JP2007517775A - 血管内皮細胞増殖インヒビターであるｖｅｇｉ−１９２ａを使用して、癌を処置するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌を処置するための方法を特徴とする。本発明はまた、癌を処置するための組成物を特徴とする。これらの方法および組成物は、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与することによる。本発明はまた、癌を処置するためのキットを提供する。そのキットは、ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドと、癌を処置するためにそのＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与するための指示と、を備える。いくつかの実施形態において、その癌は、肺癌である。またはいくつかの実施形態において、その癌は、乳癌である。

Description

（関連出願の援用）
本願は、２００３年１２月１１日に出願した米国仮特許出願番号６０／５２９，１７３および２００４年１月１３日に出願した米国仮特許出願番号６０／５３６，６５３の優先権の利益を要求し、これらの米国仮特許出願は、その全体は参考として援用される。

（連邦政府により後援を受けている研究または開発に関する陳述）
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金ＮＩＨ−ＨＬ０６０６６０およびＮＩＨ−ＣＡ１０２１８１のもと、米国政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。

（発明の分野）
本発明は、血管内皮細胞増殖インヒビターであるＶＥＧＩ−１９２Ａを使用して、癌を処置するための方法に関連する。

（発明の背景）
血管内皮細胞増殖インヒビター（ＶＥＧＩ）は、内皮細胞特異的な遺伝子産物である。ヒトＶＥＧＩについて４つのアイソフォームが報告されている。発見されたＶＥＧＩの最初の形態は、長さが１７４アミノ酸である；１９２アミノ酸残基の２つの異なる形態および２５１アミノ酸残基の１つの形態が、遅れて発見された。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２を参照のこと。全てのアイソフォームは、共通の遺伝子から生じるスプライシング改変体である。この４つのアイソフォームは、これらのＮ末端領域において異なるが、このタンパク質の残りをコードする１５１アミノ酸の同一コアを共有する。

その４つのアイソフォームの配列比較は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーとのタンパク質と２０〜３０％の同一性を共有することを示唆する。これらの種々のアイソフォームの役割は、明確には示されていなかった。その役割は、明らかに難解かつ複雑であり、この分子の膜結合形態および分泌形態の両方が報告されている。これまでに報告された証拠はすべて、ＶＥＧＩ−１７４の分泌形態が腫瘍細胞の増殖を阻害してアポトーシスを開始することを指摘するようである。ＶＥＧＩ−１７４についての疎水性プロファイリングは、ＶＥＧＩ−１７４が、細胞外ドメインを構成するアミノ酸２９〜１７４を有する代表的なＩＩ型膜貫通型タンパク質であることを示す。全長ＶＥＧＩ−１７４は、癌細胞において過剰発現された場合に腫瘍増殖に対して何の効果も有さず、また内皮細胞中トランスフェクトされた場合でもこれらの内皮細胞を阻害しない。非特許文献２；非特許文献３を参照のこと。ＴＮＦファミリーのいくつかのメンバー（例えば、ＴＮＦおよびＦａｓリガンド）は、膜から切断されて可溶性タンパク質として機能することが、示されている。非特許文献４；非特許文献５を参照のこと。このことはまだ、ＶＥＧＩ−１７４について証明されていない。それにもかかわらず、ＶＥＧＩ−１７４の細胞外ドメインと、分泌タンパク質に由来する分泌シグナルペプチドとのみを含む、このＶＥＧＩ−１７４の人工的な組換え分泌形態は、癌細胞において過剰発現された場合に腫瘍増殖を阻害した。非特許文献１；特許文献３を参照のこと。ＶＥＧＩ−２５１（最も豊富なアイソフォーム）は、推定上の分泌シグナルペプチドを有する。ＶＥＧＩ−２５１の過剰発現は、内皮細胞のアポトーシスおよび増殖阻害を引き起こす。特許文献１；特許文献２。同様に、ＶＥＧＩの全形態により共有される、１５１アミノ酸のコア配列を含む組換えＶＥＧＩは、低い効力ではあるが、アポトーシスを開始して腫瘍細胞の増殖を妨害することが示された。非特許文献６を参照のこと。組換え生成されリフォールディングされたＶＥＧＩ−１９２Ａは、インビトロでウシ成体大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の増殖を阻害したことが報告された。特許文献１；特許文献２。タンパク質をリフォールディングするための方法は、特許文献４において報告された。

本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、これらの全体が本明細書により参考として援用される。この背景の節における刊行物に対する言及は、その刊行物が、本発明に対する先行技術を構成することの承認ではないことが、注意されるべきである。
国際公開０３／０３９４９１号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／０１７０２４２号明細書 米国特許出願公開第２００２／０１１１３２５号明細書 米国特許第６，５８３，２６８号明細書 Ｚｈａｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８２：１３１−１３６ Ｚｈａｉら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９９）１３：１８１−１８９ Ｃｈｅｗら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．（２００２）１６：７４２−７４４ Ｂｊｏｒｎｂｅｒｇら，Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）４２：４１８−４２４ Ｋａｙａｇａｋｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１８２：１７７７−８３ Ｗａｎｇ，ら，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（２０００）３２（５）：４８５−４８９

（発明の簡潔な要旨）
本発明は、組換え生成されたＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質が、癌（例えば、肺癌および乳癌）を処置することにおいて効果的であるという発見に基づく。

１つの局面において、本発明は、個体において癌を処置する方法であり、この方法は、この個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この癌は、肺癌または乳癌である。

別の局面において、本発明は、個体において腫瘍の増殖を阻害する方法であり、この方法は、この個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドをこの個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この癌は、肺癌または乳癌である。

別の局面において、本発明は、個体における癌の進行を遅延させる方法であり、この方法は、この個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドをこの個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この癌は、肺癌または乳癌である。

別の局面において、本発明は、癌に罹患した個体における転移の発生を遅延させる方法であり、この方法は、この個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドをこの個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この癌は、肺癌または乳癌である。

別の局面において、この処置される癌は、進行型である。いくつかの実施形態において、この進行癌は、肺癌または乳癌である。

別の局面において、本発明は、ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチド（いくつかの実施形態において、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチド）と、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、薬学的組成物である。

別の局面において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、このキットは、容器、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせたＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを含む組成物、および本明細書に記載の方法のいずれかにおいてこの組成物を使用するための指示、を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、このＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａである。いくつかの実施形態において、このＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、この個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、この個体はヒトである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、治療上有効な量のＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質の投与が、末期（進行型）癌（例えば、肺癌および乳癌）を含む癌を処置するために使用され得るという発見に基づく。
（Ｉ．一般的な技術）
本発明の実施は、そうではないと示されない限りは、当業者の範囲内にある、分子生物学（組換え技術が挙げられる）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学についての従来の技術を使用する。このような技術は、文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編，１９９３−８）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９））；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３））において十分に説明されている。

（ＩＩ．定義）
薬物または薬学的組成物の「有効量」とは、有益な結果もしくは望ましい結果をもたらすために充分な量である。そのような結果としては、臨床上の結果、例えば、（例えば、乳癌または肺癌といった癌の状況において）腫瘍の大きさを減縮させること、癌性細胞の増殖の遅滞、その疾患に起因する１つ以上の症状を減少させること、その疾患に罹患している患者の生活の質を向上させること、その疾患を処置するために必要とされる他の薬物の用量を減少させること、標的化を介するなどして別の薬物の効果を増強させること、その疾患の進行を遅延させること、および／または個体の生存を延長することが挙げられる。有効量は、１回以上の投与により、投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、直接的または間接的に、癌性細胞の増殖を低減させる（または、癌性細胞を破壊する）ため、ならびに癌性細胞の転移の発生もしくは癌性細胞の増殖を低減および／または遅延させるために、充分な量である。癌の臨床的状況において理解されているように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成され得るし、または達成されないかもしれない。それゆえ、「有効量」は、１つ以上の治療剤を投与する状況において考慮され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るかまたは達成される場合には、有効量で与えられるとみなされ得る。

本明細書で使用される場合、「と併せて（と組み合わせて）」とは、１種の処置様式を、ＶＥＧＩ−１９２Ａおよび他の抗癌薬物の投与などの別の処置様式にさらに、投与することを指す。従って、「と併せて（と組み合わせて）」とは、１種の処置様式を、個体に他の処置様式を投与する前に、その投与中、またはその投与後に、投与することを指す。

