JP2007514655A - メタドヘリンポリペプチドとそのコード核酸及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年11月13日付けで出願された米国仮出願第60/519,675号(その全体が参照により本明細書に援用される)に対する優先権を主張する。
この研究は、国立衛生研究所の国立癌研究所からの助成CA 82713、CA30199及びCA09579、並びに国防省からのDAMD17−02−1−0315により後援された。政府は本発明に確かな権利を有し得る。
である(Harris, J. et al., Cancer of the breast. In Cancer, principles and practice of oncology (Philadelphia, Lippincott Co.), pp. 1602-1616 (1982))。
276: 25438-25446 (2001); Cheng, H.C. et al., J Biol Chem 273: 24207-24215 (1998); Johnson, R.C. et al., J Cell Biol 121: 1423-1432 (1993))。小毛細血管における機械的な捕捉又は内皮との接着性相互作用による転移部位での腫瘍細胞の拘束は、二次部位で腫瘍が樹立されるのに必須の段階である(Chambers, A.F. et al., Nat Rev Cancer 2: 563-572 (2002); Orr, F.W. and Wang, H.H., Surg Oncol Clin N Am 10:357-381, ix-x (2001))。いったん腫瘍細胞が標的臓器に播種すると、局所的微小環境が、特定の癌細胞が増殖するかどうかに影響を与える(Fidler, I.J., Surg Oncol Clin N Am 10: 257-269, vii-viiii (2001); Radinsky, R., Cancer Metastasis Rev 14: 323-338 (1995))。残念ながら、臓器特異的転移の原因となる要因の多くがいまだに解明されていない。
002))。したがって、組織特異的血管マーカーへの腫瘍細胞の結合は、他の組織への選択的腫瘍転移において役割を果たす可能性がある。
1423-1432 (1993))。別のマウスモデルでは、肺内皮細胞上のCa2+感受性塩素チャネルであるhCLCA2は、転移性乳癌細胞上のβ4インテグリンに対するリガンドであることが報告された(Abdel-Ghany, M., et al., J Biol Chem 276: 25438-25446 (2001); Elble, R.C., et al., J Biol Chem 272: 27853-27861 (1997))。ごく最近では、肺、肝臓及びリンパ節において高度に発現される分泌ケモカインであるCXCL12は、転移性乳癌細胞の表面上のCXCR4受容体へ結合することが示された(Muller et al., 2001)。さらに、転移を阻害するには、これらの相互作用のたった1つを妨害すれば十分である(Abdel-Ghany, M., et al., J Biol Chem 276: 25438-25446 (2001); Cheng, H.C. et al., J
Biol Chem 273: 24207-24215 (1998); Muller, A., et al., Nature 410: 50-56 (2001))。乳癌におけるこれらの相互作用の重要性に関して有効な根拠は存在しないが、細胞接着分子と成長因子受容体との多数の相互作用が、循環性腫瘍細胞の付着及び成長に必要である可能性がある。特有の血管アドレスに基づく類似のメカニズムは、他の臓器への臓器特異的転移において役割を果たしている可能性がある。
本明細書中で開示するように、メタドヘリン及びその機能的フラグメントは、特に肺血管を認識し、且つ腫瘍の転移に関与する細胞表面タンパク質であると特徴付け及び発見された。機能的フラグメントの1つは、配列番号3に示され、マウスメタドヘリン(配列番号1)のアミノ酸378〜440に相当する。本明細書中で開示するように、メタドヘリンは、転移性胸部腫瘍において過剰発現され、細胞外ドメインにおけるC末端セグメントを通じて肺血管系に結合されることが見出された。したがって、メタドヘリンの発現又は機能を阻害することにより、腫瘍転移を阻害する方法及び組成物が提供される。メタドヘリンが、肺血管系におけるその受容体に結合することを阻害する方法及び組成物もまた提供される。
体を含有するキットを包含する。このようなキット及び試薬は、癌を診断したり、治療法に対する応答をモニタリングしたり、或いは癌患者の予後を予測するのに使用することができる。
されてもよく、細胞はそれにより、肺組織へと特異的に局在化されるようになる。メタドヘリンの考え得る肺ホーミングドメインは、図1Aに示される。図1Bは、タンパク質の予測される疎水性を示す。図1Cは、メタドヘリンタンパク質に関するさらなる構造情報を提供する。「TM」は、推定上の膜貫通ドメインの位置を示す。数字は、メタドヘリンタンパク質におけるアミノ酸の位置を示す。
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド塩基の一本又は二本鎖ポリマーを意味し、DNA及び、
センス鎖及びアンチセンス鎖の両方のHnRNA及びmRNA分子を含む、対応するRNA分子を包含し、またcDNA、ゲノムDNA及び組換えDNA、並びに完全又は部分的合成ポリヌクレオチドを包含する。HnRNA分子はイントロンを含有し、概して1対1の様式でポリヌクレオチドに相当する。mRNA分子は、イントロンが削除されているHnRNA及びポリヌクレオチドに対応する。ポリヌクレオチドは、全遺伝子、又はその任意の部分から構成され得る。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドのフラグメントを含んでもよく、したがって「ポリヌクレオチド」の定義は、すべてのこのような操作可能なアンチセンスフラグメントを包含する。
位特異的突然変異誘発等のような標準的な突然変異誘発法を用いて容易に導入することができる。ヌクレオチドバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントでも天然に存在しないバリアントでも良い。変異ヌクレオチド配列は好ましくは、上述の配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、最も好ましくは少なくとも約95%の相同性(以下に記載するように決定される)を示す。
Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein sequence and structure, National Biomedical Research Foundation. Washington D.C., Vol 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach of Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments on microcomputer CABIOS 5:151-153; Myers E.W. and Muller W. (1988) Optimal alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) The neighbor joining method.
