JP2008013663A - Semi-IPN gel and bioarray-immobilized microarray using the same - Google Patents
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Abstract
【課題】セミIPNゲルおよびそれを用いた生体関連物質固定化マイクロアレイを提供する。
【解決手段】モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとの共重合により作製される網目構造体からなるゲルと、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを含む、ゲル組成物、前記ゲル組成物が管状体の中空部に保持されているゲル保持管状体、前記ゲル組成物が基板上の区画に配置されたマイクロアレイ、並びに、以下の工程を順次含むマイクロアレイの製造方法を提供する：（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程、（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、請求項１記載のゲルを保持する工程、ならびに、（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。
【選択図】 図１A semi-IPN gel and a bioarray-immobilized microarray using the same are provided.
A gel composition comprising a gel composed of a network structure produced by copolymerization of a monomer, a crosslinking agent, and a capture probe, and a polymer component that is not covalently bonded to a constituent component of the gel, the gel composition Provided are a gel-holding tubular body in which an object is held in a hollow portion of a tubular body, a microarray in which the gel composition is disposed in a partition on a substrate, and a microarray manufacturing method including the following steps in sequence: (a B) converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide with each other; (b) holding the gel according to claim 1 in a hollow portion of each tubular body of the bundling; and (c) A step of cutting the convergent object in a direction crossing the longitudinal direction of the tubular body.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとを共重合して作製される網目構造体ゲル中に、当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分を含むゲル、及びそれを用いた生体関連物質固定化マイクロアレイに関する。該マイクロアレイは遺伝子発現解析等に使用される。 The present invention relates to a gel containing a polymer component that is not covalently bonded to a component constituting the gel in a network structure gel prepared by copolymerizing a monomer, a crosslinking agent, and a capture probe, and a living body using the gel The present invention relates to a related substance-immobilized microarray. The microarray is used for gene expression analysis and the like.
遺伝子の分析手段として、特定のプローブを使用して所望の遺伝子の変異解析及び発現解析を一括して実施できるDNAマイクロアレイが開発されている。DNAマイクロアレイとしては、例えば、２次元表面上にフォトリソグラフィーを用いてキャプチャープローブを逐次的に合成されたマイクロアレイ（特許文献１）、予め合成されたキャプチャープローブが２次元表面上にスポッティングされたマイクロアレイ（特許文献２）、樹脂板等の基板に複数の溝又は貫通孔が形成され、それらの溝又は穴の内部にDNAを含むゲルが保持されたマイクロアレイ（特許文献３）、平面基盤上にDNA等を含むゲルのスポットが配置されたマイクロアレイ（特許文献４）等が知られている。本発明者らの一部も中空繊維の中空部にゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交叉する方向で切断することにより得られるマイクロアレイを開発している（特許文献５）。
ゲルを使用したマイクロアレイ（特許文献３〜５参照）（ゲルマイクロアレイという）は、２次元表面にキャプチャープローブが固定されたマイクロアレイに比べて、一区画に固定化できるプローブ量が増加することから、ハイブリダイゼーション効率に優れたマイクロアレイといえる。
上記ゲルマイクロアレイは、検査の対象となる試料（以下、検体）がゲルの多孔質構造中で十分に拡散し、ゲル中のキャプチャープローブと反応することにより、高いハイブリダイゼーション効率を達成することができる。しかし、これまでに知られているゲルマイクロアレイでは、ゲルの多孔質構造の中を検体が十分に拡散できず、検査に使用できる領域はゲル表面に限定される場合もあった。
このため、ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくし、検体の拡散を向上させる目的で、ゲルを構成するモノマーの種類の検討、モノマー濃度の検討等が行われている。例えば、特許文献６には、マイクロアレイに使用する好適なゲルとして、N,N-ジメチルアクリルアミドを２〜７質量％含むゲルを使用することにより、高いハイブリダイゼーション効率を得ることができると記載されている。また、N-イソプロピルアクリルアミド等の感温性ゲルを利用する方法も知られている（非特許文献１）。
さらにN-イソプロピルアクリルアミド等の感温性ゲルの体積変化を利用し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法なども知られている（特許文献７）。
A microarray using a gel (refer to Patent Documents 3 to 5) (referred to as gel microarray) has a higher amount of probes that can be immobilized in one section than a microarray in which a capture probe is immobilized on a two-dimensional surface. It can be said that it is a microarray excellent in hybridization efficiency.
The above-mentioned gel microarray can achieve high hybridization efficiency by allowing the sample to be examined (hereinafter referred to as specimen) to sufficiently diffuse in the porous structure of the gel and react with the capture probe in the gel. . However, in the gel microarrays known so far, the specimen cannot be sufficiently diffused in the porous structure of the gel, and the region that can be used for the examination is sometimes limited to the gel surface.
For this reason, for the purpose of increasing the effective pore size of the porous structure of the gel and improving the diffusion of the specimen, the types of monomers constituting the gel and the monomer concentration have been studied. For example, Patent Document 6 describes that high hybridization efficiency can be obtained by using a gel containing 2 to 7% by mass of N, N-dimethylacrylamide as a suitable gel for use in a microarray. Yes. In addition, a method using a thermosensitive gel such as N-isopropylacrylamide is also known (Non-Patent Document 1).
Furthermore, a method for detecting the presence or absence of hybridization using a volume change of a thermosensitive gel such as N-isopropylacrylamide is also known (Patent Document 7).
しかし、ゲルの濃度を下げて、ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくする試みは、ゲルの強度が弱くなるため、基板表面や貫通孔にゲルを配置、保持した際、基板表面や貫通孔からゲルが脱落するという問題がある。従って、このような解決手段では、検体の拡散度を向上させ、かつ、ゲル強度を高めるという２つの課題を両者とも解決できるゲルを作製することは困難である。また、N-イソプロピルアクリルアミドのような相転移温度（LCST）を持つモノマーと架橋剤のみでゲル化させた場合、LCST以上の温度で重合した際、重合中に多孔質構造を形成し、不透明なゲルが形成される。このようなゲルは、有効細孔径は大きくなり、検体の拡散速度が速くなるが、例えば蛍光により検体を検出する際に、ゲル内部まで励起光が到達せず、ゲル全体の検体量をすべて検出することが極めて困難であった。またN-イソプロピルアクリルアミド（以下NIPAM）のようなLCSTを持つモノマーおよび持たないモノマーならびに架橋剤からなるゲルを用いた場合、相転移挙動が不十分であるため、十分な多孔質構造を有するゲルの構築は難しい。
そこで、本発明は上記課題を解決し得るゲル及びそれを用いたマイクロアレイを提供することを目的とする。
However, attempts to lower the gel concentration and increase the effective pore size of the gel porous structure reduce the strength of the gel, so when placing and holding the gel on the substrate surface or through-holes, There is a problem that the gel falls off from the pores. Therefore, with such a solution, it is difficult to produce a gel that can solve both of the two problems of improving the diffusivity of the specimen and increasing the gel strength. In addition, when gelled only with a monomer having a phase transition temperature (LCST) such as N-isopropylacrylamide and a cross-linking agent, when polymerized at a temperature higher than LCST, a porous structure is formed during the polymerization, making it opaque. A gel is formed. Such a gel has a larger effective pore size and a faster specimen diffusion rate, but when detecting the specimen by fluorescence, for example, the excitation light does not reach the inside of the gel, and the entire specimen volume is detected. It was extremely difficult to do. In addition, when a gel consisting of a monomer with and without LCST, such as N-isopropylacrylamide (hereinafter referred to as NIPAM), and a gel composed of a crosslinking agent are used, the phase transition behavior is insufficient. Building is difficult.
