primer number 1 (100ng / μl)
2μlのプライマー番号2(100ng/μl) 2μl of primers number 2 (100ng / μl)
1μlの鋳型(遺伝子特異性)(100ng/μl) 1μl of the template (gene-specific) (100 ng / [mu] l)
1μlの拡張長鎖ポリメラーゼ混合物【0346】 Extended long-chain polymerase mixture of 1μl [0346]
3. 3. PCR増幅: PCR amplification:
ロボサイクラー Robosaikura
用いたプラスミドに適切なアニール化温度を用いる。 * Using a suitable annealing temperature plasmids used.
** 1分間/標的の長さのkbであるとよい。 ** 1 minute / target may is the length of kb.
【0347】 [0347]
4. 4. PCR精製キットを用いて反応生成物を精製する。 Purify the reaction product by using a PCR purification kit. 50μlの5T. 50μl of 5T. 1EまたはキアゲンのEB緩衝液(10mMのトリス pH8.5)で溶出する。 1E or Qiagen EB buffer eluted with (10 mM Tris pH 8.5).
【0348】 [0348]
5.5μlをアガロースゲル上で確認する。 It is confirmed on an agarose gel 5.5μl.
注:この反応生成物はビオチンが組み込まれるため、予想されるサイズより僅かに大きくなると思われる。 Note: the reaction product because biotin is incorporated, it appears to be slightly larger than the expected size.
【0349】 [0349]
バイオパニング試薬:ストレプトアビジン複合化常磁性ビーズ(CPG MPG−ストレプトアビジン 10mg/mlの番号MSTR0502)(ダイナルダイナビーズ(Dynel Dynabeads)M−280ストレプトアビジン) Biopanning Reagents: Streptavidin conjugated paramagnetic beads (CPG MPG-streptavidin 10mg / ml Number of MSTR0502) (Dynal Dynabeads (Dynel Dynabeads) M-280 Streptavidin)
超音波処理し、変性したサケ精子DNA(95℃に5分間加熱されている)(ストラタジーン番号201190) Sonicated, (which is heated 95 ° C. for 5 minutes) denatured salmon sperm DNA (Stratagene No. 201190)
PCR試薬dNTP混合物磁性粒子セパレータTop10F構成細胞を用いるTopo−TAクローニングキット(インビトロゲン番号K4550−40) PCR reagents dNTP mix the magnetic particles separator Top10F cells constituting the used Topo-TA cloning kit (Invitrogen No. K4550-40)
高塩緩衝液:5MのNaCl、10mMのEDTA、10mMのトリス pH7.3 High salt buffer: NaCl of 5M, 10 mM of EDTA, 10 mM Tris pH7.3
【0350】 [0350]
1. 1. 各ライブラリー/フックの組み合わせのための以下の反応混合物を作製する。 Producing the following reaction mixture for the combination of each library / hook.
5μgの挿入物DNA(PCR増幅させたラムダDNA) 5μg of the insert DNA (lambda DNA obtained by PCR amplification)
100ngのビオチン化フック(1個以上のフックを用いたのであれば全部で100ng) 100ng of biotinylated hook (100ng total long as using one or more hooks)
最終濃度を3倍にするための4.5μlの20×SSC(即ち高塩緩衝液) 20 × SSC of 4.5μl to a final concentration of 3 times (i.e. high salt buffer)
最終容量を30μlにするためのXμlのdH DH 2 O of Xμl to a final volume of 30μl
【0351】 [0351]
2.10分間、95℃に加熱することによって変性する。 2.10 min, denatured by heating to 95 ° C.. (ロボサイクラーはこの工程をうまく進行させる)。 (Robosaikura is allowed to proceed with this process successfully).
【0352】 [0352]
3.70℃で90分間ハイブリダイズする。 Hybridize for 90 minutes at 3.70 ° C.. (ロボサイクラー) (Robosaikura)
【0353】 [0353]
4. 4. 各試料のための100μlのMPGビーズを調製する: The MPG beads 100μl for each sample are prepared:
1mlの3×SSCを用いて二度100μlのビーズを洗浄する再懸濁する:50μlの3×SSC(または高塩緩衝液) Resuspend washed beads twice 100μl with 3 × SSC in 1ml: 3 × SSC (or high salt buffer) of 50μl
遮断するための10μlの超音波処理し変性したサケ精子DNA(10mg/ml)(即ち全体で100ng) Sonicated denatured salmon sperm DNA 10μl for blocking (10mg / ml) (i.e. a total of 100 ng)
(氷はない) (Ice is not)
【0354】 [0354]
5. 5. 洗浄し、遮断したビーズにハイブリダイズしたDNAを添加する。 Washed, adding hybridized DNA in blocked beads.
【0355】 [0355]
6. 6. ハイブリダイゼーションオーブン中で静かに攪拌しつつ30分間、室温でインキュベートする。 Gently stirring for 30 minutes in a hybridization oven to incubate at room temperature.
【0356】 [0356]
7. 7. 磁気粒子セパレータを使用し、1mlの0.1×SSC/0.1%のSDS(または高塩緩衝液)を用いて室温で二度洗浄する。 Using magnetic particles separator, washed twice at room temperature with 0.1 × SSC / 0.1% of SDS in 1 ml (or high salt buffer).
【0357】 [0357]
8.1mlの0.1×SSC/0.1%のSDS(または高塩緩衝液)を用いて42度で二度、それぞれ10分間かけて洗浄する。 Twice with 42 times with 0.1 × SSC / 0.1% of SDS (or high salt buffer) of 8.1 ml, washed over 10 minutes each. (磁性体) (Magnetic material)
【0358】 [0358]
9.1mlの3×SSCを用いて室温で一度洗浄する。 Once washed at room temperature with 3 × SSC in 9.1 ml. (磁性体) (Magnetic material)
【0359】 [0359]
10.50μlのdH Oにビーズを再懸濁し、ハイブリダイゼーションオーブン中で70℃で30分間、または85℃で10分間ビーズを加熱する(または500rpmでサーモミキサーで)ことによってDNAを溶出する。 Beads were resuspended dH 2 O for 10.50Myueru, 30 minutes at 70 ° C. in a hybridization oven, or (at or 500rpm in thermomixer) to 85 ° C. with heating for 10 minutes the beads to elute the DNA by. 使用中の磁性体を分離し、ビーズを捨てる。 To separate the magnetic material in use, throw away the beads.
【0360】 [0360]
11. 11. 上記のラムダDNAに由来する挿入物DNAを調製するのと同様のプロトコールを用いて、パニングしたDNAの1〜5μlをPCR増幅する。 Using the same protocol as for preparing an insert DNA derived from the above lambda DNA, PCR amplification of 1~5μl panning the DNA.
【0361】 [0361]
12.5μlをアガロースゲル上で確認する。 It is confirmed on an agarose gel 12.5μl.
注:この反応生成物は、通常0.5〜5kbの範囲内の大きさで1.5〜2kb当たりに中心がある生成物からなる濃い塗末標本でなくてはならない。 Note: The reaction product must be dark smears made from the product centered per 1.5~2kb a size in the range of usually 0.5~5Kb.
【0362】 [0362]
13.1〜4μlを、PCR2.1−TopoTAクローニングベクターにクローニングする。 The 13.1~4μl, is cloned into PCR2.1-TopoTA cloning vector.
【0363】 [0363]
14.2×3μlをTop10Fの化学的に構成した細胞に形質転換する。 Transforming 14.2 × 3 [mu] l chemically configuration cells of Top 10 F. 各形質転換体を2×150mmのLB−kanプレートにプレーティングする。 Each transformant plated onto LB-kan plates 2 × 150 mm. 30℃で一晩インキュベートする。 Incubate overnight at 30 ° C.. (理想的な密度はプレート一枚当たり〜3000コロニーである)。 (Ideal density is 3,000 colonies per one plate).
ライブラリーに対して多くの表示コロニーを得る必要があれば形質転換を繰り返す。 If it is necessary to get a lot of display colonies against libraries repeated transformation. バイオパニングしたDNAを公記録する。 Bio-panning the DNA to public record.
【0364】 [0364]
15. 15. 適当な鋳型とPCR 32 P標識化反応を避けて進行させるための単一のプライマーとともに、プレートをハイブリダイゼーショングループに移す。 With a single primer for advancing avoiding suitable mold and PCR 32 P-labeled reaction, transfer the plates to the hybridization groups.
【0365】 [0365]
結果の分析1. Analysis of the results 1. プレートからフィルターリフティングが行われ、適切なプローブにハイブリダイズする。 Plate filter lifting is performed from the hybridized to appropriate probes. 得られたフィルムはバイオパニングを行うために提供されうる。 The resulting film can be provided in order to perform the biopanning.
【0366】 [0366]
2. 2. 当初のコロニープレートにフィルムを並べる。 Arrange the film to the original colony plate. 陽性の「フィルム上の点」に対応するコロニーをつま楊枝で取り上げ、LB−Kanプレートに貼り付け、そして4mlのTB−Kan中でインキュベートする。 Colonies corresponding to the "point on the film" positive featured in toothpicks, stuck on LB-Kan plates and incubated in TB-Kan in 4 ml. 自動化のためには1mlのTB−kanを96−ウェルのプレートでインキュベートし、そして37℃で18時間インキュベートする。 For automation incubated plates of TB-kan 96-wells 1 ml, and incubated for 18 hours at 37 ° C..
【0367】 [0367]
3. 3. 一晩の培養物のミニプレップを行う(可能であればバイオメック(Biomek))。 Perform a mini-prep of a culture of overnight (if possible Biomek (Biomek)). 挿入物サイズを調べるためにEcoRIを用いて消化する。 Digestion with EcoRI to examine the insert size.
2μlのDNA 2μl of DNA
0.5μlのEcoRI EcoRI of 0.5μl
1μlの10×EcoRI緩衝液6.5μlのdH DH 2 O in 1μl of 10 × EcoRI buffer 6.5μl
37℃で1時間インキュベートする。 Incubated for 1 hour at 37 ° C.. アガロースゲル上で挿入物の大きさを確認する。 Check the insert size on an agarose gel.
大きい挿入物クローン(>500bp)は、可能な場合には遺伝子特異性のプライマーを用いてPCRで確認される。 Large insert clones (> 500 bp), if possible is confirmed by PCR using primers gene specificity.
4. 4. 次に複数の陽性のクローンを配列決定する。 Then sequenced clones multiple positive.
5. 5. グリセロールストックは全ての対象のクローン(>500bp)から作製すべきである。 Glycerol stock should be made from all of the target clone (> 500bp).
【0368】 [0368]
実施例8 Example 8
海水試料から得られる海洋微生物の高処理培養17. Of marine microorganisms obtained from seawater sample high-throughput culture 17. 細胞懸濁液の調製細胞は、0.22μmの膜を通過させて110Lの表面の水を濾過すると得られた。 Preparation cells in the cell suspensions were obtained and passed through a 0.22μm membrane and filtering water of the surface of 110L. 次にこの細胞ペレットを海水で再懸濁し、容量100μLを細胞を封入するために用いた。 Then the cell pellet was resuspended in sea water, with capacity 100μL to encapsulate cells. これによって、1mL当たり約10 個の細胞数が提供された。 Thus, about 10 7 cell number per 1mL is provided.
