JP2007525492A - Ｐｒａｍｅ阻害剤とｈｄａｃ阻害剤との併用 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌抗原ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優勢発現抗原）、ならびに、治療を必要とする患者に有効量のＰＲＡＭＥ阻害剤をＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびレチノイドからなる群より選択される第２の薬剤と組み合わせて投与することを含む、腫瘍の治療方法でのその使用に関する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、既知の癌抗原ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優勢発現抗原）の新規用途を定めたものであり、特に、ＰＲＡＭＥ発現に基づいて癌患者を重症度分類（stratification）するための方法、およびＰＲＡＭＥ発現または活性の阻害により癌患者を治療するための方法を提供する。

レチノイン酸（ＲＡ）は、多種多様な細胞タイプにおいて増殖停止、分化およびアポトーシスを誘導する（Altucci, 2001；Freemantle, 2003）。レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）シグナル伝達の異常、例えば、急性前骨髄球性白血病においてＰＭＬ−ＲＡＲαおよびＰＬＺＦ−ＲＡＲαの転座により引き起こされるような異常が、癌と関連付けられている（Altucci, 2001；Freemantle, 2003）。ＲＡがその受容体に結合すると、コリプレッサー分子が放出されてコアクチベーターがＲＡＲに動員され、結果として転写が活性化される（Xu, 1999）。

ヒストンのアセチル化および脱アセチル化は、細胞の増殖および／または分化をもたらす転写事象と関連がある。転写因子の機能の調節もまたアセチル化に媒介される。ヒストン脱アセチル化に関する最近の総説としては、Kouzarides, 1999およびPazinら, 1997が挙げられる。

ヒストンのアセチル化状態と遺伝子の転写との相関関係は３０年以上も前から知られている（例えば、Howeら, 1999を参照されたい）。ヒストンのアセチル化状態を調節するある種の酵素、具体的にはアセチラーゼ（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ＨＡＴ）およびデアセチラーゼ（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、ＨＤＡＣ）は多くの生物において同定されかつ多数の遺伝子の調節に関与しており、このことから、アセチル化と転写との関連が裏付けられる。例えば、Davie, 1998を参照されたい。一般に、ヒストンアセチル化は転写活性化と関連があり、ヒストン脱アセチル化は遺伝子抑制と関連がある。

同定されるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の数は増え続けている（例えば、NgおよびBird, 2000を参照されたい）。最初のデアセチラーゼであるＨＤＡＣ１は、１９９６年に同定された（例えば、Tautonら, 1996を参照されたい）。その後、２種類の他の哺乳動物核デアセチラーゼ（ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３）が見出された（例えば、Yangら, 1996、1997、およびEmilianiら, 1998を参照されたい）。また、Grozingerら, 1999；Kaoら, 2000；およびVan den Wyngaertら, 2000も参照されたい。

ＨＤＡＣは、プロモーターに連結されて転写を抑制する、巨大な多タンパク質複合体の一部として機能する。Ｍａｄ（Lahertyら, 1997）、ｐＲｂ（Brehmら, 1998）、核内受容体（Wongら, 1998）およびＹＹ１（Yangら, 1997）などの、十分に特徴付けられた転写リプレッサーは、ＨＤＡＣ複合体と会合してそのリプレッサー機能を発揮する。

ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の研究により、これらの酵素が細胞の増殖および分化において重要な役割を果たすことが示されている。阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（Yoshidaら, 1990a）は、Ｇ１とＧ２期の両期に細胞周期の停止を引き起こし（YoshidaおよびBeppu, 1988）、種々の細胞株の形質転換された表現型を元に戻してフレンド白血病細胞および他の細胞の分化を誘導する（Yoshidaら, 1990b）。ＴＳＡ（およびＳＡＨＡ）は、マウスにおいて細胞成長を阻害し、最終分化を誘導し、さらに腫瘍の形成を予防すると報告されている（Finninら, 1999）。

ＨＤＡＣおよびＨＡＴ（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ）の活性は、癌ではその調節が解除されていることが多く、これらの酵素が癌に関与するための手段の１つはレチノイン酸受容体シグナル伝達の抑制である。

細胞の増殖と分化の制御におけるＨＤＡＣの明らかな関与は、異常なＨＤＡＣ活性が癌の一因となっている可能性があるということを示唆している。デアセチラーゼが癌発達の原因となっているということの最も直接的な証拠は、種々の急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）についての解析によって得られる。殆どのＡＰＬ患者では、第１５染色体と第１７染色体との転座（ｔ（１５；１７））が、ＲＡＲα（レチノイン酸受容体）の大部分を連結したＰＭＬ遺伝子産物のＮ末端部分を含有する融合タンパク質の発現を招く。幾つかの症例では、別の転座（ｔ（１１；１７））がジンクフィンガータンパク質ＰＬＺＦとＲＡＲαとの融合を引き起こす。リガンドの非存在下では、野生型ＲＡＲαが、ＨＤＡＣリプレッサー複合体をプロモーターＤＮＡに連結することにより標的遺伝子を抑制する。正常な造血時には、レチノイン酸（ＲＡ）がＲＡＲαと結合してそのリプレッサー複合体を移動させることにより、骨髄分化に関与する遺伝子の発現を可能にする。ＡＰＬ患者に見られるＲＡＲα融合タンパク質は生理学的レベルのＲＡに応答しなくなっており、それらは骨髄分化を促すＲＡ誘導性遺伝子の発現を妨害する。このことは、骨髄球細胞のクローン性増大および白血病の発症を招く。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、ＴＳＡは、融合ＲＡＲαタンパク質に対するＲＡ応答性を回復させて骨髄分化を可能にすることが示されている。これらの結果は、ＨＤＡＣと腫瘍形成との関連性を立証しており、またＨＤＡＣがＡＰＬ患者における薬剤介入の潜在的標的であることを示唆している（例えば、Kitamuraら, 2000；Davidら, 1998；Linら, 1998を参照されたい）。

さらに、異なる系列の証拠により、ＨＤＡＣが他のタイプの癌の重要な治療標的でありうることが示唆されている。多くの異なる癌（前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、神経癌、肝癌）に由来する細胞株は、ＨＤＡＣ阻害剤により誘導されて分化する（YoshidaおよびHorinouchi, 1999）。数多くのＨＤＡＣ阻害剤が癌の動物モデルで研究されている。それらは腫瘍の成長を抑え、メラノーマ、白血病、結腸癌、肺癌および胃癌などを含む様々なタイプの移植腫瘍を抱えたマウスの寿命を延ばす（Uedaら, 1994；Kimら, 1999）。

従って、ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は有望で新しいクラスの抗癌剤であるが、癌細胞に対するそれらの選択的増殖阻害活性の分子基盤は現在のところ不明である。

ＰＲＡＭＥは、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を誘発するヒトメラノーマの抗原として最初に同定された（Ikedaら, 1997）。またＰＲＡＭＥは、急性および慢性白血病、非小細胞肺癌、頭頸部癌、腎癌を含む様々な他のヒト悪性腫瘍においても過剰発現され、その発現は乳癌における不良な臨床転帰の前兆とされている（Ikeda, 1997；van’t Veer, 2002；van Baren, 1998；Neumann, 1998；Boon, 2003）。しかし、ＰＲＡＭＥの機能についてはこれまで一切記載されていない。

本発明は、ＰＲＡＭＥ発現がレチノイン酸誘導性の分化、増殖停止およびアポトーシスを阻害すること、ひいてはＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達の優性リプレッサーまたは負の調節因子であることを証明する。また本発明は、ＰＲＡＭＥがＨＤＡＣｉ媒介性のＲＡＲシグナル伝達活性化を抑制することも示す。ＰＲＡＭＥの機能に関するこれらの発見は、既知の抗癌治療薬（例えば、レチノイドおよびＨＤＡＣｉ）による治療に先立って患者を重症度分類できるようにしただけでなく、ＰＲＡＭＥの抑制を介して癌治療に新たな道を切り開いた。

発明の概要
従って、第１の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に、有効量のＰＲＡＭＥ阻害剤を、ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびレチノイドからなる群より選択される第２の薬剤と組み合わせて投与することを含む、腫瘍の治療方法を提供する。

さらなる態様では、前記方法は、治療法での同時、別個または連続的使用のための併用薬剤としての、ＰＲＡＭＥ阻害剤ならびにＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびレチノイドからなる群より選択される第２の薬剤を提供する。

また本発明は、腫瘍の治療での同時、別個または連続的使用のための併用薬剤としての医薬の製造における、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドと組み合わせたＰＲＡＭＥ阻害剤の使用も提供する。

本発明はさらに、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドの投与の時点で、患者が腫瘍中のＰＲＡＭＥのレベルを抑制するための治療を受けている、患者の腫瘍を治療するためのＨＤＡＣｉまたはレチノイドの使用を提供する。

本発明はさらに、ＰＲＡＭＥレベルに基づく患者の重症度分類方法を提供する。この重症度分類は、治療のために患者を選別する目的での診断および予後診断に利用してもよいし、または予想される治療有効性を確認するために利用してもよい。

また本発明は、ＰＲＡＭＥとレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）との相互作用の阻害剤についてのアッセイであって、
（ｉ） 候補阻害剤；および
（ｉｉ） ＰＲＡＭＥタンパク質およびＲＡＲタンパク質
を一緒に併せるステップ、ならびに推定的な阻害剤が前記ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲタンパク質の間の相互作用を妨げることが可能かどうかを確認するステップを含むアッセイも提供する。