Then, an object of this invention is to provide the gel which can solve the said subject, and a microarray using the same.
本発明者らは上記問題点を解決するために鋭意検討した結果、モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとを共重合して作製されるゲルと、ゲル中に当該ゲルを構成する成分とは共有結合していないポリマー成分とを含むゲル組成物を作製することに成功した。また、本発明者は、モノマー、架橋剤およびキャプチャープローブを共重合して作製されるゲルと、ゲル中に当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分とを含むゲル組成物を核酸のハイブリダイゼーションに使用すると、ハイブリダイゼーション時にはゲルのネットワーク構造が不均一となり、ゲルのポアサイズが拡大し、且つ検出時にはゲルのネットワークが均一に変化し、透明となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとの共重合により作製される網目構造体からなるゲルと、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを含む、ゲル組成物。
（２）モノマーが1成分または2成分から成る（１）記載の組成物。
（３）ポリマーが1成分または2成分から成る（１）又は（２）記載の組成物。
（４）ポリマーの少なくとも1成分が相転移温度を有するポリマーである（３）記載の組成物。
（５）相転移温度を有するポリマーが、N-イソプロピルアクリルアミドである（４）記載の組成物。
（６）ポリマーの少なくとも1成分が両イオン性ポリマーである（３）記載の組成物。
（７）両イオン性ポリマーが、N,N-ジメチル（アクリルアミドプロピル）アンモニウムプロパンサルフォネイトである（６）記載の組成物。
（８）ポリマーの少なくとも１成分と、モノマーの少なくとも１成分とが同一成分である（１）または（２）記載の組成物。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲル組成物が管状体の中空部に保持されているゲル保持管状体。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲル組成物が基板上の区画に配置されたマイクロアレイ。
（１１）区画が複数の溝または貫通穴で形成されている（１０）記載のマイクロアレイ。
（１２）上記（９）記載の管状体を複数本集束させた集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断して得られるマイクロアレイ。
（１３）以下の工程を順次含むマイクロアレイの製造方法：
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程、
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、（１）記載のゲルを保持する工程、ならびに
（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。
（１４）モノマーと架橋剤とを含むゲル重合液と、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを混合し、重合させることを特徴とするゲル組成物の製造方法。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a gel produced by copolymerizing a monomer, a crosslinking agent, and a capture probe and a component constituting the gel in the gel are covalently bonded. A gel composition containing a polymer component that has not been prepared has been successfully produced. In addition, the present inventor has obtained a gel composition comprising a gel prepared by copolymerizing a monomer, a crosslinking agent and a capture probe, and a polymer component that does not covalently bond to the component constituting the gel in the gel. When used for hybridization, the present inventors have found that the gel network structure becomes non-uniform during hybridization, the pore size of the gel increases, and the gel network changes uniformly and becomes transparent during detection, thereby completing the present invention. .
That is, the present invention is as follows.
(1) A gel composition comprising a gel composed of a network structure produced by copolymerization of a monomer, a crosslinking agent, and a capture probe, and a polymer component that is not covalently bonded to a constituent component of the gel.
(2) The composition according to (1), wherein the monomer comprises one component or two components.
(3) The composition according to (1) or (2), wherein the polymer comprises one component or two components.
(4) The composition according to (3), wherein at least one component of the polymer is a polymer having a phase transition temperature.
(5) The composition according to (4), wherein the polymer having a phase transition temperature is N-isopropylacrylamide.
(6) The composition according to (3), wherein at least one component of the polymer is a zwitterionic polymer.
(7) The composition according to (6), wherein the zwitterionic polymer is N, N-dimethyl (acrylamidopropyl) ammonium propane sulfonate.
(8) The composition according to (1) or (2), wherein at least one component of the polymer and at least one component of the monomer are the same component.
(9) A gel-holding tubular body in which the gel composition according to any one of (1) to (8) is held in a hollow portion of the tubular body.
(10) A microarray in which the gel composition according to any one of (1) to (8) is arranged in a partition on a substrate.
(11) The microarray according to (10), wherein the section is formed by a plurality of grooves or through holes.
(12) A microarray obtained by cutting a converging object obtained by converging a plurality of tubular bodies according to (9) in a direction intersecting the longitudinal direction of the tubular body.
(13) Microarray manufacturing method including the following steps in sequence:
(A) converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide;
(B) A step of holding the gel described in (1) in a hollow portion of each tubular body of the convergent body, and (c) a step of cutting the convergent body in a direction crossing the longitudinal direction of the tubular body.
(14) A method for producing a gel composition, comprising mixing and polymerizing a gel polymerization liquid containing a monomer and a crosslinking agent and a polymer component that is not covalently bonded to a constituent component of the gel.
