JP2007521813A - スクリーニングアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
p(a)=Z(a)/Zのフラクションとして再び計算することができる。Z(a=φ)は、集合上で制約条件が何も無い(そしてこの故にp(φ)=1)ことを意味する一方で、a={B1, B2,..., BM}は、モチーフが全ての可能な部位で形成されることを意味する。
(a)リガンド、例えばタンパク質、による認識に要求されるRNA分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(b)当該RNA二次構造の集合において工程(a)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(c)少なくとも部分的に逆相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該RNA二次構造の集合において工程(a)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(d)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドを測定すること、
(e)工程(d)で測定されるようにオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(f)工程(a)の当該二次構造要素を含むRNAを工程(e)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を測定すること
を含む調節RNA−リガンド相互作用を調整する方法を提供する。
本発明のRNAは、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボゾームRNA(rRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、転移RNA(tRNA)、ミクロRNA(miRNA)、核小体低分子RNAおよびスプライセオソームRNAからなる群からの、共有的に修飾されたRNAを含む、生物学的機能を持つ任意のRNA分子を含む。好ましくは、RNAは、例えば、BMP6(骨形態形成タンパク質6)、CCL11(ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド11)、エオタキシン、CSF2(コロニー刺激因子2)、GMCSF(顆粒球単球コロニー刺激因子)、FSHB(濾胞刺激ホルモンベータ)、IL1b(インターロイキン1ベータ)、IL2(インターロイキン2)、IL3(インターロイキン3)、IL4(インターロイキン4)、IL6(インターロイキン6)、IL8(インターロイキン8)、MYOD1(ミオゲン因子3)、MYOG(ミオゲニン)、NF1(ニューロフィブロミン1)、PITX2(ペア様ホメオドメイン転写因子2)、TNFα(腫瘍壊死因子アルファ)、VEGF(血管内皮成長因子)、CCNA2(サイクリンA)、CCNB1(サイクリンB1)、CCND1(サイクリンD1)、CCND2(サイクリンD2)、CD83、CDKN1A(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤1A、即ち、p21もしくはCip1)、CDKN1B(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤1B、即ち、p27もしくはkip1)、DEK、FOS(v−fos FBJマウス骨肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、c−fos)、HLF(肝白血病因子)、JUN(v−jun肉腫ウイルス17腫瘍遺伝子ホモログ(鳥類の)、c−jun)、MYC(v−myc骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、c−myc)、MYCN(v−myc骨髄球腫症ウイルス関連腫瘍遺伝子、神経芽細胞腫由来、n−myc)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、HDAC2(ヒストンデアセチラーゼ2)、MMP9(マトリックスメタロプロテイナーゼ9)、NDUFB6(NADH脱水素酵素(ユビキチン)1ベータ小複合体)、NOS2A(一酸化窒素合成酵素2A)、PLAU(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子)、PTGS2(プロスタグランジン−エンドペルオキシド合成酵素2)、COX2(シクロオキシゲナーゼ2)、SERPINB2(セリン(もしくはシステイン)タンパク質分解酵素阻害剤)、PAI−2(プラスミノーゲン活性化因子阻害剤2)、UBE2N(ユビキチン結合酵素E2N)、ADRB1(ベータ−1アドレナリン性受容体)、ADRB2(ベータ−2アドレナリン性受容体)、AR(アンドロゲン受容体)、CALCR(カルシトニン受容体)、CDH2(カドヘリン2,1型)、N−カドヘリン、GAP43(成長関連タンパク質43)、SLC2A1(溶質担体ファミリー2 