本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」とは、有益な結果または望ましい結果（好ましくは、臨床上の結果）を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益な臨床上の結果または望ましい臨床上の結果としては、癌性細胞の増殖を低減する（または、癌性細胞を破壊する）こと、癌において見られる癌性細胞の転移を低減すること、その腫瘍の大きさを減縮させること、その疾患に起因する１つ以上の症状を減少させること、その疾患に罹患している患者の生活の質を向上させること、その疾患を処置するために必要とされる他の薬物の用量を減少させること、その疾患の進行を遅延させること、および／または個体の生存を延長すること、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「転移の発生を遅延させること」は、転移の発生を、遅らせること、妨害すること、遅延させること、遅滞させること、安定させること、および／または延期させることを意味する。この遅延は、処置される癌および／または個体の病歴に応じて、種々の時間の長さであり得る。当業者にとって明白であるように、十分な遅延または有意な遅延は、実際には、その個体がその転移を発生しないという点で、予防を包含する。

「個体」とは、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜、競技用動物、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「薬剤」とは、生物学的化合物、薬学的化合物、または化学的化合物を指す。限定しない例としては、単純であるかもしくは複雑である有機分子または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントが挙げられる。様々な化合物（例えば、低分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物）が合成され得る。さらに、様々な天然の供給源（例えば、植物抽出物または動物抽出物など）が、スクリーニングのための化合物を提供し得る。

本明細書で使用される場合、「治療剤」とは、治療（本明細書では、一般的に、癌の状況における治療）のために有用であるあらゆる薬剤（抗腫瘍薬物、毒物または細胞毒、細胞毒因子、および放射性薬剤が挙げられる）を意味する。

本明細書で使用される場合、そうではないと示されない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の言及物を包含することが、注意されるべきである。

（ＩＩＩ．治療目的のためにＶＥＧＩ−１９２Ａを使用する方法）
本発明は、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａを個体に投与することにより、その個体において癌を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、その癌は肺癌または乳癌である。

本発明はまた、個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａをその個体に投与することにより、その個体において腫瘍増殖（例えば、肺癌または乳癌）を阻害するための方法も提供する。

本発明はまた、個体に対して有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａをその個体に投与することにより、その個体において癌（例えば、肺癌または乳癌）の進行を遅延させる方法も提供する。

本発明はまた、癌（例えば、肺癌または乳癌）に罹患した個体における転移の発生を、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａをその個体に投与することにより遅延させる方法も提供する。

本発明はまた、癌（例えば、肺癌または乳癌）に罹患した個体における血管内皮細胞の成長および／または増殖を、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａをその個体に投与することにより阻害する方法も提供する。本発明はまた、癌（例えば、肺癌または乳癌）に罹患した個体における新血管形成を、有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａをその個体に投与することにより阻害する方法も提供する。

処置される癌は、進行型であり得る。いくつかの実施形態において、この進行癌は、肺癌または乳癌である。

種々のＶＥＧＩ−１９２Ａ処方物が、投与のために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＩ−１９２Ａは、そのまま投与され得る。他の実施形態において、ＶＥＧＩ−１９２Ａおよび薬学的に受容可能な賦形剤が、投与され、そして様々な処方物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤は、当該分野において公知である。薬学的に受容可能な賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態または粘度を与え得、あるいは希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、容量オスモル濃度を変化させるための塩、被包剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経口薬物送達および経口薬物送達のための賦形剤および処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において示されている。

一般的に、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、筋内注射など）による投与のために処方されるが、他の投与形態（例えば、経口投与、粘膜投与など）もまた、使用され得る。投与は、全身投与（例えば、静脈内投与および腹腔内投与）であっても、限局的投与であってもよい。ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、部位特異的送達技術または標的化局所送達技術を介して投与される。部位特異的送達技術または標的化局所送達技術の例としては、様々な移植可能なＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質蓄積源もしくは局所送達カテーテル（例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、または針状カテーテル）、合成移植物、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の移植可能なデバイス、部位特異的キャリア、直接注射、または直接塗布が挙げられる。例えば、ＰＣＴ国際公開第００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。したがって、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、好ましくは、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液など）と組み合わされる。

特定の投薬レジメン（すなわち、用量、時期および反復）は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。一般的に、以下の用量のいずれかが使用され得る：少なくとも約５０ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約２０ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約５ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約１ｍｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約５００μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約２５０μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約５０μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの用量；少なくとも約１μｇ／体重ｋｇの用量、あるいはそれ以上が投与される。経験的な考慮事項（例えば、半減期）は、一般的に投与量の決定に寄与する。

いくつかの個体においては、１回以上の投与が必要とされ得る。投与頻度は、治療の経過にわたって決定および調整され得る。投与頻度は、癌性細胞の個数を減少させること、癌性細胞の退縮を維持すること、癌性細胞の成長および／または増殖を低減すること、あるいは転移の発生を遅延させることに基づく。癌性細胞の存在は、当業者にとって公知であるかまたは本明細書で考察される、多くの方法（例えば、免疫組織化学による検出、または生検材料もしくは生物学的サンプルのフローサイトメトリーによる検出）により同定され得る。いくつかの場合において、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質の連続徐放性処方物が、適切であり得る。持続的放出を達成するための様々な処方物および装置が、当該分野において公知である。

一つの実施形態において、ＶＥＧＩ−１９２Ａについての投与量は、１回以上の投与を与えた個体において経験的に決定され得る。個体は、ＶＥＧＩ−１９２Ａの追加の用量を与えられる。ＶＥＧＩ−１９２Ａの効力を評価するために、特定の癌疾患の状態についてのマーカーが、モニターされ得る。これらのマーカーとしては、触診または視覚での観察による腫瘍の大きさの直接測定；Ｘ線技術または他の画像化技術による腫瘍の大きさの間接測定；直接腫瘍生検および腫瘍サンプルの顕微鏡検査により評価される改善；間接的腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ）の測定、痛みもしくは麻痺の低減；発語、視覚、呼吸、または癌に関連した他の障害の改善；食欲増加；あるいは、一般に認められた試験または生存の延長により測定されるような、生活の質の増強が挙げられる。その投与量が、その個体、癌の型、癌の病期、その癌がその個体中の他の部位へ転移を始めたかどうか、ならびに使用された過去の処置および同時に行っている処置に依存して変動することは、当業者にとって明白である。

他の処方物としては、当該分野において公知である適切な送達形態（例えば、リポソームのようなキャリアが挙げられるが、これに限定されない）が挙げられる。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照のこと。リポソーム調製物として、サイトフェクチン、多重膜リポソームおよび単膜リポソームが挙げられるが、これらに限定されない。

ＶＥＧＩ−１９２Ａは、他の癌治療（例えば、放射線治療または化学療法剤）と併せて、使用され得る。ＶＥＧＩ−１９２Ａは、他の癌治療剤（例えば、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））と併せて、投与され得る。

疾患の評価は、当該分野において標準的な方法（例えば、画像化方法および適切なマーカーのモニタリング）を使用して、実施される。

（ＩＶ．組成物およびこの組成物を作製するための方法）
本発明の方法において使用される組成物は、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、このＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、組換え生成される。いくつかの実施形態において、このＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉから組換え生成され、そして精製される。この組成物は、ＶＥＧＩ−１９２Ａおよび１つ以上の他の抗癌剤を含み得ることが、理解される。

ＶＥＧＩ−１９２Ａ（ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質とＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドとで互換可能に使用される）としては、天然に存在する任意の種（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物由来の全長）、生物学的に活性なペプチドフラグメント（例えば、国際公開第０３／０３９４９１号および米国特許出願公開第２００３／０１７２４２号において記載されるＶＥＧＩ−１９２Ａフラグメント、ならびに配列番号１のアミノ酸２６を含むＮ末端短縮型ＶＥＧＩ−１９２Ａフラグメント）、ならびに天然に存在する改変体および天然に存在しない改変体（例えば、生物学的特性に有意には影響しない機能的に同等な改変体、および増大した活性または低下した活性（例えば、内皮細胞の増殖を阻害すること）を有する改変体）が挙げられる。

ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａのヌクレオチド配列およびヒトＶＥＧＩ−１９２Ａのアミノ酸配列は、ＰＣＴ国際公開第０３／０３９４９１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２４２号において記載され、ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａのアミノ酸配列はまた、表１（配列番号１）においても示されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、表１に示される配列番号１のアミノ酸配列を含む。ＶＥＧＩ−１９２Ａの実施形態は、融合タンパク質（Ｎ末端融合物またはＣ末端融合物）（例えば、表２に示されるＮ末端融合タンパク質）を含む。ＶＥＧＩ−１９２Ａは、いかなる種（例えば、ヒト）由来でもあり得る。

（表１．ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａのアミノ酸配列）

本発明は、ＶＥＧＩ−１９２Ａの機能的に同等な改変体を使用する方法を包含する。本発明のＶＥＧＩ−１９２ＡおよびＶＥＧＩ−１９２Ａの機能的に同等な改変体は、次の判定基準のうちのいずれか（１つ以上）により同定され特徴付けられる：（ａ）内皮細胞の成長および／または増殖を阻害する能力；ｂ）内皮細胞の死を誘導する能力；ｂ）新血管形成を阻害する能力；ｃ）腫瘍（例えば、乳癌および肺癌）の増殖を阻害する能力；ｄ）宿主の免疫系を活性化する能力（例えば、１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５およびＩＰ−１０）の産生を誘導する能力）。ＶＥＧＩ−１９２Ａの改変体の生物学的な活性は、当該分野において公知である方法および実施例２〜５に記載の方法を使用して、試験され得る。いくつかの実施形態において、機能的に同等な改変体は、上記の（または当該分野において公知である）生物学的アッセイのうちの１つ以上に関して全長ネイティブＶＥＧＩ−１９２Ａと比較した場合に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の活性のいずれかを有する。いくつかの実施形態において、機能的に同等な改変体は、インビトロで血管内皮細胞の増殖を阻害すること（例えば、実施例２に記載のアッセイ）において、１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、または６ｎｇ／ｍｌのうちのいずれかの、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のいずれかのＩＣ_５０を有する。

本発明のＶＥＧＩ−１９２Ａの改変体としては、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（例えば、配列番号１）と、少なくとも約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、または約９９％同一のいずれかであるポリペプチドが挙げられ得る。

２つのポリペプチド配列は、下記のように最大一致を求めて整列させた場合にその２つのポリペプチド配列中のアミノ酸の配列が同一である場合に、「同一である」と言われる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウィンドウにわたってそれらの配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定および比較することによって、実施される。本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、ある配列が、同数の連続位置である参照配列と、その２つの配列が最適に整列された後に比較され得る、少なくとも約２０個連続する位置、通常は３０個〜約７５個連続する位置、４０個〜約５０個連続する位置の部分を指す。

比較のための配列の最適なアライメントは、生命情報科学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用し、デフォルトパラメーターを使用して行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されたいくつかのアライメントスキームを実現する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ 第５巻，増補３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６−６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．，１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。

好ましくは、「配列同一性の割合」は、最適に整列された２つの配列を、少なくとも２０の位置についての比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、ここで、この２つの配列の最適な整列のため参照配列（付加も欠失も含まない）と比較された場合に、比較ウィンドウ中のそのポリペプチド配列の部分は、２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）、通常は５％〜１５％の付加または欠失、あるいは１０％〜１２％の付加または欠失を含み得る。この割合は、同一のアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置数を決定して一致した位置の数を得ること、この一致した位置数をその参照配列中の位置の総数（すなわち、そのウィンドウの大きさ）で割ること、そして、この結果に１００をかけて配列同一性の割合を得ることよって、計算される。

本発明のＶＥＧＩ−１９２Ａの改変体は、そのタンパク質の活性を有意には変化させない１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加を含み得る。改変体は、自然変異由来であっても、人間の操作由来であってもよい。変化は、例えば、そのタンパク質のフォールディングにも活性にも有意には影響しない、微細な性質（例えば、保存的アミノ酸置換）であり得る。ＶＥＧＩポリペプチドの特性を改善または変更するために、タンパク質工学が使用され得る。当業者にとって公知である組換えＤＮＡ技術は、新規な変異タンパク質または改変体（例えば、単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加または融合タンパク質）を創出するために、使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、少なくとも特定の精製条件下および特定の貯蔵条件下において、対応する天然ポリペプチドよりも高い収率で精製され得、かつより優れた溶解度を示し得る。それゆえ、本発明はまた、選択された宿主細胞における発現、スケールアップなどによりよく適合されたＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを生成するように１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、もしくは置換された、ＶＥＧＩ−１９２Ａ誘導体およびＶＥＧＩ−１９２Ａアナログもまた包含する。

本発明の方法において使用されるＶＥＧＩ−１９２Ａの機能的に同等な改変体は、ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを含む融合タンパク質を包含する。生物学的に活性なＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、配列（例えば、免疫学的反応性を増強する配列、支持体もしくはキャリアへのこのポリペプチドの結合を促進する配列、またはリフォールディングおよび／もしくは精製を促進する配列（例えば、エピトープ（例えば、Ｍｙｃ、インフルエンザウイルス血球凝集素由来ＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧ、または表２に示されるＨｉｓ−Ｔａｇ）をコードする配列））に融合させられ得る。これらの配列は、ＶＥＧＩ−１９２ＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で、ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドに融合させられ得る。さらに、このタンパク質またはこのポリヌクレオチドは、その機能を増強するかまたは細胞内での局在化を特定する他のポリペプチド（例えば、分泌配列）に融合させられ得る。上記の組換え融合タンパク質を生成するための方法は、当該分野において公知である。この組換え融合タンパク質は、当該分野において周知の方法により、生成、リフォールディング、および単離され得る。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質は、実施例に記載されるように調製され得る、ヒスチジン残基を含む融合ポリペプチドを使用した。いくつかの実施形態において、このヒスチジン融合タンパク質は、配列番号１を含む。

本明細書中に記載されるＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質実施形態のいずれも、ＶＥＧＩ−１７４、ＶＥＧＩ−２５１、ＶＥＧＩ−１９２Ｂを含まないことが理解される。米国特許出願公開第２００２０１１１３２５号；米国特許出願公開第２００３０１７０２４２号を参照のこと。

本発明において使用される組成物は、凍結乾燥処方物の形態または水溶液の形態において、薬学的に受容可能なキャリア、薬学的に受容可能な賦形剤、または薬学的に受容可能な安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ．）をさらに含み得る。受容可能なキャリア、受容可能な賦形剤、または受容可能な安定剤は、その投与量およびその濃度において、レシピエントにとって非毒性である。これらは、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸およびメチオニン）；保存薬（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類、および他の糖質（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストラン）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含み得る。薬学的に受容可能な賦形剤が、本明細書でさらに記載される。

ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質およびその組成物はまた、この薬剤の効果を増強および／または補完するように働く他の抗癌剤と併せて使用され得る。

ＶＥＧＩ−１９２Ａ（改変体も含む）は、当該分野において公知の方法を使用して生成（例えば、組換え生成）され得る。ＶＥＧＩ−１９２Ａおよび改変体は、米国特許第６，５８３，２６８号、同時係属中の出願（代理人整理番号５４４１１−２０００４．００；米国仮出願６０／５２８，９８３に対する優先権を主張する）に記載の方法および実施例に記載の方法に従って、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で発現され、リフォールディングされ、精製され得る。

（Ｖ．ＶＥＧＩ−１９２Ａを含む治療目的のためのキット）
本発明はまた、本方法における使用のためのキットを提供する。本発明のキットは、精製ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質を含む１つ以上の容器、および本明細書に記載される発明の方法のいずれかに従って使用するための指示を含む。一般的に、この指示は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って、癌（例えば、肺癌および乳癌）を処置するためのＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質の投与についての説明を含む。このキットは、個体が癌を保有しているかどうかおよびその癌の病期を同定することに基いて、処置に適した個体を選択することの説明をさらに含む。

ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質の使用に関するこの指示は、一般的に、意図された処置のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路についての情報を含む。上記の容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）、またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットに供給される指示は、代表的に、ラベルまたは包装挿入物（例えば、このキットに含まれる紙のシート）上の文書での指示であるが、機械で読み取り可能な指示（例えば、磁気保存ディスクまたは光保存ディスクに保有される指示）もまた、許容可能である。

ラベルまたは包装挿入物とは、この組成物が癌（例えば、転移性癌）を処置するために使用されること、を示す。指示は、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するために提供され得る。

本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装として、バイアル、ボトル、びん、柔軟な包装物（例えば、封をされたマイラー（Ｍｙｌａｒ）製の袋またはプラスティック製の袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。特殊なデバイスと組み合わせて使用するための包装（例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、噴霧器）または注入デバイス（例えば、小型ポンプ））もまた、企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針により貫通可能な栓を有する、静脈内溶液用の袋またはバイアルであり得る）。この容器はまた、無菌のアクセスポートも有し得る（例えば、この容器は、皮下注射針により貫通可能な栓を有する、静脈内溶液用の袋またはバイアルであり得る）。上記組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質である。この容器は、別の薬学的活性薬剤をさらに含み得る。

キットは、さらなる構成要素（例えば、緩衝液および解釈できる情報）を必要に応じて提供する。通常、このキットは、容器、およびこの容器に接触しているラベルまたは包装挿入物、あるいはこの容器に付随したラベルまたは包装挿入物を含む。

いくつかの実施形態において、本発明は、上記のキットの中身を含む製品を提供する。いくつかの実施形態において、このキットは、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質を、癌（例えば、肺癌および乳癌）を処置するための使用を指示する情報とともに含む。いくつかの実施形態において、このキットは、ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質および別の抗癌剤を、互いに組み合わせて癌（例えば、肺癌および乳癌）を処置するための使用を指示する情報とともに含む。

（実施例１：組換えＶＥＧＩ−１９２Ａのリフォールディングおよび精製）
（ベクターの構築およびベクターの発現）：表１に示したヒトＶＥＧＩ−１９２ＡをコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ増幅により作製した。そのＰＣＲ産物を、ｐＥＴ−１９ｂ（カタログ番号６９６７７−３，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＮｄｅ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ部位に挿入し、Ｎ末端融合タグ付きＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質（表２）を作製した。ＰＣＲ、連結反応、およびＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１ ＤＥ３株への形質転換の後、シングルのコロニーを選択し、増幅させた。それから最終的に、ＤＮＡ配列の正確さを確実にするために、その構築物を配列決定した。Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ付きＶＥＧＩ−１９２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表２に示す。

（表２．Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ付きＶＥＧＩ−１９２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）

ＶＥＧＩ−１９２Ａタンパク質を生成するために、ＶＥＧＩ−１９２Ａ発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１ ＤＥ３株へトランスフェクトし、アンピシリンを含むＺＢプレート上に播いた。シングルコロニーを選択し、１００ｍＬのアンピシリンを含むＺＢ培地（１０ｇ／ｌ ＮＺ ａｍｉｎｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）および５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）に接種するために使用した。そして３０℃で一晩（約１６時間）増殖させた。次に、その１００ｍＬのスターター培養のうちの２０ｍＬを、１Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種するために使用した。６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ_６００）が０．４〜０．６に達するまで、この培養を、振とうしながら３７℃でインキュベートした。次に、ＶＥＧＩ−１９２Ａの発現を誘導するために、０．５ｍＭになるまで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。そしてこの培養を、振とうしながら、さらに３時間インキュベートした。大スケールでの発現を、３７℃で、複数の１Ｌ振とうフラスコを利用して達成した。

（リフォールディング前の封入体の処理）：封入体を細菌から収集した。遠心分離により、細菌細胞を収集し、次に１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（登録商標）を含む２０ｍＬのＴＮ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０）中に再懸濁した。１０ミリグラムのリゾチーム（ｌｙｓｏｓｙｍｅ）を添加し、その細胞懸濁物を、−２０℃で一晩凍結させた。次に、この細胞溶解物を融解し、２０μＬの１Ｍ 硫酸マグネシウムおよび１００μｇのＤＮａｓｅを添加した。遊離した細菌性ＤＮＡが完全に溶解するまで、この細胞を、撹拌しながらインキュベートした。それから、この溶解物を、１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（登録商標）を含む２５０ｍＬのＴＮを用いて希釈し、この混合物を２〜４時間撹拌した。封入体を、遠心分離により収集し、（再懸濁および遠心分離により）３回洗浄した。

（リフォールディング、および、リフォールディングしたタンパク質のクロマトグラフィー単離）：この洗浄した封入体を、８Ｍ 尿素、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ グリシン、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１Ｍ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．１ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、ｐＨ １０．５中に溶解させた。このタンパク質溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）を、２．０に調整した。この溶液を、超遠心分離（３０分×６６，０００ｇ）により清澄にし、それからリフォールディングさせた。

清澄化した溶液を、迅速に、２０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．３６ｍＭ ラウロイルサルコシンナトリウム、０．００９ｍＭ トリメチルアミンＮ−オキシド二水和物、０．００５ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ｐＨ １０．５中に希釈した。生じた溶液を、１Ｍ ＨＣｌを用いて、４日間にわたり段階的にｐＨ ８．０に調整した。

リフォールディングさせたタンパク質を、限外ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ，１０，０００Ｄａカットオフメンブレン）により濃縮し、平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムに適用した。そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ 尿素、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ８で溶出させた（図１）。図１Ａ由来の画分をプールし（１、２，３と示した）、実施例２〜４に記載した、内皮細胞阻止アッセイおよび動物腫瘍モデル試験のために、約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した（図１Ｂに示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。

機能的なＶＥＧＩ−１９２Ａもまた、Ｎｉ^＋−アフィニティカラムを使用して、精製した。Ｎｉ^＋−キレート化カラム（５００ｍｌ）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．３６ｍＭ ラウロイルサルコシンナトリウム、０．４Ｍ 尿素、ｐＨ ８を使って、平衡化した。リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２Ａ（４Ｌ）を、そのカラムに適用した。そのカラムを１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ 尿素、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８（緩衝液Ａ）で洗浄した。緩衝液Ａ中のイミダゾールの線形勾配（５〜５００ｍＭ）により、ＶＥＧＩ−１９２Ａをそのカラムから溶出させた。図２Ａに示す溶出ピークをプールし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ 尿素、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ８に対して透析した。次に、透析したＶＥＧＩ−１９２Ａを、限外ろ過により約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。生成したＶＥＧＩ−１９２Ａについての、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２Ｂに示す。

別の実験において、可溶化したＶＥＧＩ−１９２Ａを含む清澄化した溶液を、２０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０３４ｍＭ ラウロイルサルコシンナトリウム、０．００９ｍＭ トリメチルアミンＮ−オキシド二水和物、０．００５ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ｐＨ １０．５中に、迅速に希釈することにより、リフォールディングプロセスを実行した。生じた溶液を、１Ｍ ＨＣｌを用いて、４日間にわたり段階的にｐＨ ８．０に調整した。リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２Ａを、上記と同じ方法で濃縮および精製した。実施例２に記載の内皮細胞阻止アッセイにより測定すると、このリフォールディング緩衝液を使用した精製ＶＥＧＩ−１９２Ａの活性は、上記のリフォールディング状態に比べ、１／１００であった。

（実施例２：内皮細胞増殖阻止アッセイによる、組換えＶＥＧＩ−１９２Ａの生物学的活性についての特徴付け）
ウシ成体の大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２で、ＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢｉｏＦｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％ ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中で培養した。この細胞の休止の程度を、^３Ｈ−チミジン取り込みにより、決定した。細胞の５％以下しか^３Ｈ−チミジンを取り込まない場合、この細胞が細胞周期のＧ_０期において同調したとみなした。１０％ ＦＢＳおよび１ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子−２を含むＩＭＥＭ中で、Ｇ_０で同調した細胞を、ごくわずか（５０００細胞／ｃｍ^２）再播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートしたとき、この細胞が増殖の周期に再び入った。実施例１に記載のように調製したＶＥＧＩ−１９２Ａを、細胞を播く時か、または播いた後２０時間以内の、細胞が増殖の周期に入る時点のいずれかに、培養培地に添加した。単細胞懸濁物を、所定の時間間隔でそれぞれの培養ウェルから、トリプシン処理により調製した。各懸濁物中の細胞数を、クールター計数器を使用することにより、または、テトラゾリウム化合物−ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）−（生細胞により代謝され得、４９０ｎｍにおいて検出可能な青色の化合物を生成する；ＭＴＳの代謝の速度は、培養内の生細胞数に比例する）を利用した比色定量アッセイを使用することにより、決定した。このアッセイにおいて、利用したＶＥＧＩ−１９２Ａの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬに及んだ。