本発明により、網目構造体からなるゲルと、当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分とを含むゲル組成物が提供される。本発明において、キャプチャープローブが含まれる網目構造体からなるゲルを使用した場合は、ハイブリダイゼーションにおける高温時には、添加したポリマーが疎水性相互作用によって基盤ゲルのネットワークを巻き込みながら収縮し、ゲルのネットワーク構造が不均一となりポアサイズが大きくなる部分が現れ、結果としてハイブリダイゼーション効率が高くなる。さらに、検出における室温時にはネットワークが均一に変化し、透明となるゲル及び生体関連物質マイクロアレイを得ることができ、検出感度が極めて高くなる。従って、本発明のゲル組成物は、ゲルの強度を維持しつつ、検体の拡散度を高めることができるため、極めて有用である。 The present invention provides a gel composition comprising a gel composed of a network structure and a polymer component that is not covalently bonded to the component constituting the gel. In the present invention, when a gel composed of a network structure including a capture probe is used, the added polymer contracts while entraining the network of the base gel by hydrophobic interaction at a high temperature in hybridization, and the network structure of the gel As a result, a portion where the pore size becomes large due to non-uniformity appears, resulting in an increase in hybridization efficiency. Further, the network changes uniformly at room temperature in detection, and a transparent gel and a bio-related substance microarray can be obtained, and the detection sensitivity becomes extremely high. Therefore, the gel composition of the present invention is extremely useful because it can increase the diffusion degree of the specimen while maintaining the strength of the gel.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、モノマーと架橋剤との共重合により作製される網目構造体からなるゲル中に、ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分を含むゲル組成物である。また、ゲル中にキャプチャープローブを共重合することもできる。
１．ゲル組成物（Semi-IPNゲル）
本発明のゲル組成物は、基盤となるゲル（以下、「基盤ゲル」という）中に、基盤ゲルとは共有結合しないポリマー成分を含むものである。「共有結合しない」とは、基盤ゲルとは性質が全く異なるために共有結合できないこと、および、性質は同一であって共有結合し得るポリマーであっても物理的または化学的条件により共有結合していないことの両者を意味する。
このようなゲル組成物の特徴は、基盤ゲルとポリマー成分とが独立にそれぞれの機能を発揮できる点にある。本発明のゲル以外にこのようなゲルとして相互貫入ポリマーネットワーク (interpenetrating polymer network , IPN)が知られている。IPNとは、高分子網目の人為的な重なり合いを利用したポリマーブレンドの一種であり、一般には、IPNに使用されるゲルは互いに共有結合していない２つの架橋されたポリマーネットワークからなるゲルである。本発明において、ゲル組成物は、１つの成分は架橋されたポリマーネットワークであり、他の成分は線状ポリマーである。成分の一方だけが架橋されていることから、本発明のゲル組成物はセミIPN（以下semi-IPNと記す）と呼ぶことができる。
２．網目構造体
本発明のゲル組成物のうち網目構造体からなるゲルは、モノマーと架橋剤とを共重合して作製することができる。
網目構造体の構成成分として用いられるモノマーとしては、アクリルアミド、メタクリルアミド（methacrylamide）、Ｎ-メチルアクリルアミド（Ｎ-methlylacrylamide）、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide(DMAAm)）等が挙げられる。好ましくは、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide）、N-イソプロピルアクリルアミドが用いられる。本発明においては、これらのモノマー成分の１またはそれ以上の成分を使用することができ、１または２成分であることが好ましい。２成分のモノマーの場合は、DMAAmとNIPAMを使用することが好ましい。
「架橋剤」とは、エチレン性不飽和結合を２個以上持つ多官能性単量体である。例えばN,N'-メチレンビスアクリルアミド、N,N'-ジアリル（1,2-ヒドロキシエチレン）-ビスアクリルアミド、N,N'-シスタミン-ビスアクリルアミド、N-アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ポリエチレングリコールジメタクリレート等である。好ましくはN,N'-メチレンビスアクリルアミドが用いられる。
共重合反応に使用する架橋剤の量は、使用するモノマーの和に対し、モル比で８:２〜５００：１の範囲で添加するのが好ましい。
架橋剤のモル比が８：２より大きくなるとゲルネットワークが不均一化し、白濁が生じやすい。一方モル比が５００：１以下になるとゲルとしての構造が保てなくなってしまう。
重合開始剤は、重合反応の際にキャプチャープローブの分解が生じないものであればいずれも選択できる。好ましい開始剤は、2,2'-アゾビス〔2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン〕ジハイドロクロライド、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、ＫＰＳ（過硫酸カリウム）等である。また開始剤としてＡＰＳまたはＫＰＳを用いた場合、重合促進剤としてＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）を使用することも可能である。
重合温度はアゾ系の開始剤を用いた場合には４５℃以上が好ましい。またＡＰＳ、ＫＰＳを単独で用いた場合には５０℃以上が好ましい。ＡＰＳ、ＫＰＳにＴＥＭＥＤを使用した場合には室温から４０℃の範囲での重合が好ましい。
また、本発明において使用される網目構造体は、モノマーと、架橋剤と、キャプチャープローブとを共重合することにより得ることもできる。キャプチャープローブを共重合することにより、得られる網目構造体からなるゲルを後述のマイクロアレイに使用することが可能である。キャプチャープローブを共重合させるときの添加量は目的に応じて任意に調整できるが、ポリマーが基盤ゲル成分の総モル数に対して1/10以下が好ましい。重合条件は、上述のキャプチャープローブを添加しないゲルの重合条件と同一の条件を採用することができる。
本発明において「キャプチャープローブ」とは、検出又は測定の対象となる物質を捕獲するプローブを意味し、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、蛋白質、脂質等が挙げられる。これらのプローブは、市販品又は生細胞等から得ることができる。例えば、生細胞からのDNAの抽出は、Blinらの方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)）等により、また、RNAの抽出は、Favaloroらの方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)）等により実施することができる。
また、DNAとしては、鎖状若しくは環状のプラスミドDNA又は染色体DNAが用いられる。さらには、制限酵素若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
上記の通り、キャプチャープローブは、モノマー及び架橋剤との共重合反応により、ゲルの網目構造に固定することができる。よって、キャプチャープローブには共重合反応可能な不飽和官能基が導入されている（以下、修飾プローブという）。不飽和官能基としては、（メタ）アクリルアミド基、グリシジル基等が挙げられる。不飽和官能基は、キャプチャープローブの機能を損なわない限り、いずれの部位に導入されていても良い。たとえば、キャプチャープローブが核酸の場合、不飽和官能基は核酸の末端、鎖中のいずれに導入されていても良い。核酸の鎖の末端に導入されていることが好ましい。修飾プローブの製造方法に関しては、WO02/062817に記載のごとく製造することができる。
３．ポリマー
本発明のゲル組成物は、基盤ゲルに、それとは共有結合しないポリマーが挿入されている形態となっている。このため、ポリマーは、基盤ゲルの外に拡散してしまう可能性がある。そこで、本発明においては、基盤ゲルの構成成分を、ポリマーと同成分とすることにより、ポリマーと基盤ゲル成分との相互作用を利用し、ポリマーがゲル外部へ拡散することを抑制することが可能となる。