図面の簡単な説明
図１：ＰＲＡＭＥはＲＡＲシグナル伝達のリプレッサーである
ａ，２９３細胞に、ＧＡＬ４−ＰＲＡＭＥキメラ構築物およびＧＡＬ４−ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした。ｂ，２９３細胞をａと同様にトランスフェクトし、さらにこれをＰＸＤ１０１で処理した。ｃ，Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦにＲＡ応答性ルシフェラーゼレポーター（ＲＡＲＥ−ｌｕｃ）およびＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。ｄ，Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦをｃと同様にトランスフェクトし、さらにこれをＰＸＤ１０１で処理した。ｅ，Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦにＲＡＲＥ−ルシフェラーゼおよびＲＡＲαまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＰＸＤ１０１で処理した。
図２：ＰＲＡＭＥおよびそのＲＡＲとの相互作用
ａ，ＰＲＡＭＥの概略図。７個のＮＲボックスモチーフのアミノ酸残基数を示す。ｂ，Ｂ１６メラノーマ細胞に、ＲＡＲＥ−ｌｕｃおよびＰＲＡＭＥまたはＰＲＡＭＥ−ΔＬＸＸＬＬの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。平均値は、３回の独立したトランスフェクションの平均値である（±ｓ．ｄ．）。
図３：ＰＲＡＭＥ発現の影響
通常培地または５μＭのＲＡを添加した培地で増殖させたＡ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞の増殖曲線。
図４：ＰＲＡＭＥはＲＡＲシグナル伝達を抑制する
ａ，Ｂ１６メラノーマ細胞に、ＲＡＲＥ−ルシフェラーゼおよびＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。ｂ，Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦをａと同様にトランスフェクトし、さらにこれをＴＳＡで処理した。ｃ，Ｂ１６メラノーマ細胞にＲＡＲβ２−プロモータールシフェラーゼレポーター（ＲＡＲβ２−ｌｕｃ）およびＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。ｄ，Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦに、ＲＡＲβ２−ルシフェラーゼレポーター（Ｒ１４０−ｌｕｃ）または変異型ＲＡＲＥを含むＲＡＲβ２−ルシフェラーゼレポーター（Ｍ３Ｍ７−ｌｕｃ）およびＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。平均値は、３回の独立したトランスフェクションの平均値である（±ｓ．ｄ．）。
図５：ＰＲＡＭＥ発現がメラノーマのＲＡシグナル伝達に及ぼす影響
ａ，ｂ，ＦＭ６（ａ）およびＳＫ２３（ｂ）ヒトメラノーマ細胞に、ＲＡＲＥ−ルシフェラーゼおよびｐＲＳ−ＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。ｃ，Ａ３７５細胞をａと同様にトランスフェクトし、さらにこれをＰＸＤ１０１で処理した。ｄ，Ｂ１６メラノーマ細胞にｐ２１プロモーター−ルシフェラーゼ構築物およびＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。平均値は、３回の独立したトランスフェクションの平均値である（±ｓ．ｄ．）。

発明の詳細な説明
ＰＲＡＭＥ阻害剤
ＰＲＡＭＥ阻害剤としては、ＰＲＡＭＥの発現を妨げるか、またはＰＲＡＭＥが発現された場合にその正常な活性を発揮するのを妨げることが可能ないずれかの化合物が挙げられる。正常な活性とは、この点に関して使用する場合、ヒトまたは動物の体内でＰＲＡＭＥ発現産物により示される全ての活性を指す。典型的には、かかる活性には転写および／またはＲＡＲとの相互作用の抑制が含まれる。

好適なＰＲＡＭＥ阻害剤は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡ干渉は、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレンシングする遺伝子と配列上相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞への導入が、配列依存的な様式で遺伝子発現を翻訳後に阻害するためのプロセスである。この過程は、転写後遺伝子サイレンシングとしても知られている。ＲＮＡｉの現行モデルにより、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」として知られる短い（典型的には２０〜２５ヌクレオチドの）ｄｓＲＮＡにより媒介されることが示されている。ｄｓＲＮＡが細胞内で切断されてｓｉＲＮＡを生み出しているものと思われる。その後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれて、該複合体を相同的な内在性ｍＲＮＡへと導く。その後、活性化されたＲＩＳＣはｍＲＮＡ転写産物を切断し、結果として該ｓｉＲＮＡに相同な細胞内ｍＲＮＡが破壊される。該ｓｉＲＮＡは再利用される。こうして、比較的少数のｓｉＲＮＡが大過剰の細胞ｍＲＮＡを選択的に破壊することが可能となる。

細胞内でＲＮＡ干渉を誘導するために、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるトランスジーン、プラスミドまたはウイルスを介してｄｓＲＮＡを細胞に導入してもよい。あるいは、ｓｉＲＮＡを合成し、これを状況に応じて医薬組成物の形で細胞に直接導入してもよい。

ｓｉＲＮＡの相補鎖は、１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜３０ｎｔ長、好ましくは２０ｎｔ〜２５ｎｔ長でありうる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、２０、２１または２２ｎｔ長である。一般に、ヌクレオチドは、相補的二本鎖を形成するが、これは１または２ｎｔの短い突出部を有していてもよい。

ｓｉＲＮＡの配列は、ＰＲＡＭＥのｃＤＮＡ配列に由来する１０〜３０ヌクレオチドの連続配列に基づくものとすることができる。ＰＲＡＭＥのヒトｃＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０１４０７４として利用可能であり、本明細書中では配列番号１として示してある。配列番号１の幾つかの残基、すなわち、残基１７７（Ｔ／Ｃ）、６２１（Ｃ／Ａ）、９２４（Ｔ／Ｃ）、１４２１（Ｔ／Ｃ）、１６８５（Ｔ／Ｃ）および１９６６（Ｔ／Ａ）は、一塩基多型部位であることが知られているので、これらのＳＮＰのうちのいずれかを含む領域を標的化するように設計されたｓｉＲＮＡは、１種もしくはそれ以上の該ＳＮＰ残基を含んでいてもよいし、またはｓｉＲＮＡがそれらの混合物であってもよい。しかし好ましくは、ｓｉＲＮＡは、前記配列の既知ＳＮＰを含有しない領域を標的化する。

ｓｉＲＮＡを使用して配列番号１のコードまたは非コード領域を標的化してもよい。該コード領域は配列番号１の１５９〜１６８８を占める。標的化しうる配列番号１の特定の領域は、７１４〜７３４の２１ヌクレオチド領域であり、配列番号２として後に示す。

ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野で公知の標準的な固相または液相合成技術を利用して合成することができる。ヌクレオチド間の結合はホスホジエステル結合であってもよいし、あるいはその代替手段、例えば、化学式Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；またはＣＯＮＲ’２（式中のＲはＨ（もしくは塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１〜９Ｃ）である）の結合基が−Ｏ−または−Ｓ−を介して隣接するヌクレオチドに連結している。

修飾ヌクレオチド塩基は、天然に存在する塩基に加えて使用することが可能であり、またそれらを含有するｓｉＲＮＡ分子に有利な特性を付与する場合がある。

例えば、修飾塩基は、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を高め、それによってサイレンシングに要する量を減らす場合がある。修飾塩基の供給により、非修飾ｓｉＲＮＡよりも安定な、または不安定なｓｉＲＮＡ分子が提供される場合もある。

「修飾ヌクレオチド塩基」という用語は、共有結合的に修飾された塩基および／または糖を含有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドとして、３’位ではヒドロキシル基以外、および５’位ではリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドが挙げられる。従って、修飾ヌクレオチドとしてはまた、２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロまたは２；アジド−リボース、炭素環式糖類似体ａ−アノマー型の糖；アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー型の糖、ピラノース型の糖、フラノース型の糖、およびセドヘプツロースといった、２’置換型の糖を挙げることができる。

修飾ヌクレオチドは当該技術分野で公知であり、これらのものとして、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、ならびに他の複素環が挙げられる。これらのクラスのピリミジンおよびプリンは当該技術分野で公知であり、これらのものとして、プソイドイソシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンチル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５メトキシウラシル、２メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル（psueouracil）、２−チオシトシン、５−メチル−２チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ケオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−プロピルウラシル、５−プロピルシトシン、５−エチルウラシル、５−エチルシトシン、５−ブチルウラシル、５−ペンチルウラシル、５−ペンチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルシトシンが挙げられる。

あるいは、ｓｉＲＮＡ分子またはより長いｄｓＲＮＡ分子を、好ましくは後述のベクター内に含有されている核酸配列の転写によって組換えにより作製してもよい。かかるベクターは、ｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで産生させるために標的腫瘍細胞に導入されるように設計されたベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡを組換え手段によって産生させる場合、該ｓｉＲＮＡの二本の鎖を別々の転写産物として産生させてもよい。しかし、より望ましくは、ｓｉＲＮＡを、例えばBrummelkampら, Science 2002に記載されているような、二本鎖ｓｉＲＮＡ配列を含むヘアピンループ構造を形成する一本鎖転写産物の形で作製してもよい。

従って、ＰＲＡＭＥ阻害剤として、標的腫瘍細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることが可能な組換えベクターが挙げられることは理解されよう。かかるベクターは、プロモーターに機能しうる形で連結されたｓｉＲＮＡをコードする配列を含んでいてもよい。該プロモーターは、真核生物のプロモーターなどの、ｓｉＲＮＡの転写に適した任意のプロモーターでありうる。かかるプロモーターは、好ましくはポリＡ尾部を欠いた所定の３’末端を有する、小ＲＮＡ転写産物を産生するプロモーターなどのＲＮＡ遺伝子プロモーターでありうる。好適なかかるプロモーターは、ポリメラーゼ−ＩＩＩ Ｈ１遺伝子ＲＮＡプロモーターである。

ベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはレトロウイルスのベクターなどの、ウイルスベクターでありうる。例えば米国特許第６，２２８，８４４号および同第６，３３９，０６８号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）に記載されているような、ヒトまたは動物被験体に送達するための様々なウイルスベクター系が当該技術分野で公知である。該ベクターは、天然のベクター遺伝子の代わりの、または該ベクター内に追加のＤＮＡとして挿入された、該ベクターにより保持されている構築物として、プロモーターに機能しうる形で連結されたｓｉＲＮＡコード配列を含む。

