JP2008005797A - 溶媒組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止する。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明にかかる溶媒組成物は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。本発明にかかる溶媒組成物においては、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止することができる。
本発明は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質を含み、特定の用途に使用される溶媒組成物に広く適用される。ここで、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質としては、例えば、鉱油等の潤滑油基油成分、マイクロエマルジョン等の水系潤滑剤成分、エチレングリコール等の冷媒成分、等を挙げることができる。また、これら物質以外にも、リン酸エステル、シリコーン油、水-グリコール混合物といった物質を挙げることができる。これら各物質は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けることによって、潤滑油基油としての機能、水系潤滑剤としての機能、冷媒成分としての機能が毀損されることとなる。
1.耐熱性SOD酵素のクローニング
Thermus thermophilus HB8株のゲノムDNAを以下のようにして調製した。
上記1.で調製した大量発現系である大腸菌をそれぞれ37℃、12時間LB培地で振とう培養した。その結果、菌体は約3g/L得られ、各系において耐熱性SODは良好に発現したことを確認した。各系において発現した耐熱性SODは、共に以下の方法によって精製した。
上記2.で精製された耐熱性SODの酵素活性は、キサンチン-キサンチンオキシダーゼから発生させた酸素ラジカルによる水溶性テトラゾリウム塩(WST)の酸化を指標として測定した。すなわち、酸素ラジカルによる酸化基質にWSTを用い、耐熱性SODの有無でどれだけ水溶性テトラゾリウムフォルマザンの生成が抑えられるかを指標にして測定した(以下の文献を参照:H. Ueda, D. Kawana, S. Maeda, M. Sawamura, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 485-488,1999)。WSTが酸化されて水溶性テトラゾリウムフォルマザンになると、450 nmに紫外吸収が生じるので、これを測定することで酸素ラジカルによる酸化反応を簡便に測定できる。活性測定緩衝液には0.17 mM キサンチンと0.11 mM EDTAを含む35 mM 炭酸ナトリウム(pH 10.2)を使用した。酸化基質としては0.24 mMのWSTを用いた。耐熱性SODは、0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5 各温度で調整済)に1 mg/ml SODになるように溶かして使用した。
Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODについて、上記3.に記載した活性測定を25℃から85℃までの温度範囲で測定した。結果を図1に示す。図1から判るように、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODは、75℃以上で最大活性を持ち、55℃でもおよそ最大活性の50%の活性を発揮することが分かった。
上記1.で記述した同様な方法を用いて調製したPyrococcus furiosusのゲノムDNAを鋳型として、5’上流側プライマーにGTCTGTACATATGGCCCAGTTAGCAGGCCAA(Pfu-cpnNde+)(配列番号13)を、3’下流側プライマーにGAACGGATCCTTAGTCCAGATCACTGCTGAAGTCCT(Pfu-cpnBam-)(配列番号14)を用いたPCR法によって、耐熱性シャペロニン遺伝子(Pfu-cpn)を含むDNA断片を増幅した。また、得られたDNA断片を発現プラスミドpET23a(+)のNdeI-BamHIサイトに導入し、これを用いて、上記1.と同様にして、大腸菌による大量発現系を確立した。大量発現した耐熱性シャペロニンは、次のようにして精製した。菌体を破砕緩衝液(25 mM HEPES-KOH(pH 7.6)、50 mM KCl及び1 mM フッ化フェニルメタンスルフォニルからなる組成)に懸濁し、その後、氷中で超音波破砕を行った。次に、遠心後、上澄み溶液(粗抽出液)を80℃、30分間熱処理し、熱に弱い大腸菌由来のタンパク質を失活・沈殿化した。最後に、熱処理後の上澄み液をリソースQ陰イオン交換カラム(アマシャムバイオサイエンス社製)にかけ、0 - 0.5 M KClで溶出させて精製することができた(以下の文献を参照:K. Hongo, H. Hirai, C. Uemura, S. Ono, J. Tsunemi, T. Higurashi, T. Mizobata, Y. Kawata, FEBS Letters, 580, 34-40, 2006)。
一般的に酵素は有機溶媒中では不安定になることが多い。燃料電池の冷媒として使用されるエチレングリコール(EG)-水系での使用環境を考慮して、有機溶媒中における耐熱性シャペロニン(Pfu-cpn)の酵素の安定化効果を検証した。
Claims (11)
- 酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含む溶媒組成物。
- 耐熱性分子シャペロンを更に含むことを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは、Thermus thermophilis又はAeropyrum pernix由来であることを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 上記耐熱性分子シャペロンは、好熱性細菌由来のものであることを特徴とする請求項2記載の溶媒組成物。
- 上記好熱性細菌は、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、 Methanococcus jannaschii又はThermoplasma acidophilumであることを特徴とする請求項4記載の溶媒組成物。
- 水系溶媒を含むことを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 上記水系溶媒は、エチレングリコールを含有することを特徴とする請求項6記載の溶媒組成物。
- 上記物質は潤滑剤成分又は冷媒成分であることを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 潤滑剤として使用されることを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 冷媒として使用されることを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
- 上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは担体へ固定化されていることを特徴とする請求項1記載の溶媒組成物。
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