また、本発明のsemi-IPNゲル組成物の特徴はポリマー成分（線状ポリマー）の少なくとも１成分が相転移温度、すなわちLCST（Lower Critical Solution Temperature）を持つことにある。LCSTは下限臨界溶液温度とも呼ばれ、LCSTをもつポリマーはこの温度以上で相分離を引き起こし、不溶化して白濁するか沈殿する。ポリマーがLCSTを持つ誘導体としては、例えば、N-エチルアクリルアミド（N-Ethylacrylamide）、N-シクロプロピルアクリルアミド（N-Cyclopropylacrylamide）、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）、N-メチル-N-エチルアクリルアミド（N-Methyl-N-Ethylacrylamide）、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-Isopropylacrylamide）、N-メチル-N-n-プロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-n-propylacrylamide）等が挙げられる。これらのうち、好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide）、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）が用いられる。
また、本発明においては、ポリマー成分として両イオン性のポリマー（ベタインポリマー）を用いることもできる。このようなポリマーは分子内に第４アンモニウム塩基、オキソニウム塩基、スルホニウム塩基などを持つものであるが、本発明においてはN,N-ジメチル（アクリルアミドプロピル）アンモニウムプロパンサルフォネイト（以下DMAAPS）が好ましい。
本発明に用いられるLCSTを持つポリマーは、用いる溶液の塩濃度などによってLSCTが大きく変化する。特に、本発明において使用されるゲルは核酸検出などのマイクロアレイなどに用いられるため、ハイブリダイゼーション時のバッファー組成によってポリマーを選定することが重要となる。NIPAMなどは高い塩濃度領域ではLCSTが下がり、室温においても白濁してしまい、マイクロアレイには使用できなくなる。しかし低い塩濃度バッファーでは良好な相転移挙動を示す。
一方、DMAAPSは、両イオン性ポリマーであるため高い塩溶液中では分子が溶解する。したがって、用いるバッファー組成によってポリマー成分を選ぶことが可能になる。本発明においては、2ｘSSC以下の塩濃度（0.2%SDS添加）であればNIPAMポリマーを、２ｘSSCより大きい塩濃度（0.2%SDS添加）であればDMAAPSを用いることが好ましい。
本発明において、ポリマー成分は１成分もしくは２成分から選択することができる。特にポリマーにDMAAPSを用いた場合には、単独では塩溶液中で分子は溶解し、温度を上げても相転移しなくなる。従って、DMAAPSを用いる場合には、多成分として塩溶液中で溶解しなくなるLCSTをもつポリマー（好ましくはNIPAM）と共重合させることが好ましい。これにより、相転移温度を調整することが可能となる。ポリマーの添加量は、当業者が任意に設定することができ、例えばDMAAPSの場合は、共重合率は5mol%〜15mol%の範囲である。
ポリマー成分は、先に記したように塩濃度や温度の影響で相転移を起す成分である。従って、基盤ゲルとしてポリマーと同一成分のみ（１成分のみ）を用いると、基盤ゲル自体が相転移により収縮及び白濁をおこし、目的とするゲルが得られない。そこで、本発明においては、上記のモノマー成分（LCSTを持たない成分）と、ポリマーの作製に用いたモノマー成分との共重合ゲルを用いることが好ましい。共重合比は、ポリマーの作製に用いたモノマー成分が５０％以下であることが好ましい。
このように作製されたsemi-IPNゲル組成物は、LCST以上でポリマーが相転移により収縮する。この時、ポリマーは基盤ゲルの一部を巻き込むように収縮するため、基盤ゲルに粗密構造生じ、一部ポアサイズが大きくなる。例えば図１Aに示すように、相転移前の状態ではゲルの網目構造３０が規則的に配列されているとする。相転移後は、ポリマー１０は基盤ゲル２０を巻き込み、基盤ゲルに粗構造４０及び密構造４１を生じる（図１B)。その結果、粗構造４０によって、核酸等が内部へ拡散しやすくなる。
４．マイクロアレイ
本発明のゲル組成物は、キャプチャープローブを保持するゲルとして、遺伝子解析のツールとして使用される。例えば、上述のゲルを管状体の中空部に充填することによりゲル保持管状体が作製できる。その管状体は特開平3-47097号公報に記載のごとく、遺伝子変異を解析するためのツールとして使用できる。中空部へのゲルの保持は、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する要領で実施可能である。
また、本発明のゲル組成物は、マイクロアレイの構成部材としても使用できる。例えば、平面基板上に重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を、予め定めた区画にスポッティングすることによりマイクロアレイを製造することができる（特表平6-507486号、米国特許5,770,721号公報参照）。区画が溝又は貫通穴により形成されている場合、それら溝又は貫通穴に、重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施することによりマイクロアレイを作製することができる（特開2000-60554号公報参照）。
さらに、本発明において、プローブ固定化ゲルを保持した管状体を複数本集束し（つまり、複数本を束ねて樹脂等により固定化する）、該集束物を管状体の長手方向に対して交差する方向で切断を繰り返すことにより、マイクロアレイを作製することができる（WO 00/5376号公報参照）。複数の管状体を集束した後、集束物の各中空部にゲルを保持しても良い。その場合、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を順次行うことによりマイクロアレイが製造できる。
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程。
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、モノマー、架橋剤およびキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、中空部内で所定の重合温度（例えば４０℃以下の重合温度）で共重合反応する工程。
この工程では、中空部に本発明のゲル組成物（キャプチャープローブを含むゲル組成物）を含むものを充填させることが好ましい。
（ｃ） 集束物の長手方向と交差する方向で切断する工程。
管状体としては、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。なお、中空繊維としては、特に限定されるものではないが、例えば合成繊維、半合成繊維、再生繊維、天然繊維等が挙げられる。
本発明におけるゲルの重合温度は用いるポリマーの相転移温度以下で行うことが好ましい。好ましい温度範囲は４０℃以下である。４０℃より高い温度で行うと、重合中に相転移してしまい、白濁したゲルになってしまう。相分離した状態でゲル化すると、温度を低くしても透明には戻らなくなるため、上記の温度で重合させる。このような温度で重合を行うための開始剤としては、APS（過硫酸アンモニウム）にTEMED（テトラメチルエチレンジアミン）を添加したものや光分解型の開始剤などを用いることができる。
従来の固定化ゲルでは、ハイブリダイゼーションの効率を高くするためには、ゲルの濃度を下げて網目の有効細孔径を大きくしなければならなかった。このためゲル強度が不十分となり、高いハイブリダイゼーション効率を得ることは困難であった。しかし、本発明のゲルは、従来のゲルと異なり、ハイブリダイゼーション時にはゲルの感温性により、ネットワークが不均一となり、ポアサイズが拡大し（網目の有効細孔径が大きくなり）、ハイブリダイゼーション効率が高くなる。更に、検体の検出時にはゲルのネットワークが均一に戻って透明なゲルに変化し、蛍光検出の際の励起光をゲル全体に透過させることが可能であるため、検出感度が極めて高くなる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、ゲルとしてベタインsemi-IPNゲル及びNIPAM semi-IPNゲルの２種類を用いた。
評価法として（１）光透過度、（２）水の透過度及び（３）マイクロアレイにおける評価を行った。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a gel composition containing a polymer component that is not covalently bonded to a component constituting a gel in a gel composed of a network structure produced by copolymerization of a monomer and a crosslinking agent. In addition, a capture probe can be copolymerized in the gel.
1. Gel composition (Semi-IPN gel)
The gel composition of the present invention contains a polymer component that is not covalently bonded to the base gel in the base gel (hereinafter referred to as “base gel”). “Non-covalently bonded” means that it cannot be covalently bonded because it is completely different from the base gel, and even if it is a polymer that has the same property and can be covalently bonded, it is covalently bonded by physical or chemical conditions. It means not both.