さらなるＰＲＡＭＥ阻害剤を、本明細書中に記載した、本発明のさらなる態様を成すアッセイを利用して特定してもよい。

ＨＤＡＣ阻害剤
癌の治療での使用に適したＨＤＡＣ阻害剤は当該技術分野で公知である。典型的なＨＤＡＣｉとしては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、およびフェニルブチレートが挙げられ、これらは少なくとも部分的には、ヒストンデアセチラーゼを阻害することによって作用することが報告されている（例えば、Yoshidaら, 1990；Richonら, 1998；Kijimaら, 1993を参照されたい）。

さらに、硫化ジアリルおよび関連分子（例えば、Leaら, 1999を参照されたい）、オキサムフラチン（oxamflatin）（例えば、Kimら, 1999；Sonodaら, 1996を参照されたい）、ＭＳ−２７−２７５、合成ベンズアミド誘導体（例えば、Saitoら, 1999；Suzukiら, 1999を参照されたい；ＭＳ−２７−２７５は後にＭＳ−２７５に改名されている点に注意されたい）、ブチレート誘導体（例えば、LeaおよびTulsyan, 1995を参照されたい）、ＦＲ９０１２２８（例えば、Nokajimaら, 1998を参照されたい）、デプデシン（depudecin）（例えば、Kwonら, 1998を参照されたい）、ならびにｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサムアミド（bishydroxamide）（例えば、Richonら, 1998を参照されたい）は、ヒストンデアセチラーゼを阻害することが報告されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、これらの化合物の一部は、細胞周期をＧ１およびＧ２期で停止させることにより線維芽細胞の成長を阻害することが報告されており、様々な形質転換細胞株の最終分化と形質転換能力の喪失をもたらすことができる（例えば、Richonら, 1996；Kimら, 1999；Yoshidaら, 1995；YoshidaおよびBeppu, 1988を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、レチノイン酸との併用では、フェニルブチレートが急性前骨髄球性白血病の治療に有効であると報告されている（例えば、Warrellら, 1998を参照されたい）。ＳＡＨＡはラットの乳腺腫瘍およびマウスの肺腫瘍の形成を予防するのに有効であると報告されている（例えば、Desaiら, 1999を参照されたい）。

好適なクラスの阻害剤は以下の刊行物に記載されているものであり、これらの刊行物の記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする：
Watkins, C.ら, 2002, "Carbamic acid compounds comprising a sulfonamide linkage as HDAC inhibitors," 公開された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０２／３０８７９（ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４３２６）、２００２年４月１８日公開；
Watkins, C.ら, 2002, "Carbamic acid compounds comprising an ether linkage as HDAC inhibitors" 公開された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０２／２６７０３（ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４３２７）、２００２年４月４日公開；
Watkins, C.ら, 2002, "Carbamic acid compounds comprising an amide linkage as HDAC inhibitors," 公開された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０２／２６６９６（ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４３２９）、２００２年４月４日公開；および
Watkins, C.ら, 2003, "Carbamic acid compounds comprising a piperazine linkage as HDAC inhibitors," 公開された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０３／０８２２８８（ＰＣＴ／ＧＢ０３／０１４６３）、２００３年１０月９日公開

特に好適な化合物はＰＸＤ１０１（Ｎ−ヒドロキシ−３−（３−フェニルスルファモイル−フェニル）−アクリルアミド）として公知であり、その構造は以下の通りである：

この化合物、またはその製薬上許容しうる塩を、本発明に従って使用してもよい。

レチノイド
レチノイド型の化合物は、オールトランスレチノイン酸または９−シス−レチノイン酸の生物活性プロフィールと似たプロフィールを持つ化合物であり、かかる化合物自体を本発明の実施に際して使用してもよい。これらの化合物は、ＲＡＲおよびＲＸＲＳなどのレチノイン酸ファミリーの受容体を介して遺伝子の発現を改変することができる。このため、レチノイドは、マウス胚奇形腫細胞（Ｆ９）の分化試験（Stricklandら, 1983）および／またはマウスにおけるＴＰＡによる誘導後のオルニチン脱炭酸酵素の阻害試験（Vermaら, 1978）で活性を示す場合がある。これらの試験により、細胞分化と細胞増殖の分野それぞれにおけるこれらの化合物の活性が示される。

多種多様なレチノイドが当該技術分野で公知である。例えば、米国特許出願第２００３００５５１１０号（その記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）には、数多くのレチノイド化合物が記載されている。特に以下の化合物は、ＲＡＲ受容体アンタゴニスト型の活性を持つことが見出されている：
４−［４−（６−メトキシメトキシ−４’−メチルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル］安息香酸；４−［４−（６−メトキシ−４’−メチルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル］安息香酸；４−（６−メトキシエトキシメトキシ−７−（１−アダマンチル）−２−ナフチル）サリチル酸；（Ｅ）−４−［４−（５−メトキシメトキシ−４’−メチルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル］安息香酸；４−［４−（３−メトキシ−４’−メチルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル］安息香酸；２−メトキシメトキシ−２’−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタール−エン−２−イル）［１，１，４’１’’］テルフェニル−４’’−カルボン酸；４−［４−（４’−メチルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル］安息香酸；および４−（４−（４’−プロピルビフェニル−２−イル）ブタ−３−エン−１−イニル）安息香酸。

これらのようなレチノイド化合物、およびＲＡＲ受容体において活性を示す（該受容体にＲＡ応答遺伝子、例えば、本明細書中に記載したＲＡＲβ遺伝子の発現を誘導させることを指す）他のものは、本発明で使用するのに適している場合がある。

腫瘍の治療
本発明を、多種多様な腫瘍、特に、例えばＨＤＡＣ遺伝子の遺伝子増幅または調節の喪失の結果としてＨＤＡＣの過剰発現を伴う腫瘍の治療に適用することができる。

かかる過剰発現が生じうる腫瘍としては、メラノーマ、急性および慢性白血病、非小細胞肺癌、頭頸部癌、腎癌、および乳癌が挙げられる。

「治療」とは、これが、例えば、腫瘍の進行速度を遅くすることにより、外科手術を含む他の腫瘍治療法の補助療法（adjunct）を提供することにより、腫瘍を安定させるかまたは腫瘍の部分もしくは完全寛解を達成することにより、患者の症状を緩和するために設計されたいずれかの介入を含むものと理解されよう。

投与
本知見は、ＰＲＡＭＥ阻害剤をＨＤＡＣｉまたはレチノイドと共に投与する場合、ＰＲＡＭＥ阻害剤（ＰＲＡＭＥｉ）の使用によりＨＤＡＣ阻害剤またはレチノイドをより効果的に使用できるようになることを示唆している。ＨＤＡＣｉまたはレチノイドの投与について述べる場合、本発明はその両方の投与も含むものとする。

「同時」（simultaneous）投与とは、ＰＲＡＭＥｉおよびＨＤＡＣｉ（またはレチノイド）を、同じ投与経路により単回投与で患者に投与することを意味する。

「別個」（separate）投与とは、ＰＲＡＭＥｉおよびＨＤＡＣｉ（またはレチノイド）を、同時に行う２つの異なる投与経路により患者に投与することを意味する。これを例えば、一方の薬剤を注入により投与し、この注入時間中に他方を経口で与える場合に行ってもよい。

「連続的」（sequential）とは、２種の薬剤を異なる時点で投与するが、第２の薬剤を投与する時点で第１の投与薬剤の活性が患者体内に存在しかつ継続していることを意味する。例えば、患者の腫瘍細胞中のＰＲＡＭＥタンパク質の量がＨＤＡＣｉおよび／またはレチノイドを投与する時点で減少しているように、ＰＲＡＭＥｉを最初に投与してもよい。

一般に、連続投与は、２種の薬剤のうちの２番目が第１の薬剤の４８時間以内、好ましくは２４時間以内、例えば１２、６、４、２または１時間以内に投与されるように行う。

薬剤は、それらの目的とする投与経路に合わせて製剤される。薬剤または該薬剤を含んでなる医薬組成物を、全身的／末梢的または局所的（すなわち、所望の作用部位に）かにかかわらず、任意の好都合な投与経路によって患者に投与することができる。

投与経路としては、限定するものではないが、経口投与（例えば、摂取による投与）；頬腔投与；舌下投与；経皮投与（例えば、パッチ、絆創膏などによる投与を含む）；経粘膜投与（例えば、パッチ、絆創膏などによる投与を含む）；鼻腔内投与（例えば、鼻腔用スプレーによる投与）；眼内投与（例えば、点眼薬による投与）；経肺投与（例えばエアロゾルによって、例えば口または鼻を経由する、吸入または吹送療法による投与）；直腸投与（例えば、坐薬または浣腸剤による投与）；膣内投与（例えば、ペッサリーによる投与）；非経口投与、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心腔内、髄膜内、髄腔内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、および胸骨内注射を含む注射による投与；持続性製剤（depot）または貯蔵器（reservoir）の、例えば皮下または筋肉内への移植による投与が挙げられる。

投与するＰＲＡＭＥｉ、ＨＤＡＣｉおよびレチノイドの量は、最終的には、患者の年齢および状態、ならびに投与する薬剤の特定の活性を考慮に入れた上で、医師の裁量に委ねられる。ｉｎ ｖｉｖｏ投与は、治療過程全体を通して、１回の投与で、連続的に、または断続的に行うことができる。投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は当業者に周知であり、治療法に使用する製剤、治療法の目的、治療対象の標的細胞、および治療対象の患者によって異なる。単回または複数回の投与は、治療を行う医師により選択される投与レベルおよびパターンを用いて実施することができる。

例えば、ＰＲＡＭＥがｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡの投与量を、投与あたり０．００１μｇ〜１００ｇ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲としてもよい。投与は、毎日、または医師により決定された間隔をおいて行ってもよい。ｓｉＲＮＡをベクターの形で腫瘍部位に送達する場合、 投与量を１０^５〜１０^８コピーの範囲のベクターとしてもよく、該ベクターがウイルスベクターの形であるならばウイルス粒子の数と同じであってもよい。ＨＤＡＣｉ化合物の場合、投与量は、０．１〜約２５０ｍｇ／患者体重ｋｇ／日の範囲としてもよい。レチノイドは、０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜７．５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇ／日という桁範囲の投与量を投与してもよく、１日に１回、または２〜４回に分けて投与してもよい。

前治療した患者への投与
特定の態様では、本発明は、新しい患者タイプ、すなわち、患者体内に存在する腫瘍中のＰＲＡＭＥの発現レベルがＨＤＡＣｉまたはレチノイドによる治療時には医学的処置により抑制されている該患者の治療のための、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドの使用に関する。

ＰＲＡＭＥの発現の抑制は、本明細書中に記載した通りにＰＲＡＭＥｉを使用して達成することができる。患者は、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドの有効性を、前治療を行わない場合の有効性と比べて十分に高めるために、ＰＲＡＭＥｉを最近投与しておいた患者とする。望ましくは、患者を、４８時間前、好ましくは２４時間前、より好ましくは１２時間前、例えば、６、４、２または１時間前にＰＲＡＭＥｉで処置しておく。

一実施形態では、患者は、ＰＲＡＭＥｓｉＲＮＡがその体内に存在する患者と特徴付けられる。

患者の重症度分類および選択
本知見により、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドによる治療のための患者の重症度分類および／または選択も可能となる。

本発明のこの態様では、まず既存の腫瘍患者のコホート（例えば、少なくとも２０人）からのデータを確立するかまたは取得し、該患者の腫瘍中のＰＲＡＭＥ発現のレベルを測定する必要がある。発現のレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲを利用してＲＮＡ発現のレベルで、または例えば抗体に基づくアプローチを利用してタンパク質発現のレベルで、測定することができる。かかる方法は、それ自体は当該技術分野で公知である。発現レベルは、低値、中間値および高値に分けられる。いかなるものを低値、中間値および高値と判断するかは、例えば出生前診断に用いる生化学的マーカー等と同様に、いずれか１箇所の特定の治療施設で用いられている基準に左右される、ある程度任意の表示であることは理解されよう。とは言え、このことは、ＰＲＡＭＥのレベルを新規な患者において測定し、これを収集したデータと比較することによって本明細書中に後述するように本発明に従って予測または投与計画を立てることができる限り、本発明の方法の実施を妨げるものではない。

一態様では、本発明を利用して、ＨＤＡＣｉもしくはレチノイドによる治療クールの有効性を予測するか、またはＨＤＡＣｉもしくはレチノイドによる治療がより有効であると思われる患者を選択してもよい。

従って、一態様では、本発明は、
患者の腫瘍中のＰＲＡＭＥの発現レベルを測定するステップ；
前記レベルを、患者のコホートにおいて予め測定しておいたレベルと比較するステップ；および
前記レベルが低発現を示す場合に、前記患者をＨＤＡＣｉまたはレチノイドで治療するステップ
を含む方法を提供する。

比較ステップは過去に蓄積された（histric）データについて行ってもよいことと、上記方法を実践するたびに前記コホートについての測定を繰り返す必要はないことは理解されよう。

「低発現」とは、好ましくは前記コホートの分布の下位３分の１、好ましくは下位４分の１に入るレベルを意味する。

参照するコホートは、腫瘍タイプ、年齢、性別または疾患の重篤度のうちの１つ以上について一致していることが望ましい。

別の態様では、本発明は、
患者の腫瘍中のＰＲＡＭＥの発現のレベルを測定するステップ；
前記レベルを、患者のコホートにおいて予め測定しておいたレベルと比較するステップ；および
前記レベルが高発現を示す場合に、前記患者をＰＲＡＭＥｉおよびＨＤＡＣｉまたはレチノイドの一方もしくは両方で治療するステップ
を含む方法を提供する。

「高発現」とは、好ましくは、前記コホートの分布の上位３分の１、好ましくは上位４分の１に入るレベルを意味する。

同様にして、本発明を利用して患者に投与するＨＤＡＣｉまたはレチノイドの頻度または量を、より高い頻度またはより多くの投与を中〜高レベルのＰＲＡＭＥ発現を示す患者に施すように決定してもよい。

アッセイ方法
別の態様では、ＰＲＡＭＥがＲＡＲと直接的に相互作用するという知見により、細胞の増殖、分化および生命力を調節することが可能な薬剤の新規標的が提供される。

従って、ＰＲＡＭＥとＲＡＲとの相互作用の候補阻害剤は、
候補阻害剤；および
ＰＲＡＭＥタンパク質およびＲＡＲタンパク質
を一緒に併せるステップ、ならびに該候補阻害剤が該ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲタンパク質の間の相互作用を妨げることが可能かどうかを確認するステップを含む方法により特定される。

本発明のこの態様の目的上、ＰＲＡＭＥタンパク質とは、全長野生型ＲＡＲタンパク質、特にヒトＲＡＲと複合体を形成することが可能な、真核生物、好ましくは哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えばマウス）または霊長類（例えばヒト））のＰＲＡＭＥタンパク質またはその断片を含む。

ヒトＰＲＡＭＥタンパク質は、本明細書中に記載した配列番号１によりコードされている。他の種に由来するタンパク質を使用してもよく、またそれらを例えば、ゲノム配列データベースが利用可能であればかかるデータベースについての相同性検索により、あるいは配列番号１の全部または一部を目的の種に由来するゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブとして利用するといった組換え分子ＤＮＡ技術により取得してもよい。

ＰＲＡＭＥの断片は、好ましくは、本明細書中で特定した７個の「ＬＸＸＬＬ」配列のうちの少なくとも１個、例えば、少なくとも２、３、４、５または６個のかかる配列を含む。断片は、少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも３００、例えば少なくとも４００アミノ酸のサイズでありうる。これらの好適なサイズの断片は、上記の好適な数のＬＸＸＬＬモチーフを含有していることが望ましい。

本発明のこの態様の目的上、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲ）タンパク質とは、全長野生型ＰＲＡＭＥタンパク質、特にヒトＰＲＡＭＥと複合体を形成することが可能な、真核生物、好ましくは哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えばマウス）または霊長類（例えばヒト））のＲＡＲタンパク質またはその断片を含む。該タンパク質はα１アイソフォームであっても、α２アイソフォームであってもよい。

数多くの異なるＲＡＲαタンパク質を公共データベースで入手することができる。ヒトＲＡＲαはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｐ１０２７６であり、マウスはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１４１６である。ラットα２アイソフォームは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ２３４３９．１である。非哺乳動物型のタンパク質は、ニワトリ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９０９６６）、アフリカツメガエル（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ５１１２６）およびフグ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９Ｗ５Ｚ３）において明らかになっている。

断片は、少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも３００、例えば少なくとも４００アミノ酸のサイズでありうる。

本発明のアッセイを、当業者が利用可能ないずれの形式で実施してもよい。本発明のアッセイの厳密な形式は、当業者が通常の技術および知識を用いて変更してもよい。

例えば、ＰＲＡＭＥタンパク質とＲＡＲとの間の相互作用は、一方を検出可能な標識で標識し、これを固体支持体上に固相化しておいた他方と接触させることにより調べてもよい。適切な検出可能な標識としては^３５Ｓ−メチオニンが挙げられ、これは組換えにより産生されたＰＲＡＭＥおよび／またはＲＡＲ中に組み込むことができる。また、この組換えにより産生されたＰＲＡＭＥおよび／またはＲＡＲを、抗体で標識可能なエピトープを含有する融合タンパク質として発現させてもよい。

固体支持体上に固相化するタンパク質は、該固体支持体上に結合させる該タンパク質に対する抗体を使用して、またはそれ自体は公知である他の技術により、固相化してもよい。好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んでなる融合タンパク質を利用することができる。これをグルタチオンアガロースビーズ上に固相化してもよい。上記タイプのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ形式では、場合によっては、推定的なモジュレーター化合物を、固相化したＧＳＴ−ＲＡＲまたはＧＳＴ−ＰＲＡＭＥに結合する標識ＰＲＡＭＥまたはＲＡＲの量を調節するその能力を確認することにより分析できる。これは、グルタチオン−アガロースビーズをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分画することにより確認してもよい。あるいは、ビーズをリンスして非結合タンパク質を除去してもよく、また結合しているタンパク質の量は、例えば、適切なシンチレーションカウンター内に存在する標識の量をカウントすることにより測定できる。

あるいは、固体支持体に結合させた、ＰＲＡＭＥまたはＲＡＲの一方に対する抗体をＧＳＴの代わりに使用することにより、この分子を固体支持体に結合させてもよい。ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲに対する抗体は、当該技術分野でそれ自体は公知の、または本明細書中に記載した様々な方法で取得することができる。

別の様式では、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲの一方を蛍光ドナー部分で標識し、他方を該ドナーからの発光を低減することが可能なアクセプターで標識してもよい。これにより、本発明のアッセイを蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって行うことが可能となる。この様式では、ドナーの蛍光シグナルは、ＰＲＡＭＥとＲＡＲが相互作用すると変化する。この相互作用を調節する候補モジュレーター化合物が存在すると、ドナーの蛍光シグナルの変化していない分の量が増加する。

ＦＲＥＴはそれ自体が当該技術分野で公知の技術であるため、的確なドナーおよびアクセプター分子ならびにそれらをＰＲＡＭＥおよびＲＡＲに連結するための手段は、文献を参照することによって行うことができる。

適切な蛍光ドナー部分は、蛍光発生エネルギーを別の蛍光発生分子または化合物の一部へと移動させることが可能なものであり、これらとしては、限定するものではないが、クマリンならびにフルオレセイン、ロドール（rhodols）およびローダミンなどの関連色素、レゾルフィン、シアニン色素、ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールおよびイソルミノール誘導体などのアミノフタル酸ヒドラジン、アミノフタリミド、アミノナフタリミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、ならびにユーロピウムおよびテルビウム錯体ならびに関連化合物が挙げられる。