【0369】 [0369]
18. 18. GMDへの細胞の封入以下の試薬を用いた:セルミックス(CelMix)(登録商標)エマルジョンマトリックス及びセルゲル(CelGel)(登録商標)封入化マトリックス(One Cell Systems, Inc., Cambridge, MA)、プルロニック(Pluronic)F−68溶液、並びにダルベッコのリン酸緩衝塩(Ca 2+及びMg 2+を含まないPBS)である。 With a reagent of inclusion following cells to GMD: Cell Mix (CelMix) (R) emulsion matrix and Sergel (CelGel) (TM) encapsulated matrix (One Cell Systems, Inc., Cambridge, MA), Pluronic (Pluronic) F-68 solution, and phosphate buffered salt Dulbecco (PBS without Ca 2+ and Mg 2+). 15mlのセルミックス(CelMix)(登録商標)エマルジョンマトリックスを含むそれぞれのシンチレーションバイアルを40℃の水浴中に置き、最短30分間で40℃で平衡化させた。 15ml cell mix (CelMix) (registered trademark) each scintillation vials containing emulsion matrix placed in a water bath at 40 ° C., and allowed to equilibrate at 40 ° C. for a minimum 30 minutes. 30ulのプルロニック溶液F−68(10%)を溶解したセルゲル(CelGel)(登録商標)アガロースの6バイアルそれぞれに添加した。 30ul Pluronic solution F-68 Sergel obtained by dissolving (10%) (CelGel) was added to (R) 6 vials each agarose. このアガロース混合物を最短で3分間かけて40℃にインキュベートした。 The agarose mixture was over a minimum 3 minutes and incubated in 40 ° C.. 100ulの細胞(PBSに再懸濁されている)をセルゲル(CelGel)(登録商標)ボトルからなる6バイアル毎に添加し、得られる混合液を40℃で3分間インキュベートした。 Was added 100ul of cells (which is resuspended in PBS) Sergels (CelGel) for each (R) consists of a bottle 6 vials, the resulting mixture was incubated 40 ° C. for 3 minutes. 1mlのピペットを用い、空気泡の入るのを避けつつセルゲル(登録商標)−細胞混合物を、シンチレーションバイアル中の加温したセルミックス(登録商標)に滴下して加えた。 Using 1ml pipette enters while avoiding the Sergel (TM) of air bubbles - the cell mixture was added dropwise to the heated cell mix (registered trademark) in a scintillation vial. 続いてこの混合物を、セルシス(CellSys)100(登録商標)微小液滴(MicroDrop)マーカーを用いて以下の通りに乳濁化した。 Subsequently the mixture was emulsified as follows using CELSYS (CellSys) 100 (R) microdroplets (Microdrop) markers. 即ち、室温(RT)で1分間、2200rpmをかけ、続いて氷上で1分間、2200rpmをかけ、続いて氷上で6分間1100rpmをかけて、結果的に直径が約10〜20ミクロンの微小液滴を含む封入混合物とする。 That is, 1 minute at room temperature (RT), and subjected to 2200 rpm, followed by ice for 1 minute, multiplied by 2200 rpm, followed by over 6 min 1100rpm on ice, resulting in diameter fine droplets of about 10-20 microns and encapsulating the mixture comprising. 次に封入した混合物を二本の15mlの円錐型チューブに分割し、それぞれのチューブにおいて乳濁液を5mlのPBSで重層した。 Then the mixture was sealed and divided into conical tubes two of 15 ml, was layered emulsion with 5ml of PBS in each tube. 続いてこのバイアルチューブをベンチトップ(bench top)の遠心分離装置で室温にて10分間、1800rpmで遠心分離すると、結果的に可視化したゲル微小液滴(Gel MicroDrop)(GMD)ペレットが得られた。 Followed by 10 minutes at room temperature centrifuge benchtop the vial tubes (bench top), when centrifuged at 1800 rpm, resulting in visible gel microdroplets (Gel MicroDrop) (GMD) pellets were obtained . このオイル相を続いてピペットで除去し、オイル廃棄用容器に廃棄した。 The oil phase is subsequently removed by pipette and discarded containers oil disposal. 残っている水性の上清を吸引し、それぞれのペレットを2mlのPBSに再懸濁した。 The supernatant of the remaining aqueous was aspirated and resuspended each pellet of PBS 2 ml. 次にそれぞれの再懸濁したペレットを10mlのPBSで重層した。 Then the pellet was resuspended in each overlaid with 10ml of PBS. GMD懸濁液をそれから室温で5分間、1500rpmで遠心分離した。 GMD suspension then 5 minutes at room temperature and centrifuged at 1500 rpm. 上層に載せる工程を繰り返し、GMD懸濁液を再び遠心分離することによって、生存している細菌を含まない全てを除去した。 Repeating the step of placing the top layer, by again centrifuging the GMD suspension, to remove any free of surviving bacteria. 続いてその上清を取り除き、ペレットを1mlの海水に再懸濁した。 Then remove the supernatant, the pellet was resuspended in sea water of 1ml. それからGMDの大きさと、さらにGMDに封入した微生物の包含が均一であることを確認するために10ulのGMD懸濁液を顕微鏡下で調べた。 Then the size of GMD, was examined further GMD suspension 10ul to ensure that inclusion of microorganisms encapsulated in GMD is uniform under a microscope. このプロトコールによると結果的に、それぞれのGMDに1〜4個の細胞が封入されていた。 Consequently, according to this protocol, 1-4 cells were encapsulated in each GMD.
【0370】 [0370]
19.16S rRNA遺伝子配列により同定を行うための単一細胞を含むGMDの選別培養を行う第1日目に、本発明者らは、1個〜4個の細胞を含み(ただしほとんどは1個だけの細胞を含んでいる)占領されたGMDを選別した。 On the first day of performing screening cultures of GMD include a single cell for performing identification by 19.16S rRNA gene sequence, we include one to four cells (although mostly one only include the cells) were selected occupied the GMD. この選別は、GMDの内側の細胞をSyto9を用いて染色し、続いて緑色蛍光(その染料から発する)とゲートを選別するためのパラメータである側方散乱とを選別することによって、Mo−Flo装置(Cytomation)にて行った。 This selection is by selecting the side scattered and is a parameter for the inner cells of GMD were stained with SYTO 9, followed by green fluorescence (emitted from the dye) and sorting gates, Mo-Flo It was carried out by apparatus (Cytomation). この染色は、細胞が大腸菌よりもずっと小さく、そのために非常にゆっくりとした光の散乱シグナルを示すために必要であった。 This staining, cells much smaller than E. coli, was required to show the scattering signal of the light very slow for that. 標的のGMDはPCR混合物を含む96−ウェルプレートに選別されて、その選別後、直ちに増幅できるように準備された。 GMD targets are sorted into 96-well plates containing PCR mixtures, after their selection, it is prepared to amplify immediately. 15分間の煮沸の前に反応が起こらず、そのため増幅させる前に室温で作業することが可能になるように、本発明者らは、ホットスタート(HotStart)酵素(Qiagen)を用いた。 The reaction does not occur prior to the 15 minutes boiling, therefore so it is possible to work at room temperature prior to amplification, we used a hot start (HotStart) enzyme (Qiagen). PCRを開始する前に、ストラタリンカー(Stratalinker)(Stratagene)とともにPCR混合物を14分間、充分なパワーで照射することによって、選別の前にその混合物に存在する何らかの潜在的なゲノムDNAを架橋する必要があった。 Before starting the PCR, Stratalinker (Stratalinker) (Stratagene) with PCR mixture for 14 minutes, by irradiating with sufficient power, need to cross any potential genomic DNA present in the mixture prior to sorting was there. 用いたプライマーには、大腸菌遺伝子配列における位置に応じて27Fと1392Rのペア、及び27Fと1522Rのペアが含まれる。 The primers used, include 27F and 1392R pairs, and 27F and 1522R pair depending on the position in E. coli the gene sequence. このプライマーは、IDT−DNAテクノロジーから入手し、HPLCによって精製した。 The primer were obtained from IDT-DNA technology and purified by HPLC. この反応で用いたプライマーの濃度は0.2μMであった。 The concentration of the primers used in this reaction was 0.2 [mu] M. 本発明者らは、3段階、即ちa)15分間の煮沸、b)1サイクル毎に0.5℃ずつ62℃から55℃にアニール化温度を減少させて行う15サイクル、c)30秒間で始めて1サイクル毎に1秒ずつアニール化時間を増加させ、ただし温度は55℃で一定に保って行う一連のサイクル(20〜40回)、からなる「タッチダウン」プログラムを用いた。 The present inventors have three stages, namely a) 15 minutes boiling, b) 15 cycles performed by decreasing the annealing temperature from 62 ° C. by 0.5 ℃ per cycle 55 ° C., c) 30 seconds started by increasing anneal time by 1 second per cycle, except the temperature was using a series of cycles performed kept constant at 55 ° C. (20 to 40 times), consisting of "touch-down" program. PCRの他の段階は全て製造者によって推奨されているとおりにした。 Other stages of PCR were as recommended by all manufacturers. このプロトコールによって、封入された個々の細胞、または小さく連合した細胞由来の16S rRNA遺伝子の増幅ができた。 This protocol could amplify the 16S rRNA genes from encapsulated individual cells or small Union cells. 次にこのPCR産物をTOPO−TA(Invtrogen)クローニングベクターにクローニングし、ダイ−ターミネーションサイクルシークエンシング(dye−termination cycle sequencing)(Perkin−Elmer ABI)によって配列決定した。 Then clone this PCR product into TOPO-TA (Invtrogen) cloning vector, die - were sequenced by termination cycle sequencing (dye-termination cycle sequencing) (Perkin-Elmer ABI).
【0371】 [0371]
GMD内部に封入した細胞の細胞増殖封入したGMDを、増殖のための栄養素を提供する培養培地を流すことが可能で、かつ細胞から生じる老廃物を洗い流すことが可能なクロマトグラフィーカラムにかけた。 The GMD was cell proliferation encapsulation of cells encapsulated GMD therein, can flow the culture medium which provides nutrients for growth, and subjected to a chromatography column which can wash away the waste products arising from the cell. この実験は、海水の使用、及び改善剤(痕跡量の金属及びビタミン、痕跡量の金属とビタミンを含むアミノ酸、希釈された豊富な有機的海洋培地を含む無機の栄養分)を含む4つの処理からなる。 This experiment used the sea water, and improving agents of four processes including (trace metals and vitamins, amino acids including trace metals and vitamins, nutrients inorganic containing abundant organic marine medium diluted) Become. この異なるセットの栄養素によって、別個の微生物集団に傾向させるための勾配が与えられる。 The nutrients of different sets, is given a gradient in order to tend to separate microbial population. 培地として基本的に用いた海水は、カラムに改良と導入を行う前に、1000kDaと0.22μmのフィルター膜を通過させてフィルター滅菌し、続いて細胞を17週間インキュベートし、細胞の増殖を位相差顕微鏡でモニターした。 Essentially sea water used as medium, prior to the introduction and improvements to the column, filter sterilized by passing through a 1000kDa and 0.22μm filter membrane, cells were then incubated for 17 weeks, much cell proliferation phase difference was monitored under a microscope. 細胞の同定は、増殖したコロニーの16S rRNA遺伝子配列によって行った。 Identification of cells was performed by 16S rRNA gene sequence of grown colonies.