The characteristic of such a gel composition is that the base gel and the polymer component can exhibit their respective functions independently. In addition to the gel of the present invention, an interpenetrating polymer network (IPN) is known as such a gel. IPN is a type of polymer blend that utilizes artificial overlapping of polymer networks. Generally, gels used in IPN are gels composed of two crosslinked polymer networks that are not covalently bonded to each other. . In the present invention, the gel composition has one component being a crosslinked polymer network and the other component being a linear polymer. Since only one of the components is crosslinked, the gel composition of the present invention can be referred to as semi-IPN (hereinafter referred to as semi-IPN).
2. Network structure The gel which consists of a network structure among the gel compositions of this invention can be produced by copolymerizing a monomer and a crosslinking agent.
Examples of the monomer used as a component of the network structure include acrylamide, methacrylamide, N-methlylacrylamide, and N, N-dimethylacrylamide (DMAAm). It is done. Preferably, N, N-dimethylacrylamide (N, N-dimethylacrylamide) or N-isopropylacrylamide is used. In the present invention, one or more of these monomer components can be used, and one or two components are preferred. In the case of a two-component monomer, it is preferable to use DMAAm and NIPAM.
The “crosslinking agent” is a polyfunctional monomer having two or more ethylenically unsaturated bonds. For example, N, N'-methylenebisacrylamide, N, N'-diallyl (1,2-hydroxyethylene) -bisacrylamide, N, N'-cystamine-bisacrylamide, N-acryloyltris (hydroxymethyl) aminomethane, polyethylene Glycol dimethacrylate and the like. N, N′-methylenebisacrylamide is preferably used.
The amount of the crosslinking agent used in the copolymerization reaction is preferably added in a molar ratio of 8: 2 to 500: 1 with respect to the sum of the monomers used.
When the molar ratio of the crosslinking agent is larger than 8: 2, the gel network becomes non-uniform and white turbidity is likely to occur. On the other hand, when the molar ratio is 500: 1 or less, the gel structure cannot be maintained.
Any polymerization initiator can be selected as long as it does not cause degradation of the capture probe during the polymerization reaction. Preferred initiators are 2,2′-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, APS (ammonium persulfate), KPS (potassium persulfate), and the like. When APS or KPS is used as an initiator, TEMED (tetramethylethylenediamine) can be used as a polymerization accelerator.
The polymerization temperature is preferably 45 ° C. or higher when an azo initiator is used. Moreover, when APS and KPS are used independently, 50 degreeC or more is preferable. When TEMED is used for APS and KPS, polymerization in the range of room temperature to 40 ° C. is preferred.
The network structure used in the present invention can also be obtained by copolymerizing a monomer, a crosslinking agent, and a capture probe. By copolymerizing the capture probe, it is possible to use the resulting gel composed of the network structure in the microarray described later. The amount added when copolymerizing the capture probe can be arbitrarily adjusted according to the purpose, but the polymer is preferably 1/10 or less with respect to the total number of moles of the base gel component. As the polymerization conditions, the same conditions as the gel polymerization conditions to which the above-described capture probe is not added can be employed.
In the present invention, the “capture probe” means a probe that captures a substance to be detected or measured, and examples include deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), protein, and lipid. These probes can be obtained from commercial products or living cells. For example, DNA extraction from living cells is performed by the method of Blin et al. (Nucleic Acids Res.3.2303 (1976)), and RNA extraction is performed by the method of Favaloro et al. (Methods. Enzymol. 65.718 (1980)). Can be implemented.
As the DNA, a chain or circular plasmid DNA or chromosomal DNA is used. Furthermore, a restriction enzyme or a chemically cleaved DNA fragment, DNA synthesized by an enzyme or the like in a test tube, or a chemically synthesized oligonucleotide can also be used.
As described above, the capture probe can be fixed to the gel network structure by a copolymerization reaction with the monomer and the crosslinking agent. Therefore, an unsaturated functional group capable of copolymerization reaction is introduced into the capture probe (hereinafter referred to as a modified probe). Examples of unsaturated functional groups include (meth) acrylamide groups and glycidyl groups. The unsaturated functional group may be introduced at any site as long as the function of the capture probe is not impaired. For example, when the capture probe is a nucleic acid, the unsaturated functional group may be introduced either at the end of the nucleic acid or in the chain. It is preferably introduced at the end of the nucleic acid chain. The modified probe can be produced as described in WO02 / 062817.
3. Polymer The gel composition of the present invention is in a form in which a polymer that is not covalently bonded to the base gel is inserted. For this reason, the polymer may diffuse out of the base gel. Therefore, in the present invention, it is possible to suppress the diffusion of the polymer to the outside of the gel by utilizing the interaction between the polymer and the base gel component by using the same component as the polymer as the constituent component of the base gel. It becomes.
Further, the semi-IPN gel composition of the present invention is characterized in that at least one of the polymer components (linear polymers) has a phase transition temperature, that is, LCST (Lower Critical Solution Temperature). LCST is also called the lower critical solution temperature, and polymers with LCST cause phase separation above this temperature and become insoluble and become cloudy or precipitate. Derivatives having a polymer LCST include, for example, N-Ethylacrylamide, N-Cyclopropylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide (N, N-Diethylacrylamide), N-Methyl-N-Ethylacrylamide, N-Methyl-N-Isopropylacrylamide, N-Methyl-Nn-propylacrylamide ( N-Methyl-Nn-propylacrylamide), etc. Among them, N-isopropylacrylamide and N, N-diethylacrylamide are preferably used.
In the present invention, an amphoteric polymer (betaine polymer) can also be used as the polymer component. Such a polymer has a quaternary ammonium base, an oxonium base, a sulfonium base, etc. in the molecule, but N, N-dimethyl (acrylamidopropyl) ammonium propane sulfonate (hereinafter referred to as DMAAPS) is preferable in the present invention. .
The LSCT of the polymer having LCST used in the present invention varies greatly depending on the salt concentration of the solution used. In particular, since the gel used in the present invention is used for microarrays such as nucleic acid detection, it is important to select a polymer according to the buffer composition at the time of hybridization. NIPAM, etc., has a low LCST at high salt concentrations and becomes cloudy even at room temperature, making it unusable for microarrays. However, low phase buffer shows good phase transition behavior.
On the other hand, since DMAAPS is a zwitterionic polymer, molecules are dissolved in a high salt solution. Therefore, the polymer component can be selected depending on the buffer composition to be used. In the present invention, it is preferable to use NIPAM polymer if the salt concentration is 2 × SSC or less (0.2% SDS added), and DMAAPS if the salt concentration is higher than 2 × SSC (0.2% SDS added).