メンバー1)、GLUT1(グルコース輸送体1)、PLAUR(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体)、SLC5A1(溶質担体ファミリー5)、TNFSF5(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー5、CD154)、ACTG1(アクチン、ガンマ1)、CTNNB1(カテニン(カドヘリン−関連タンパク質)、ベータ1)、MARCKS(ミリストイル化アラニン富化タンパク質キナーゼC基質)、MTA1(転移関連1)、PITX2(ペア様ホメオドメイン転写因子2)、およびSLC7A1(陽イオンアミノ酸輸送体、CAT−1)からなる群よりの、AU−富化要素mRNAのような、mRNAであって、例えば、RNAは、IL−2 mRNAもしくはTNF−α mRNAのような、mRNAである。
他のタグとまたは合成ポリマー、例えばポリリシンもしくは(ポリ)エチレングリコールと、3'もしくは5'末端においてまたは内部の位置において例えば標識される、標識形でまた存在し得る。オリゴヌクレオチドの長さは、RNAの二次構造および望ましい配列特異性に依存して、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10〜100個のように、10〜200個、好ましくは約20個のヌクレオチドのように、10〜50個のヌクレオチドの長さを有する。
配列番号1: AAGGCCTGATATGTTTTAAG、
配列番号2: AATATAAAATTTAAATATTT、
配列番号3: TAGAGCCCCTAGGGCTTACA、
配列番号4: TGAAACCATTTTAGAGCCCC、
配列番号5: AAGGCCUGAUAUGUUUUAAG、
配列番号6: AAUAUAAAAUUUAAAUAUUU、
配列番号7: UAGAGCCCCUAGGGCUUACA,
配列番号8: UGAAACCAUUUUAGAGCCCC
からなる群より選択される配列を有する、本発明の方法を提供する。
配列番号9: TCGGCCAGCTCCACGTCCCG、
配列番号10: TCTGGTAGGAGACGGCGATG、
配列番号11: ACGGCGATGCGGCTGATGGT、
配列番号12: TTCTGGAGGCCCCAGTTTGA、
配列番号13: ATTCCAGATGTCAGGGATCA,および
配列番号14: ATCACAAGTGCAAACATAAA
からなる群より選択される配列を有する、本発明の方法を提供する。
配列番号1: AAGGCCTGATATGTTTTAAG、
配列番号2: AATATAAAATTTAAATATTT、
配列番号3: TAGAGCCCCTAGGGCTTACA、
配列番号4: TGAAACCATTTTAGAGCCCC、
配列番号5: AAGGCCUGAUAUGUUUUAAG、
配列番号6: AAUAUAAAAUUUAAAUAUUU、
配列番号7: UAGAGCCCCUAGGGCUUACA、
配列番号8: UGAAACCAUUUUAGAGCCCC、
配列番号9: TCGGCCAGCTCCACGTCCCG、
配列番号10: TCTGGTAGGAGACGGCGATG、
配列番号11: ACGGCGATGCGGCTGATGGT、
配列番号12: TTCTGGAGGCCCCAGTTTGA、
配列番号13: ATTCCAGATGTCAGGGATCA、および
配列番号14: ATCACAAGTGCAAACATAAA
からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する:
例えば、2'−O−メチル−ホスホロチオエート−、コレステロール−、ビオチン−および蛍光色素からなる群より選択される修飾を持つ、配列番号1〜配列番号14のオリゴヌクレオチドである。
もう一つの好ましい態様では、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは配列番号1〜配列番号14のオリゴヌクレオチドは、PNAまたはLNA分子である。
(I)RNA分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイであって、
(a)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAを候補化合物の存在下においておよび不在下において規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化オリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(b)当該候補化合物の存在下においておよび不在下において当該RNAの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を測定すること、ならびに
(c)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