A new method for reconstructing phylogenetic trees Mol. Biol. Evol. 4: 406-425;
Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy -- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730. アラインメントに関して多くの選択肢が存在し、別の選択肢は、ncbiウェブページ、bl2seqにより提供されるものである。
ンの機能的構造が、メタドヘリン肺結合ドメインと同じであることを意味する。擬似体は、本明細書中で記載されるように、元のメタドヘリンタンパク質が発見されたのと同じプロセスにより決定され得る。或いは、擬似体は配列解析及び構造予測により創出されてもよく、ここでメタドヘリン肺結合タンパク質の予測される又は実際のタンパク質構造は、肺結合ドメインの代替的擬似体を創出するための設計図として使用される。或いは、擬似体は、構造的に類似していなくてもよいが、ただ機能的には類似しており、小分子薬物を含み得る。
チド擬似体のライブラリーを含有するデータベースのスクリーニングを包含する。例として、Cambridge構造データベースは、既知の結晶構造を有する300,000個を超える化合物の収集を含有する(Allen et al., Acta Crystallogr. Section B, 35:2331 (1979))。この構造データベースは、新たな結晶構造が決定される場合に継続的に更新されて、本発明のペプチドと同じ形状の適切な形状並びに標的分子に対する潜在的な幾何学的及び化学的相補性を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明のペプチド又はそのペプチドに結合する標的分子の結晶構造が入手可能でない場合、構造は、例えばプログラムCONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29: 251
(1989))を用いて生成することができる。別のデータベースであるAvailable Chemicals Directory(Molecular Design Limited, Information Systems;San Leandro CA.)は、市販されている約100,000個の化合物を含有しており、例えばメタドヘリン、そのバリアント又はメタドヘリン受容体へ選択的結合活性を有する本発明のペプチドの潜在的ペプチド擬似体を同定するのに探索することができる。
ク質又はバリアントに結合される所望の物質であり得る。別の実施形態では、ナノデバイスは、メタドヘリンタンパク質又はバリアントに結合される所望の物質であり得る。粒子及びデバイスを作製並びに使用する方法は、当該技術分野で既知である。この技術の概説に関しては、Erkki Ruoslahi, Cancer Cell, August 2002, 97-98を参照されたい。
の3’末端は、ペプチドリンカーの存在下又は非存在下で、第2のポリペプチドをコードするDNA配列の5’末端へ連結されて、その結果、配列のリーディングフレームは、同調し、2つのDNA配列からメタドヘリン及び第2のポリペプチドの両方の生物活性を保持する単一の融合タンパク質へのmRNA翻訳を可能にする。当業者に理解されるように、メタドヘリン分子のほんの一部が、融合タンパク質に含まれる必要がある。好ましい実施形態では、配列番号1のアミノ酸378〜440のみが使用される。
タドヘリン又はそのバリアントが肝臓における受容体へも結合する場合、メタドヘリン又はそのバリアントは、肺診断に関して本明細書中に記載するように、診断薬として使用することができるか、或いはメタドヘリン又はそのバリアントは、乳癌の拡大を停止させることに関して本明細書中で記載されるように、癌の肝臓への広がりを停止させるのに使用することができる。当業者は、身体中の特定の位置への局在化に対してなされるはずの変化を理解するであろう。
NJ)及びパクリタキセル(Taxol, Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ)が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Chan et al., J. Clin. Oncol. 17:2341-2354 (1999)を参照されたい。
Ratain, Cancer: Principles and practice of oncology 5th ed., Chap.19 (eds. DeVita, Jr., et al.; J.P. Lippincott 1997);Harris et al., Cancer: Principles and practice of oncology, supra, 1997)。さらに、ドキソルビシンは、抗血管新生活性を有し(Folkman, Nature Biotechnology 15: 510 (1997)、Steiner, Angiogenesis: Key principles Science, technology and medicine pp. 449-454 (eds. Streiner et al.; Birkhauser Verlag, 1992))、これは、癌を治療する際にその有効性に寄与し得る。
isher et al., J. Natl. Cancer Instit. 90:1371 1388 (1998))。
以下で及び実施例で記載するように、ファージに肺組織を選択的に標的とさせるタンパク質が発見され、「メタドヘリン」と称された。このタンパク質の核酸配列は、配列番号2(マウス)及び配列番号16(ヒト)に示される。このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1(マウス)及び配列番号13(ヒト)に示される。図1Aはメタドヘリン配列を表示し、このタンパク質における推定上の肺ホーミングドメインを特定する。図1Bは、このタンパク質の疎水性プロットを示し、このタンパク質の様々な構造的特徴を示唆する。mycエピトープタグをこのタンパク質へ挿入することにより(例えば、図1Cに示すように)、このタンパク質は、細胞接着に関与する細胞外ドメインを有することが見出された。このドメインは、ファージに肺組織を標的とさせるだけでなく、メタドヘリンを過剰発現している細胞を肺組織へと局在化させることが見出された。