In the present invention, the polymer component can be selected from one component or two components. In particular, when DMAAPS is used for the polymer, the molecule dissolves alone in the salt solution and does not undergo phase transition even when the temperature is raised. Therefore, when DMAAPS is used, it is preferably copolymerized with a polymer (preferably NIPAM) having LCST that does not dissolve in the salt solution as a multicomponent. Thereby, the phase transition temperature can be adjusted. The addition amount of the polymer can be arbitrarily set by those skilled in the art. For example, in the case of DMAAPS, the copolymerization rate is in the range of 5 mol% to 15 mol%.
The polymer component is a component that causes a phase transition under the influence of salt concentration and temperature as described above. Therefore, when only the same component as the polymer (only one component) is used as the base gel, the base gel itself contracts and becomes cloudy due to the phase transition, and the target gel cannot be obtained. Therefore, in the present invention, it is preferable to use a copolymer gel of the above-described monomer component (a component not having LCST) and the monomer component used for production of the polymer. The copolymerization ratio is preferably 50% or less of the monomer component used for producing the polymer.
In the semi-IPN gel composition produced in this way, the polymer shrinks due to phase transition at LCST or higher. At this time, the polymer shrinks so as to entrain a part of the base gel, so that a dense structure is formed in the base gel, and the pore size is partially increased. For example, as shown in FIG. 1A, it is assumed that the
4). Microarray The gel composition of the present invention is used as a gene analysis tool as a gel holding a capture probe. For example, a gel-holding tubular body can be produced by filling the hollow portion of the tubular body with the gel described above. The tubular body can be used as a tool for analyzing gene mutation as described in JP-A-3-47097. The retention of the gel in the hollow part can be carried out in the manner of producing a capillary column used for capillary gel electrophoresis.
Moreover, the gel composition of this invention can be used also as a structural member of a microarray. For example, a microarray can be manufactured by spotting a monomer solution containing a probe before polymerization or immediately after the start of polymerization on a flat substrate in a predetermined section (Japanese Patent Publication No. 6-507486, US Pat. No. 5,770,721). reference). When the compartment is formed by a groove or a through hole, a monomer solution containing a probe before polymerization or immediately after the start of polymerization is added to the groove or the through hole, and a polymerization reaction is performed in the compartment to produce a microarray. (See JP 2000-60554 A).
Furthermore, in the present invention, a plurality of tubular bodies holding the probe-immobilized gel are converged (that is, a plurality of tubular bodies are bundled and fixed with a resin or the like), and the converged objects intersect with the longitudinal direction of the tubular body. A microarray can be produced by repeating cutting in the direction (see WO 00/5376). After converging a plurality of tubular bodies, the gel may be held in each hollow part of the converging object. In that case, the microarray can be manufactured by sequentially performing the following steps (a) to (c).
(A) A step of converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide.
(B) Fill the hollow part of each tubular body of the converged product with a gel precursor solution containing a monomer, a crosslinking agent and a capture probe, and copolymerize at a predetermined polymerization temperature (for example, a polymerization temperature of 40 ° C. or less) in the hollow part. The process of reacting.
In this step, it is preferable to fill the hollow portion with the gel composition of the present invention (gel composition including a capture probe).
(C) The process of cut | disconnecting in the direction which cross | intersects the longitudinal direction of a converging body.
Examples of the tubular body include a glass tube, a stainless tube, and a hollow fiber. In view of processability and ease of handling, it is preferable to use hollow fibers. In addition, although it does not specifically limit as a hollow fiber, For example, a synthetic fiber, a semi-synthetic fiber, a regenerated fiber, a natural fiber etc. are mentioned.
In the present invention, the gel polymerization temperature is preferably not higher than the phase transition temperature of the polymer used. A preferable temperature range is 40 ° C. or less. If it is carried out at a temperature higher than 40 ° C., it undergoes a phase transition during the polymerization, resulting in a cloudy gel. If gelation occurs in a phase-separated state, it will not return to transparent even if the temperature is lowered. As an initiator for carrying out the polymerization at such a temperature, a material obtained by adding TEMED (tetramethylethylenediamine) to APS (ammonium persulfate), a photodegradable initiator, or the like can be used.
In the conventional immobilized gel, in order to increase the efficiency of hybridization, it was necessary to reduce the gel concentration to increase the effective pore size of the network. For this reason, the gel strength was insufficient, and it was difficult to obtain high hybridization efficiency. However, unlike the conventional gel, the gel of the present invention has a heterogeneous network due to the temperature sensitivity of the gel, the pore size is enlarged (the effective pore size of the mesh is increased), and the hybridization efficiency is high. Become. Furthermore, the gel network returns uniformly to a transparent gel upon detection of the specimen, and excitation light at the time of fluorescence detection can be transmitted through the entire gel, so that the detection sensitivity becomes extremely high.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
In this example, two kinds of gels, betaine semi-IPN gel and NIPAM semi-IPN gel, were used.
As evaluation methods, (1) light transmittance, (2) water permeability, and (3) evaluation in a microarray were performed.
（１）光透過度の測定法：
光透過度の測定は波長６００nmを用いて行った。ゲルは10×20mmにカットし、ハイブリダイゼーションバッファーが入っている透過度測定用の通常の角型セル（10mm×10mm）の内面に光路に対して垂直に立てて測定した。
（２）水の透過度の測定法：
水の透過係数は、ゲル複合膜を２つのセルではさみ、これに一方（上流側）から水圧をかけたときの水の透過量の経時変化を、下流側に取り付けたピペットで測定し、これから流速Vを求め、次式で定義される水の透過係数ｐを算出した。
V = p x ΔＰ/d・μ
（ΔＰ：ゲル膜にかかる圧力 d:ゲル膜の厚さ μ:水の粘度）
(1) Light transmittance measurement method:
The light transmittance was measured using a wavelength of 600 nm. The gel was cut into 10 × 20 mm, and the measurement was carried out by standing perpendicular to the optical path on the inner surface of a normal square cell (10 mm × 10 mm) for measuring permeability containing a hybridization buffer.
(2) Measuring method of water permeability:
The water permeation coefficient was determined by measuring the time-dependent change in water permeation when a gel composite membrane was sandwiched between two cells and water pressure was applied from one (upstream side) with a pipette attached to the downstream side. The flow velocity V was determined, and the water permeability coefficient p defined by the following equation was calculated.