(II)RNA分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(a)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(b)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAをオリゴヌクレオチドのように同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(c)ハイブリダイゼーションの作用を工程(a)および(b)について測定すること、ならびに
(d)工程(a)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
小分子もしくは他の化学物質のように薬剤を、例えば、転位の間にmRNAの構造の中で特異的立体配座に結合することにより、この作用を阻害すること、強化することもしくは刺激することのいずれかについて試験し得る。
好ましい態様では、当該アッセイの中のRNAはmRNAである。
もう一つの好ましい態様では、RNA、リガンドおよびオリゴヌクレオチドは、上記で規定されているようである。
もう一つの態様では、本発明は、高処理能力スクリーニングのために本発明のアッセイの使用を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、もう一つの医薬的に活性な薬剤をさらに含む、本発明の医薬組成物を提供する。
処置は、処置および予防を含む。
図1:オープナーの作用の図式的説明図
オープナーの作用無しでは、HuRの結合は、結合部位(1でマーク)のアクセス不可能性により減退されている。標的mRNA(mRNAα)へのオープナー(2でマーク)のハイブリダイゼーション時には、αmRNA内で局所二次構造の特異的モジュレーションが、アクセス可能な立体配座にあるHuRの結合部位の提示に至って、他のいずれのHuR標的mRNA(例えば、mRNAβ)に影響を及ぼすこと無しにmRNAαの安定化をもたらしている。
37°におけるHuR結合部位のアクセス可能性p* MO(即ち、アクセス可能なRNAのフラクション)が、3'UTR内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、x軸)において逆相補性の20マーオリゴヌクレオチドへのIL−2 3'UTRのハイブリダイゼーションの依存性を示している。IL−2 AREは白い四角として指し示され、NNUUNNUUUのHuR結合部位はオープナー開始位置の約50および約150において連続した黒線でブロックとして示されている。アクセス可能性の著しい増加は、HuR結合部位の近くにおいて孤立の“ホットスポット”に限定されている。実験的に試験されたオープナー分子のOp1、Op2、Op3およびOp4の位置が指し示されて、負の対照(N1、N2)がまたマークされている(表1で特定される配列)。オープナーのOp1およびOp3は、ARE内でHuR結合部位を主として標的にし、Op2およびOp4は、第二のNNUUNNUUUモチーフに指向されている。
IL−2 3'UTR(左のパネル)のおよびオープナーのOp1にハイブリダイズされたIL−2 3'UTR(右のパネル、Op1は黒い実線として表されている)の最小自由エネルギー(MFE)二次構造。NNUUNNUUU要素は、右のパネルの中で小斑点としてマークされている。複合体のMFE立体配座の中で図示されるように、オープナーは、図1にスケッチされているモデルに従って―アクセス可能な(即ち、単鎖の)NNUUNNUUU要素を持つ立体配座に向かって平衡をシフトしている。重要なことに、オープナーの作用は、構造の集合がオープナーの予測に適切であるので、MFEの構造に必ずしも反映される必要は無い。3'UTR−オープナー複合体についてのMFE二次構造は、Cofold(ViennaのRNAパッケージで入手可能)を用いて計算される。
組換えHuRのIL−2 3'UTRへの見かけの親和性をオープナーの存在下および不在下において1D−FIDA検出で測定する。全ての4個の試験されたIL−2特異的オープナーは、見かけの解離定数Kd app(Op1有りで:Kd app=11.80±1.48nM;Op2有りで:Kd app=18.91±1.91nM;Op3有りで:Kd app=8.38±1.18nM;Op4有りで:Kd app=19.52+/−2.20nM;オープナー無しで:Kd app=32.77±4.48nM;0.5nMでのIL−2 3'UTR;それぞれ、25、25、5および1nMでのオープナー)の減少により反映された、IL−2 3'UTRとのHuRの会合を強化する。負の対照オリゴヌクレオチドのIL−2 3'UTRへのハイブリダイゼーションは、HuRとの相互作用を影響を受けないままにする(N1有りで:Kd app=32.91±6.34nM;N2有りで:Kd app=32.77±3.72nM、25nM濃度でのN1およびN2)(A)。オープナーのハイブリダイゼーションにより誘発される親和性の増加は、0.38nMのオープナー濃度で最大半減飽和を持つ飽和カーブを示している(Op3ハイブリダイゼーションの見かけの親和性=134(±54)pM)。開かれたIL−2 3'UTRへのHuR結合の見かけの親和性は、両方が1.56nMで、8.57±1.33nMのKd appにおいて最大値に近づいている(全ての実験において0.5nMでのIL−2 3'UTR)(B)。Op1の存在下においては、解離定数は、オープナーの濃度が増加するにつれて1.56nMのOp1濃度において、Kd app=11.80±1.48nMの最小値に減少している(全ての実験において2.5nMでのIL−2 3'UTR)。Op1については、この最適値を超えて濃度を増加させることは、作用を逆戻りさせて、解離定数が再び増加する。
オープナーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドのOp1、Op2、N2およびOpTとの処置無しでまたは後でヒトPBMCの溶菌液から、HuR mRNA複合体を共−免疫沈澱する。HuRが結合したIL−2 mRNAを実時間RT−PCRにより定量化する。IL−2 mRNAの量を、未処理の細胞の中のレベル(白色棒)に正規化する。オープナーを2.5μM(斜線の棒)にもしくは10μM(黒色棒)、負対照のN2およびOpTに10μM濃度を加える。両方のオープナーは、HuR mRNA複合体化を6.5倍(Op1)のもしくは3.1倍(Op2)の更に高いレベルにまで増強する。
内因性のIL−2 mRNAの分解をヒトPBMCの溶菌液の中でモニターする。Mg2+の添加時に(t=0分)、(A)10μM、(B)25μMおよび(C)40μMの濃度でオープナーのOp1、Op2もしくはN2の存在下においておよび不在下において、残存するIL−2 mRNAの量を定量的実時間RT−PCRにより経時的に定量化する。全てのデータは、少なくとも3個の独立した試料からの平均を表して、時点t=0分でのレベルに正規化されている。データは、単一の指数関数型減衰(実線:オープナーなし;破線:N2)に当てはめられている。オープナーは何も無しで(白丸)、t1/2=8.34±0.96分(A)、t1/2=8.44±1.98分(B)、およびt1/2=8.84±2.19分(C)、ならびに10μMの負の対照N2の存在下において(×印)、(A)、t1/2=6.82±1.96分、の半減期で、IL−2 mRNAは急速に分解されている。オープナーのOp1(黒丸)もしくはOp2(黒三角)の添加は、濃度依存様式で((A)の中で10μM、(B)の中で25μMおよび(C)の中で40μMでのオープナー)一過性のIL−2 mRNAの安定化を促進している。40μMの濃度(C)で、Op1は、70分のインキュベーション時間全体に亘って分解をブロックしている。Op2は同様な安定化作用を、それはもう一つのHuRの結合部位を標的にするけれども、示している(黒三角、(B)および(C))。EF−1α、非ARE mRNA、は、70分の観察時間全体に亘って安定のままである(B)。
オープナーが誘発するmRNAの安定化の特異性を、サイトカインのmRNA類(TNF−α(A)およびIL−1β(B))を含む他のAREの減衰へのそれらの作用をモニターすることにより試験する。TNF−αのおよびIL−1βのmRNAの分解は、それぞれ、t1/2=36.0±2.2分(白丸(A))およびt1/2=37.6±5.6分(白丸(B))の半減期を特徴としている。IL−2特異的オープナーのOp1(黒丸)もしくはOp2(黒三角、両方とも25μMで)のいずれかの存在下において、TNF−αまたはIL−1β mRNAの減衰のいずれも変化しない。
37°におけるHuR結合部位のアクセス可能性p* MO(即ち、アクセス可能なRNAのフラクション)が、mRNA(RefSec NM_000594)内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、x軸)において逆相補性の20マーオリゴヌクレオチドへのTNF−α mRNAのハイブリダイゼーションの依存性を示している。TNF−α 3'UTRは、黒い線により図示され、AREは白い四角として指し示され、NNUUNNUUU HuR結合部位は、黒い小さな四角として示されている。アクセス可能性の著しい変化を持つハイブリダイゼーション部位は、HuR結合部位の主に近くにだがまた遠くにおいて、“ホットスポット”の中に集中している。注目すべきことには、また推定上の“クローザー”の位置が同定されて、NNUUNNUUUのアクセス可能性を著しく減少すると予測されている。興味あることには、これらの位置は、オープナーのホットスポット領域内に位置している。推定上のオープナー、クローザー及び負の対照オリゴの位置は、それぞれ、小さな四角としてまた示されている。実験的に試験されたOpT、ClTおよびNTを含む同定されたTNF−αのオープナー/クローザー(OpA、OpB、ClC、OpE、OpH)の配列は、表1の中で指定されている。