適切なアクセプターとしては、限定するものではないが、クマリンおよび関連蛍光団、フルオレセイン、ロドールおよびローダミンなどのキサンテン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン、ならびにフタロシアニンが挙げられる。

好適なドナーはフルオレセインであり、また好適なアクセプターとしてはローダミンおよびカルボシアニンが挙げられる。これらのフルオレセインおよびローダミンのイソチオシアネート誘導体はAldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset, UKから入手可能であり、これらを使用してＰＲＡＭＥおよびＲＡＲを標識してもよい。カルボシアニンの結合については、例えばGuoら, J. Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995を参照されたい。

上記アッセイ形式を利用して、ＰＲＡＭＥとＲＡＲとの相互作用を調節する推定的なモジュレーター化合物の能力を確認してもよい。かかるアッセイは、状況に応じて、レチノイン酸などのレチノイド化合物の存在下で実施する。
本発明のアッセイをｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよい。かかるアッセイは、任意の適切な宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞で実施してもよい。酵母および哺乳動物の宿主細胞が特に適している。

かかるアッセイをｉｎ ｖｉｖｏで実施するために、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲを発現することが可能な構築物とレポーター遺伝子構築物とを細胞に導入してもよい。これは、任意の適切な技術、例えば、リン酸カルシウム沈殿またはエレクトロポレーションにより達成することができる。３種の構築物を一過性に、もしくは安定なエピソームとして発現させるか、または宿主細胞のゲノム内に組み込んでもよい。

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲが融合タンパク質として発現され、その一方が酵母ＧＡＬ４結合ドメインなどのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む融合タンパク質、他方がＧＡＬ４またはＶＰ１６由来のものなどの活性化ドメインを含む融合タンパク質となる、ツーハイブリッドアッセイの形態としてもよい。このような場合、宿主細胞（これもやはり、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物、特に酵母または哺乳動物の細胞でありうる）は、レポーター遺伝子構築物を、前記ＤＢＤと適合しうるＤＮＡ結合配列を含むプロモーターと共に担持する。該レポーター遺伝子は、先に開示したレポーター遺伝子であってもよい。該遺伝子のプロモーターは、上記のプロモーターであってもよい。

ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲならびにレポーター遺伝子を細胞に導入して、一過性に、または安定に発現させてもよい。

候補阻害剤化合物は、薬物スクリーニングプログラムで使用される天然または合成の化合物でありうる。幾つかの明らかになった、もしくは明らかになっていない成分を含有する植物、微生物その他の生物の抽出物を使用することができる。コンビナトリアルライブラリー技術（固相合成法およびパラレル合成法を含む）により、場合によっては膨大な数となる種々の物質を、相互作用を調節するその能力ついて試験する効率的な方法が提供される。あらゆる種類の天然物、中でも小分子およびペプチドに関するかかるライブラリーおよびそれらの用途は、当該技術分野で公知である。多くのかかるライブラリーが市販されており、またここで本発明により想定されるタイプの薬物スクリーニングプログラム用に販売されている。

さらに別のクラスの候補阻害剤は、タンパク質標的に結合する抗体またはその結合性断片を含む。

抗原または他の結合パートナーを結合することが可能な抗体フラグメントの具体例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである。１本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。あるタンパク質に特異的な抗体は、例えば、機能的免疫グロブリン結合ドメインをそれらの表面上に呈示するλバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから取得することができる；例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照されたい。かかる技術により抗原に対する抗体の迅速な産生が可能となり、その後はこれらの抗体を本発明に従ってスクリーニングしてもよい。

別のクラスの候補分子は、阻害対象のタンパク質配列の断片に基づくペプチドである。特に、他のタンパク質またはＤＮＡと相互作用するタンパク質の部分に相当するタンパク質断片は、タンパク質機能の競合的阻害剤として作用する小ペプチドの標的となりうる。かかるペプチドは、例えば、５〜２０アミノ酸長でありうる。

前記ペプチドにより、ミメティクスの設計の基礎が提供される場合もある。かかるミメティクスは、薬理作用団を明らかにして該薬理作用団をモデル化することにより必須残基またはその一部を適切な３次元関係で保持するミメティクスを設計するための、生物活性に不可欠でかつ重要なアミノ酸残基またはその側鎖の一部分を決定するためのペプチドの解析に基づいている。かかるミメティクスの設計を容易にする手段として、様々なコンピュータ利用技術が当該技術分野に存在している。

本発明のこれらの態様に従って取得した阻害剤を、患者の癌を治療する方法に使用してもよい。

従って、本発明はさらに、ＰＲＡＭＥとＲＡＲとの間の相互作用の阻害剤を、該阻害剤用の製薬上許容しうる担体と一緒に含む医薬組成物も提供する。

一般に、前記阻害剤は、患者への選択された投与経路に適した１種以上の製薬上許容しうる担体と共に製剤化される。固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムが挙げられ、こうしたものを使用することができる。薬剤として投与しうる液体組成物は、例えば、阻害剤および任意の製薬助剤を、例えば、水、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール、エタノールなどといった担体に溶解する、分散させるなどし、それによって溶液または懸濁液を形成させることにより調製することができる。必要に応じて、投与する医薬組成物が、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどをさらに含有していてもよい。かかる剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者には明らかであろう；例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 第15版, 1975を参照されたい。投与する組成物または製剤は、いずれにしても、治療対象の患者の症状を和らげるのに有効な量の活性化合物を含有する。

投与の経路は治療対象の症状に左右される場合があるものの、内皮細胞は血管系の内層を形成しているので、 血流への投与（例えば、注射による投与）は１つの実施しうる経路である。

また、本発明は、治療法での使用のための、ＰＲＡＭＥとＲＡＲとの間の相互作用の阻害剤を提供する。

さらに、本発明は、癌の治療のための医薬の製造における、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲの間の相互作用の阻害剤の使用を提供する。

方法および実験
癌細胞に及ぼすＨＤＡＣｉの選択的増殖阻害活性の分子基盤について検討するために、本発明者らは、機能的遺伝学的スクリーニングを実施することによりＰＸＤ１０１（Plumbら, 2003）と命名された小分子ＨＤＡＣｉに対する耐性を付与する遺伝子を同定した。発癌性ＲＡＳ^Ｖ１２形質転換マウス胎児線維芽細胞（ＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦ）を、ヒトＫ５６２赤白血病細胞から得た複雑な（high complexity）レトロウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリーに感染させて、これを１μＭのＰＸＤ１０１に３週間曝露した。ＨＤＡＣｉ耐性コロニーは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーによる感染後に初めて低頻度で出現した。組み込まれたプロウイルスを、既述のモロニーウイルス重感染（Jacobsら, 2000）によりＰＸＤ１０１耐性コロニーから集めた。２回目の選別後に、ｃＤＮＡインサートをＰＣＲにより回収し、ＤＮＡ配列解析により同定した。このアプローチを使用して、本発明者らは、ヒトメラノーマ腫瘍抗原ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優勢発現抗原（Ikedaら, 1997））およびレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）をコードする全長ｃＤＮＡを、１μＭのＰＸＤ１０１の存在下での連続増殖を可能にするｃＤＮＡとして同定した。ＰＲＡＭＥはまた、０．１μＭの濃度の関連するＨＤＡＣｉであるトリコスタチンＡによる増殖停止からもこれらの細胞を救済する。

Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦのレトロウイルス感染によるＰＲＡＭＥ発現を、ヒトメラノーマ細胞株ＦＭ６、ＳＫ２３、４５３Ａ０、Ａ３７５、ＦＭ３およびＤ１０中の内在性ＰＲＡＭＥ発現レベルと比較した。細胞抽出物を、ＰＲＡＭＥおよびＣＤＫ４（対照）について免疫ブロットした。ＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦにおいてＨＤＡＣｉに対する耐性を付与するのに必要なＰＲＡＭＥレベルは、幾つかのヒトメラノーマ細胞株で見られるレベルに匹敵する。

また、Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦにＰＲＡＭＥまたはＲＡＲαレトロウイルスを形質導入し、さらにこれを１μＭのＰＸＤ１０１で１６時間処理した。抽出物をアセチル−Ｈ３、ｐ２１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＲαおよびＣＤＫ４（対照）について免疫ブロットした。ＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦ中のＰＲＡＭＥまたはＲＡＲαの発現は、ＨＤＡＣｉ処理によるヒストンＨ３アセチル化の増加および十分に裏付けされたｐ２１^ｃｉｐ１発現の誘導のいずれをも妨げないことが見出され、このことは、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲαが、ＨＤＡＣの下流で作用することによってＨＤＡＣｉが細胞増殖に及ぼす影響を抑制することを示唆している。

ＰＲＡＭＥは、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を誘発するヒトメラノーマの抗原として最初に同定された（Ikedaら, 1997）。またＰＲＡＭＥは、急性および慢性白血病、非小細胞肺癌、頭頸部癌、腎癌を含む様々な他のヒト悪性腫瘍においても過剰発現され、その発現は乳癌における不良な臨床転帰の前兆とされている（Ikedaら, 1997；van’t Veerら, 2002；van Barenら, 1998；Neumannら, 1998；Boonら, 2003）。しかし、ＰＲＡＭＥの機能はこれまで一切記載されていない。ＨＤＡＣ阻害剤は遺伝子転写に影響を及ぼすので、本発明者らは、ＰＲＡＭＥが転写のリプレッサーまたはアクチベーターとして作用するかどうかを調べた。これを検証するため、本発明者らは、ＰＲＡＭＥを酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合したベクター（ＧＡＬ４−ＰＲＡＭＥ）を、ＧＡＬ４−ルシフェラーゼレポータープラスミドと共にヒト２９３細胞にコトランスフェクトした。図１ａは、ＧＡＬ４−ＰＲＡＭＥの発現により遺伝子発現が強力かつ用量依存的に阻害されたことを示しており、このことは、ＰＲＡＭＥが転写のリプレッサーであることを示唆している。細胞のＨＤＡＣｉ処理がこれに影響を及ぼすことはなく、このことは、ＰＲＡＭＥ抑制が殆どＨＤＡＣに依存しないことを示している（図１ｂ）。