V = px ΔP / d ・ μ
(ΔP: pressure applied to the gel film d: thickness of the gel film μ: viscosity of water)
NIPAM semi-IPNゲルの光透過度
表１に示すモル比で調整した重合液にNIPAMポリマーを０．５ｗｔ％添加し、開始剤としてAPSおよびTEMEDを用いて２０℃で１時間重合させることにより、semi-IPNゲルを作製した。
このゲルを２ｘSSC 0.2%SDSの塩溶液中に浸し、十分にゲル中の水を置換させた後、波長600nmでの室温での透過度を測定した。またその後温度を７０℃に昇温した後、同様に透過度を測定した。
その結果、透過度は室温では９０％以上あったものが、７０℃では１０％以下に落ち、ゲルは白濁した。
つまり、低温ではポリマーはゲル中に拡散し透明であったものが、相転移温度以上にしたことによりＮＩＰＡＭポリマーが収縮し、ゲルに粗密構造が現れたことで白濁したものと考えられる。
This gel was immersed in a 2 × SSC 0.2% SDS salt solution to sufficiently replace the water in the gel, and the transmittance at room temperature at a wavelength of 600 nm was measured. Further, after raising the temperature to 70 ° C., the transmittance was measured in the same manner.
As a result, the transmittance was 90% or more at room temperature, but dropped to 10% or less at 70 ° C., and the gel became cloudy.
That is, it is considered that the polymer diffused into the gel at a low temperature and was transparent, but the NIPAM polymer contracted when the temperature was higher than the phase transition temperature, and the gel became cloudy due to the appearance of a dense structure.
ベタイン semi-IPNの光の透過度
実施例１と同様のモル比で調整した重合液にNIPAM-co-DMAAPSポリマー(DMAAPS 共重合率10mol%)を０．５ｗｔ％添加し、開始剤としてAPSおよびTEMED用いて４０℃で１時間重合させることにより、semi-IPNゲルを作製した。
このゲルを６ｘSSC 0.2%SDSの塩溶液中に浸し、十分にゲル中の水を置換させた後、波長600nmでの室温での透過度を測定した。またその後温度を５０℃に昇温した後、同様に透過度を測定した。
その結果、透過度は室温では９０％以上あったものが、５０℃では１０％以下に落ち、ゲルは白濁した。
つまり６ｘSSC 0.2%SDSにおいても実施例１同様、低温ではポリマーはゲル中に拡散し透明であったものが、相転移温度以上にしたことによりNIPAM-co-DMAAPSポリマーが収縮し、ゲルに粗密構造が現れたことで白濁したものと考えられる。
Light transmittance of betaine semi-IPN 0.5 wt% of NIPAM-co-DMAAPS polymer (DMAAPS copolymerization rate: 10 mol%) was added to the polymerization liquid adjusted at the same molar ratio as in Example 1, and APS and A semi-IPN gel was prepared by polymerization at 40 ° C. for 1 hour using TEMED.
This gel was immersed in a salt solution of 6 × SSC 0.2% SDS to sufficiently replace the water in the gel, and the transmittance at room temperature at a wavelength of 600 nm was measured. Further, after raising the temperature to 50 ° C., the transmittance was measured in the same manner.
As a result, the transmittance was 90% or more at room temperature, but dropped to 10% or less at 50 ° C., and the gel became cloudy.
That is, even in 6xSSC 0.2% SDS, as in Example 1, the polymer diffused into the gel at a low temperature and was transparent, but the NIPAM-co-DMAAPS polymer contracted when the temperature was higher than the phase transition temperature, and the gel had a dense structure. It is thought that it became cloudy because of appearing.
ベタインsemi-IPNの水の透過度
表２に示す組成で作製したsemi-IPNゲルに４０℃および７０℃にて水を透過することによって、透過係数を算出した。その結果、透明なゲルであった４０℃では透過係数 p=4.63x10-17 白濁した７０℃ではp=1.60x10-16となり高温時は低温時に比べて約3.5倍透過性が上昇することが分かった。
DMAAm NIPAM共重合ゲルの光の透過度
実施例１および２で用いたポリマーを添加せず、その他の組成は実施例２と同様にしてゲルを作製した。その後実施例２と同様にして光の透過度を測定した。
その結果、透過度は５０℃においても９０％程度と十分に白濁しなかった。
つまり相転移しやすいと考えられるポリマーを添加しなかったために高温で十分に相転移せず、目的とする構造（図１Ｂ）にならなかったと考えられる。
Light transmittance of DMAAm NIPAM copolymer gel A gel was prepared in the same manner as in Example 2 except that the polymer used in Examples 1 and 2 was not added. Thereafter, the light transmittance was measured in the same manner as in Example 2.
As a result, the transmittance was not sufficiently cloudy at about 90% even at 50 ° C.
That is, it is considered that the phase transition was not sufficiently performed at a high temperature because the polymer considered to be easily phase transition was not added, and the intended structure (FIG. 1B) was not achieved.
DNAチップでの評価（NIPAM semi-IPNのみ）
１．ＤＮＡマイクロアレイの製造
（１）プローブの調製
プローブとして、核酸の5'末端をビニル化した核酸（６５mer）を用いた（核酸１〜１０）。これら核酸は、以下の方法により合成した。
まず、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5'-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5'末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
核酸１：tcaccccagtggcccaggagaatcaatgagtatccttctcctgtcctgcaacaacatccatatcc（配列番号１）
核酸２：cagtgaggtaccctgagcccctttccacatgtgggctaaatacagtttacttgggtgacactgct（配列番号２）
核酸３：aactcatgaatcggatgtcaacagtgttcggtactaccccagtggggatgcttttgcttcggggt（配列番号３）
核酸４：tcgcgtccatgccctgagtccaccccggggaaggtgacagcattgcttctgtgtaaattatgtac（配列番号４）
核酸５：agcagccctgacccacctggctctctgctcatgtctacaagaatcttctatcctgtcctgtgcct（配列番号５）
核酸６：cccaactcggcccccaacactgagcatctccctcacaatttccatcccagacccccataataaca （配列番号６）
核酸７：acttcgctgtgagcgagtacaacaagggcagcaacgatgcgtaccacagccgcgccatacaggtg（配列番号７）
核酸８：attacaacatccagaaggagtcaaccctgcacctggtccttcgcctgagaggtggcatgcagatc（配列番号８）
核酸９：cacagcagcggcctctgaacttggacagcgaaaccattgcttcactacccatcggtgttcattta（配列番号９）
核酸１０：cctgagaatgtcactaggctctcagggtcttggcaccactcgcccaagttatatccaccagatta（配列番号１０）
（２）中空繊維束の作製
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔（５２）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１０列で合計１００個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（５０）２枚を準備した。これらの多孔板（５０）を重ね合わせて、そのすべての孔（５２）に、ポリカーボネート中空繊維（５４）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック1質量％添加）を１本づつ、通過させた。
ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（５６）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
（３）ゲル充填中空繊維配列体の製造
表３に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。ゲル前駆体重合性溶液は氷中で保存した。
次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。
（３）検体調整、ビオチン標識検体を用いたハイブリダイゼーション
マウスのRNAから逆転写反応でcDNAを合成した。次にcDNAをDNApolymeraseを用いてdsDNAを合成した。このdsDNAを鋳型としてaRNAを逆転写合成した。この際Biotin-UTPを取り込ませた。こうして得られたBiotin標識aRNAを断片化し、検体を調整した。
この検体を用いてチップのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションバッファーは２ｘSSC 0.2%SDSを用い、６５℃、１６時間でハイブリダイゼーションを行った。その後２ｘSSC 0.2%SDSバッファーを用い６５℃で２０分洗浄を行った後、Streptavidin-Alexa647を用いて染色を行った。
（４）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナル検出
洗浄を施したマイクロアレイを、水を入れたシャーレに浸漬させて固定し、非共焦点レーザー顕微鏡（ジェノミックッソリューション社製）でハイブリダイゼーションシグナルを検出した。結果を表４に示す。
Evaluation with DNA chip (NIPAM semi-IPN only)
1. Manufacture of DNA microarray (1) Preparation of probe A nucleic acid (65mer) in which the 5 'end of a nucleic acid was vinylated was used as a probe (nucleic acids 1 to 10). These nucleic acids were synthesized by the following method.