【0372】 [0372]
20. 20. 一個またはそれ以上の細胞型からなるコロニーを含むGMDの選別異なる処理についての相違する構成と共通する構成を同定するために本発明者らは、GMDの「大量選別」を行った。 The present inventors to identify differences constituting the common configuration for selecting different processing of GMD containing colonies consisting of one or more cell types were "mass screening" of GMD. これは、それぞれのカラムからGMDのサブ試料を採取することによって行い、それらをフローサイトメーターにかけた。 This is done by taking the sub-sample of GMD from each column was subjected them to flow cytometer. 空のGMDと区別することが容易である、個々の細胞の大きさが0.5〜5μmの範囲内にある10個またはそれ以上の細胞のコロニーで占領されたGMDとして、前方散乱及び側方散乱をゲート基準として選択した。 It is easy to distinguish an empty GMD, as GMD in which the size of individual cells was occupied by 10 or more cell colonies that are within the scope of 0.5 to 5 [mu] m, the forward scatter and side the scattering was chosen as the gate criteria. 選別について正しいゲートを本発明者らが選択したことについては、位相差顕微鏡によってそれぞれの時点で立証した。 For the present inventors have the correct gate for sorting it has been selected have demonstrated at each time point by phase contrast microscopy. それから本発明者らは、それぞれの個々のPCR反応(上記のとおりに準備した)につき全部で300個のGMDを選別し、ゲル電気泳動で可視化できるのに充分なPCR生成物が得られるように、全部で50から60サイクル行うべくサーモサイクラーでその反応を進行させた。 Then the present inventors have screened 300 of GMD in total for each of the individual PCR reaction (prepared as described above), as sufficient PCR product for can be visualized by gel electrophoresis to obtain It was allowed to proceed the reaction in a thermocycler to total performed from 50 60 cycles. 同カラムから得られるPCR反応液を合わせ(2〜4回の複製物)、クローニングしてから上記のように配列決定することによって、それぞれのカラムから得られる系統発生的な多様性を評価でき、且つ異なる栄養素の管理下で利用して得られた偏向作用が観察できた。 The combined PCR reaction solution obtained from the column (2-4 times replicates), by sequencing as described above after cloning, can evaluate the phylogenetic diversity obtained from each column, deflecting action obtained by utilizing and under the control of different nutrients could be observed.
【0373】 [0373]
遺伝子の配列決定と系統発生論的分析遺伝子の配列は、ARB系統発生論的プログラムを用い、本発明者らの16S rRNAデータベースと並べて比較した。 Sequencing and phylogenetic analysis sequence of a gene of a gene, using the ARB phylogenetic program were compared side by side with 16S rRNA database of the present inventors. 最大のパーシモニー(Maximun Parsimony)及び隣接する連結ツリーは、増幅した遺伝子配列(約1400bp)を用いて構築した。 Maximum Pashimoni (Maximun Parsimony) and adjacent linkage tree was constructed using the amplified gene sequence (approximately 1400 bp).
【0374】 [0374]
実施例9 Example 9
ミクロ抽出方法 Micro extraction method
混合集団から得られるクローンを含むストレプトミセスの単一コピーが寒天上でFACS選別され、これは個々のコロニーに発生させることが可能で、個々のクローンとしてバイオアッセイされる。 Single copy of Streptomyces containing clones obtained from a mixed population is FACS sorted on agar, which can be generated in individual colonies are bioassays as individual clones.
【0375】 [0375]
生物活性代謝産物を発現するクローンの構築 Construction of clones expressing biologically active metabolite
ストレプトミセス−ムラヤマンシス(Streptomyces murayamansis)のゲノムライブラリーはpJO436(Biermanら、Gene 1991 116: 43−49)ベクターで構築され、ポリケタイド合成の際のプローブとハイブリダイズされる。 Streptomyces - Murayamanshisu (Streptomyces murayamansis) genomic library pJO436 (Bierman et al., Gene 1991 116: 43-49) are constructed in the vector, it is hybridized with probes during polyketide synthesis. ハイブリダイズしたクローン(IB)を選択して、ストレプトミセス−ベネズエラ(Streptomeces venezuelae)ATCC 10712菌株にシャトルさせた。 Select hybridized clones (IB), Streptomyces - were shuttle Venezuela (Streptomeces venezuelae) ATCC 10712 strain. ベクターpMF17も陰性の対照としてS. Vector pMF17 also S. as a negative control ディバーサ(S. diversa)に導入した。 It was introduced into Dibasa (S. diversa). 固体培地上でバイオアッセイした場合、クローンIBはミクロコッカス−ルテウス(Micrococcus luteus)に対して強い生物活性を示したが、これはその挿入物が生物活性のポリケタイド分子をコードするクローンIBに存在していることを示す。 If bioassayed on solid media, Clone IB is Micrococcus - showed strong biological activity against luteus (Micrococcus luteus), which is present in the clone IB of the insert encodes a polyketide molecule bioactive show that is.
【0376】 [0376]
S. S. ベネズエラクローンの FACS 選別 FACS sorting of Venezuela clone
pJO436ベクターだけでなく、クローンIBを含むS. pJO436 vector as well, S. including Crohn IB ベネズエラの外接合個体の胚種を、MYM寒天+50ug/mlのアプラマイシン(Apramycin)を含む対応するプレートに48−ウェル、96−ウェル、及び384−ウェルの形式でFACS選別する。 The germ Venezuela outer joining individual is FACS sorted with the corresponding plates 48-well, 96-well, and 384-well formats including MYM agar + 50 ug / ml of apramycin (Apramycin). 単一の胚種クローンは、発芽され、増殖され、4〜5日間で胞子形成されうる。 Single germ clones were germinated, grown, may be sporulated by 4-5 days.
【0377】 [0377]
天然産物抽出法:クローンが充分に増殖し、4〜5日間で胞子形成した後、以下の容量の溶媒メタノールをクローンを含む各ウェルに添加した。 Natural product extraction method: clone sufficiently grown, was sporulated by 4-5 days, and the solvent methanol following volume was added to each well containing clones.
48ウェル形式:0.8ml 48-well format: 0.8ml
96ウェル形式:0.100ml 96-well format: 0.100ml
384ウェル形式:0.06ml 384-well format: 0.06ml
このプレートを室温で一晩インキュベートした。 The plates were incubated overnight at room temperature.
翌日、以下の容量をクローンを含むウェルから回収した。 The next day, it was recovered the following capacity from wells containing clones.
48ウェル形式:0.3ml 48-well format: 0.3ml
96ウェル形式:0.060ml 96-well format: 0.060ml
384ウェル形式:0.030ml 384-well format: 0.030ml
抽出物は一個のウェルからアッセイし、2、4及び10ウェルから得られる抽出物を合わせた後にアッセイした。 The extracts were assayed from one of the wells were assayed after the combined extracts obtained from 2, 4 and 10 wells.
メタノール抽出物を乾燥し、40ulのメタノール:水に再懸濁してからその20ulを指標の菌株であるM. The methanol extract was dried, methanol 40 ul: a strain indicator that 20ul after resuspension in water M. ルテウスに対してアッセイした。 It was assayed against luteus.
【0378】 [0378]
クローンIBを含むS. S. including Crohn IB ベネズエラの単一コロニーは、ミクロ抽出法によって抽出できるように、またバイオアッセイ法によって検出できるように、384−ウェル形式と同様、48−ウェル、96−ウェルでも充分な生物活性分子を産生した。 Single colonies of Venezuela, as can be extracted by microextraction method, and as can be detected by bioassay, similarly to the 384-well format, were produced 48-well, a sufficient biologically active molecules even in a 96-well.
【0379】 [0379]
実施例11 Example 11
S. S. ベネズエラ 10712 におけるアクチノルホジン経路の発現 Expression of actinorhodin route in Venezuela 10712
pJO436において構築されたSau3A pIJ2303ライブラリーがS. Sau3A pIJ2303 libraries constructed in pJO436 is S. ベネズエラに導入された場合に、青灰色が出現する一つの外接合個体がスポットされた。 When introduced into Venezuela, one exterior junction individuals blue-gray appears were spotted. この外接合個体はR2−S寒天上に青色の色素を示したが、それはS. This outer joint individuals showed a blue dye on R2-S agar, which S. ベネズエラJO436において異種経路(アクチノルホジン)がうまく発現することを示唆している。 Heterologous pathway (actinorhodin) suggesting that expressed well in Venezuela JO436.
【0380】 [0380]
S. S. ベネズエラ 10712(pJO436:: アクチノルホジン の分離安定性 Venezuela separation stability of the 10712 (pJO436 :: actinorhodin)
低分子を産生するストレプトミセスクローンは抗生物質選択性のない状態で増殖するため、S. Because Streptomyces clones that produce small molecules to grow in the absence of antibiotic selective, S. ベネズエラのpJO436組換えクローンが安定であるかどうかを決定するために重要であった。 Venezuela pJO436 recombinant clones was important in order to determine whether it is stable. S. S. ベネズエラ10712(pJO436::アクチノルホジン)クローンが一例として用いられた。 Venezuela 10712 (pJO436 :: actinorhodin) clones were used as an example.
【0381】 [0381]
活動性クローンをアプラマイシンを用いた場合と用いない場合に、R2−S液体培養物において増殖させ、全細胞の計数を、アプラマイシンを用いた場合と用いない場合にR2−S寒天上にプレーティングすることによって行った。 Play active Crohn when with and without apramycin, grown in R2-S liquid cultures, the counting of all cells, in the case with and without apramycin on R2-S agar It was performed by computing. 活動性のクローンは、アプラマイシンを用いて増殖させた場合と用いないで増殖させた場合にそれぞれ、100%と96%のアプラマイシン耐性コロニーを生じた。 Activity clones, respectively when grown without using a when grown with apramycin, resulted in 100% and 96% of the apramycin resistant colonies. このことは、S. This means that, S. ベネズエラpJO436クローンが分離的に全く安定であることを示唆している。 Venezuela pJO436 clones suggesting that the disjunctive is quite stable.