ＭＴＳによる比色定量アッセイを使用した、ＡＢＡＥ内皮細胞阻止アッセイにおいて、３つのプール全てに活性があり、プール３が最も活性があった（図１Ｃ）。図１Ｃに示すように、プール３中の組換えＶＥＧＩ−１９２Ａは、インビトロでの内皮細胞の増殖を阻止することにおいて、ＩＣ_５０ １２ｎｇ／ｍｌ（０．４９ｎＭ）を示した。別の実験において、生成した組換えＶＥＧＩ−１９２Ａは、インビトロでの内皮細胞の増殖を阻止することにおいて、ＩＣ_５０ ０．２４ｎＭ（６ｎｇ／ｍｌ）を示した。

（実施例３：ルイス肺癌の増殖の阻害、および、組換えＶＥＧＩ−１９２Ａによる、腫瘍を保有するマウスの生存期間の増強）
Ｃ５７Ｂ１６／Ｊマウスに、ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を、皮下に移植した。この癌細胞を、ＰＢＳで洗浄し、０．０５％ トリプシン溶液中に分散させ、再懸濁させた。８℃において４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、その濃度を２．５×１０^６細胞／ｍｌに調整した。次に、０．１ｍｌの癌細胞懸濁物を、マウスの側腹に、皮下注射した。腫瘍を、目盛りノギスを用いて測定し、腫瘍体積を、式：体積＝幅×幅×長さ×０．５２を使用して決定した。腫瘍体積が少なくとも１００〜２００ｍｍ^３（体重の０．５〜１％）になった（５〜７日以内に起こった）後、マウスを３つの群に無作為化した。２つの群のマウスに、ＰＢＳに懸濁した組換えヒトＶＥＧＩ−１９２Ａ（実施例１に記載のように調製した）を、５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで、週に２回、腹腔内（ＩＰ）注射か、または腫瘍内（ＩＴ）注射のいずれかにより、与えた。腫瘍が触知可能であるときか、または腫瘍体積が７００〜１０００ｍｍ^３に達したとき、ＩＰ注射またはＩＴ注射を開始した。第３の群に、ビヒクル（リン酸緩衝化生理食塩水）のみの比較可能な注射を与えた。コントロールの群の腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたとき、実験を終了し、マウスを屠殺および検死した。

腫瘍を保有する動物における腫瘍の増殖速度についての十分な阻害が、その腫瘍が触知可能であるときに、その腫瘍を保有する動物への腹腔内（ＩＰ）注射により組換えＶＥＧＩ−１９２Ａを送達した場合か、または腫瘍体積が７００〜１０００ｍｍ^３に達したときに、その腫瘍を保有する動物への腹腔内（ＩＰ）注射により組換えＶＥＧＩ−１９２Ａを送達した場合に、観察された。図３Ａに示すように、７００〜１０００ｍｍ^３の腫瘍体積を持つマウスへのＩＰ注射またはＩＴ注射による、５ｍｇ／Ｋｇの組換えＶＥＧＩ−１９２Ａの全身性送達は、腫瘍の増殖の明白な阻害を示した。腫瘍体積が、処置の開始時に体重の５％近く（７００〜１０００ｍｍ^３）である場合でさえ、腫瘍の増殖速度に５０％もの阻害が達成された。

この動物の体重の５％近く（７００〜１０００ｍｍ^３の腫瘍体積）に達した病期のＬＬＣ腫瘍は、臨床の場における末期のヒト肺癌に類似し得る。なぜなら、この病期のＬＬＣ腫瘍を保有する動物は、特に肺へ広範囲に広がった微小転移巣（一度、この原発性腫瘍を外科的に除去すると、巨大転移巣に成長する）をすでに発生させているからである。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，Ｃｅｌｌ ７９（２）：３１５−２８（１９９４）；Ｃａｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）：１０５５−６３（１９９８）を参照のこと。

腫瘍を保有するマウスの生存期間もまた試験した。生存期間を、ＬＬＣ細胞を移植した日と、腫瘍体積が３０００ｍｍ^３を超えた量に達した日、または、高侵襲性腫瘍が増殖するにつれての脊柱への腫瘍の浸潤に起因して動物が麻痺する状態になった日との間の日数によって、決定した。このルイス肺癌モデルにおける動物を、腫瘍体積が３０００ｍｍ^３を超えた量に達したとき、または、高侵襲性腫瘍が増殖するにつれての脊柱への腫瘍の浸潤に起因する動物が麻痺する状態になったとき、屠殺した。その時点での生存期間および生存動物数のプロット（図３Ｂ）から示されるように、生存期間のメジアン（処置時（未処置群についての腫瘍の平均の大きさが７００ｍｍ^３である１１日目に始めた）から開始した）は、約４日であった。一方、処置した群についての生存期間のメジアンは１２日間であり、３倍長い生存期間を示した。

別の実験において、ＬＬＣ細胞（１注射あたり１×１０^６）を、Ｃ５７ＢＬ／６黒色マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の側腹に皮下注射した。腫瘍が触知可能である早い時期に、処置を開始した（図９）。この動物を、５日目、９日目、および１２日目に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ投与により、処置した。コントロールの群を、ビヒクルで処置した。図９に示すように、ＶＥＧＩ処置した群について、有意により遅い腫瘍の増殖速度が観察された。

（実施例４：組換えＶＥＧＩ−１９２Ａによる、ヒト肺癌異種移植腫瘍の処置）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト肺癌を、雌の無胸腺ヌードマウスの乳房の脂肪パッドに注射した（１注射あたり１×１０^６細胞）。注射した癌細胞は、５〜７日以内に触知可能な腫瘍を形成した。この腫瘍体積（Ｖ）を、楕円形の体積についての等式Ｖ＝０．５２ＬＷ^２を使用することにより、決定した。一旦、腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達した後、実施例１に記載のように生成した組換えＶＥＧＩ−１９２Ａを、腫瘍部位への皮下（ＳＣ）注射により、この動物に送達した（５ｍｇ／Ｋｇ、週に２回）。このコントロール群を、代わりにビヒクル（ＰＢＳ）を使用した以外は同じ実験条件下で、処置した。一旦、腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超過した後、または、腫瘍重量が、体重の約１０％である２グラムより重くなった後、この動物を屠殺した。生物病理学分析のために、腫瘍、他の器官（肺、肝臓、脾臓）、および末梢血を収集した。

腫瘍血管系へのＶＥＧＩ−１９２Ａ処置の効果を分析するために、新鮮な凍結切片（コントロール群の動物由来のもの、および腫瘍部位へのＳＣ注射を与えた群の動物由来のもの）を、アポトーシス細胞を蛍光標識すること（図４のパネルＡおよびＣに示す）、またはＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）について免疫染色すること（図４のパネルＢおよびＤに示す）により分析した。パネルＡにおいて、未処置腫瘍は、ほとんどアポトーシス細胞を示さず、パネルＢにおいて、未処置腫瘍は、大量の微小血管を示した。相対的に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置した腫瘍（パネルＣ）は、腫瘍内部において、アポトーシス細胞および壊死領域について強力な蛍光標識を示した。パネルＤに示すように、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置した腫瘍は、顕著に低減した微小血管密度を示した。腫瘍組織における細胞死が観察された。

（実施例５：組換えＶＥＧＩ−１９２Ａの投与による、ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞取り込みの阻害）
ＬＬＣ細胞を、実施例３に記載のように調製し、Ｃ５７Ｂ１マウスの背部に接種した（１注射あたり１×１０^５細胞）。この動物を、ＬＬＣ細胞の接種（０日目）と同時に、５ｍｇ／ｋｇ ＶＥＧＩ−１９２Ａ（実施例１に記載のように調製した）の腹腔内（ＩＰ）注射により、処置した。腫瘍体積を、４日目に測定した。図５に示すように、腫瘍接種時での動物の処置は、腫瘍取り込み速度の顕著な阻害という結果をもたらした（ｔ検定、ｐ＜０．００２）。