組換えHuRのTNF−α 3'UTRへの見かけの親和性をオープナー、クローザーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドの存在下においておよび不在下において1D−FIDAアッセイで測定する。TNF−αのクローザーClTは、見かけの解離定数Kd appの増加により反映された、TNF−α 3'UTRとのHuRの会合を明らかに低減する。作用は、クローザーの濃度と相関している。作用は、最高のクローザーの濃度で2.5倍までのKdの増加(ClT有りで:Kd app=13.80±2.41nM、クローザー無しで:Kd app=5.63±0.87nM)をもって最高値に近づいている(A)。オープナーのOpTは、TNF−α 3'UTRへのHuRの親和性を2倍まで増加して(B)、それは計算で予測された作用と良好な整合性にある(図8)。しかしながら、0.5nM以上のオープナーの濃度では、作用は、増加した解離定数に向かって再び逆戻りする。負の対照オリゴヌクレオチドNTとのハイブリダイゼーションは、実験の全体の濃度範囲に亘ってHuR−TNF−α 3'UTRの親和性に影響を及ぼさない(C)。TNF−α 3'UTRの濃度は、全ての実験において1nMである。
TNF−αについてデザインされたオープナー(OpT、図8および表1を参照)は、IL−1β mRNAのレベルに影響を及ぼすこと無しに(B)、TNF−α mRNAを特異的に安定化する(A)。(丸印:オープナーなし;星印:25μMでのオープナーOpT)。
ARE mRNAの立体配座に作用する化合物の同定のための例示的なアッセイ原理が図式化されている。オープナーにより誘発される立体配座の転位は、FRET対を構成している、適切に位置する蛍光体により例えば検出される。mRNA内に戦略的に置かれるとすると、それらの距離および、それ故に、FRETの効率は、開かれたもしくは閉鎖されたHuR結合部位(×によりマークされた)に特徴的になる。(A)にスケッチされているように、計算的にデザインされたオープナーにより誘発されるHuR結合部位の開口は、FRETの効率の減少により検出される。(B)低分子量の化合物は、異なる作用機序によりこの転位と干渉するであろう。mRNAに結合することにより、それらは、オープナーのハイブリダイゼーションと直接に競争するかもしくは閉鎖された立体配座の中でmRNAを局所に凍結するかのいずれかであり得る。オープナーの存在下において持続的なエネルギー転移を特徴とする、そのような化合物は、HuRがmRNAに結合することを防止して、それにより対応する標的遺伝子を下方調節するであろう。他方において、オープナーの作用は、開かれた立体配座を安定化する化合物により強化され得る。これらの化合物ならびにオープナーに誘発される立体配座のスイッチを模倣するそのような化合物は、それぞれ、オープナーの存在下もしくは不在下において低減されたエネルギー転移により同定される。HTSフォーマットへの適応のための主な問題点は、十分な量で部位特異的に二重に標識されたmRNAの作製であろう。それ故に、別の戦略が図12に概略されている。
これに代えて、アッセイ戦略をmRNA上でおよびHuR上で二つの蛍光体の間のエネルギー転移を測定することによりHuR結合事象の検出へシフトし得る。mRNAのラベルは、(A)3'末端に共役的に付着させる(例えば、Qin P. Z. et al., Methods, 1999, 18 (1): 60-70の中に記載されているように)もしくは(B)オープナーのオリゴヌクレオチドを介して導入されるかのいずれかであり得る。この設定では、オープナーにより誘発される立体配座の転位を、引き続く工程である、HuR mRNA会合の測定により間接的に測定する。それ故に、HuR阻害剤は、mRNAの立体配座に作用する化合物と同一のシグナルを生成して、適切な対向スクリーニングにおいて選別される必要があるであろう。
ARE mRNAの立体配座スイッチへの細胞のアッセイデザインのための例示的な戦略が概略されている(A)。標的mRNAを、適切にデザインされた蛍光プローブ(例えばCy5)により特異的に視覚化する。プローブを計算的にデザインして、熱力学的mRNAの集合への最小の影響を保証して、オープナーが誘発する構造の転位と適合性にする。内因性のHuRを、蛍光性タンパク質(例えばCFP)への融合により標識する。閉鎖されたmRNAの立体配座では、二つの蛍光体(HuR、mRNA)は、空間的に孤立しているであろう。オープナーにより誘発される、HuRの結合時に、二つの蛍光性分子は、mRNA上に共局所化するであろうが、それは高分解共焦点映像法により例えば検出され得る(B)。これに代えて、mRNAに特異的な標識を、オープナーのオリゴヌクレオチドの上に直接に置く。この設定では、開かれたmRNA分子のみが検出されて、mRNAの構造集合は(さらに別の)プローブにより影響を及ぼされない。プローブがHuR結合部位(×によりマークされた)に十分近くにハイブリダイズするという条件で、エネルギーの転移(即ち、供与体の失活/受容体の感作)が、開かれた(即ちHuRが結合した)から閉鎖された立体配座を区別するための好ましい検出モードである。図11の図示に類似して、オープナーが誘発する作用を阻害するかもしくは強化する化合物を、開かれた対閉鎖されたmRNAの立体配座の区別に基づいて同定することができる。構成的に“開かれた”mRNAを用いる対向スクリーニングは、HuRの阻害剤を選別するために適切であり得る。
表1:同定されたオープナー/クローザーのオリゴヌクレオチド