【0382】 [0382]
S. S. ベネズエラ 10712(pJO436:: アクチノルホジン の発現安定性 Venezuela expression stability of the 10712 (pJO436 :: actinorhodin)
本発明者らは、S. The present inventors have, S. ベネズエラ10712においてアクチノルホジン遺伝子クラスターが首尾良く発現することを示した。 Actinorhodin gene cluster showed that successfully express in Venezuela 10712. しかしながらこのクローンを液状培養物中で増殖させた場合、アクチノルホジンをうまく産生できず、それはその青色が存在しないことによって検出されるとおりである。 However when grown this clone in liquid culture, can not successfully produce actinorhodin, it is as detected by absence of its blue color. それにも関わらずそのような培養物から得られる菌糸体を固体培地にプレーティングすると、アクチノルホジン産生コロニーが明らかに顕在化した。 If nevertheless such mycelia obtained from the culture is plated on solid medium, actinorhodin production colonies clearly manifested. そのコロニーの大部分はかすかな青色を生じたのに対して、数個のコロニーは豊富なアクチノルホジンを産生した。 Most of the colonies whereas yielded faint blue, several colonies produced a rich actinorhodin. 豊富にアクチノルホジンを産生するこれらのコロニーは、HBC(超青色クローン(hyper blue clones))クローンと命名した。 These colonies rich produce actinorhodin is, HBC (super blue clones (hyper blue clones)) was designated clone.
【0383】 [0383]
これらの観察結果は、HBCクローンにおいてはおそらく、非常に効率よくアクチノルホジンを発現することを可能にするような宿主の突然変異が起こっていたことを示唆している。 These observations, in HBC clones probably suggest that mutations of hosts such as to allow it to express very efficiently actinorhodin had occurred. 効率のよいアクチノルホジン発現を導くことのできる突然変異には、cutRSのような陰性の調節因子の減少、陽性の調節因子の過剰発現、またはアクチノルホジンに対する前駆体を提供する経路の効率よい発現といった、さまざまな標的が含まれる。 Mutations capable of directing the efficient actinorhodin expression, decreased regulator negative as CutRS, overexpression of the regulatory factors positive, or such efficient expression of a path that provides a precursor for actinorhodin, various such is included target. したがってHBSクローンによるアクチノルホジンの過剰産生は、ランダム突然変異によるか、あるいは特定のcutRSノックアウト突然変異によって、低分子の異種発現に対してより最適な菌株を構築することが現実に可能であることを強く示唆している。 Overproduction of actinorhodin by HBS clones therefore, strongly either by random mutagenesis, or by specific cutRS knockout mutant, it is possible to construct a more optimal strains against heterologous expression of low molecule capable actually It suggests.
【0384】 [0384]
S. S. ベネズエラのジャドマイシン( jadomycin )遮断性突然変異体の構築 Construction of Judd hygromycin (jadomycin) blocking mutant Venezuela
ジャドマイシン生合成遺伝子クラスターのOrf1を標的として選択した。 The Orf1 Judd biosynthetic gene cluster was chosen as a target. プライマーは、将来のサブクローニングのための適当な制限酵素切断部位を用いてjad−Lとjad−R断片を増幅することができるように設計した。 Primers were designed to be able to amplify the jad-L and jad-R fragment with a suitable restriction enzyme cleavage sites for future subcloning. S. S. ベネズエラはハイグロマイシン(hygromycin)に感受性であって、したがってハイグロマイシン耐性遺伝子がorf−1遺伝子を分裂させるために用いられるであろう。 Venezuela will be sensitive to hygromycin (hygromycin), therefore hygromycin resistance gene is used to divide the orf-1 gene. ジャドマイシンorf−1を分裂させるために用いられる戦略は、添付した図面で説明される。 Strategy used to disrupt Judd hygromycin orf-1 are set forth in the accompanying drawings. そこでorf−1遺伝子のハイグロマイシン−分裂性コピーはpKC1218上に配置できるし、またVS153の染色体だけでなく、S. Therefore orf-1 gene hygromycin - fissile copy to be placed on PKC1218, also well chromosomes of VS153, S. ベネズエラ10712において遺伝子を置換するために用いることができる。 It can be used to replace genes in Venezuela 10712.
【0385】 [0385]
S. S. ベネズエラにおける黄色クローンの発現 Expression of yellow clones in Venezuela
S. S. リビダンス(S. lividans)クローン525Sm575から得られる黄色クローンの挿入物を回収するためのシングルアームレスキュー法(single arm rescue technique)が記載された。 Lividans (S. lividans) yellow clones derived from clone 525Sm575 insert single arm rescue to recover (single arm rescue technique) have been described. 回収したクローン番号3は、S. The recovered clone number 3, S. ベネズエラ10712に、同様にVS153にも同等であった。 In Venezuela 10712, it was similar as well to VS153. 黄色はVS153のプレートと同様に10712のプレートの両方において数日後に顕在化したが、pJO436ベクター単独の対照においては現れなかった。 Yellow became apparent after a few days in both plates 10712 As with plate VS153, but did not appear in the control of pJO436 vector alone. 10712の三つの黄色のクローンを液状R2−S培地において増殖させたところ、三つは全て豊富に黄色を産生した。 Three yellow clone 10712 was grown in liquid R2-S medium and produced all three are rich in yellow. この実験では、宿主としてS. In this experiment, S. as a host ベネズエラを確認するとともに、第1の時点ではアクチノルホジン遺伝子クラスターを用いたが第2の時点では異種発現させるためのベクターとしてpJO436を確認した。 Reaffirmed Venezuela, was used actinorhodin gene cluster at a first time point at the second time point was confirmed pJO436 as a vector to heterologous expression. この黄色クローン挿入物は、本発明者らの菌株改良プログラムにおいて、異なる菌株を確認する際に現在用いられている。 The yellow clone insert in strain improvement program of the present inventors, are currently used when checking different strains.
【0386】 [0386]
3. 3. マイクロタイタープレート形式における交配プロトコールの開発 Development of mating protocol in the microtiter plate format
公記録された個々の大腸菌クローンを得るために、本発明者らのマイクロタイタープレート形式で交配プロトコールを開発を試みている。 To obtain a public recorded individual E. coli clones, and tried to develop a mating protocol in the microtiter plate format of the present inventors. このプロトコールによると本発明者らは、96−ウェルのマイクロタイタープレートに大腸菌ライブラリーを選別するように計画している。 The present inventors have found, according to this protocol are planning to sort the E. coli library 96-well microtiter plate. その際S. At that time S. ディバーサとの交配は、大腸菌クローンを含む96−ウェルのマイクロタイタープレートに対応する配列形式でR2−S寒天プレート上でなされると考えられる。 Mating with Dibasa is believed to be made in R2-S agar plates in an array format corresponding to a 96-well microtiter plate containing E. coli clones. バイオアッセイ法を交配用R2−Sプレート上で誘導することができ、またはクローンを別の適当な寒天プレート上にプレーティングされた第1の複製物を形成して、その後、バイオアッセイすることもできる。 Can induce bioassay Mating for R2-S plate, or clone first replica to form which is plated with another suitable agar plates, then, also be bioassay it can. 本発明者らは、S. The present inventors have, S. ディバーサ外接合個体のライブラリーの中に生物活性なクローンを検出し、このアプローチによって大腸菌クローンに戻ることが可能になると思われる。 Detecting the biological activity clones in libraries Dibasa outside bonding individual appears to be possible to return to the E. coli clones by this approach. この際大腸菌クローンを、再形質転換と生物活性の確認を行うためにS. S. The time E. coli clones, in order to check the re-transformation and biological activity ディバーサに戻して交配させるとよい。 It may be crossed back to the Dibasa.
【0387】 [0387]
予備的な実験では、交配はR2−S寒天プレートにS. Preliminary experiments, mating S. in R2-S agar plates ディバーサの胞子を大腸菌のドナー細胞をともにスポットする(広げるのではない)ことによってなされる。 Spores of Dibasa made by both spotted donor cells of E. coli (not widen). 約8時間後にプレートは、アプラマイシンとナリジキシ酸を用いて通常どおり重層した。 After about 8 hours the plates were normally overlaid with apramycin and nalidixic acid. 外接合個体は、大腸菌ドナーを添加したこれらのスポットでのみ出現するが、S. Outer bonding individuals, but it appears only in those spots was added E. coli donor, S. ディバーサ胞子のみを含むスポットでは出現しなかった。 It did not appear in the spot, including the only Dibasa spores. この技術を充分に開発するにはいくつかのさらに標準化を行うべき必要があるが、これらの当初のデータは非常に将来の見込みがある。 Although in developing this technique adequately, it is necessary to make some further standardization, these initial data is very promising for the future.
【0388】 [0388]
実施例12 Example 12
単細胞または断片化した菌糸体の産生 Production of single cell or fragmented mycelium
単細胞または断片化菌糸体を産生するためには、25mlのMYM培地をストレプトミセス10712の胞子の懸濁液100ulとともに、250mlのバッフルフラスコ中でインキュベートし(下記の配合表参照)、30℃で250rpmにて一晩インキュベートした。 To produce single-cell or fragmented mycelium, the MYM medium 25ml with suspension 100ul of spore of Streptomyces 10712, and incubated in baffled flasks 250 ml (see recipe below), 250 rpm at 30 ° C. It was incubated overnight at. 24時間、インキュベートした後、10mlを50mlの円錐型ポリプロピレン製遠心分離用チューブに移し、4,000rpmで10分間、25℃で遠心分離した。 24 hours after incubation, transferred to 10ml to conical polypropylene centrifuge tubes 50 ml, 10 minutes at 4,000 rpm, and centrifuged at 25 ° C.. 上清をデカントし、ペレットを10mlの0.05M TES緩衝液中に再懸濁した。 The supernatant was decanted, the pellet was resuspended in 0.05 M TES buffer 10 ml. 細胞をMYM寒天プレートに選別し(1滴当たり1個の細胞、1滴当たり5個の細胞、1滴当たり10個の細胞に分離する)、プレートを30℃でインキュベートした。 Cells were sorted into MYM agar plates (one cell per drop, 5 cells per drop, is separated into 10 cells per 1 drop), and the plates were incubated at 30 ° C..
【0389】 [0389]
MYM培地(Stuttard, 1982, J. Gen. Microbiol. 128: 115−121)は、4gのマルトース、10gの麦芽抽出物、4gの酵母抽出物、20gの寒天、pH7.3、水により1Lとする。 MYM medium (Stuttard, 1982, J. Gen. Microbiol 128:. 115-121), the maltose 4g, malt extract 10 g, yeast extract 4g, 20 g agar, pH 7.3, and 1L with water .