本発明者らは上記遺伝学的スクリーニングでＰＲＡＭＥとＲＡＲαの両方を同定したので、本発明者らはこれらの２つのタンパク質が同一経路内で作用するかどうかを調べた。これを検討するため、本発明者らはＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかを調べた。本発明者らは、ＰＲＡＭＥを、レチノイン酸応答配列により駆動されるレポーター遺伝子（ＲＡＲＥ−ルシフェラーゼ）と一緒にＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦにトランスフェクトした。図１ｃは、ＰＲＡＭＥ発現が、幅広いＲＡ濃度範囲にわたってＲＡ応答性レポーター遺伝子のＲＡ誘導性活性化を強力に阻害したことを示す。同様の結果がマウスＢ１６メラノーマ細胞で得られた（図４）。ＰＲＡＭＥは、ＨＤＡＣｉ処理により誘導されるＲＡＲシグナル伝達も抑制した（図１ｄおよび図４）。重要なことに、ＲＡＲαの異所性発現もまた、ＨＤＡＣｉによるＲＡ応答性レポーター遺伝子構築物の活性化を抑制した（図１ｅ）。従って、本発明者らが上記遺伝学的スクリーニングで同定したｃＤＮＡはいずれも、ＲＡ応答性レポーター遺伝子のＨＤＡＣｉ媒介性活性化を抑制する。これにより、ＨＤＡＣｉ誘導性ＲＡシグナル伝達の抑制（Linら, 1998、および図１ｃ）は細胞をＨＤＡＣｉ処理に対して耐性にならしめる１つの方法である、という可能性が高まる。しかし、本発明者らのデータは、ＲＡＲαおよびＰＲＡＭＥが他の経路に作用してＨＤＡＣｉ誘導性増殖停止からの回避を媒介するということを排除するものではない。

ＰＲＡＭＥがＲＡシグナル伝達に及ぼす影響についてさらに検討するために、本発明者らはＲＡＲβを詳しく調べた。何故なら、この遺伝子はＲＡ応答配列をそのプロモーター内に含むからである（de Theら, 1990）。ＰＲＡＭＥ発現が内在性ＲＡＲβ遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを調べるために、Ｆ９マウス胎児性癌細胞にＰＲＡＭＥまたは空ベクターをトランスフェクトし、１０^−７ＭのＲＡで処理し、さらにこれをＲＡＲβについて免疫ブロットした。３回の独立したトランスフェクションの平均値を測定した。内在性ＲＡＲβタンパク質の発現は親および偽トランスフェクトＦ９細胞でのみ誘導され、ＰＲＡＭＥトランスフェクトＦ９誘導体では誘導されないことが見出された。またＰＲＡＭＥは、ＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦとＢ１６メラノーマ細胞の両方におけるＲＡＲβ２プロモーター−ルシフェラーゼ構築物のＲＡ誘導性活性化も抑制した（図４）。全体として考えると、これらのデータは、ＰＲＡＭＥがＲＡシグナル伝達の負のレギュレーターであることを示唆している。

ＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達に及ぼした実際の影響は、ＰＲＡＭＥとＲＡＲとの物理的相互作用、またはより間接的な影響の結果として生じた可能性がある。ＰＲＡＭＥがＲＡＲと物理的に相互作用するかどうかを調べるために、本発明者らは、ＴＡＰ−タグ付き（Rigautら, 1999）ＰＲＡＭＥをＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦで安定に発現させた。Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦにＴＡＰ−ＰＲＡＭＥ、ＲＡＲα、またはＧＦＰ（対照）レトロウイルスを感染させてから、これらを１μＭのＰＸＤ１０１の存在下で培養した。ＴＡＰ−ＰＲＡＭＥは、これが細胞をＰＸＤ１０１誘導性増殖停止から救ったので、有効であった。

Ｒａｓ^Ｖ１２ＭＥＦ（ＭＥＦ）にＴＡＰ−タグ付きＰＲＡＭＥを形質導入し、発現レベルをＳＫ２３およびＡ３７５メラノーマ中の内在性ＰＲＡＭＥと比較した。重要なことに、ＴＡＰ−ＰＲＡＭＥタンパク質レベルは、ヒトメラノーマ細胞株ＳＫ２３およびＡ３７５中の内在性ＰＲＡＭＥレベルに匹敵するものであった。

ＴＡＰ−ＰＲＡＭＥを、１μＭのＲＡによる処理の前後に（ＩｇＧビーズ（Rigautら, 1999）を使用して；抗ＴＡＰと表示される）免疫沈降し、沈降物をＲＡＲαについて免疫ブロットした。内在性ＲＡＲαは、ＲＡの非存在下と存在下の両方でＴＡＰ−ＰＲＡＭＥと共沈することが見出され、このことは、ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲαがヒト腫瘍で見られるタンパク質濃度においてリガンド非依存性複合体を形成することを示唆している。

ＰＲＡＭＥのアミノ酸配列は、７個の潜在的なロイシンリッチ核内受容体（ＮＲ）ボックス（ＬＸＸＬＬモチーフ（Heeryら, 1997）、図２ｃ）を含む。核内受容体活性の多くのモジュレーターは、それらの標的受容体と、これらのモチーフの１個以上を介して直接的に相互作用する（Heery ら, 1997；Torchiaら, 1997）。ＰＲＡＭＥ中のこれらのモチーフがＲＡＲシグナル伝達の阻害に必要であるかどうかを検証するために、本発明者らは、ＰＲＡＭＥに点突然変異を導入し、７個のＮＲボックス各々のロイシン残基の幾つかをバリンに変えた。得られた変異体ＰＲＡＭＥ−ΔＬＸＸＬＬは、野生型ＰＲＡＭＥに匹敵するレベルで発現した（免疫ブロット法により測定した）が、ＲＡＲシグナル伝達を抑制することはなかった（図２ｂ）。該変異体は、上記免疫沈降を実施した時にはＲＡＲαに結合しなかった。本発明者らは、ＰＲＡＭＥ中のＬＸＸＬＬモチーフはＲＡＲ活性の調節に必要であると結論する。

ＲＡは、多くの細胞タイプでの増殖停止、分化およびアポトーシスを誘導する。そこで、本発明者らは、ＰＲＡＭＥ発現がＦ９マウス胎児癌細胞の壁側内胚葉（parietal endoderm）へのＲＡ誘導性分化に影響を及ぼすかどうかを調べた（StricklandおよびMahdavi, 1978）。Ｆ９細胞にＰＲＡＭＥまたは対照ベクターを安定にトランスフェクトし、個々のコロニーを選別した。ＲＡの非存在下では、全てのトランスフェクト細胞の形態は、親Ｆ９細胞の形態と同様であった。しかし、ＰＲＡＭＥまたは空ベクターを安定にトランスフェクトし、かつ１０^−７ＭのＲＡで処理したＦ９細胞は、ＲＡ誘導性の形態分化および増殖停止に耐性を示した。分化するだけでなく、ＲＡで処理したＦ９細胞の一部はアポトーシスにより死滅する（Atenciaら, 1994）。また、Ｆ９細胞におけるＰＲＡＭＥ発現は、ＲＡ誘導性アポトーシスに対する耐性も付与した。何故なら、ベクター対照には切断カスパーゼ３が見られたが、ＰＲＡＭＥトランスフェト体には見られなかったからである。本発明者らは、ＰＲＡＭＥ発現はＲＡ誘導性の増殖停止、分化およびアポトーシスに対する耐性を付与すると結論する。

ヒトメラノーマ細胞はＲＡシグナル伝達に問題があることが多い（Atenciaら, 1994；van der Leedeら, 1993）。ＰＲＡＭＥはメラノーマの約９０％で過剰発現される（Ikedaら, 1997）ことから、本発明者らは、ＰＲＡＭＥ発現によりそれらのＲＡ非応答性を説明できるかどうかを調べた。これを検証するため、本発明者らは、幾つかのＲＡ耐性メラノーマ細胞株（Demaryら, 2001）中のＰＲＡＭＥ発現を、ＲＮＡ干渉により阻害した。本発明者らは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）様の性質を持つ短鎖ヘアピン型ＲＮＡの合成を介して遺伝子発現の抑制を媒介するベクターであるｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ（ｐＲＳ）（Brummelkampら, 2002a；Brummelkampら, 2002b）にクローニングするために、ＰＲＡＭＥ転写産物中のユニークな２１ｍｅｒ配列を選択した。２９３細胞に、ｆｌａｇタグ付きのＰＲＡＭＥおよびｐＲＳ−ＰＲＡＭＥまたはｐＲＳ空ベクターをトランスフェクトした。抽出物をｆｌａｇまたはＧＦＰ（対照）について免疫ブロットした。また、Ａ３７５細胞にＲＡＲＥ−ルシフェラーゼおよびｐＲＳ−ＰＲＡＭＥまたは空ベクターの一方をトランスフェクトし、これをＲＡで処理した。３回の独立したトランスフェクションの平均値を測定した。Ａ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞および対照Ａ３７５細胞を、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＲα、ｐ２１およびＲＡＲβについて免疫ブロットした。