別の実験（図１０に示す）において、ＬＬＣ細胞（１注射あたり１×１０^６）を、Ｃ５７ＢＬ／６黒色マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の側腹に接種した。この動物を、癌細胞接種直後に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ、実施例１に記載のように調製した）により処置した。４日目まで毎日、この処置を繰り返した。接種後５日目に腫瘍体積を評価したときに、ビヒクル処置した群における全ての動物は、３５ｍｍ^３の平均体積（＋／−標準偏差）の皮下腫瘍を発達させた（５匹中５匹、すなわち１００％）。一方で、ＶＥＧＩ処置した群の約半分が、測定可能な腫瘍を示し（６匹中２匹、すなわち３３％）、その腫瘍体積は、はるかに小さかった（図１０）。この結果は、ＶＥＧＩの全身投与が、癌細胞による腫瘍形成の遅滞を引き起こしたことを、示す。

（実施例６：組換えＶＥＧＩ−１９２Ａの投与による宿主の免疫系の活性化）
ＬＬＣ細胞を、実施例３に記載のように調製し、Ｃ５７Ｂ１マウスの背部に接種した（１注射あたり１×１０^５細胞）。ＶＥＧＩ−１９２Ａの投与を、この腫瘍が触知可能になった、４日目に開始した。ＶＥＧＩ−１９２Ａ（実施例１に記載のように調製した）を、４日目、７日目、８日目、９日目、および１０日目に５ｍｇ／ｋｇ注射した。１１日目に、脾臓を回収し、計量した。血清もまた１１日目に収集した。血清中のサイトカインレベルを、製品の指示に従って、抗体結合体化発光アッセイキット（ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ，ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を使用して、測定した。

ＶＥＧＩ−１９２Ａによる動物の処置は、有意に大きくなった脾臓（図６に示す）、および顕著に増強した数種のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−１５、およびＩＰ−１０）の産生（図７に示す）をもたらした。ＩＬ−１５およびＩＰ−１０は、様々なリンパ球の活性化および新血管形成の阻害に関与することが、公知である。

マウス血清における上記サイトカインのプロフィールを、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置に応答した培養ヒト内皮細胞と比較した。増殖中またはコンフルエントな（Ｇ_０で同調した）ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＩ−１９２Ａにより５時間処置した。処置後、処置した増殖中のＨＵＶＥＣおよびコンフルエントなＨＵＶＥＣ、ならびに処置しなかった増殖中のＨＵＶＥＣおよびコンフルエントなＨＵＶＥＣの両方についてのサイトカイン発現のプロフィールを、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから取得したｃＤＮＡマイクロアレイを使用して測定した。図７Ｂ由来のマウス血清におけるサイトカインのプロフィールを、ＶＥＧＩ−１９２Ａにより処置した、増殖中のＨＵＶＥＣおよびコンフルエントなＨＵＶＥＣの両方についてのサイトカインのプロフィールと比較した。図８に示すように、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置は、増殖中のＨＵＶＥＣおよびコンフルエントなＨＵＶＥＣの両方において、ＩＬ−１５発現およびＩＰ−１０発現を誘導した。これは、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置が、ヒトにおいてこれら２つのサイトカインの産生を増強し得ることを示唆した。

（実施例７：ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置後のＬＬＣ腫瘍保有マウスにおける、腫瘍血管系の免疫組織化学的分析）
本発明者らは、腫瘍血管の豊富さおよび構造に対する、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（実施例１に記載されるように調製した）によるＬＬＣ腫瘍保有マウスの全身処置の影響を決定した。ＬＬＣ細胞を、実施例３に記載のように調製し、Ｃ５７ＢＬ／６黒色マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の側腹に皮下接種した（１注射あたり１×１０^６細胞）。ＶＥＧＩ−１９２Ａまたはビヒクルの腹腔内投与を、４日目に開始した。３週間にわたり、週に２回、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ビヒクル処置群に、比較可能なリン酸緩衝化生理食塩水注射を与えた。免疫組織化学的分析を、下記のように実行した。腫瘍を取り出し、４℃で４時間、ＰＢＳ中に４％パラホルムアルデヒドを含む固定液の中へ置いた。それから、この腫瘍を、ＲＮａｓｅを含まないＰＢＳ中の３０％ショ糖（４℃）中へと移し、４℃で一晩置いた。次に、この腫瘍を、ドライアイス上のＯＣＴ化合物内に置いた。免疫染色の前に、切片（厚さ８μｍ）を、４５℃で２時間、スライドガラス上で乾燥させた。内皮細胞を、ＣＤ３１に対するラットモノクローナル抗体（ＰＥＣＡＭ−１；ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，クローン ＭＥＣ １３．３、１：２５０希釈，カタログ番号０１９５１Ｄ）により同定した。血管平滑筋細胞を、モノクローナル抗アクチン−α−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ，クローン１Ａ４、１：２５０希釈、カタログ番号Ｆ３７７７）により同定した。血管基底膜を、ＩＶ型コラーゲンに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０，０００希釈；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により同定した。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）により同定した。使用した二次抗体は、ビオチン化抗ラット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ．カタログ番号ＢＡ４００１）、ウサギ抗ラットＩｇＧ−ＴＲＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ，カタログＴ４２８０）、およびロバ抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ カタログ番号７１２−０９６−１５３）、ビオチン検出用ＡＭＣＡアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号Ａ−２００８）、ならびにヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＴＲＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｔ６７７８）であった。ＡＢＣ標準キットおよびＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、免疫組織化学のために使用した。この標本を、内因性ペルオキシダーゼ活性を妨害するため、室温で１５分間、０．０３％Ｈ_２Ｏ_２（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、それから、非特異的な抗体結合を妨害するため、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％ ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳとともにインキュベートした。次に、この標本を、ＰＢＳ中で１〜２μｇ／ｍｌに希釈した一次抗体とともに、室温で１時間かまたは４℃で１２〜１５時間インキュベートした。コントロール標本を、一次抗体をＰＢＳに置換した以外は同一の条件下で処理した。ＰＢＳを使ってすすいだ後、この標本を、二次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳを使ってすすいだ。次に、室温で３０分間、ＡＢＣ標準キットかまたはＡＭＣＡアビジンＤとともにインキュベートした。この標本を、ＰＢＳを使ってすすぎ、ＤＡＢキットとともにインキュベートした。それから、すすぎ、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で顕微鏡標本を作製した。

この標本を、シングル蛍光フィルター、二重蛍光フィルターおよび三重蛍光フィルター、ならびに低照度ＲＥＴＩＧＡ １３００Ｃ ＣＣＤ Ｃａｍｅｒａ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｒｎａｂｙ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）をＱｃａｐｔｕｒｅソフトウェアとともに装備した、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００蛍光顕微鏡により調べた。画像を、デジタルデータとして保存した。画像分析を、Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）またはＩｍａｇｅ−Ｊ（ＮＩＨ）を用いて実行した。

（腫瘍における内皮細胞の特異的な根絶）：新鮮な凍結腫瘍切片を作製し、内皮マーカーであるＣＤ３１（赤色）および平滑筋細胞抗原−α（ＳＭＡ−α）（緑色）についての免疫染色に供した（図１１Ａ、１１Ｂ）。それから、本発明者らは、コンピュータ支援型画像分析によって、最大の微小血管（「ホットスポット」）数を含む、それぞれのスライドガラス上の１５の視野を分析した。１つの視野（倍率４００×）あたりの赤色画素および緑色画素の密度を測定した（図１１Ｃ）。この結果（図１１に示される）は、腫瘍血管における内皮細胞の特異的な消失を示唆する。ＣＤ３１陽性細胞により占められた全画素として測定した内皮細胞の密度は、１週間の処置以内に８８％の減少を示し、３週間以内にさらなる減少を示した。興味深いことに、平滑筋細胞の数は、比較的変化しないままであった。結果として、内皮細胞 対 平滑筋細胞の比は、ＶＥＧＩ処置した腫瘍において顕著に減少し、この動物を１週間または３週間処置した後に、１．８から０．４に、および、１．８から０．１５に、それぞれ変化した。同様な免疫染色を、別の内皮細胞マーカー（ＣＤ１０５）について行い、同一の結果を得た。これらの結果は、ＶＥＧＩ−１９２Ａの抗血管形成活性が、腫瘍血管内皮細胞の特異的な根絶を引き起こしたことを示す。