【0390】 [0390]
実施例13 Example 13
以下に、超高処理能力のフローサイトメトリーを用いて大きな基質(例えば、セルラーゼ類、アミラーゼ類、キシラナーゼ類)を必要とする新規な酵素を開発するための方法が記載されている。 Hereinafter, a large substrate (e.g., cellulases, amylases, xylanases) using flow cytometry ultra high throughput method for developing novel enzymes that require is described. これらの基質はあまりに大きいため細菌細胞に入ることができないので、単一の細胞内検出法以外の戦略をフローサイトメトリーを用いるためには利用する必要がある。 These substrates can not enter into bacterial cells for too big, in order to use the flow cytometry strategy other than a single cell detection methods should be utilized. この目的のため、本発明者らはゲル微小液滴(GMD)法(One Cell Systems, Inc.)を適合させた。 To this end, the present inventors have adapted the gel microdroplets (GMD) method (One Cell Systems, Inc.). 特定すると、酵素の基質はGMDの中に捕獲され、酵素によってこの微小環境中で基質を加水分解させることができる。 With particular, substrate for the enzyme is trapped in the GMD, substrates can be a hydrolyzing in this microenvironment by the enzyme. しかしながら本方法は、何らかの特定のゲル微小液滴法に限定されない。 However, the present method is not limited to any particular gel microdroplets method. 捕獲分子を用いて誘導できるある種の微小液滴−形成物質が利用可能である。 Certain microdroplets can be induced using a capture molecule - forming substance is available. 基本的な実験計画は以下のとおりである。 The basic experimental design is as follows. 即ち、GMD内にDNAライブラリーを含む個々の細菌を封入し、細菌が数百から数千の細胞をそれぞれ含む大きさのコロニーに増殖できるようにする。 That is, the individual bacteria containing DNA library encapsulated within GMD, so that bacteria thousands of cells from a few hundred can grow to a size colonies each containing. GMDは、商業的に入手可能なビオチン(One Cell Systems)を用いて誘導したアガロースを用いて作製する。 GMD is prepared using agarose derived using commercially available biotin (One Cell Systems). 適当なコロニー増殖を行った後、ストレプトアビジンをビオチン化基質とビオチン−標識したアガロースとの間の架橋として機能させるために添加する。 After appropriate colony growth, streptavidin biotinylated substrate and biotin - added in order to function as a bridge between the labeled agarose. 最終的にビオチン化基質がGMDに添加され、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン架橋を介してGMD内に捕獲されると考えられる。 Finally biotinylated substrate is added to the GMD, biotin - believed to be trapped within the GMD via the biotin bridge - streptavidin. 細菌細胞が溶解されると酵素が細胞から放出される。 When bacterial cells are lysed enzymes are released from the cells. この酵素は基質の加水分解を触媒し、それによってGMD内の基質の蛍光が増加する。 This enzyme hydrolyzed the substrate to the catalyst, whereby the fluorescence of the substrate in the GMD is increased. 蛍光を発する基質は、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン架橋を介してGMD内に保持させることができ、したがってフローサイトメトリーを用いて蛍光に基づきGMDを単離することが可能になると考えられる。 Substrate that emits fluorescence, biotin - streptavidin - can be held in the GMD via the biotin bridge, thus believed to be possible to isolate the GMD based on fluorescence using flow cytometry. 完全な微小液滴を分離し、細菌コロニーからDNAをPCR法を用いて回収することができる。 Separating the complete microdroplets, the DNA from the bacterial colonies can be recovered by PCR. 本技術は、蛍光が増加するという結果を伴う基質を加水分解する何らかの酵素の発見に適用することができる。 This technique can be applied to a substrate with the result that fluorescence increases to the discovery of some enzymes hydrolyze. 例としては、限定するわけでないが、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、セカンダリーアミダーゼなどが含まれる。 Examples include, but are not necessarily limited to, include glycosidase, protease, lipase, ferulic acid esterase, such as secondary amidase.
【0391】 [0391]
あるシステムは、GMD内に分泌した抗体を保持するビオチン捕獲システムを用いる。 Some systems use a biotin capture system that holds the antibodies secreted into the GMD. このシステムは、望ましい抗体を高いレベルで分泌するハイブリドーマを単離できるように設計されている。 This system is designed hybridomas secreting the desired antibody at a high level so that it can be isolated. この基本的な設計は、ビオチン化アガロース、ストレプトアビジン、及び分泌した抗体を認識するビオチン化捕獲抗体を用いてビオチン−ストレプトアビジン−ビオチンサンドウィッチを形成することである。 This basic design is biotin using biotinylated agarose, streptavidin, and biotinylated capture antibody recognizes the secreted antibody - is to form a biotin sandwich - streptavidin. 「捕獲された」工程は蛍光化したレポーター抗体によって検出される。 "Captured" step is detected by a reporter antibody fluoresceinated. 続いてフローサイトメトリーを用いることによって、蛍光強度の増加に基づいて微小液滴を単離できる。 By using flow cytometry subsequently be isolated microdroplets based on the increase in fluorescence intensity. ここに記載された方法についての潜在的に独特な態様は、GMD内の酵素活性を決定するために大きな蛍光発生物質を使用することである。 Potentially unique aspects of the methods described herein is to use a large fluorescing substance in order to determine the enzyme activity in the GMD. さらにこの実施例は、真核細胞の代わりにDNAライブラリーを含む細菌細胞を使用しており、その細菌細胞が溶解して酵素へのアクセスが可能になるようなことは分泌したタンパク質には確認されない。 In addition, this embodiment is confirmed in proteins secreted are used bacterial cells, such as to allow access to the enzyme dissolved its bacterial cells containing DNA library instead of eukaryotic cells not.
【0392】 [0392]
蛍光発生物質は対象となる特定の酵素に容易に組み込むことができる。 Fluorogenic substances can be easily incorporated into a particular enzyme of interest. エステラーゼ基質の化学的合成についての特定の実施例が以下に記載されている。 Specific examples for the chemical synthesis of esterase substrate is described below. さらに、非常にさまざまな基質を作製するために利用できる別個のありうる化学的組み合わせを記載した二つの実施例が提供されている。 Furthermore, the two embodiments described chemical combinations which may be separate which can be used to generate a wide variety of substrates is provided.
【0393】 [0393]
GMD に結合可能な基質に至る反応シーケンスの例 Examples of the reaction sequence leading to a substrate capable of binding to GMD
【0394】 [0394]
最初の工程では、1−アミノ−11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン[参考文献3]、即ち不斉のスペーサーが、5−カルボキシフルオロセインのN−ヒドロキシサクシンアミドエステル(Molecular Probes)に結合する。 In the first step, 1-amino-11-azido-3,6,9-trio key sound decane [Reference 3], i.e. the spacer asymmetric is the 5-carboxy fluorescein N- hydroxysuccinimide amide ester (Molecular Probes ) to join. 結合したスペーサーの末端にあるアジド官能基の還元(段階2)を行った後、活性化ビオチン(Molecular Probes)をアミン末端に結合し(段階3)、続いてそのシーケンスはフルオレセイン部分のフェノール基をエステル化する(段階4)ことによって達成される。 After reduction of the azide functional group at the terminus of the bound spacer (Step 2), and the binding activity of biotin (Molecular Probes) in amine-terminated (step 3), followed by phenol groups of the sequence fluorescein moiety is accomplished by esterification (step 4). 得られる化合物は、エステラーゼ活性についてスクリーニングする際の基質として利用できる。 The resulting compounds can be used as a substrate for screening for esterase activity.
【0395】 [0395]
GMD− 結合可能な蛍光発生性の基質の設計 GMD- bondable fluorogenic substrate design
発光体−中心の発蛍光団構造であり、例えばクマリン、リゾルフィン、キサンテン、及び他のものなどの蛍光発生性の誘導体を形成する能力がある。 Emitters - a fluorophore structure of the center, e.g. coumarin, Rizorufin are capable of forming a fluorogenic derivatives such as xanthene, and others.
【0396】 [0396]
スペーサー−ビオチン部分と発蛍光団の間を連結させる化学的に不活性な部分である。 Spacer - a chemically inert moiety that connects the biotin moiety and the fluorophore. 例としては、アルカン類とオリゴエチレングリコールが挙げられる。 Examples include alkanes and oligoethylene glycol. スペーサーのタイプと長さの選択は、所望の生成物への合成経路、生成物の物理的性質(種々の溶媒における溶解度など)、及びアビジンの深部ポケットに結合するビオチンの能力に影響を与えるであろう、 Selection of the type and length of the spacer, affect the ability of biotin to bind to the desired synthetic route to product, the physical properties of the product (such as solubility in various solvents), and avidin deep pockets It will allo,
【0397】 [0397]
C1、C2、C3、C4−連結器単位であって、中心の発蛍光団構造と他の部分の間に共有結合を形成する。 C1, C2, C3, a C4- coupler units to form a covalent bond between the fluorophore structure and other parts of central. C1及びC2は、別個の酵素に指向する構造の特異性に影響を与える。 C1 and C2 affects the specificity of the structure directed to separate the enzyme. C3及びC4は、所望の生成物の安定性と、それへの合成経路を決定する。 C3 and C4 are determined and stability of the desired product, a synthetic route to it. 例には、エーテル、アミン、アミド、エステル、尿素、チオ尿素、及び他の部分が挙げられる。 Examples include ethers, amines, amides, esters, urea, thiourea and other parts.
【0398】 [0398]
R1及びR2−官能基であって、その結合は、発蛍光団の蛍光を消光するために与えられる。 A R1 and R2- functional groups, the binding is provided to quench fluorescence of the fluorophore. これらの置換基は、異なる酵素に指向する基質の特性を決定している。 These substituents are determining the characteristics of the substrate to be directed to different enzymes. 例には、直鎖状及び分枝状のアルカン類、モノ−及びオリゴ糖、不飽和炭化水素、並びに芳香族基が含まれる。 Examples include linear and branched alkanes, mono - and oligosaccharides, unsaturated hydrocarbons, as well as aromatic groups.
【0399】 [0399]
a. a. GMDに結合可能な蛍光共鳴エネルギー転移基質の設計 Binding fluorescent resonance energy transfer substrate design to GMD
発光体−発蛍光団。 Light emitter - the fluorophore. 例としては、アクリジン類、クマリン類、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、リゾルフィン、ポリフィリンなど。 Examples, acridines, coumarins, fluorescein, rhodamine, BODIPY, Rizorufin, like porphyrins.
【0400】 [0400]
消光物質−充分に近い距離にある場合、発蛍光団の蛍光を消光する能力のある部分。 Quencher - when in sufficiently close distance, is capable of quenching the fluorescence of the fluorophore moiety. 消光物質は、発蛍光団と同じ部分にあってもよいし、または異なる部分であってもよい。 Quencher may be may be in the same part as fluorophores, or different moieties.
【0401】 [0401]
ポリマーは数個のブロックからなり、その間の結合が酵素によって開裂できる部分である。 Polymers consists of several blocks, a portion where the coupling therebetween can be cleaved by an enzyme. 例としては、アミン、エーテル、エステル、アミド、ペプチド、及びオリゴ糖が挙げられる。 Examples are amines, ethers, esters, amides, peptides, and oligosaccharides thereof.
C1及びC2は、前述した設計におけるC3及びC4に等価である。 C1 and C2 are equivalent to C3, and C4 in the design described above.
スペーサーは前述した設計のスペーサーと等価である。 Spacer is equivalent to a spacer design described above.
【0402】 [0402]
参考文献: References:
[1]Gay, F, Kenney, J. [1] Gay, F, Kenney, J. S. S. , Dunne, J. , Dunne, J. F. F. 「分泌物の捕獲と報告ウェブ:ハイブリドーマ細胞を選択するための親和的誘導性のアガロース微小液滴の利用(Secretion capture and report web: use of affinity derivatized agarose microdroplets for the selections of hybridoma cells.)」J. "I reported the capture of secretions web: use of affinity induction of agarose microdroplets for selecting a hybridoma cell (Secretion capture and report web:. Use of affinity derivatized agarose microdroplets for the selections of hybridoma cells)" J . Immunol. Immunol. Meth. Meth. 1995, 182, 155−163. 1995, 182, 155-163.