IL−2もしくはTNF−αについて同定された推定上のオープナーまたは負の対照オリゴリボヌクレオチドの配列が指定されている。実験的確認のために選択されているオープナー/クローザー、ならびに負の対照オリゴが下線で示されている。配列は、標的mRNAの中で指定された領域に逆相補性であって、5'から3'への方向で示されている。
IL−2、TNF−αおよびIL−1βの標的mRNAのRT PCRの定量化にならびに内部対照のmRNAとしてのEF−1−αに用いられるプライマーの配列が、5'から3'への方向で指定されている。
以下の略語が使用されている:
ACN アセトニトリル
BSA ウシ血清アルブミン
dsDNA 二重鎖DNA
EDTA N,N,N',N'−エチレンジアミン四酢酸
EF−1α 伸長因子−1α
FCS ウシ胎仔血清
FIDA 蛍光強度分布分析
(1D−FIDA=一次元のもしくは2D−FIDA=2次元のFIDA)
FCS 蛍光相関分光法
hPBMC ヒト末梢血単核細胞
IPTG イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド
LC/EI−MS 液体クロマトグラフィー/電気スプレーイオン化−質量分光法
OD 光学濃度
ORN オリゴリボヌクレオチド
PBS リン酸塩緩衝食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PMA ホルボール−12−ミリステート−13−アセテ−ト
RRM RNA認識モチーフ
rt 室温
RP−HPLC 逆相高速液体クロマトマトグラフィー
RT−PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SDS−PAGE ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ss 単鎖
TEAAc 酢酸トリエチルアンモニウム
TMR カルボキシテトラメチルローダミン
UTR 未翻訳領域。
実施例A―実験プロトコル
a)蛍光的に標識したRNAの作製。公表された手順[例えば、Chaix C. et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 1989, (21): 45-6; Scaringe S. A. et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18 (18): 5433-41、を参照]および製造業者のプロトコルを採用して、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−トリイソプロピルオキシメチルで保護されたβ'−シアノエチル−(N,N−ジイソプロピル−)ヌクレオチド ホスホラミダイト(Glen Research)を用いる394A合成機(Applied Biosystems)の上で、5'−アミノ−C6で修飾されたRNAを合成する。ORNを支持体から開裂し、塩基で、ホスフェートでおよび2'で脱保護して、標準的プロトコルに従って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。参考文献(Gray D. M. et al., Methods in Enzymology 1995, 246: 19-34)にしたがって測定するように、260nmにおける正確な分子吸光係数を用いて、ブーゲ−ランベルト−ベーアの法則にしたがって260nmにおけるUV吸収から、RNAの濃度を計算する。解析RP−HPLC分析(VYDAC C18カラム、5μm、300Å、4.6mm×250mm、45分で0〜50%CH3CNの勾配溶出でもってTEAAc(0.1M、pH7.0)の中で、260nmにおけるUV検出)にしたがって、全てのORN類は>99%純粋である。第一級アミンのサクシニミジルエステルで活性化した蛍光体との標準的反応で、TMR(Molecular Probes)を5'アミノリンカーに付着して、安定なカルボキサミドを形成する。未反応の染料を、ヒドロキシルアミン塩酸塩の添加により加水分解する。標識RNAをゲルろ過により遊離の染料から分離し、RP−HPLCにより未標識RNAから精製して、上で説明されるように、UV吸収分光法によるが、260nmにおける染料の吸収を補正して、濃度を測定する。
限定分配関数を用いてRNAのアクセス可能性p* Mを計算すること。我々は、二次構造の制約条件を持つ配列パターン、例えば完全に単鎖の立体配座でのNNUUNNUUU、により規定される二次構造要素のためのp* Mの計算をここで説明する。方程式[III]の中でp*について述べているように、p* Mを直接に計算することができる。数値の誤差を避けるために、p* (a)を分配関数のフラクションとして計算しないが、集合自由エネルギー、
オープナー、クローザーおよび負の対照のORN類をIL−2およびTNF−α mRNAから構築され、インビトロでおよびヒトの一次細胞溶菌液の中で実験的にバリデートする。IL−2のためにオープナーおよび負の対照のORN類のデザインについて計算されたアクセス可能なRNA構造のフラクションへの20マーORN類のハイブリダイゼーションの作用を示しているプロットが図2に示されている。注目すべきことには、著しいアクセス可能性の増加が、HuR結合部位の外側であるが近くに主として位置している、mRNA内で“ホットスポット”の限定数に限定されている。大抵の他の位置では、ハイブリダイゼーションは、局部的なARE立体配座を大抵は影響を及ぼされないままにする。これらのホットスポットから、4個の顕在的なオープナーORNならびに2個の負の対照のORN類が、実験的特性化のために選択されている(表1)。最初の工程では、我々はssORN類を使用する。