を変化並びに低減させるのに使用できることが見出された。
必要はなく、後にin vivoで発現される核酸形態で投与することができる。
8:17-21, 1990; 米国特許第4,603,112号; 第4,769,330号及び第5,017,487号; WO 89/01973号; 米国特許第4,777,127号; 英国特許第2,200,651号; 欧州特許第0,345,242号; WO 91/02805号; Berkner, Biotechniquies 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 43
1-434, 1991; Kolls et al., PNAS 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 及びGuzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993に開示されている。このような発現系へDNAを組み込むための技法は当業者に既知である。例えば公開済みのPCT出願WO 90/11092号及びUlmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993により概説されるように、DNAはまた「裸」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、生分解性ビーズ上へDNAをコーティングすることにより増大され得て、これは効率的に細胞へ輸送される。
リン受容体に結合するペプチド又は他の作用物質は、被験体へ投与されると検出可能な作用物質へ連結され、被験体に対して外部で検出される。一実施形態では、このような検出可能な作用物質は、例えば、インジウム113、インジウム115又はテクネチウム99等のγ線放出核種であってもよく、被験体への投与後に、結合体又は作用物質は、固体シンチレーション検出器を用いて可視化され得る。
価され得る。「結合性作用物質」は、本発明の状況では、メタドヘリンに結合する任意の作用物質(例えば、化合物又は細胞)である。本明細書中で使用する場合、「結合」は、「複合体」が形成されるような、2つの別個の分子(これらはそれぞれ、遊離(すなわち、溶液状態)であり得るか、或いは細胞又は固体支持体の表面上に存在し得る)間の結合を指す。このような複合体は、遊離であり得るか、或いは支持体材料上に固定化され得る(共有結合的に又は非共有結合的に)。結合する能力は一般的に、複合体の形成に関して結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を構成成分濃度の積で除算した場合に得られる結果である。好ましい実施形態では、2つの化合物は、本発明の状況では、複合体形成に関する結合定数が約103L/molを超える場合に「結合」と考えられる。結合定数は、当業者に既知の方法を用いて決定され得る。結合は、ジスルフィド結合の形成を伴うような共有結合であり得るか、或いは、非共有結合であり得る。
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harobor Laboratory, 1988を参照されたい。好ましい実施形態では、アッセイは、ポリペプチドへ結合し、ポリペプチドをサンプルの残部から除去するための、固体支持体上に固定された結合パートナーの使用を包含する。続いて、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含有する第2の結合パートナーを使用して検出され得る。適切な第2の結合パートナーとしては、結合パートナー/ポリペプチド複合体に結合する抗体が挙げられる。或いは、競合アッセイを利用してもよく、ここでは、メタドヘリンはレポーター基で標識され、結合パートナーをサンプルとインキュベーションした後、固定化された結合パートナーに結合される。サンプルの構成成分が、結合パートナーに標識メタドヘリンが結合するのを阻害する程度は、固定化された結合パートナーとのサンプルの反応性を示す。
結合(これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接的な連結であってもよく、或いは架橋剤による連結であってもよい)の両方を指す。マイクロタイタープレートにおけるウェル又は膜への吸着による固定化が好ましい。このような場合では、吸着は適切な緩衝液中で、結合性作用物質を適切な時間、固体支持体と接触させることにより達成され得る。接触時間は温度により様々であるが、好ましい実施形態では、通常約1時間〜約1日である。概して、プラスチックマイクロタイタープレート(例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル)のウェルを約10ng〜約10マイクログラム、好ましくは約100ng〜約1マイクログラムの範囲の量の結合性作用物質と接触させることは、適切な量の結合性作用物質を固定化するのに十分である。
結合の第2の抗体は除去されて、結合された第2の抗体は、レポーター基を用いて検出さされる。レポーター基を検出するのに使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基に関しては、シンチレーションカウンティング又はオートラジオグラフィ法が一般的に適切である。色素、発光基及び蛍光基を検出するのに、分光学的方法が使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基(通常、放射性若しくは蛍光基、又は酵素)にカップリングされたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は概して、基質の添加(一般的に、特定の時間)、続く反応生成物の分光学的又は他の分析により検出され得る。
合を実際に促進又は強化し得る。専門用語に関して十分に明瞭にするために、このような結合性作用物質は、単に結合性作用物質ではなく「結合増強作用物質」と称するべきである。一実施形態では、結合性作用物質はメタドヘリンに結合して、それを阻害する小分子である。別の実施形態では、結合性作用物質はペプチドである。別の実施形態では、結合性作用物質は抗体である。一実施形態では、結合性作用物質は、癌を治療するか、又は癌の広がりを防止するのに使用され得る。別の実施形態では、結合性作用物質は、本明細書中に記載するように、診断用イメージング方法において使用され得る。