[2]Powell, K. [2] Powell, K. T. T. and Weaver, J. and Weaver, J. C. C. 「ゲル微小液滴及びフローサイトメトリー:細胞集団に含まれる個々の細胞による抗体分泌の急速決定法(Gel microdroplets and flow cytometry: Rapid determination of antibody secretion by individual cells within a cell population.)」Bio/technology 1990, 8, 333−337. "Gel microdroplets and flow cytometry: rapid Determination of antibody secretion by individual cells contained in the cell population (Gel microdroplets and flow cytometry:. Rapid determination of antibody secretion by individual cells within a cell population)" Bio / technology 1990, 8, 333-337.
[3]Schwabacher, A. [3] Schwabacher, A. W. W. ; Lane, J. ; Lane, J. W. W. 、Shiesher, M. , Shiesher, M. W. W. 、Leigh, K. , Leigh, K. M. M. 、Johnson, C. , Johnson, C. W. W. J. J. Org. Org. Chem. Chem. 1998, 63, 1727−1729. 1998, 63, 1727-1729.
【0403】 [0403]
実施例14 Example 14
この実験の目的は、新規な抗癌剤を発見するために設計された超ハイスループットスクリーニング方法を開発することである。 The purpose of this experiment is to develop an ultra-high throughput screening methods designed to discover new anti-cancer agents. 従来のコンビナトリアルケミストリーまたは天然産物の抽出アプローチと対照される。 It is contrast to extraction approach conventional combinatorial chemistry, or natural products. 実施例14の方法は、生物活性分子の発見に対する組み合わせアプローチを利用している。 The method of Example 14 using a combination approach to the discovery of biologically active molecules. この実施例は、全遺伝子経路から組換え体を発現させることによって天然産物の大きな供給源をもたらす非培養微生物からなる混合集団より得られる複合DNAライブラリーを利用している。 This embodiment utilizes a composite DNA library obtained from a mixed population of uncultivated microorganism bring great source of natural products by expressing a recombinant from the entire gene pathway. この実施例の二つの目的には、 The two purposes of this example,
1)超ハイスループットアッセイ系で用いられるように、癌標的に対するレポーター細胞として哺乳動物細胞系を操作する段階、 1) As used in ultra high throughput assay system, the step of operating the mammalian cell line as a reporter cells to cancer targets,
2)超ハイスループットのFACS−ベースのスクリーニング形式を用いて新規な抗癌剤を検出する段階が含まれる。 2) it includes the step of detecting a new anticancer agent by using a FACS- based screening format ultra high throughput.
【0404】 [0404]
本発明は、フローサイトメトリーを用いる三次元超ハイスループットスクリーニングにおいて、低分子のライブラリーと標的をともにをもたらすスクリーニング技術についての新規な典型を提供する。 The present invention provides a three-dimensional super-high throughput screening using flow cytometry, to provide a novel typical for screening technique which provides for both library and target small molecule. この形式では、1日当たり10 個までのスクリーニング速度を達成することが可能である。 In this format, it is possible to achieve the screening rates of up to 1 day 10 8. このシステムの実行可能性は、シグナル伝達とアポトーシスの領域で新規な抗癌剤を発見することに焦点が当てられたアッセイ法を用いて試験される。 Feasibility of the system is tested using the assays focused on discovering novel anticancer agents in the area of ​​signaling and apoptosis. 確認されたアッセイ法の開発は、新規な有力化合物の開発速度に絶大なインパクトを持つに違いない。 Development of validated assay methods, must have a profound impact on the development speed of the novel potent compounds.
【0405】 [0405]
実験上の設計と方法 Design and methods of experimental
1. 1. 細胞系の開発この実施例の目的は、癌では重要であることが知られているある範囲の分子標的に対して活性で、新規な化学療法剤を発見するために用いることのできる超ハイスループットスクリーニング形式を開発することである。 Development of cell lines The purpose of this example, active against the molecular target of a range known to be important in cancer, ultra high throughput that can be used to find new chemotherapeutic agents it is to develop a screening format. このアプローチの実行可能性は、レポータータンパク質の発現の誘導を伴う上皮増殖因子受容体(EGFR)の活性化に応答する哺乳動物の細胞系を用いて試験するとよい。 Feasibility of this approach, be tested with mammalian cell lines that respond to the activation of epidermal growth factor receptor with the induction of expression of the reporter protein (EGFR). EGFR応答性細胞は、微小液滴内にある本発明者らの細菌性の発現に伴ってもたらされると思われる(実施例13、並びに同時係属中の米国特許第6,280,926号、及び米国特許出願出願番号第09/894,956号を参照のこと。なおこの両方は参照として本明細書に組み入れられる)。 EGFR responsive cells is believed to be brought along with the expression of bacterial present inventors in micro-liquid droplets (Example 13, as well as U.S. Pat. No. 6,280,926 copending, and U.S. Patent application Serial No. 09 / 894,956 see Nos. Note that both are incorporated herein by reference). これらの発現宿主はストレプトミセスであってもよいしまたは大腸菌であってもよく、生物の混合集団から誘導されたライブラリー、即ち適当なベクターにクローニングされて宿主に移される高分子量の環境DNA(10〜100kbの断片)を含んでいると思われる。 These expression host may be may to or E. coli even Streptomyces, organisms derived libraries from mixed populations, namely of being cloned into a suitable vector high molecular weight to be transferred to the host environment DNA ( suspected of containing a fragment of 10~100kb). これらの大きなDNA断片は、生物活性低分子を産生するのに必要な遺伝子からなる生合成オペロン含むと思われる。 These large DNA fragment is believed to include biosynthetic operon consisting of the genes necessary to produce the biologically active small molecules. 細菌宿主から得られる生物活性分子は、蛍光性レポーターの発現を誘導する哺乳動物における生物学的応答を刺激することができる。 Biologically active molecules derived from the bacterial host is capable of stimulating a biological response in a mammal to induce the expression of fluorescent reporters. 完全な微小液滴は、回収した宿主から得られる蛍光とDNAに基づいて、フローサイトメトリーで個別に選別されると思われる。 Complete microdroplets, based on the fluorescence and DNA from harvested host, appears to be screened individually by flow cytometry. 混合集団ライブラリーは、10 、10 、10 、10 、10 、またはその何倍かを含む、10 〜10 10個のクローンを含有しているとよい。 Mixed population library 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, or containing that several times, may contain a 10 4 to 10 10 clones.
【0406】 [0406]
EGFレポーターに基づくアッセイ法は、数人の癌の病因において見込みのある役割を持つために選択された。 Based assays EGF reporter was chosen to have a role prospective in several cancer etiology. EGF−仲介シグナル伝達経路は非常によく特徴が明らかにされており、EGF受容体の数個の阻害剤が天然の起源から見出された(21、22)。 EGF- mediated signaling pathway is very well characterized and is revealed, several inhibitors of the EGF receptor has been found from natural sources (21, 22). EGFRは、トリ発芽球症レトロウイルスから発見された初期癌遺伝子(erbB)の一つであり、細胞外ドメインのほとんど全てが欠失しているために本質的に活性である(23)。 EGFR is one of the initial oncogene discovered from avian germination sphere diseases retrovirus (erbB), is essentially active for almost all of the extracellular domain is deleted (23). 同じタイプの突然変異が、多形膠芽腫、即ち主要なヒト脳腫瘍の20〜30%でみられた(24)。 Mutation of the same type, glioblastoma multiforme, that was seen in 20% to 30% of the major human brain tumors (24). EGFRの過剰発現は、膀胱癌(25)、乳癌(26、27)、及び多形膠芽腫(28)での予後の悪さとの間に相互関係がある。 Overexpression of EGFR, bladder cancer (25), breast cancer (26, 27), and mutual relationship between poor prognosis in glioblastoma multiforme (28). これらの癌のほとんどはEGF分泌性のバックグラウンドで起こり、それはこれらの癌の自己分泌増殖機構を示唆している。 Most of these cancers occur in EGF secretion of the background, it suggests the autocrine growth mechanism of these cancers. さらにEGFRは非小細胞の肺癌の40〜80%で過剰発現し、またEGFは原発性肺癌の半分で過剰発現しており、EDFRとEGFが同時に発現する場合では患者の予後は有意に悪くなる(29、30)。 Further EGFR is overexpressed in 40% to 80% of non-small cell lung cancer, also EGF is overexpressed in half of primary lung cancer, comprising a significantly worse prognosis of the patient in the case where EDFR and EGF are expressed simultaneously (29, 30). これらの理由からEGF受容体の阻害剤は、これらの癌の治療に対する化学療法剤として有用である可能性を有する。 Inhibitors of the EGF receptor these reasons, have the potential to be useful as chemotherapeutic agents for the treatment of these cancers.
【0407】 [0407]
この実験の目的は、抗癌剤に対するレポーター細胞として働く哺乳動物の細胞系を作製することである。 The purpose of this experiment is to produce a cell line of mammalian acting as a reporter cells for the anti-cancer agents. HeLa細胞は、抗EGFR抗体であるAb−1(Calbiochem)を用いたFACS分析によって確認されるように、EGFRを内因的に発現する。 HeLa cells, as confirmed by FACS analysis using Ab-1 (Calbiochem) is an anti-EGFR antibody, expressing EGFR endogenously. 対照的にCHO細胞はEGFRをほとんど、または全く発現しない。 In contrast, CHO cells is almost the EGFR, or not expressed at all. EGFRをコードする遺伝子はGordon Gill教授(カリフォルニア大学、San Diego)から入手し、pcDNA3/hygoベクターにクローニングした。 The gene encoding the EGFR is Gordon Gill professor (University of California, San Diego) was obtained from, and cloned into pcDNA3 / hygo vector. 得られたベクターをCHO細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体をハイグロマイシンを用いて選択した。 The resulting vector was transfected into CHO cells, and stable transfectants were selected with hygromycin. 抗EGFR発現CHO細胞の富化は、抗EGFR抗体を用いるFACS選別を二回行ってなされた。 Enrichment of anti-EGFR expressing CHO cells was made by performing twice the FACS sorting using anti-EGFR antibody. 活性化経路を検出するために、平行なアプローチがStratagene(San Diego, CA)製のPathDetectシステムと、Clontech(San Diego, CA)製のマーキュリープロフィーリング(Mercury Profiling)システムの両方を用いて採用されている。 To detect activation pathway, it is employed using parallel approaches Stratagene (San Diego, CA) manufactured and PathDetect system, both Clontech (San Diego, CA) manufactured by Mercury profiling (Mercury Profiling) system ing. このPathDetectシステムは、有糸分裂促進性の刺激を検出する手段として研究者らに認められている(31、32)。 The PathDetect system has been observed to researchers as a means of detecting the mitogenic stimuli (31, 32).