TNF−αのためにオープナーおよび負の対照のORN類のデザインについて計算されたアクセス可能なRNAの構造のフラクションへの20マーORN類のハイブリダイゼーションの作用を示しているプロットが、図8に示されている。再び、著しいアクセス可能性の変化は、HuR結合部位の近くにだがまた遠くに位置する、mRNAの中の“ホットスポット”の中に集中している。これらのホットスポットから、一つの潜在的なオープナーのORNならびに推定上のクローザーおよび負の対照のORNが実験的特性化のために選択されている(表1)。最初の工程では、我々はssORN類を使用する。オープナーの作用をインビトロで確認する。1D−FIDAアッセイで測定されるように、クローザーのClTは、TNF−α 3'UTR(697nt)へのHuRの親和性を著しく減少した。作用は、クローザーの濃度と相関していて、最高のクローザーの濃度(5nM)において、2.5倍までの親和性の減少をもって、最大の作用に近づいている(図9A)。反対に、親和性は、2倍までオープナーのOpTにより増加されている(0.25nMでのOpTについて、図9B)。両方の作用は、予測のアクセス可能性変化と定量的に一致している(図8)。OpTの更に高い濃度においては、しかしながら、作用は逆戻りして、HuR−TNF−α 3'UTRの親和性は、再び低減されている。一つの可能な説明は、ある特定の濃度の上では、この特異的な配列がTNF−α 3'UTR内で二次部位にまたハイブリダイズして、それにより逆の立体配座転位を誘発することであろう。重要なことには、負の対照オリゴのNTとのハイブリダイゼーションは、HuR−TNF−α 3'UTRの親和性を変化していない(図9C)。
Claims (18)
- 調節RNA−リガンド相互作用を調整する方法であって、
(a)リガンド、例えばタンパク質による認識に必要なRNA分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(b)当該RNAの二次構造の集合において工程(a)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(c)少なくとも部分的に逆相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該RNAの二次構造の集合において工程(a)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(d)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドを測定すること、
(e)工程(d)で測定されるようにオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(f)工程(a)の当該二次構造要素を含むRNAを工程(e)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすること、そして
(g)当該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を測定すること
を含む、方法。 - RNAがIL−2 mRNAであり、リガンドがELAVL1であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号1: AAGGCCTGATATGTTTTAAG、
配列番号2: AATATAAAATTTAAATATTT、
配列番号3: TAGAGCCCCTAGGGCTTACA、
配列番号4: TGAAACCATTTTAGAGCCCC、
配列番号5: AAGGCCUGAUAUGUUUUAAG、
配列番号6: AAUAUAAAAUUUAAAUAUUU、
配列番号7: UAGAGCCCCUAGGGCUUACA、
配列番号8: UGAAACCAUUUUAGAGCCCC
からなる群より選択される配列を有する、請求項1に記載の方法。 - RNAがTNF−α mRNAであり、リガンドがELAVL1であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号9: TCGGCCAGCTCCACGTCCCG、
配列番号10: TCTGGTAGGAGACGGCGATG、
配列番号11: ACGGCGATGCGGCTGATGGT、
配列番号12: TTCTGGAGGCCCCAGTTTGA、
配列番号13: ATTCCAGATGTCAGGGATCA、および
配列番号14: ATCACAAGTGCAAACATAAA
からなる群より選択される配列を有する、請求項1に記載の方法。 - 対応するRNAの二次構造を変更することにより遺伝子の発現を操作するための請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法の使用。