（内皮細胞の消失後の腫瘍における平滑筋細胞の存続）：本発明者らは、内皮細胞が消失した後も、実験期間の間は平滑筋細胞が存続することを確認した（図１２）。腫瘍血管系のいくつかの管腔は、多少維持されているように見えた。これは、良好な平滑筋細胞の支持を持つ腫瘍血管は、その内皮細胞のほとんどがもはや存在しなくなった後で多少の残存機能を有し得るという可能性を高めた。

（ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置した腫瘍における残存血管構造の存在）：この残存血管構造を、さらに調べた。常に内皮細胞により覆われているビヒクル処置腫瘍中の血管の管腔（図１２Ａ）とは違って、赤血球を含むが内皮細胞に覆われていないＶＥＧＩ処置腫瘍において、空間が存在した（図１２Ｂ）。次に、これら空間が、内皮細胞が欠如した残存血管であるかどうかを決定した。これは、コラーゲンＩＶ（血管の基底膜の主要な成分）についての免疫染色により、達成した。図１２Ｃおよび１２Ｄに示すように、コントロール群のビヒクル処置腫瘍中の血管基底膜に関連する、容易に検出可能な内皮細胞（図１２Ｄ）と比較すると、腫瘍血管系の基礎構造は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置によって内皮細胞がほぼ完全に消失した場合でさえ、ほぼ無傷に維持されていた（図１２Ｃ）。これらの基底膜構造は、腫瘍が、ＶＥＧＩ−１９２Ａで処置されるか（図１２Ｅ）、または、ビヒクルで処置されるか（図１２Ｆ）に関わりなく、しばしば平滑筋細胞を伴った。これらの残存管の外見は、処置しなかった腫瘍において見られる管の外見と区別不能であり、唯一の相違点は、処置しなかった腫瘍における血管構造が内皮細胞を含むことである。これらの結果は、内皮細胞がこれらの腫瘍から取り除かれた後も、少なくとも実験期間を通して、基底膜および平滑筋細胞からなる残存血管構造が存在することを示す。

上記の発明は、明瞭にするためおよび理解するために、例示および実施例によって多少詳細に記載されているが、特定の変更および特定の改変が実施され得ることが、当業者にとって明らかである。それゆえ、説明および実施例は、添付の特許請求の範囲よって示される本発明の範囲を、限定しないものとして解釈されるべきである。