【0408】 [0408]
EGFRは、転写因子E1k−1を活性化するMAP−キナーゼ経路を介して機能するチロシンキナーゼ受容体である(33)。 EGFR is a tyrosine kinase receptor that functions via the MAP- kinase pathway which activates the transcription factor E1k-1 (33). PathDetect生成物は、Elk−1転写アクチベーターの活性化ドメインと酵母GAL4のDNA結合性ドメインとを含む融合タンパク質の発現をコードする融合トランス−アクチベータープラスミド(pFA−Elk1)を含む。 PathDetect product, Elk1 fusion trans coding for expression of a fusion protein comprising a DNA binding domain of the activation domain and the yeast GAL4 transcriptional activator - containing activator plasmid (pFA-Elk1). 第2のプラスミドは、Photinus蛾のルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節する酵母GAL4結合性部位の5個のタンデム繰り返しを持つ合成プロモーターを含む。 The second plasmid contains a synthetic promoter with five tandem repeat of the yeast GAL4 binding site that regulates the expression of the luciferase gene of Photinus moth. このルシフェラーゼ遺伝子を取り出して、増強緑色蛍光タンパク質(enhanced green fliorescent protein)(EGFP)(pFR−d2EGFPと設計されたプラスミド)の不安定化型をコードしている遺伝子で置き換えた。 The luciferase gene removed and replaced with enhanced green fluorescent protein (enhanced green fliorescent protein) (EGFP) gene encoding the destabilized form of (plasmids designed as pFR-d2EGFP). この二つのプラスミドをEGFR/CHOとHeLa細胞に10:1(pFR−EGFP:pFA−Elk1)の比率で共にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて選択された安定な形質転換体をpFA−Elk1プラスミドに位置づけた。 The two plasmids EGFR / CHO and HeLa cells 10: 1 (pFR-EGFP: pFA-Elk1) were transfected together in a ratio of, pFA-Elk1 stable transformants selected using neomycin resistance gene It was positioned in the plasmid. こうしてEGFRに結合したリガンドは、結果的に融合タンパク質のElk1タンパク質の活性化を引き起こすシグナル伝達カスケードを開始させ、そのため酵母GAL4のDNA結合性ドメインがそのプロモーターに結合するのが可能となって、巡ってEGFRが発現することになる。 Ligand bound to EGFR thus, results in the activation of Elk1 protein fusion protein initiates a signaling cascade that causes, DNA binding domain of the for the yeast GAL4 becomes possible to bind to the promoter, come around EGFR is to be expressed Te.
【0409】 [0409]
血清の存在下での刺激は、このシグナル伝達経路がほとんどの増殖因子に共通しており、またFGFを含む多くの増殖因子が血清中に存在しているらしいため驚くことではない。 Stimulation in the presence of serum is common this signaling pathway for most growth factors, also not surprising because seems to exist in a number of growth factors in serum containing FGF. 有意の血清飢餓を24時間行った後ではこの応答は大きく減少する(図2A)。 In After 24 hours a significant serum starvation this response is greatly reduced (Figure 2A). 次の段階は組換えEGF(Calbiochem)を用いてこれらの細胞を選択的に刺激するものであって、フローサイトメトリーを用いて応答性の高い単クローンを単離できると思われる。 The next step be one which selectively stimulate these cells using recombinant EGF (Calbiochem), it seems to be isolated with high responsiveness monoclonal using flow cytometry. これらのクローンは高レベルのGFRとEGFRに対して同時に選別することによって選択できる。 These clones can be selected by selecting simultaneously for high levels of GFR and EGFR. EGFRはフィコエリスリンで標識した二次抗体を伴う抗EGFR抗体を用いて検出できる。 EGFR can be detected using an anti-EGFR antibody with a secondary antibody labeled with phycoerythrin. このシステムは、これらの細胞に酵母GAL4プロモーターを利用すると、バックグラウンド、即ちEGFRの見せかけの導入を最小に保てるという利点をもっている。 This system has the these cells utilizing the yeast GAL4 promoter, the background, i.e. the advantage that maintain the introduction of spurious EGFR minimized. 第2グループの細胞系は、Mercury Profillingシステムを利用することで同じEGFR経路をアッセイすることができる。 Cell lines of the second group can be assayed the same EGFR pathway by utilizing Mercury Profilling system. このシステムは、ヒト胎盤分泌性のアルカリホスファターゼ(SEAP)の発現を増加させる経路の活性化に応答する。 The system responds to activation of the pathway to increase expression of the human placental secreted alkaline phosphatase (SEAP). 蛍光シグナルはホスファターゼ基質のELF−97−リン酸塩(Molecular Probes)を添加することによって得られ、それは開裂部上に明るい蛍光体の沈殿を生じる。 Fluorescent signal obtained by the addition of ELF-97- phosphate (Molecular Probes) in phosphatase substrate, which cause precipitation of a bright phosphor on cleavage. PathDetectシステムについてのこのアプローチの利点は、経路を低レベルで活性化するための酵素触媒によってシグナルを増幅させる能力があることである。 The advantage of this approach for PathDetect system is that the ability to amplify the signal by enzymatic catalysts for activating the pathway at a low level. この平行アプローチによって、生物活性の化合物を発見する場合の成功の可能性が大きくなると思われる。 This parallel approach is believed that the success possibility increases in the case of discovering compounds of biological activity. Mercury Profilingシステムでは、シス作用エンハンサー素子であるSREとチミジンキナーゼプロモーター由来のTATAボックスとを含むベクターが、アルカリホスファターゼ(pTA−SEAP)の発現を進行させるために用いられる。 The Mercury Profiling systems, vectors containing the TATA box from SRE and thymidine kinase promoter is a cis-acting enhancer element is used to advance the expression of alkaline phosphatase (pTA-SEAP). このシステムは、ベクターに存在するSRE素子に結合し、EGFRの刺激によるSEAPの発現を起こさせるElk−1のような細胞の内因性のトランスアクチベーターの存在に関連している。 This system is coupled to the SRE element present in the vector, is related to the presence of the transactivator of endogenous cells such as Elk-1 to cause expression of SEAP by stimulation of EGFR. pTA−SEAPベクターをEGFR/CHOとHeLa細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体をネオマイシンを用いて選択した。 Were transfected with pTA-SEAP vector EGFR / CHO and HeLa cells, stable transformants were selected with neomycin. 培地における血清因子の存在下で再び該経路の刺激が起こった。 Stimulation in the presence again pathway of serum factors in the medium occurs. 血清を飢餓させると、この応答は大きく減少した(図2B)。 When serum is hunger, this response was greatly reduced (Figure 2B). 単一の高発現クローンは、EGFを用いる刺激とフローサイトメトリーを用いる選別を行った後で単離できると思われる。 Single high expressing clone is believed to be isolated after screening was conducted using the stimulus and flow cytometry using EGF.
【0410】 [0410]
超ハイスループットの FACS アッセイ法の開発 The development of the FACS assay of ultra-high-throughput
本発明者らは、>99%の培養できない微生物に存在する手をつけていない生物多様性へのアクセスを提供する複合的な混合集団ライブラリー(>10 プライマリークローン/ライブラリー)を発生させた。 The present inventors have found that to generate> 99% complex mixed population library that provides access to biodiversity not untouched present in a microorganism can not be cultured (> 10 6 primary clones / library) It was. これらの新規なライブラリーは、完全な範囲のライブラリーを得るための超ハイスループットスクリーニング法の開発を必要とする。 These new libraries requires the development of ultra-high throughput screening methods for obtaining a library of full range. 本発明者らは、10 クローン/日までの検出を可能にするフローサイトメトリーを用いたアッセイ法を開発することを目的とする。 The present inventors intended to develop an assay using flow cytometry to enable detection of up to 10 8 clones / day.
【0411】 [0411]
このアッセイ形式(図1)では、発現宿主(ストレプトミセス、大腸菌)と哺乳動物のレポーター細胞を、微小液滴内に一緒に同時封入する。 In this assay format (FIG. 1), the expression host (Streptomyces, Escherichia coli) and mammalian reporter cell, co-encapsulated with the fine liquid in droplets. この微小液滴は細胞を互いに密接に隣接させて保持し、二つの細胞型の間で生物分子の交換が容易に行われるような微小環境を提供する。 The microdroplet is held by neighboring cells closely together, to provide a microenvironment such as the exchange of biological molecules between the two cell types can be easily performed. このレポーター細胞は蛍光読み出し情報を備えており、微小液滴全体をクローンの単離のためにフローサイトメトリーを通して走査させるとよい。 This reporter cell includes a fluorescent readout, the entire fine droplets may be scanned through flow cytometry to isolate clones. 対象の遺伝子または経路から得られるDNAは、インビトロでの分子技術を用いて引き続いて回収できる。 DNA obtained from a gene or pathway of interest may be recovered subsequently by using molecular techniques in vitro. このアッセイ形式は、アポトーシスを誘導する低分子を発見するためだけでなく、両方のEGFRインヒビターを発見するためにも妥当とされると思われる。 This assay format is not only to find small molecules that induce apoptosis, it appears to be reasonable in order to discover both EGFR inhibitor. この形式の妥当性を利用すれば、腫瘍形成の根底にあるこれらの重要な分子機構に対して活性な新規の化学療法剤を発見するように設計された超ハイスループットスクリーニング段階に進歩させることができる。 By using the validity of this type, it is advanced to the ultra high throughput screening step designed to discover active novel chemotherapeutic agents for these important molecular mechanisms underlying tumorigenesis it can.
【0412】 [0412]
このアプローチの実行可能性は、レポータータンパク質(即ち、EGFRまたはアルカリホスファターゼ)の発現増加に伴いEGFによる活性化に応答する上記の操作された細胞系を用いて最初に分析するとよい。 Feasibility of this approach, the reporter protein (i.e., EGFR or alkaline phosphatase) may initially analyzed using the engineered cell lines that respond to activation by EGF with the increased expression of. さらにこの最初の研究は、細菌のペリプラズムに向かう分泌タンパク質としてのヒトEGFを過剰発現する大腸菌宿主を用いるとよい(34)。 Furthermore this initial study may be performed using E. coli host overexpressing human EGF as secreted proteins directed to the periplasm of the bacteria (34). このアプローチは、本発明者らの大腸菌とストレプトミセスの発現ライブラリーを用いてEGFR経路のインヒビターについてスクリーニングするのに先立ち、そのアッセイ形式を認めさせる。 This approach, prior to screening for inhibitors of the EGFR pathway by using an expression library of E. coli and Streptomyces present inventors, admit the assay format. この実験では、操作した細胞系が1対1の比率で大腸菌宿主とともに封入されると思われる。 In this experiment, engineered cell lines are likely to be filled with an E. coli host in a ratio of 1: 1. EGF発現細菌は、微小液滴内で増殖し、コロニーを形成することを許容する。 EGF expression bacteria, grown in micro-liquid droplets, allows to form colonies. 細菌の増殖速度が大きいため、細菌のコロニーは真核細胞のいくらかかまたは最小の細胞分割が起こる前に形成される。 Because the growth rate of the bacteria is high, bacterial colonies are formed before any or minimal cell division eukaryotic cells occurs. その際このコロニーは、有意に増加した濃度の生物活性の分子を提供できる。 At that time the colonies can provide molecules significantly increased concentration of the biological activity. この細菌コロニーは、細胞の生存を可能にする濃度で抗生物質のポリミキシンを用いて選択的に溶解するとよい(35)。 The bacterial colonies may selectively dissolved using polymyxin antibiotic at a concentration that allows for cell survival (35). この抗生物質は細菌の細胞壁に穴を開けるように作用し、真核細胞に影響を与えることなく結果的にこれらの細胞からEGFを放出させることになるはずである。 The antibiotic should be possible to act on the so holes in the cell walls of bacteria, thereby releasing the EGF from resulting in these cells without affecting eukaryotic cells. 最後の発見的アッセイ法では、低分子生成物が自由に細胞の外に拡散できるらしいため、この溶解処理は必須ではないと思われる。 The last discovery assays, since apparently low molecular products can freely diffuse out of the cell, the lysis process seems not essential. EGFは真核細胞においてシグナル伝達経路を活性化し、そうするとレポータータンパク質が発現することになる。 EGF is a signal transduction pathway activated in eukaryotic cells, Then the reporter protein will be expressed.