ｐＲＳ−ＰＲＡＭＥは異所的に発現されるＰＲＡＭＥならびに内在性ＰＲＡＭＥタンパク質の効果的な減少を媒介することが見出された。ＰＲＡＭＥのノックダウンによりＲＡ応答性が回復するかどうかを調べるため、本発明者らは、高レベルの内在性ＰＲＡＭＥを発現するＡ３７５ヒトメラノーマ細胞に、ｐＲＳ−ＰＲＡＭＥおよびＲＡ応答性レポーター遺伝子構築物をコトランスフェクトした。ＲＡＲＥ−ルシフェラーゼ構築物を使用して測定したところ、ＰＲＡＭＥのノックダウンにより、Ａ３７５細胞におけるＲＡシグナル伝達が大いに増大した。同様の結果が、ＳＫ２３およびＦＭ６ヒトメラノーマ細胞株において見出された（図５）。メラノーマはＨＤＡＣｉ処理に対して比較的耐性を示す（Plumbら, 2003）が、ｐＲＳ−ＰＲＡＭＥをトランスフェクトしたＡ３７５細胞ではＰＸＤ１０１誘導性ＲＡＲシグナル伝達がベクター対照と比べて増大した（図５）。

ＰＲＡＭＥノックダウンが細胞増殖に及ぼす影響を評価するために、本発明者らは、ＰＲＡＭＥ発現をｓｈＲＮＡによりノックダウンしたＡ３７５メラノーマの安定な誘導体（Ａ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ）を作製した。これらのＡ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞を、３Ｔ３プロトコルに従って１５日間培養した。図３は、ＰＲＡＭＥ^ＫＤが、特にＲＡの存在下で培養した場合に増殖速度を著しく落としたことを示している。ＰＲＡＭＥ^ＫＤがＲＡシグナル伝達を回復させるという概念と一致して、本発明者らは、公知のＲＡ標的遺伝子であるＲＡＲβおよびｐ２１^ＣＩＰ１（de Theら, 1990、Liuら, 1996）がＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞において著しくアップレギュレーションされ、またそれらの誘導が５μＭのＲＡ処理によりさらに増強されることを見出した。これと一致して、ｐ２１プロモーター−ルシフェラーゼレポーターはＢ１６メラノーマ細胞においてＲＡにより活性化されたが、その活性はＰＲＡＭＥにより強力に抑えられた（図５）。ＲＡＲαはＲＡシグナル伝達に応じてプロテアソームにより分解され（Zhuら, 1999）、これに一致して、ＲＡＲαタンパク質レベルはＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞では著しく減少した。全体として考えると、これらのデータは、ＰＲＡＭＥが、ヒトメラノーマのＲＡ非応答の一因となるＲＡシグナル伝達の主なレギュレーターであることを示唆している。

ＰＲＡＭＥ中のＮＲボックスの存在（図２ａ）は、ＰＲＡＭＥとＲＡＲαとの間の相互作用がこれらのモチーフのうちの１つ以上を介して生じることを示唆している。ＰＲＡＭＥのＮＲボックスがＲＡＲへの結合およびＲＡＲシグナル伝達の阻害に必要であるかどうかを検証するため、保存されているロイシン（Ｌ）残基をバリン（Ｖ）に変更することによりＰＲＡＭＥ中の７個のＬＸＸＬＬモチーフ各々に点突然変異を導入した。得られたＰＲＡＭＥ変異体を、変異させた各ＮＲボックスにちなんで命名した。７個のＬＸＸＬＬモチーフ全てを変異させた１つの別の変異体を作製し、これをＰＲＡＭＥ−ΔＬＸＸＬＬと呼ぶことにした。ＭＥＦにＲＡＲＥ−ｌｕｃおよびＰＲＡＭＥまたはＰＲＡＭＥ ＮＲボックス変異体をトランスフェクトし、さらにこれをＲＡで処理した。

ボックス７のＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＶＶ変異体を除き、７種類のＰＲＡＭＥ単一ＮＲボックス変異体のうちの６種類は、ＲＡＲシグナル伝達を野生型ＰＲＡＭＥと同程度まで阻害した。この変異体は、７個のＮＲボックス全てを変異させたＰＲＡＭＥ変異体と同様に、ＲＡＲシグナル伝達を抑制する点で問題があった。この観察結果と一致して、内在性ＲＡＲαがＴＡＰ−ＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＶＶ変異タンパク質と免疫共沈降することはなかった。ＰＲＡＭＥの抑制機能がＬＲＥＶＶ変異の影響を受けるかどうかを調査するために、本発明者らは、Ｇａｌ４−ＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＶＶ融合タンパク質のコトランスフェクションがＧａｌ４−ルシフェラーゼレポーターの発現に及ぼす影響を検証した。Ｇａｌ４−ＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＶＶはＧａｌ４−ＰＲＡＭＥと同程度まで発現を阻害し、このことは、抑制が影響を受けなかったことを示している。

野生型ＰＲＡＭＥ構築物、Ｇａｌ４−ＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＬＬ（４１６〜５０９）またはボックス７変異体Ｇａｌ４−ＰＲＡＭＥ−ＬＲＥＶＶ（４１６〜５０９）を、ＲＡの存在下でＶＰ１６−ＲＡＲαＬＢＤと共に同時発現させる、哺乳動物ツーハイブリッドアッセイを実施した。標準化したルシフェラーゼ活性を、３回の独立したトランスフェクションの平均値として測定した。ＰＲＡＭＥ野生型ＬＲＥＬＬ ＮＲボックスはＶＰ１６−ＲＡＲαと相互作用したが、ＰＲＡＭＥにＬＲＥＶＶ変異を導入するとこの結合が妨げられた。全体として考えると、これらのデータは、ＰＲＡＭＥ中の完全なＬＲＥＬＬモチーフがＲＡＲαへの結合およびＲＡＲシグナル伝達の抑制に必要であることを示唆している。

ヒトメラノーマはＲＡＲシグナル伝達に問題があることが多く（Demaryら, 2001；van der Leedeら, 1993）、ＰＲＡＭＥは原発性メラノーマの８８％、転移メラノーマの９５％で過剰発現される（Ikedaら, 1997）。このことから、ＰＲＡＭＥ発現がそれらのＲＡ非応答に関与している可能性が高まる。この仮説を検証するために、本発明者らは、安定なＲＮＡ干渉（Brummelkampら, 2002a）により、３種の異なるメラノーマ細胞株（Ａ３７５、ＦＭ６およびＳＫ２３）でＰＲＡＭＥ発現を阻害した。Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞にＰＲＡＭＥ特異的ｓｈＲＮＡベクター（ｐＲＳ−ＰＲＡＭＥ）をトランスフェクトすると、内在性ＰＲＡＭＥのレベルが著しく低下した。ＰＲＡＭＥをノックダウンすると、ＲＡに対しては比較的非感受性である３種のヒトメラノーマ細胞株のＲＡＲシグナル伝達が大いに増進した。全体として考えると、これらのデータは、ＰＲＡＭＥ発現がヒトメラノーマにおいてＲＡに対する細胞耐性を付与するという考えを裏付けている。

ＰＲＡＭＥのｉｎ ｖｉｖｏＲＡ応答性における役割を調べるために、本発明者らは、ヒトメラノーマ異種移植モデルを使用した。ヌードマウスの一方の側腹部に親Ａ３７５細胞を、また反対側の側腹部にＡ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞を皮下移植し、該マウスを毎日５ｍｇ／ｋｇのＲＡまたはビヒクルのみで経口的に（ｐ．ｏ．）処理し、その間の腫瘍体積を毎週測定した。腫瘍の成長は、ＰＲＡＭＥ^ＫＤメラノーマではＲＡ処理により非常に遅くなったが、同一マウスの異なる解剖学的部位で成長させた親Ａ３７５メラノーマでは遅くならなかった。全体として考えると、これらのデータは、ＰＲＡＭＥが、ヒトメラノーマのＲＡ非応答の一因となるＲＡＲシグナル伝達の負のレギュレーターとして機能することを示唆している。

ここで提示したデータは、ＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達の優性でリガンド非依存的なリプレッサーであって、ＲＡ駆動性の分化、増殖停止および／またはアポトーシスに対する細胞応答の低下をもたらすことを示している。ＰＲＡＭＥは、核内受容体との相互作用がリガンド結合時には失われるＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴなどの公知の核内受容体コリプレッサーとは異なる（Xuら, 1999）。また、本発明者らのデータにより、ＰＲＡＭＥ発現は、腫瘍細胞が腫瘍抑制性ＲＡシグナル伝達から逃れるための新規メカニズムであると確認された。この点において、ＰＲＡＭＥ発現は、急性前骨髄球性白血病に見られるＰＭＬ−ＲＡＲαおよびＰＬＺＦ−ＲＡＲα転座の表現型を模写（phenocopy）している。従って、メラノーマ細胞およびＰＲＡＭＥを過剰発現する他の腫瘍細胞にはＰＲＡＭＥ陰性細胞よりも選択的優位性があり、このことから、ＰＲＡＭＥ発現の存在が細胞傷害性Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を引き出すという事実にもかかわらず、なぜその発現がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞により保持されるかを説明することができる（Ikedaら, 1997）。最終的には、本発明者らのデータにより、ＨＤＡＣｉ化合物による治療が最も有効であると思われる患者を選ぶ方法が示唆される。

方法
試薬、抗体およびプラスミド構築
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ（＋）中の全長ＰＲＡＭＥは、M. Griffioen博士およびC. Melief博士（Leiden, The Netherlands）からの寄贈品である。レトロウイルスＰＲＡＭＥは、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ ＰＲＡＭＥ断片をｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＭＩＧ）にクローニングすることにより作製した。ＴＡＰ−タグ付きＰＲＡＭＥは、ＰＣＲ増幅したＥｃｏＲＩ ＰＲＡＭＥ断片をｐＺＯＭＥ−１−Ｎ（Cellzome）にクローニングすることにより作製し、またＧａｌ４−ＰＲＡＭＥは、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ ＰＲＡＭＥ断片をＧＡＬ４−ＤＢＤ発現ベクターにクローニングすることにより作製した。レトロウイルスＲＡＲαは、ＥｃｏＲＩで消化したＲＡＲαｃＤＮＡをｐＭＸにクローニングすることにより作製した。ＰＲＡＭＥ−ΔＬＸＸＬＬ変異体は、QuikChange Site-Mutagenesisキット（Stratagene）を使用して作製した。ＰＲＡＭＥ−ΔＬＸＸＬＬは、そのＬＸＸＬＬモチーフ内の複数のロイシン（Ｌ）をバリン（Ｖ）に変更したものである。得られた配列は次の通りであった：ＬＤＶＶＶ、ＶＲＲＬＬ、ＬＤＱＶＶ、ＶＱＡＬＬ、ＬＬＡＶＶ、ＬＱＳＶＶ、ＬＲＥＶＶ。