First, oligonucleotides were synthesized by an automatic DNA synthesizer. In the final stage of synthesis, aminolink ™ (manufactured by PE Biosystems) was reacted with the oligonucleotide and then subjected to deprotection, whereby an aminohexyl group was introduced at the end of each oligonucleotide. -O-aminohexyl oligonucleotide was prepared. Next, these oligonucleotides were reacted with methacrylic anhydride to prepare 5′-terminal vinylated oligonucleotides.
Nucleic acid 1: tcaccccagtggcccaggagaatcaatgagtatccttctcctgtcctgcaacaacatccatatcc (SEQ ID NO: 1)
Nucleic acid 2: cagtgaggtaccctgagcccctttccacatgtgggctaaatacagtttacttgggtgacactgct (SEQ ID NO: 2)
Nucleic acid 3: aactcatgaatcggatgtcaacagtgttcggtactaccccagtggggatgcttttgcttcggggt (SEQ ID NO: 3)
Nucleic acid 4: tcgcgtccatgccctgagtccaccccggggaaggtgacagcattgcttctgtgtaaattatgtac (SEQ ID NO: 4)
Nucleic acid 5: agcagccctgacccacctggctctctgctcatgtctacaagaatcttctatcctgtcctgtgcct (SEQ ID NO: 5)
Nucleic acid 6: cccaactcggcccccaacactgagcatctccctcacaatttccatcccagacccccataataaca (SEQ ID NO: 6)
Nucleic acid 7: acttcgctgtgagcgagtacaacaagggcagcaacgatgcgtaccacagccgcgccatacaggtg (SEQ ID NO: 7)
Nucleic acid 8: attacaacatccagaaggagtcaaccctgcacctggtccttcgcctgagaggtggcatgcagatc (SEQ ID NO: 8)
Nucleic acid 9: cacagcagcggcctctgaacttggacagcgaaaccattgcttcactacccatcggtgttcattta (SEQ ID NO: 9)
Nucleic acid 10: cctgagaatgtcactaggctctcagggtcttggcaccactcgcccaagttatatccaccagatta (SEQ ID NO: 10)
(2) Production of Hollow Fiber Bundle A hollow fiber bundle was produced using the array fixture shown in FIG. In the figure, x, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the x-axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
First, two perforated plates (50) having a thickness of 0.32 mm and a total of 100 perforated plates (50) each having 10 rows in the vertical and horizontal directions, each having a center distance of 0.42 mm, were prepared. did. These perforated plates (50) were overlapped, and polycarbonate hollow fibers (54) (added by 1% by mass of carbon black manufactured by Mitsubishi Engineering Plastics) were passed through all the holes (52) one by one.
The position of the two perforated plates was moved in a state where a tension of 0.1 N was applied to each fiber in the x-axis direction, and was fixed at two positions of 20 mm and 100 mm from one end of the hollow fiber. . That is, the interval between the two perforated plates was 80 mm. Next, the three surrounding surfaces of the space between the perforated plates were surrounded by a plate-like object (56). In this way, a container having an open top only was obtained. Next, the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container. As resin, what added 2.5 mass% carbon black was used with respect to the total weight of polyurethane resin adhesives (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd., Nippon-Poran 4276, Coronate 4403). The resin was cured by standing at 25 ° C. for 1 week. Next, the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle.
(3) Production of Gel Filled Hollow Fiber Array A gel precursor polymerizable solution containing a monomer and an initiator mixed at a mass ratio shown in Table 3 was prepared. The gel precursor polymerizable solution was stored in ice.
Next, the obtained hollow fiber bundle was sliced in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain 50 thin sheet sheets (DNA microarray) having a thickness of 0.25 mm.
(3) Sample preparation, hybridization using biotin-labeled sample cDNA was synthesized from mouse RNA by reverse transcription. Next, dsDNA was synthesized from the cDNA using DNApolymerase. Using this dsDNA as a template, aRNA was reverse-transcribed and synthesized. At this time, Biotin-UTP was incorporated. The biotin-labeled aRNA thus obtained was fragmented to prepare a sample.
Using this specimen, hybridization of the chip was performed. Hybridization was performed using 2 × SSC 0.2% SDS as a hybridization buffer at 65 ° C. for 16 hours. Thereafter, the plate was washed with 2 × SSC 0.2% SDS buffer at 65 ° C. for 20 minutes, and then stained with Streptavidin-Alexa647.
(4) Detection of hybridization signal of DNA microarray The washed microarray was fixed by immersing it in a petri dish containing water, and a hybridization signal was detected with a non-confocal laser microscope (Genomic Solutions). The results are shown in Table 4.
１０ ポリマー
２０ ゲル
３０ 網目構造
４０ 粗構造
４１ 密構造
５０ 多孔板
５２ 孔
５４ 中空繊維
５６ 板状物
DESCRIPTION OF
Claims (14)
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、請求項１記載のゲルを保持する工程、ならびに
（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。 A microarray manufacturing method including the following steps in sequence:
(A) a step of converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide with each other (b) a step of holding the gel according to claim 1 in a hollow portion of each tubular body of the converging object; and (c) A step of cutting the convergent object in a direction crossing the longitudinal direction of the tubular body.
A method for producing a gel composition, comprising mixing a gel polymerization liquid containing a monomer and a crosslinking agent and a polymer component that is not covalently bonded to a constituent component of the gel and polymerizing the mixture.
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| JP2006186429A JP2008013663A (en) | 2006-07-06 | 2006-07-06 | Semi-IPN gel and bioarray-immobilized microarray using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008013663A true JP2008013663A (en) | 2008-01-24 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014210915A (en) * | 2013-04-01 | 2014-11-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | New self-excited vibration gel without strong acid |
-
2006
- 2006-07-06 JP JP2006186429A patent/JP2008013663A/en active Pending
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