【0413】 [0413]
微小液滴をフローサイトメトリーを通して走査されるであろうが、すると蛍光の増加を示すそれらの微小液滴が分離できると思われる。 It will be scanned microdroplets through flow cytometry, but Then their microdroplets showing the increase in fluorescence seems to be separated. 分離された微小液滴から得られるDNAは、EGFについてコードしている挿入物のPCR増幅法を用いて回収できる。 DNA obtained from the separated fine droplets can be recovered using PCR amplification of the insert encoding the EGF. 分泌性のアルカリホスファターゼを発現するレポーター細胞については、蛍光読み出しを達成するために一対の追加工程が必要である。 The reporter cells expressing secreted alkaline phosphatase, are required a pair of additional steps in order to achieve fluorescence reading. 酵素が細胞から分泌される場合、微小液滴のマトリックスにそれを選択的に捕獲させることによって微小液滴からタンパク質が拡散するのを抑制することが可能である。 If the enzyme is secreted from the cell, it is possible to proteins from microdroplets by selectively capturing it in a matrix of fine droplets can be inhibited from spreading. これは、ビオチンを用いて誘導したアガロースを用いて作製された微小液滴を利用することによって達成できる。 This can be achieved by utilizing fine droplets produced using the agarose that were induced with biotin. ストレプトアビジンとビオチン化抗アルカリホスファターゼ抗体とのサンドウィッチを形成することによって、微小液滴に含まれるELF−97リン酸基質の変換を触媒できる場合にアルカリホスファターゼを捕獲することが可能である(図3A)。 By forming a sandwich between streptavidin and biotinylated anti-alkaline phosphatase antibodies, it is possible to capture the alkaline phosphatase in the case capable of catalyzing the conversion of ELF-97 phosphate substrate contained in the microdroplets (Fig. 3A ). この技術は、高く発現するハイブリドーマを単離するためのOne Cell Systemsによって首尾良く開発された(36、37)。 This technique successfully developed by One Cell Systems for isolating hybridomas expressing high (36, 37). 本発明者らの研究によって、SEAP発現細胞を封入した場合、Elf−97ホスファターゼ基質を添加すると蛍光体が微小液滴内に型を沈殿させることが示された(図3Bおよび図3C)。 Studies of the present inventors, when encapsulating SEAP expressing cells, the addition of Elf-97 phosphatase substrate phosphor was shown to precipitate the mold micro-liquid droplets (Figs. 3B and 3C).
【0414】 [0414]
最初の実験は、微小液滴内に大腸菌と哺乳動物細胞(例えば、CHO)を同時封入する実行可能性を証明している。 Initial experiments, E. coli and mammalian cells micro-liquid droplets (e.g., CHO) have demonstrated the feasibility of co-encapsulating. 微小液滴は、オイルに滴下し、2600rpmで混合した3%のアガロースを用いて形成した。 Microdroplets, and added dropwise to an oil was formed using a 3% agarose mixed with 2600 rpm. 大腸菌とCHO細胞は、1:1の比率で封入した(図4A)。 E. coli and CHO cells, 1: encapsulated 1 ratio (Figure 4A). 6時間後、一個の細菌細胞は数千個の細胞を含むコロニーに増殖した(図4B)。 After 6 hours, one of the bacterial cells were grown to colonies containing thousands of cells (Figure 4B). 微小液滴内の細胞はプロピジウムアイオダイドを用いて染色することによって、生存能力と、24時間後に生存している約70〜85%のCHO細胞を検出することができる。 Cells of the micro-liquid droplets by staining with propidium iodide, and viable, can be detected about 70 to 85% of CHO cells surviving after 24 hours. 続く工程には、チルホスチン(Tyrphostin)A46またはチルホスチンA48(Calbiochem)のようなEGFRの存在下および非存在下において、さまざまに濃度を変えたEGFに対する封入したクローナルEGF応答性の哺乳動物細胞の応答を測定する工程が含まれる。 The subsequent step, in the presence and absence of EGFR, such as tyrphostin (Tyrphostin) A46 or tyrphostin A48 (Calbiochem), the response of clonal EGF-responsive mammalian cells encapsulated to EGF was changed variously concentration the step of measuring includes. さらに高レベルの分泌性EGFを産生する大腸菌クローンは、QuantikineヒトEGFイムノアッセイ法(R&D Systems)を用いて単離できる。 Moreover E. coli clones that produce high levels of secretory EGF can be isolated using Quantikine human EGF immunoassay method (R & D Systems). 最終的にこれらの二つの細胞型は微小液滴内に一緒に運搬されており、真核細胞の蛍光の変化はEGFRインヒビターの存在下、及び非存在下でフローサイトメトリーにて分析できる。 Finally these two cell types are transported together fine liquid in droplets, the change in fluorescence of eukaryotic cells can be analyzed by flow cytometry in the presence and absence of the EGFR inhibitor. この実験での陽性の結果では、EGFRインヒビターによって遮断できる蛍光が増加すると思われる。 In results positive in this experiment appears to fluorescence can be blocked by the EGFR inhibitor is increased.
【0415】 [0415]
次の工程は、混合集団ライブラリー発見スクリーニングの条件を擬態できるように、EGF発現大腸菌を非発現細胞と、1:1,000から1:1,000,000のさまざまな比率で混合するとよい。 The next step is a condition of mixed population library discovery screening as possible mimic, and non-expressing cells EGF expression E. coli, 1: 1,000 to 1: may be mixed in various ratios of 1,000,000. この細菌の混合物と哺乳動物の細胞を、上記したように同時封入する。 The cell mixtures with mammals this bacterium, co-encapsulation as described above. 蛍光性の強い微小液滴は、フローサイトメトリーによって別個に分離するとよい。 Strong fine droplets of fluorescence, it is preferable to separately separated by flow cytometry. 陽性の当たりを確認するために、DNAをEGF遺伝子に対して指向するプライマーを用いてPCR増幅することによって回収するとよい。 To confirm the per-positive, may be recovered by PCR amplification using primers directed to DNA against EGF gene. ノイズに対するシグナルの比率を改善するためには、とりわけ混合比率が高い場合には、陽性のEGF−発現クローンを単離する前に数ラウンドの富化工程を行う必要がありそうである。 To improve the ratio of signal to noise, especially when the mixing ratio is high, it is likely to need to perform the enrichment step of several rounds before isolating EGF- expressing clones positive.
【0416】 [0416]
この場合には、微小液滴をまず大量に分離し、その微小液滴材料をGELase(Epicentre Technologies)を用いて取り出してから細菌の増殖を許容するとよい。 In this case, microdroplets first mass separation, may allow the growth of bacteria from the removed using the microdroplets material GELase (Epicentre Technologies). この封入プロトコールは、富化が高まった集団が観察されるまで新しい真核細胞を用いて繰り返す。 The encapsulation protocol is repeated with a new eukaryotic cells to a population of increased enrichment is observed. この時点で単一の微小液滴を単離して、EGF発現クローンが回収されたことをPCRによって確認する。 The single microdroplets at this point is isolated, EGF expression clones confirmed by PCR that was recovered. このアッセイ法には妥当性があるため、その目的は、最適化した大腸菌とストレプトミセスの宿主に発現させた本発明者らの混合集団ライブラリーを用いてEGFRのインヒビターをスクリーニングすることであろう。 Because this is the assay has validity, the purpose would be to screen for inhibitors of EGFR with a mixed population library of optimized E. coli and the inventors were expressed in Streptomyces host . このアッセイ法はEGFの存在下で行なわれ、そのアッセイ法の終了点は蛍光の減少がみられる。 The assay is carried out in the presence of EGF, the end point of the assay decrease in fluorescence is observed. この形式は、この経路に含まれる何らかのタンパク質を阻害でき、そしてこのスクリーニングで陽性になる場合はEGFRインヒビターのみに限定されない。 This format can inhibit some proteins contained in the path, and is not limited only to the EGFR inhibitor may become positive in this screening. 同様にこのスクリーニングは、遺伝子発現を調節することがわかっている抗癌標的の多数にも適合できる。 Likewise This screening can be adapted to many anticancer targets have been found to regulate gene expression. 実際にこの現在のシステムを用いると、適当な受容体を添加した場合、PDGF及びVEGFのような他の増殖因子のインヒビターについてのスクリーニングが可能になるであろう。 In fact using this current system, if adding suitable receptors would enable the screening for inhibitors of other growth factors such as PDGF and VEGF.
【0417】 [0417]
EGF発現細胞と哺乳動物のレポーター細胞の同時封入を行っても蛍光の増加が観察されない場合には、いくつかの理由がある可能性がある。 If you are still having coentrapped reporter cells of the EGF-expressing cells and mammalian not increase in fluorescence is observed, there may be several reasons. まず、EGFが細胞の外に素速く拡散しすぎるため、反応が顕在化しない可能性がある。 First, since the EGF are too diffuse containing fast out of the cell, there is a possibility that the reaction does not become obvious. この場合には、拡散を制限するとともに、レポーター細胞の部位で生物活性の分子を濃縮するように微小液滴を修飾することが必要であろう。 In this case, as well as limiting the spread, at the site of the reporter cell it may be necessary to modify the microdroplets to concentrate the molecules of biological activity. また、EGFアッセイ法の特定の場合では、ポリミキシン処理の後では細胞はEGFを産生し続けず、したがってEGFとのレポーター細胞のインキュベート時間が最短になるという可能性もある。 Moreover, in the specific case of EGF assay, after the polymyxin treatment cells are not continued to produce EGF, thus incubation time reporter cells with EGF there is a possibility that the shortest. これは、用いたポリミキシン処理が細胞の生存能力を減少させるのよりも十分低い濃度でなされるため、起こりそうにない。 This is because the polymyxin treatment with is made at a sufficiently lower concentration than reduce the viability of cells, not the unlikely. しかしながらEGFがこのシステムで発現し続けない場合には、バクテリオシン放出タンパク質(BRP)システム(Display Systems Biotech)のような細胞代謝に有意に影響を与えない他の透過法(permeabilization)を探索するとよい。 However, if the EGF does not continue expressed in this system, it is preferable to search for the bacteriocin release protein (BRP) system (Display Systems Biotech) other transmission method which does not significantly affect the cell metabolism, such as (permeabilization) . BRPは、培養培地へのタ