JP2007520209A - 移植片拒絶反応のバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
a)基線値として、拒絶反応、例えばCRを発症しないことが既知の対照移植対象の特定の組織サンプルにおける、例えば表1、2または3に同定した通りの、少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを取り;
b)試験移植後患者から得たa)と同じ組織タイプの組織サンプルにおいて、a)で同定した少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し;そして
c)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が試験移植対象が拒絶反応、例えばCRを発症するリスクにあるとの予測である)
ことを含み得る。
a)例えば表1、2または3に同定した通りの、少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを、ドナー、好ましくは生存ドナーから得た組織サンプルにおいて移植の日に検出し、
b)移植後患者から得た組織サンプルにおいて、a)で同定した少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
c)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測である)
ことを含み得る。
a)移植対象から、該阻害剤の投与前に投与前サンプルを得て、
b)投与前サンプルにおける少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
c)移植患者から1個またはそれ以上の投与後サンプルを得て、
d)投与後サンプル(複数もある)における少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
e)投与前サンプルのmRNAの発現または少なくとも1個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルと、投与後サンプル(複数もある)におけるmRNAの発現または少なくとも1個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを比較し、そして
f)薬剤をそれに準じて調整する
ことを含む。
急性および慢性拒絶反応の腎臓移植非ヒト霊長類(カニクイザル)モデル由来の組織サンプルを得る。これらのモデルで誘発された病巣を試験し、ヒトにおいて観察される組織学的変化と非常に類似していることが判明した。
対照腎臓を移植日(片側または両側腎切除)に採取する。
全て液体窒素で急速冷凍した腎臓皮質サンプルを、クライオチューブ(cryotube)中、−80℃で貯蔵する。700μlホモジネーション緩衝液(ABI融解緩衝液/PBS 1:1)添加直後、ホモジネーション工程を、Polytronローター/ステーター・ホモジナイザーPT 3100の棒を、組織含有混合液に浸し、ホモジナイザーを最高速度で30秒運転することにより行う。この後、残存組織片が見えるならば、この工程を、均質性が達成されるまで繰り返す。その後、該均質物をRNA抽出工程において使用するまで−80℃で貯蔵する。
ホモジネートの前濾過およびRNA抽出を、ABI 6700 Biorobotワークステーション(Applied Biosystems, USA)により行う。組織ホモジネートを、96深ウェルプレートのウェルに入れ、該6700ワークステーションの濾液位置に置く。組織前濾過トレイを精製キャリッジに入れ、その位置に固定する。その装置のドアを占め、そしてワークステーションソフトウエアを開始する。
工程1:洗浄溶液1、400μl、減圧80%を180秒、2回;
工程2:洗浄溶液2、500μl、減圧80%を180秒、1回;
工程3:洗浄溶液2、300μl、減圧60%を120秒、2回。
22μl aRNA
4μl 10X HY反応緩衝液、
4μl 10X ビオチン標識リボヌクレオチド、
4μl 10X DTT、
4μl RNase阻害剤混合物、
2μl 20X T7 RNAポリメラーゼ。
15μg標識aRNAを、20μl容量中、4μl 5X MES フラグメント化緩衝液およびRNaseを含まない水の添加によりフラグメント化する。該混合物を20分、94℃でインキュベートする。
ハイブリダイゼーションを、300μl容量で行う。フラグメント化したaRNAを150μl 2X MESハイブリダイゼーション緩衝液、3μlニシン精子DNA(10mg/ml)、3μl BSA(50mg/ml)、3μl 948b対照オリゴヌクレオチド(5nM)、および3μl 20X 真核生物ハイブリダイゼーション対照(Affymetrix)と混合する。DEPC水を最終容量300μlまで添加する。
マイクロアレイを45℃で15分インキュベートする。該アレイチャンバーを、45℃に予め温めた新たに調製した前処置溶液で満たす。
RNAを、約12,000ヒト遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含むAffymetrix HG U133Aチップにハイブリダイズさせ、分析する。
マイクロアレイは45℃で前処置されているが、該ハイブリダイゼーション混合物を99℃で5分インキュベートする。5分、14,000rpmで遠心分離後、上清を新しいエッペンドルフ試験管に移し、45℃で5分インキュベートする。前処置溶液をマイクロアレイチャンバーから除き、泡を避けながらハイブリダイゼーション混合物で置き換える。プラスチックカートリッジの隔壁をテープで覆い、カートリッジを45℃のオーブンに、ガラス前面を下に向けておく。ハイブリダイゼーションを16から18時間続ける。
ハイブリダイゼーション混合物をプローブアレイから除き、マイクロ遠心管に取っておく。280μl 1X MESハイブリダイゼーション緩衝液をチャンバーに添加し、流体工学的洗浄をGeneChip Fluidics Station 400上で、6X SSPE−T緩衝液を使用して行う。
300ml 20X SSPE(BioWhittaker, P/N 16-010Y)
699ml 水
0.2μmフィルターを通して濾過。1ml 10% Triton X-100添加。
流体工学的洗浄後、SSPE−T緩衝液をチャンバーから除き、泡を避けながらストリンジェント緩衝液に置き換える。