図１は、リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）の精製および内皮細胞（ＡＢＡＥ）増殖阻止アッセイを示す。図１Ａは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムのクロマトグラフィーを示す。このカラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍ 尿素、ｐＨ ８．０を使って平衡化し、流した。そのピークの頂点に関して、１、２、および３は、画分の３つのプールを表す。図１Ｂは、クロマトグラフィーの画分（図１Ａにおいて示されたプール１、２、および３）の非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１Ｃは、プール３についての内皮細胞増殖阻止アッセイを示し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１２ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）であることを示す。 図１は、リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）の精製および内皮細胞（ＡＢＡＥ）増殖阻止アッセイを示す。図１Ａは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムのクロマトグラフィーを示す。このカラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍ 尿素、ｐＨ ８．０を使って平衡化し、流した。そのピークの頂点に関して、１、２、および３は、画分の３つのプールを表す。図１Ｂは、クロマトグラフィーの画分（図１Ａにおいて示されたプール１、２、および３）の非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１Ｃは、プール３についての内皮細胞増殖阻止アッセイを示し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１２ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）であることを示す。 図１は、リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）の精製および内皮細胞（ＡＢＡＥ）増殖阻止アッセイを示す。図１Ａは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムのクロマトグラフィーを示す。このカラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍ 尿素、ｐＨ ８．０を使って平衡化し、流した。そのピークの頂点に関して、１、２、および３は、画分の３つのプールを表す。図１Ｂは、クロマトグラフィーの画分（図１Ａにおいて示されたプール１、２、および３）の非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１Ｃは、プール３についての内皮細胞増殖阻止アッセイを示し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１２ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）であることを示す。 図２は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）のアフィニティ精製を示す。図２Ａは、リフォールディングさせたＶＥＧＩ−１９２ＡのＮｉ＋アフィニティカラム精製を示す。矢印は、ＶＥＧＩ−１９２Ａのピークを示す。図２Ｂは、図２Ａ由来のプールされかつ透析されたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。１、非還元的；２、還元的。 図３Ａは、本実施例に記載のように調製されたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）の腹腔内（ＩＰ）注射または腫瘍内（ＩＴ）注射による、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺腫瘍の増殖の阻害を示す。図３Ｂは、ＶＥＧＩ−１９２Ａ注射後の、この腫瘍を保有するマウスの増加した生存期間を示す。 図３Ａは、本実施例に記載のように調製されたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）の腹腔内（ＩＰ）注射または腫瘍内（ＩＴ）注射による、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺腫瘍の増殖の阻害を示す。図３Ｂは、ＶＥＧＩ−１９２Ａ注射後の、この腫瘍を保有するマウスの増加した生存期間を示す。 図４は、本実施例に記載のように調製されたＶＥＧＩ−１９２Ａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）による腫瘍内注射後の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞により形成されたヒト乳癌異種移植腫瘍を保有するマウスにおける、増加したアポトーシス内皮細胞および微小血管密度の低減を示す。パネルＡ：アポトーシス細胞について蛍光標識された未処置腫瘍；パネルＢ：ＣＤ３１（内皮細胞マーカー）について免疫染色された未処置腫瘍；パネルＣ：アポトーシス細胞について蛍光標識されたＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された腫瘍；パネルＤ：ＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）について免疫染色されたＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された腫瘍。 図５は、ＶＥＧＩ−１９２Ａによる、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌（ＬＬＣ）取り込みの阻害を示す。ＬＬＣ細胞が、Ｃ５７Ｂ１マウスの背部に接種された。ＶＥＧＩ−１９２Ａ（５ｍｇ／Ｋｇ）は、ＬＬＣ細胞の接種と同一の日（０日目）の腹腔内注射（ＩＰ）である。ビヒクル処置およびＶＥＧＩ−１９２Ａ処置（このグラフ中において「ＶＥＧＩ」と呼ばれている）の両方についての腫瘍体積が、４日目に測定された。 図６は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置後の、ＬＬＣ接種されたマウスの脾臓の重量を示す。ＬＬＣ接種されたマウスは、４日目（この腫瘍が触知可能になるとき）、７日目、８日目、９日目、および１０日目に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ（５ｍｇ／Ｋｇ）により処置された。脾臓は、１１日目に回収され、秤量された。 図７Ａは、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置後のサイトカインについてのマウス血清プロフィールを示す。サイトカインの血清濃度は、ｐｇ／ｍｌにより表わされた。血清は、１１日目に収集された。サイトカインレベルは、抗体結合体化発光アッセイキット（ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ）を使用して、決定された。図７Ｂは、ビヒクル処置された動物と比較した場合の、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物における血清サイトカインレベルの変化倍分として表された、図７Ａのデータを示す。「実験」は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された群を指す。「コントロール」は、ビヒクル処置された群を指す。「^＊」は、統計上の差を示す（ｔ検定、α＝０．０５）。 図７Ａは、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置後のサイトカインについてのマウス血清プロフィールを示す。サイトカインの血清濃度は、ｐｇ／ｍｌにより表わされた。血清は、１１日目に収集された。サイトカインレベルは、抗体結合体化発光アッセイキット（ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ）を使用して、決定された。図７Ｂは、ビヒクル処置された動物と比較した場合の、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物における血清サイトカインレベルの変化倍分として表された、図７Ａのデータを示す。「実験」は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された群を指す。「コントロール」は、ビヒクル処置された群を指す。「^＊」は、統計上の差を示す（ｔ検定、α＝０．０５）。 図８は、マウス血清中におけるサイトカインのプロフィール（図７Ｂにおいて示されたデータ）と、増殖中のＨＵＶＥＣおよびコンフルエントな（Ｇ０同調された）ＨＵＶＥＣの両方についてのサイトカイン発現プロフィールとの比較を示す。増殖中のＨＵＶＥＣ細胞またはコンフルエントなＨＵＶＥＣ細胞は、５００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＩ−１９２Ａで処置された。ＨＵＶＥＣについてのサイトカイン発現プロフィールは、ｃＤＮＡマイクロアレイ（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから得た）を使用して決定された。 図９は、新規に移植されたＬＬＣ腫瘍の増殖についての阻害を示す。ＬＬＣ細胞（動物１匹あたりの１注射あたり１×１０^６）が、０日目に、Ｃ５７ＢＬ黒色マウスの側腹に接種された。組換えＶＥＧＩ−１９２Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）が、５日目、９日目、および１２日目に、腹腔内（ＩＰ）注射により与えられた。腫瘍体積が、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置の直前に測定された。「Ｒｘなし」は、ビヒクル処置された群を指す。「Ｒｘ ＶＥＧＩ ＩＰ」は、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された群を指す。ｔ検定、ｐ＜０．０５（処置された群 ｎ＝９、処置されなかった群 ｎ＝９）。 図１０は、ＬＬＣ腫瘍形成の阻害を示す。ＬＬＣ細胞（動物１匹あたりの１注射あたり１×１０^６）が、０日目に、Ｃ５７ＢＬ黒色マウスの側腹に接種された。この動物は、癌細胞の接種直後に、組換えＶＥＧＩ−１９２Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）（グラフ中で「ＶＥＧＩ」と呼ばれる）で処置された。この処置は、４日目まで毎日繰り返され、その腫瘍体積が、５日目に決定された。アスタリスク：ｔ検定、ｐ＜０．００２（処置されなかった群 ｎ＝５；処置された群 ｎ＝６）。 図１１は、ＬＬＣ腫瘍における、ＶＥＧＩ−１９２Ａによる内皮細胞の特異的な消失を示す。腫瘍が、この実験（３週間）の終了時に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物およびビヒクル処置されたコントロールから回収され、実施例７に記載されているように処理された。この腫瘍の切片が、蛍光免疫染色に供された。内皮細胞および平滑筋細胞が、それぞれ、特異的マーカーであるＣＤ３１（赤色）およびＳＭＡ（緑色）により同定された。パネルＡ：ＶＥＧＩ処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＢ：ビヒクル処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＣ：これらの腫瘍の像の赤色領域および緑色領域についての定量分析。白色の棒グラフ：ＣＤ３１陽性内皮細胞。黒色の棒グラフ：ＳＭＡ陽性平滑筋細胞。アスタリスク：ｔ検定；ＣＤ３１染色について、ビヒクル処置された群とＶＥＧＩ処置された群との間でｐ＜０．０１（１群あたり５匹の動物；１５領域／分析された切片）。 図１１は、ＬＬＣ腫瘍における、ＶＥＧＩ−１９２Ａによる内皮細胞の特異的な消失を示す。腫瘍が、この実験（３週間）の終了時に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物およびビヒクル処置されたコントロールから回収され、実施例７に記載されているように処理された。この腫瘍の切片が、蛍光免疫染色に供された。内皮細胞および平滑筋細胞が、それぞれ、特異的マーカーであるＣＤ３１（赤色）およびＳＭＡ（緑色）により同定された。パネルＡ：ＶＥＧＩ処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＢ：ビヒクル処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＣ：これらの腫瘍の像の赤色領域および緑色領域についての定量分析。白色の棒グラフ：ＣＤ３１陽性内皮細胞。黒色の棒グラフ：ＳＭＡ陽性平滑筋細胞。アスタリスク：ｔ検定；ＣＤ３１染色について、ビヒクル処置された群とＶＥＧＩ処置された群との間でｐ＜０．０１（１群あたり５匹の動物；１５領域／分析された切片）。 図１１は、ＬＬＣ腫瘍における、ＶＥＧＩ−１９２Ａによる内皮細胞の特異的な消失を示す。腫瘍が、この実験（３週間）の終了時に、ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物およびビヒクル処置されたコントロールから回収され、実施例７に記載されているように処理された。この腫瘍の切片が、蛍光免疫染色に供された。内皮細胞および平滑筋細胞が、それぞれ、特異的マーカーであるＣＤ３１（赤色）およびＳＭＡ（緑色）により同定された。パネルＡ：ＶＥＧＩ処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＢ：ビヒクル処置された群由来の代表的な腫瘍切片の像；倍率、２００×。パネルＣ：これらの腫瘍の像の赤色領域および緑色領域についての定量分析。白色の棒グラフ：ＣＤ３１陽性内皮細胞。黒色の棒グラフ：ＳＭＡ陽性平滑筋細胞。アスタリスク：ｔ検定；ＣＤ３１染色について、ビヒクル処置された群とＶＥＧＩ処置された群との間でｐ＜０．０１（１群あたり５匹の動物；１５領域／分析された切片）。 図１２は、残存血管構造の存在を示す。ＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された動物またはビヒクル処置された動物由来のＬＬＣ腫瘍の切片が、内皮細胞（ＣＤ３１）、平滑筋細胞（ＳＭＡ）および血管基底膜（コラーゲンＩＶ）を同定するために、免疫染色に供された。パネルＡ：ＣＤ３１陽性血管（茶色）を示す、代表的なビヒクル処置された腫瘍切片の像；倍率、１０００×。パネルＢ：赤血球を含む管腔様空間を示すがＣＤ３１陽性内皮細胞を欠く、代表的なＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された腫瘍切片の像；倍率、１０００×。パネルＣおよびＣ’（挿入図）：ＣＤ３１（緑色）およびコラーゲンＩＶ（赤色）での二重染色による、代表的なＶＥＧＩ−１９２Ａ処置された腫瘍切片の像；Ｃ’において示される、コラーゲンＩＶにより覆われた管腔様空間におけるＣＤ３１＋内皮細胞の欠如に留意されたい。パネルＤおよびＤ’（挿入図）：ＳＭＡ（緑色）およびコラーゲンＩＶ（赤色）での染色による、ＶＥＧＩ処置された腫瘍の代表的な切片の像；管腔様空間の内側の縁における平滑筋細胞の存在に留意されたい。パネルＥおよびＥ’（挿入図）：ＣＤ３１（緑色）およびコラーゲンＩＶ（赤色）での染色による、代表的なビヒクル処置された腫瘍切片の像；この血管の壁における内皮細胞（ＣＤ３１＋）の存在に留意されたい。パネルＦおよびＦ’（挿入図）：ＳＭＡ（緑色）およびコラーゲンＩＶ（赤色）での染色による、代表的なビヒクル処置された腫瘍切片の像；その血管壁における平滑筋細胞の存在に留意されたい。青色の染色：細胞核。Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦについての倍率：２００×。Ｃ’、Ｄ’、Ｅ’、およびＦ’についての倍率：１０００×。

Claims (14)

1. 個体において肺癌を処置するための方法であって、該方法は、
   有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与する工程
   を包含する、方法。
2. 請求項１の方法であって、前記癌は進行型である、方法。
3. 請求項１の方法であって、前記癌は転移性である、方法。
4. 請求項１の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａである、方法。
5. 請求項１の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、方法。
6. 請求項１の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉから組換え生成される、方法。
7. 肺癌を処置するためのキットであって、該キットは、
   ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドと、
   肺癌を処置するために該ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与するための指示と、
   を備える、キット。
8. 個体において乳癌を処置するための方法であって、該方法は、
   有効量のＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与する工程
   を包含する、方法。
9. 請求項８の方法であって、前記癌は進行型である、方法。
10. 請求項８の方法であって、前記癌は転移性である、方法。
11. 請求項８の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、ヒトＶＥＧＩ−１９２Ａである、方法。
12. 請求項８の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、方法。
13. 請求項８の方法であって、前記ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉから組換え生成される、方法。
14. 乳癌を処置するためのキットであって、該キットは、
    ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドと、
    乳癌を処置するために該ＶＥＧＩ−１９２Ａポリペプチドを投与するための指示と、
    を備える、キット。

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