Immunol. 6:511-519, 1976の技法及びそれに対する改良法を使用して調製され得る。簡潔に述べると、これらの方法は、目的の特異性(すなわち、目的のメタドヘリンとの反応性)を有する抗体を生産することが可能な不死細胞系の調製を包含する。このような細胞系は、例えば、上述のように免疫化した動物から得られる脾臓細胞から生産され得る。続いて、脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは免疫化された動物と同系であるものとの融合により不死化される。様々な融合法が使用され得る。例えば、脾臓細胞及び骨髄腫細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせた後、ハイブリッド細胞の成長を支持するが、骨髄腫細胞の成長は支持しない選択培地上で、低濃度で平板培養されてもよい。好ましい選択法は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を使用する。十分な時間、通常約1〜2週後に、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択して、メタドヘリンに対する結合活性に関して試験する。高い反応性及び特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
ない。
実施例
この実施例は、乳癌転移を媒介する細胞接着タンパク質の候補が、どのようにしてin
vivoファージスクリーニングアプローチを使用して同定されたかを説明する。このアプローチはまた、類似のタンパク質を見出すのに、或いは考え得るメタドヘリンバリアントが、肺細胞を結合するそれらの能力において機能的であることを確証するのに使用することができる。高度の転移性のBALB/c由来の4T1乳腺腫瘍細胞系は、4T1細胞及びヒト乳腺腺癌が、転移の類似した部位を共有するため、腫瘍転移を研究するのに選択した(Aslakson, C.J. and Miller, F.R., Cancer Res 52:1399-1405 (1992); Dexter, D.L., et al., Cancer Res 38:3174-3181 (1978); Miller et al., 1983)。ヒト乳癌は通常、まず癌の24〜77%が肺へ、また22〜62%が肝臓へ広がる(Kamby, C. et al.,
Cancer 59: 1524-1529 (1987); Rutgers, E.J. et al., Br J Surg 76: 187-190 (1989); Tomin, R. and Donegan, W.L., J Clin Oncol 5:62-67 (1987))。同様に、4T1細胞は、マウスにおいて95%を超える場合において肺へ、また75%を超える癌において肝臓へ広がる(Pulaski, B.A., and Ostrand-Rosenberg, S., Cancer Res 58: 1486-1493 (1998))。BALB/c胸部腺癌に由来する細胞系である4T1は、ATCCから得られ、Pulaskiら(Cancer Res 58: 1486-1493(1998))により記載されるように維持した。MDA−MB−435及びKRIB細胞系は、以前に記載されるように維持した(Laakkonen, P. et al., Nat Med 8: 751-755 (2002))。ヌードBALB/cマウスに、1×106個の4T1腫瘍細胞を皮下注射して、5週(KRIB)又は10週(MDA−MB−435)間維持した。続いて、腫瘍を取り出して、OCT包埋用培地(Tissue-Tek, Elkhart, IN)中で凍結させて、切片化した。4T1細胞は、潜在的に転移に関与する分泌及び膜貫通タンパク質をコードする転写物に富んだcDNAライブラリーを調製するのに使用された。
cDNAライブラリーを、4T1細胞の膜結合ポリリボソームmRNAから調製した。簡潔に述べると、3.2×108個の4T1細胞の膜結合ポリソーム由来のRNAを、Mechler(1987)により記載される方法を用いて調製した。このRNAおよそ1μgを使用して、Luo他(1999)により記載される方法を用いて、増幅されたアンチセンスmRNA(aNA)6μgを生成した。aRNAを鋳型として使用して、Luo他(1999)により記載されるように、mRNA合成したが、但し、プライマー5’−TTNNNNNN−3’[配列番号4]をランダムヘキサマープライマーの代わりに使用し、メチル化dNTPをdNTPの代わりに使用した。cDNAライブラリーは、製造業者のプロトコルに記載されるように、mRNAから調製された(OrientExpressTMランダムプライマーcDNA合成キット、Novagen, Madison, WI)。
T7ファージを構築した。3つすべてのリーティングフレームにおけるmycエピトープ、内部EcoRI及びHindIII制限酵素制限部位、及びフランキングEcoRI/HindIIIアダプターをコードするオリゴヌクレオチドを合成した。続いて、オリゴヌクレオチドは、個々にリン酸化して、アニーリングして、EcoRI/HindIII消化したT7Select1−2a、1−2b又は1−2cベクターアーム(Novagen)に連結させて、mycエピトープファージベクターを生成した。
以下のプライマーを合成して、完全長マウスメタドヘリンcDNAを増幅した:
5’−ACCATGGCTGCACGAAGCTGGCAGGACGAGCTG−3’(配列番号5)。
5’−TCACGTTTCCCGTCTGGCCTTTTTCTTCTTTTTTA−3’(配列番号6)。
この実施例は、メタドヘリン、特にメタドヘリンの肺ホーミングドメインに対する抗体を得る方法を説明する。この実施例はまた、メタドヘリンが、腫瘍細胞の外部表面上に局在化することを説明する。抗T7ファージアフィニティ精製された抗体は、過去に記載された(Laakkonen, et al., (2002). Nat Med 8: 751-755)。ポリクローナル抗体は、グルタチオン−Sトランスフェラーゼへ融合させた、組換えメタドヘリン肺ホーミングドメイン(配列番号3)に対して、ニュージーランドホワイトウサギにおいて生成した。初期免疫化を、完全フロイントアジュバント中で行い、ブースターを、不完全フロイントアジュバントを用いて行った。抗体を、メタドヘリン(378-440)ペプチドのアミノ末端へ付加したシステイン残基を介してSulfoLink Gel(Pierce, Rockford, IL)とカップリングさせた、組換え6xヒスチンタグ付けしたメタドヘリン(378-440)ペプチド上で抗体をアフィニティ精製した。タグをまず、プライマー5’−CCCGCCATGGGGTTAAATGGTTTGTCTTCTGCTGACCC−3’(配列番号7)及び5’−CCCGAGATCTTTTAGATTTCCCAGTTGGAAGAGCTCCCTCCCC−3’(配列番号8)を使用して、ベクターpQE−60(Qiagen, Valencia, CA)中に肺結合ドメインをサブクローニングすることにより付加された。