マイクロアレイカートリッジを上に向けて45℃インキュベーションオーブン中に30分重ねる。ストリンジェント緩衝液を除去し、アレイを200μl 1X MESハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。1X MESハイブリダイゼーション緩衝液を完全に除去し、アレイチャンバーをSAPE着色剤で満たし、37℃で15分インキュベートする。
マイクロアレイをAffymetrix GeneArray(登録商標)スキャナーでスキャンする。生データセットを、生のデータセットは、200の目標強度に対して各チップの全プローブセットの75%分位に縮小するとにより標準化する。
統計学的解析をS-Plus(Insightful, Inc., USA)およびGeneSpring 5.0.3R(Silicon Genetics, USA)で行う。
一つの実験において、ARまたはCR群において2およびP値<0.001(パラメトリック検定、分散は等しくない)以上の平均発現変化を示す遺伝子を選択する。この最初のフィルターにより1434遺伝子のリストができる。このリストから、下記遺伝子を、対照、ARおよびCR群を区別する能力、急性または慢性拒絶反応の組織学的徴候との相関、および末梢体液での検出の能力を基に選択する。
Claims (15)
- 移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
a)基線値として、拒絶反応を発症しないことが既知の移植対象の特定の組織サンプルにおける、少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを取り;
b)移植後患者から得たa)と同じ組織タイプの組織サンプルにおいて、a)で同定した少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し;そして
c)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測であり、該遺伝子は表1、2または3に定義の通りである)
ことを含む、方法。 - 移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
a)少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを、ドナーから得た組織サンプルにおいて移植の日に検出し;
b)移植後患者から得た組織サンプルにおいて、a)で同定した少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
c)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測であり、該遺伝子は表1、2または3に定義の通りである)
ことを含む、方法。 - リスクにある対象における移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
a)移植対象から、拒絶反応阻害剤の投与前に投与前サンプルを得て、
b)投与前サンプルにおける少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
c)移植患者から1個またはそれ以上の投与後サンプルを得て、
d)投与後サンプル(複数もある)における少なくとも1個の遺伝子に対応するmRNA発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
e)投与前サンプルのmRNAの発現または少なくとも1個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルと、投与後サンプル(複数もある)におけるmRNAの発現または少なくとも1個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを比較し、そして
f)薬剤をそれに準じて調整する
(ここで、該遺伝子は表1、2または3に定義の通りである)
ことを含む、方法。 - 処置を必要とする対象における移植片拒絶反応を予防、阻止、低下または処置する方法であって、拒絶反応の少なくとも1個の症状が改善するように、表1、2または3に同定した1個もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調整する化合物を該対象に投与することを含む、方法。
- 移植片拒絶反応の予防、阻害、低下または処置に使用するための薬剤を同定する方法であって、表1、2または3に同定した1個もしくはそれ以上の遺伝子のmRNA発現または遺伝子産物のレベルをモニタリングすることを含む、方法。
- 移植対象が腎臓移植対象である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子発現の発現レベルを、遺伝子発現産物に対応するタンパク質の存在の検出により評価する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- タンパク質の存在を、該タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項7記載の方法。
- 1個またはそれ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCRおよび実時間定量的PCRから成る群から選択される技術により検出する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 一組の遺伝子のmRNA発現レベルを検出する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 移植片拒絶反応のバイオマーカーとしての、表1、2または3に列記の遺伝子または該遺伝子の発現産物の使用。
- 対象における移植片拒絶反応の予防または処置用医薬の製造のための、表1、2または3に列記の1個またはそれ以上の遺伝子、またはその発現産物の合成、発現または活性を調整する化合物の使用。
- 移植片拒絶反応が慢性移植片拒絶反応であり、かつ遺伝子が表2に定義の通りである、請求項1から12のいずれかに記載の方法または使用。
- 移植片拒絶反応が急性移植片拒絶反応であり、かつ遺伝子がインドルアミンデオキシゲナーゼである、請求項1から13のいずれかに記載の方法または使用。
- 組織サンプルが体液である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
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