ｐＲＳ−ＰＲＡＭＥは、標的配列ＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣ（配列番号２）に対する合成オリゴを以前に記載された方法（Brummelkampら, 2002a）と同様の方法でｐＲＳ中にライゲーションすることにより作製した。以下のオリゴヌクレオチド配列：

（配列番号３）
および

（配列番号４）
をアニールさせることにより、突出したＢａｍＨ１末端を有する二本鎖を得た。これをベクター中にライゲーションした。Ｈ１−ＲＮＡプロモーターからの発現により、前記標的配列の出発点（配列番号３中の５’側の下線領域）に始まりヘアピンループ（上記配列番号３中のイタリック体部分）を経て前記標的配列の相補鎖の末端部（配列番号３中の３’側の下線領域）で終わる、２ｎｔの突出部分が付加された転写産物を提供する。

ＲＡ応答性ルシフェラーゼ構築物およびＲＡＲαｃＤＮＡは、H. Stunnenberg博士 （Nijmegen, The Netherlands）から快く提供して頂いた。赤白血病レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーは、Koh博士およびDaley博士（Cambridge, Massachusetts）から提供して頂いた。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）およびＴＳＡはSIGMAから入手し、またＰＸＤ１０１はTopotarget/Prolifix Ltd（Abingdon, UK）から入手した。抗ＰＲＡＭＥアフィニティー精製抗体は、P. Coulie博士（Brussels, Belgium）からの寛大な寄贈品であり、ペプチドＦＰＥＰＥＡＡＱＰＭＴＫＫＲＫＶＤＧ（ＡＨ−１５１；配列番号６）およびＣＧＤＲＴＦＹＤＰＥＰＩＬ（ＡＨ−１５２；配列番号７）でウサギを免疫することにより作製されたものである。ＲＡＲα（Ｃ−２０）、ＲＡＲβ（Ｃ−１９）、ｐ２１（Ｆ５）、ＧＦＰ（ＦＬ）、ＣＤＫ４（Ｃ−２２）、およびＣＤＫ２（Ｈ−２９８）に対する抗体はSanta Cruz Biotechnologiesから、抗アセチルＨ３はSerotecから、抗Ｒａｓ（Ｒ０２１２０）はTransduction laboratoriesから、また抗切断カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）はCell Signalingから入手した。

細胞培養、遺伝学的スクリーニング、およびコロニー形成アッセイ
全ての細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭで培養した。Phoenixパッケージング細胞を使用して、既述の同種指向性レトロウイルス（Serranoら, 1997）を作製した。ｐ５３^−／−ＭＥＦにｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ−ＲＡＳ^Ｖ１２レトロウイルスを感染させてから、ピューロマイシン耐性について選別した。得られたＲＡＳ^Ｖ１２−ＭＥＦにライブラリーレトロウイルス上清を感染させて、感染の４８時間後に５．１０^４細胞／１０ｃｍディッシュの細胞密度で再び播いた。再播種の１６時間後にＨＤＡＣ阻害剤ＰＸＤ１０１（１μＭ）またはＴＳＡ（０．１μＭ）を培地に加え、このＨＤＡＣ阻害剤を含む培地を２日おきに交換した。

トランスフェクションおよびレポーター アッセイ
トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法を利用してトランスフェクトしたＲａｓ^Ｖ１２ＭＥＦおよびPhoenix細胞以外は、リポフェクタミン試薬（Invitrogen）を用いて行った。ＲＡに基づくレポーターアッセイは、チャコール処理ＦＣＳ（Hyclone）を含むＤＭＥＭ中で行った。レポーターアッセイでは、０．５μｇのレポーター−ルシフェラーゼ、１ｎｇのＣＭＶ−レニラ（CMV-renilla）、および３μｇの示したＤＮＡをトランスフェクトした。ＲＡ、ＰＸＤ１０１、またはＴＳＡをトランスフェクションの２４時間後に加え、アッセイをトランスフェクションの４８時間後に実施した。ノックダウン実験では、ＲＡまたはＰＸＤ１０１をトランスフェクションの７２時間後に加え、アッセイをトランスフェクションの９６時間後に実施した。示したルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ値とレニラ内部対照値との比を表している。

ウェスタンブロット法および共免疫沈降法
細胞を、プロテアーゼ阻害剤（完全；Roche）および０．２ｎＭのＰＭＳＦを添加したＲｉｐａバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、および０．１％ＳＤＳ）中で溶解し、タンパク質を１０〜１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Immobilon P, Millipore）にトランスファーし、示した抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＴＡＰ（共）免疫沈降法の場合は、細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびＰＭＳＦを添加したＥＬＢバッファー（０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）中で溶解した。溶解物を、ＩｇＧ結合セファロースビーズ（Amersham）と共にインキュベートすることによりＴＡＰおよびＴＡＰ−ＰＲＡＭＥ（Rigautら, 1999）を免疫沈降させるか（抗ＴＡＰと表示する）、またはプロテインＡビーズおよび正常マウス血清（偽ＩＰ）と共に２時間インキュベートし、洗浄し、さらにこれをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。

分化および増殖アッセイ
Ｆ９細胞にＰＲＡＭＥまたは空ベクターを安定にトランスフェクトし、耐性細胞を１０^−７ＭのＲＡ中で５日間分化させた。Ａ３７５細胞にはｐＲＳ−ＰＲＡＭＥまたは空ベクターを安定にトランスフェクトし、安定なクローンを３Ｔ３プロトコルに従って培養した。ＲＡを含む培地は２４〜４８時間毎に補給した。
マウス腫瘍異種移植
雌の５〜６週齢の胸腺欠損ＢＡＬＢ−Ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の体幹部の両側に、１×１０^６個の細胞を皮下移植した。各マウスの右側腹部にＡ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞を、また左側腹部に対照Ａ３７５細胞を投与した。マウスを各処理群に無作為に割り付け、２０ゲージの胃栄養チューブを用いて５ｍｇ／ｋｇのＲＡまたはビヒクル（ヒマワリ油中エタノール）で毎日経口的に処理した。腫瘍径をカリパスで毎週測定した。ウイルスの再活性化および蔓延を防ぐため、Ａ３７５−ＰＲＡＭＥ^ＫＤ細胞を作製する際に使用したｐＲＳベクターは、自己不活性化レトロウイルスベクターとした（Brummelkampら, 2002a；Brummelkampら, 2002b）。この実験をｎ＝２０とｎ＝１０のマウスを用いて２回実施したところ、両試験の結果は似通ったものとなった。

引用文献

配列番号１−ヒトＰＲＡＭＥ

ＯＲＦの翻訳（配列番号５）：

ＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達のリプレッサーであることを表すグラフである。 ＰＲＡＭＥの概略図およびそのＲＡＲとの相互作用を表すグラフである。 ＰＲＡＭＥ発現の影響を表すグラフである。 ＰＲＡＭＥがＲＡＲシグナル伝達を抑制することを表すグラフである。 ＰＲＡＭＥ発現がメラノーマのＲＡシグナル伝達に及ぼす影響を表すグラフである。

Claims (12)

1. 治療を必要とする患者に有効量のＰＲＡＭＥ阻害剤をＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびレチノイドからなる群より選択される第２の薬剤と組み合わせて投与することを含む、腫瘍の治療方法。
2. 前記ＰＲＡＭＥ阻害剤がｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードするベクターである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＨＤＡＣｉが、Ｎ−ヒドロキシ−３−（３−フェニルスルファモイル−フェニル）−アクリルアミドである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記腫瘍がメラノーマである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 治療法での同時、別個または連続的使用のための併用製剤としての、ＰＲＡＭＥ阻害剤、ならびにＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびレチノイドからなる群より選択される第２の薬剤。
6. 前記治療法がメラノーマの治療である、請求項５に記載の使用のための、阻害剤および第２の薬剤。
7. 前記ＰＲＡＭＥ阻害剤がｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードするベクターである、請求項５または６に記載の使用のための、阻害剤および第２の薬剤。
8. 前記ＨＤＡＣｉが、Ｎ−ヒドロキシ−３−（３−フェニルスルファモイル−フェニル）−アクリルアミドである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の使用のための、阻害剤および第２の薬剤。
9. 腫瘍の治療での同時、別個または連続的使用のための併用製剤としての医薬の製造における、ＨＤＡＣｉまたはレチノイドと組み合わせたＰＲＡＭＥ阻害剤の使用。
10. ＨＤＡＣｉまたはレチノイドの投与の時点で、患者が腫瘍中のＰＲＡＭＥのレベルを抑制するための治療を受けている、患者の腫瘍を治療するためのＨＤＡＣｉまたはレチノイドの使用。
11. 前記腫瘍がメラノーマである、請求項９または１０に記載の使用。
12. ＰＲＡＭＥとレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）との相互作用の阻害剤についてのアッセイであって、
    （ｉ） 候補阻害剤；および
    （ｉｉ） ＰＲＡＭＥタンパク質およびＲＡＲタンパク質
    を一緒に併せるステップ、ならびに推定的な阻害剤が前記ＰＲＡＭＥおよびＲＡＲタンパク質の間の相互作用を妨げることが可能かどうかを確認するステップを含む、上記アッセイ。

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