この実施例は、細胞上のメタドヘリンタンパク質の存在を検出する方法を実証する。FACSにより4T1細胞上のメタドヘリンの存在を分析するために、細胞を2mM EDTAを有するPBS(PBSE)とともに10分間インキュベートすることにより、培養プレートから脱離させた。続いて、細胞をPBSBで洗浄して、40μg/ml(PBSB中)の以下の抗体:抗Bcl2(SL−492、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、正常なウサギIgG(Sigma, St. Louis, MO)、抗インテグリンα5β1(ヒト
フィブロネクチン受容体に対して産生した抗体を含有するウサギ血清から精製したプロテインG)及び抗メタドヘリン(378-440)とともにインキュベートした。結合した抗体を検出するために、細胞をヤギ抗ウサギIgG−FITC(PBSB中40μg/ml、Molecular Probes, Eugene, OR)とともにインキュベートした。最後の洗浄後、2μg/mlのヨウ化プロピジニウム(PI)を含有するPBSで細胞を再懸濁させて、FACSで分析した。メタドヘリン(378-440)に対して産生した抗体は、フローサイトメトリーにおいて非透過処理4T1細胞へ特異的に結合した(図4A)。それに対して、細胞質タンパク質(Bcl−2)及びウサギIgGに対する対照抗体は、非透過処理4T1細胞の表面へ結合しなかった。
この実施例は、メタドヘリンのバリアントがFACS分析により観察することができる代替的方法を説明する。メタドヘリンを肺に局在させることが可能な融合タンパク質であるmyc−メタドヘリンを以下の実験で使用した。myc−ビメンチン、myc−メタドヘリン又はmyc−pCMVベクター単独(Clontech, Palo Alto, CA)を発現する一過的にトランスフェクトしたHEK293T細胞を、1%BSAを含有するPBS(PBSB)で穏やかに洗浄することにより、それらの培養皿から脱離させた。続いて、マウス抗myc mAb(PBSB中2μg/ml、Chemicon, Temecula, CA)を用いて4℃で20分間、細胞を染色した。細胞をPBSBで洗浄して、ヤギ抗マウスIgG PE標識した抗体(PBSB中4μg/ml、Pharmingen, San Diego, CA)で染色して、PBSBで再度洗浄して、PBS中の2%パラホルムアルデヒドで固定して、PBS中で再懸濁させて、FACScanフローサイトメーター(BD, San Jose, CA)を用いて分析した。無傷のmycメタドヘリン発現細胞は、抗myc抗体で特異的に標識されることが観察された(図4B)。しかしながら、myc−ビメンチン又はmyc−pCMVで処理した細胞は、抗myc抗体で標識されなかった。
この実施例は、肺血管中でのメタドヘリンの存在に関して検査する方法を説明し、及びメタドヘリン発現ファージが細胞を肺血管へ送達させることを説明する。メタドヘリンを発現するファージを、マウスの尾静脈への2.5×1010pfuメタドヘリンファージ(M9LB200μl中)の静脈注射により検査した。血管を、フルオレセイン及びメタドヘリンファージ(T7−メタドヘリン)又はT7−415非組換えファージ(T7−対照)へ結合させたLycopersicon esculentum(トマト)レクチン200μgとファージの同時注入により可視化させた。対照肺は、注射していないマウス(レクチン-ファージ-)、レクチンのみを注入したマウス(レクチン+ファージ-)及びメタドヘリンファージのみを注入したマウス(レクチン-ファージ+)由来であった。抗ファージ抗体を、Alexa594ヤギ抗ウサギIgG抗体により検出した。核をDAPIで染色した。注射した材料を10分間循環させた。肺を取り出して、OCT包埋用培地(Tissue-Tek)中で凍結させた。ファージは、対照ファージよりもほぼ20倍多く肺へ結合した。このファージの選択的蓄積は、胸部、皮膚、脳又は肝臓では見られず、その量は、膵臓及び腎臓において対照ファージよりも2倍未満であった。ファージは、肺中の血管と共局在した。
この実施例は、腫瘍細胞溶解物におけるメタドヘリンの量をモニタリングする方法を説明する。腫瘍細胞溶解物を、150μl当たり106個の細胞の比で、2.5×Laemmliサンプル緩衝液(Laemmli, 1970)中で調製して、4〜20%アクリルアミドグラジエントゲル上でのSDS/PAGEに付した。タンパク質を、PVDF膜へ転写して、抗
メタドヘリン(378-440)(0.1μg/ml)及びヤギ抗ウサギIgG−HRP(1:10,000で希釈、Bio-Rad, Herculees, CA)を用いて免疫ブロットを実施して、ECLPlusと化学発光試薬(Amercham BiosciencesPiscataway, NJ)を用いて、製造業者の指示書に従って発色させた。免疫ブロットにより検出されるメタドヘリンの相対量を、AlphaImager(Alpha Innotech, San Leandro, CA)を用いて定量化した。β−アクチンを、抗アクチンモノクローナル抗体(10μg/mlTemecula, CA)で検出した。トランスフェリン受容体を、抗トランスフェリン受容体ポリクローナル抗体(2μg/ml、Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)で検出した。新規175kDaタンパク質クローンD2に反応性であるアフィニティ精製したポリクローナル抗体を、抗メタドヘリン(378-440)に関して記載されるように調製した。対照免疫ブロットを、抗クローンD2(0.1μg/ml)及びヤギ抗ウサギIgG−HRP(上述)を用いて実施した。