- RNA分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(a)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAを候補化合物の存在下および不在下に規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(b)当該候補化合物の存在下および不在下に当該RNAの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を測定すること
(c)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。 - RNA分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(a)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(b)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むRNAをオリゴヌクレオチドと同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(c)ハイブリダイゼーションの作用を工程(a)および(b)について測定すること、そして
(d)工程(a)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。 - ハイブリダイゼーションの作用をハイブリダイゼーションの作用に関連するシグナルを測定することにより決定して、その作用はRNA二次構造、RNA三次構造、RNA−リガンドの親和性、RNAのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドの立体配座変化、RNA−リガンド認識の下流作用の効率、RNAのスプライシング、共有RNA修飾、RNAの局在化、RNAの安定性、RNAの翻訳およびタンパク質の発現プロフィルにおける変化からなる群より選択される、請求項5または6に記載のアッセイ法。
- RNAがmRNAである、請求項5〜7のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- RNA、リガンドおよびオリゴヌクレオチドが請求項2もしくは3に記載されているものである、請求項5〜8のいずれか1項に記載のアッセイ法。
- 高処理能力スクリーニングのための請求項5〜9のいずれか1項に記載のアッセイ法の使用。
- 医薬品としての使用のための請求項5〜9のいずれか1項に記載のアッセイ法により同定される薬剤。
- 請求項1に記載の方法により同定される規定の確率閾値を超えて二次構造要素の熱力学的確率を変化させる、オリゴヌクレオチド。
- 配列番号1: AAGGCCTGATATGTTTTAAG、
配列番号2: AATATAAAATTTAAATATTT、
配列番号3: TAGAGCCCCTAGGGCTTACA、
配列番号4: TGAAACCATTTTAGAGCCCC、
配列番号5: AAGGCCUGAUAUGUUUUAAG、
配列番号6: AAUAUAAAAUUUAAAUAUUU、
配列番号7: UAGAGCCCCUAGGGCUUACA、
配列番号8: UGAAACCAUUUUAGAGCCCC、
配列番号9: TCGGCCAGCTCCACGTCCCG、
配列番号10: TCTGGTAGGAGACGGCGATG、
配列番号11: ACGGCGATGCGGCTGATGGT、
配列番号12: TTCTGGAGGCCCCAGTTTGA、
配列番号13: ATTCCAGATGTCAGGGATCA、および
配列番号14: ATCACAAGTGCAAACATAAA
からなる群より選択される配列を有する、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド。 - 任意の化学修飾を持つRNAのもしくはDNA分子である、請求項1に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- ペプチド核酸もしくはロックド核酸分子である、請求項1に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 調節RNA−リガンド相互作用を操作するための請求項12〜15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- RNA分子の安定性に影響するための請求項12〜15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 少なくとも一つの薬学的賦形剤に加えて、請求項5に記載のアッセイにより同定される薬剤もしくは請求項12〜15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
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