この実施例は、細胞の種々の位置におけるメタドヘリンを探索するための抗メタドヘリン(378-440)抗体の使用方法を提供し、細胞全体にわたるメタドヘリン分子の分布について記載する。この実施例はまた、どの標識効果がこの抗体の特異的結合に起因するかどうかを決定する方法を説明する。
において、メタドヘリン免疫反応性は、細胞質及び原形質膜へ局在化した。抗メタドヘリン(378-440)で染色した非透過処理4T1細胞の切片(0.15μm)では、染色は、細胞の縁へ濃縮された。対照として、過剰のメタドヘリン(378-440)ペプチドとともにプレインキュベートした非透過処理4T1細胞は、抗メタドヘリン(378-440)による染色を低減した一方で、過剰の対照ペプチド中でインキュベートした細胞は低減しなかったことを示した。Alexa594ヤギ抗ウサギIgG抗体を使用した。
この実施例は、癌性であるヒト組織サンプルに存在するメタドヘリンの量を決定する方法を実証する。パラフィン包埋したヒト腫瘍切片(Spring Biosciences, Fremont, CA)を脱パラフィンした後、標的回収溶液で処理した(製造業者の指示書に従って, Dako, Carpinteria, CA)。切片を上述のように染色した。但しPBSBを、0.1M Tris/150mM NaCl中の0.5%ブロッキング試薬(NEN Life Sciemces, Boston, MA)で置き換えた。特異性を決定するために、抗メタドヘリン(378-440)(20μg/ml)を、ブロッキング緩衝液中で200μg/mlの組換えメタドヘリン肺ホーミングタンパク質(配列番号3)又は未関連組換え対照タンパク質(72個のアミノ酸、肺ホーミングクローンD2)とともに一晩プレインキュベートした後、切片を免疫染色した。ヒト胸部腫瘍及び正常ヒト胸部組織の両方の切片を、抗メタドヘリン(378-440)単独で、或いは過剰のメタドヘリン(378-440)ペプチド又は過剰の対照ペプチドとともにプレインキュベートした抗メタドヘリン(378-440)で染色した。
この実施例は、検出方法が、ヒト起源ではないサンプルに役立つことを実証する。肺転移を生成することが既知である2つの腫瘍モデルである、マウスMDA−MB−435(胸部腺癌)及びKRIB(骨肉腫腫瘍)(Berlin et al., 1993; Price et al., 1990)腫瘍異種移植片の切片で多量のメタドヘリンタンパク質が検出された。異種移植片を、ヌードBalb/cマウスで成長させて、免疫染色により分析した。切片を、抗メタドヘリン(378-440)単独で、或いは過剰のメタドヘリン(378-440)ペプチド又は過剰の対照ペプチドとともにプレインキュベートした抗メタドヘリン(378-440)で染色した。抗メタドヘリン(378-440)を、Alexa594ヤギ抗ウサギIgG抗体で検出して、核を、DAPIで染色した。メタドヘリンは、両方のモデルにおいて腫瘍細胞表面へ局在するように見え、特にメタドヘリンの強力な発現が、KRIB腫瘍の周囲で見出された。メタドヘリン(378-440)肺ホーミングペプチドとの抗体のプレインキュベーションは染色を阻害したが、対照ペプチドは阻害しなかったため、抗メタドヘリン(378-440)免疫染色は特異的であった。腫瘍に隣接する皮下組織又は皮膚は、抗メタドヘリン染色を示さなかった。
、メタドヘリン染色に関して強力に陽性であった。これらの免疫染色の結果は、メタドヘリンが、腫瘍において選択的に過剰発現されることを示す。
この実施例は、結合された物質を肺組織へ効果的に送達するメタドヘリンの能力を説明する。静脈内注射した腫瘍細胞の組織分布に対するメタドヘリンの影響を試験するために、HEK293T細胞を、メタドヘリンcDNA(配列番号2)でそれらを一過的にトランスフェクトすることにより研究した。HEK293T細胞を、DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA)及びメタドヘリン−pCMV又は空myc−pCMVベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞をPBSBで脱離させて、40μmナイロンフィルタに通して濾過した。DsRed発現細胞を、FACS Vantageフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用して単離した。この実験において目的の物質である、2.5×105個のDsRed陽性細胞をヌードBALB/cマウスの尾静脈へ注入した。5匹のマウスに各細胞型を注入した。2時間後、マウスを屠殺して、臓器を取り出し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定して、10μm厚の凍結組織切片を調製した。各肺切片に関して、3つの異なる領域を計数した。3つ又はそれ以上の細胞を有するDsRed陽性細胞の凝集塊を、計数から排除した。肺当たり5つの切片を計数した。
メタドヘリンに対するsiRNAは、メタドヘリンを阻害し得る
siRNAの、メタドヘリン生産を変更させる能力を検査した。図7Aに示されるように、メタドヘリンに反応性であるが、GAPDH又は陰性対照mRNA(例えば、「スクランブル」)に反応性でないsiRNAは、HEK293T細胞において、トランスフェクトされたmyc−メタドヘリンの発現を低減することが可能であった。メタドヘリンレベルは、2週後に正常に回復した。しかしながら、4T1細胞におけるEGFP及びメタドヘリン反応性siRNA又はスクランブルsiRNAの同時発現を用いて、機能するなモデルが創出され、細胞をFACSで選択した。メタドヘリン−siRNAによるトランスフェクションは、β−アクチン又はII型膜貫通タンパク質であるトランスフェリン受容体の発現に影響を及ぼさなかった(図7Bを参照)。しかしながら、メタドヘリン−siRNA細胞におけるメタドヘリンタンパク質発現は、スクランブルsiRNA細胞に対して、約40%低減された(図7C)。図7Cにおける矢印は、デンシトメトリにより定量化した80kDaのメタドヘリンタンパク質バンドを示す。
メタドヘリンに対するsiRNAは、マウスモデルの転移の形成を阻害する
肺ホーミングファージの肺ホーミングドメインの推定アミノ酸配列を配列番号3に示す。BLAST(Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res 25: 3389-3402 (1997))を用いて、1つのcDNAクローン(GenBankTM アクセッション番号AY082966、配列番号16)が、ファージクローンに相当する推定完全長ヒトタンパク質(配列番号13)をコードすることが決定された。メタドヘリンをコードするcDNAは、マウスメタドヘリンのコード領域(配列番号2)に対して93%相同であるコード領域を有する。GenBankTM登録は、当該タンパク質を「LYRIC」と称して、結腸癌腫における推定CEACAM1関連タンパク質として記載している。これらの結果は、乳癌転移におけるこの肺ホーミングタンパク質の重要性を示す。このタンパク質をメタドヘリン(転移接着タンパク質)と命名した。報告されたマウスメタドヘリンのcDNA相同体を使用して(GenBankTMアクセッション番号AK029915)、オリゴヌクレオチドを設計して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により完全長マウスメタドヘリンcDNA(配列番号2)を増幅した。配列番号2に示されるように、マウスメタドヘリンcDNAは、ヌクレオチド319に始まり、ヌクレオチド2058で終わる1737塩基対のコード領域を有する2530ヌクレオチド長である。ヒトメタドヘリンcDNAは、ヌクレオチド7
9に始まり、ヌクレオチド1827で終わる1748塩基対のコード領域を有する2031ヌクレオチド長である。当業者に理解されるように、この手順は、他の生物におけるさらなる相同体を同定するために容易に反復させることができる。
この実施例は、メタドヘリン又はそのバリアントの機能的特色を同定し、続いて確認する方法を説明する。メタドヘリンの疎水性領域の分析(Kyte, J. and Doolittle, R.F., J
Mol Biol 157, 105-132 (1982))により、アミノ酸残基52〜74が、推定膜貫通ドメインをコードすることが明らかとなった(例えば、図1B及び図1C)。検索は、他の既知のタンパク質に類似したメタドヘリンにおけるいかなるドメインも明らかにしなかった。膜ヘリックスを検出し、且つタンパク質における膜貫通トポロジーを予測するために隠れマルコフモデル(Glasgow, J. (1998), Proceedings, Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology: June 28-July 1, 1998, Montreal, Quebec (Menlo Park, Calif., AAAI Press); Krogh, A., et al., J Mol Biol 305: 567-580 (2001))を用いて、メタドヘリンが、細胞外肺ホーミングドメインを有するII型膜貫通タンパク質であると予測されることが分かった。この予測を確認するために、c−mycエピトープを、図1Cに示されるように、メタドヘリンcDNAの肺ホーミングドメインにサブクローニングした。まずQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、ヌクレオチド1222の後ろのメタドヘリンcDNAにEcoRI制限酵素部位挿入することにより、mycエピトープはメタドヘリンタンパク質へ付加された。続いて、mycエピトープをコードするオリゴヌクレオチド(EQKLISEEDL)[配列番号12]及びフランキングEcoRIアダプターを合成して、リン酸化して、EcoRI消化したメタドヘリンcDNAへ連結させた。myc−メタドヘリンcDNAは、pCMVベクター(Clontech, Palo Alto, CA)へサブクローニングした。鋳型としてビメンチン特異的プライマー及びヒトmRNAを使用して、ヒトmyc−ビメンチンcDNAを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により生成した後、pCMV−Mycベクター(Clontech, Palo Alto, CA)へサブクローニングした。
この実施例は、転移が、どのようにして結合性作用物質、この場合、メタドヘリンの肺結合ドメインに対する抗体の添加により阻害されるかどうかを説明する。マウスモデル系を使用して、メタドヘリンの肺ホーミングドメインに対して反応性である抗体を用いて、4T1細胞においてメタドヘリン活性を阻害した。4T1細胞を、PBSEによりプレートから脱離させて、PBSで一度洗浄して、PBS中に5×105個の細胞/mlで再懸濁させて、氷上に置いた。抗メタドヘリン(378-440)又はウサギIgG(200μg)を
5×104個の細胞に添加した後、細胞を、側方尾静脈を介して雌Balb/c nu/nuマウスへ注入した。腫瘍細胞注入の7日後に、動物を屠殺した。肺を回収して、ブアン溶液で染色して、左葉の表面上の腫瘍病巣を解剖顕微鏡下で計数した。4T1細胞とともに同時注入すると、抗メタドヘリン(378-440)は、ウサギIgGで処理した4T1細胞と比較した場合、肺転移を約40%阻害した(図.7F)。別個の実験では、抗メタドヘリン(378-440)又はウサギIgGで予め処理した4T1細胞から形成される乳腺脂肪体腫瘍の成長間に、差は観察されなかった。
この実施例は、メタドヘリンに結合して、メタドヘリンを遮断することにより転移を阻止する小分子、ペプチド又はタンパク質に関してどのようにしてスクリーニングすることができるかどうかを説明する。例えば実施例1におけるファージクローンにおけるメタドヘリン又はそのフラグメントを発現する細胞は、実施例1に従って、考え得るブロッキング作用物質と混合された後、マウスに注入される。注入された細胞が肺組織へ局在化する場合、ブロッキング作用物質は、実験の期間にわたって完全なブロッキング作用物質として有効ではない。肺組織への細胞の局在化の低減又は対照との比較は、考え得る遮断用作用物質を示す。
この実施例は、本発明のメタドヘリンが、他の癌の転移を停止させるのに有用であるかどうかをどのようにして決定できるかを説明する。全米バイオテクノロジー情報センターでの癌ゲノム詳細解析プロジェクト(The Cancer Genome Anatomy Project)の構成要素であるSAGEmap(Lal, A., et al., Cancer Res 59: 5403-5407 (1999); Lash, A.E.,
et al., Genome Res 10: 1051-1060 (2000))を使用して、メタドヘリンが、乳癌だけでなく、脳及び前立腺の癌においても有意に過剰発現される(P<0.05)ことが決定された。このことは、脳及び前立腺癌の転移におけるメタドヘリンの類似の役割を示唆する。続いて、本発明の抗メタドヘリン抗体を投与して、癌転移が停止されるかどうかを決定することができる。
この実施例は、メタドヘリンの他のバリアントを決定するための手法を説明する。BLASTアルゴリズム(Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res 25: 3389-3402 (1997))を使用して、GenBankTMデータベースにおけるさらなるマウス及びヒトメタドヘリン様分子を決定した。図2は、ヒト(配列番号13)、マウス(配列番号1)、ラット(配列番号14)及びゼブラフィッシュ(配列番号15)由来の幾つかのメタドヘリン相同体又はバリアントの機能的比較が現在既知であることを示す。
この実施例は、メタドヘリンの考え得るバリアントが、癌転移を防止するのに依然として機能的であるかどうかを決定するために、それらがどのように検査され得るかを説明する。考え得るバリアントは、実施例1と同様に、モニタリングされ得る宿主細胞において発現される。続いてバリアントは、実施例1に記載するように、宿主へ投与されて、バリアントが宿主細胞の肺組織へ局在化することが可能であるかどうかを決定する。バリアントが、依然として肺組織へ局在化することが可能であり、メタドヘリン受容体へ結合する場合、それは、癌の広がりを防止する目的で、機能的バリアントであるとみなされる。
癌及び乳癌転移の危険性を有する患者を選択する。乳癌転移の危険性は、癌を有さない患者に対して、メタドヘリンのレベルが増大した患者の系におけるメタドヘリンの存在を決定することにより検査され、患者は、乳癌転移の増大した危険性を有することを示す。続いて、メタドヘリンの結合領域を対象とする有効量の抗体を患者に投与するが、これは、他の癌化学療法又は他の治療と併用して投与され得る。有効量を、患者を基準として患者ごとに決定して、患者の系において依然として存在する抗体を有さないメタドヘリンに関する反復アッセイにより直接的にモニタリングすることができる。或いは、有効量は、患者の全般的な健康及び癌の任意の広がりの低減をモニタリングすることにより決定される。治療は、癌の広がりが低減されるまで継続される。
癌及び乳癌転移の危険性を有する患者を選択する。乳癌転移の危険性は、癌を有さない患者に対して、メタドヘリンのレベルが増大した患者の系におけるメタドヘリンの存在を観察することにより決定され、患者は、乳癌転移の増大した危険性を有することを示す。続いて、メタドヘリンを対象とする有効量のsiRNAを患者に投与するが、これは、他の癌化学療法又は他の治療と併用して投与され得る。有効量を、患者を基準として患者ごとに決定して、患者の系において依然として存在するメタドヘリンの存在に関する反復アッセイにより直接的にモニタリングすることができる。治療は、癌の広がりが低減されるまで継続される。
乳癌を有する患者を選択する。乳癌転移の危険性は、癌を有さない患者に対して、メタドヘリンのレベルが増大した患者の系におけるメタドヘリンの存在を観察することにより決定され、患者は、乳癌転移の増大した危険性を有することを示す。続いて、メタドヘリンを対象とする有効量のsiRNAを患者に投与するが、これは、他の癌化学療法又は他の治療と併用して投与され得る。有効量を、患者を基準として患者ごとに決定して、患者の系において依然として存在するメタドヘリンの存在に関する反復アッセイにより直接的にモニタリングすることができる。治療は、乳癌が低減されるまで継続される。
Claims (39)
- 患者における腫瘍転移を阻害する方法であって、
腫瘍の転移の危険性がある患者を選択すること、及び
メタドヘリン又はその結合フラグメントの、その受容体への結合を阻害する有効量の化合物を前記患者へ投与して、患者における腫瘍転移を阻害することを含む方法。 - 前記メタドヘリンポリペプチドは、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記結合フラグメントは、配列番号17に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物は、メタドヘリンに優先的に結合するモノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物は、メタドヘリンの肺結合ドメインに優先的に結合するモノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
- 前記化合物はペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物はアンチセンス分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物はsiRNA分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記受容体は、肺血管系上に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物は、前記受容体への結合に関して競合するメタドヘリン又はそのフラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍は、乳癌腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 患者における転移性癌を診断する方法であって、
転移性癌の危険性がある組織を有する患者を選択すること、及び
前記組織が、正常な組織より高レベルのメタドヘリンを発現しているかどうかを決定することを含み、より高レベルのメタドヘリンは、転移性癌の徴候を示し、それにより患者における転移性癌を診断する方法。 - 前記組織が、正常組織より高レベルのメタドヘリンを発現しているかどうかは、前記組織を、メタドヘリンと優先的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体は標識されている、請求項13に記載の方法。
- 前記標識は、放射性標識又は比色性標識である、請求項14に記載の方法。
- 前記組織が、正常組織より高レベルのメタドヘリンを発現しているかどうかを決定することが、in vivoで実施される、請求項12に記載の方法。
- 乳癌を治療する方法であって、
乳癌の危険性がある患者を選択すること、及び
メタドヘリンの、その受容体への結合を阻害する有効量の化合物を前記患者へ投与して、乳癌を治療することを含む方法。 - 前記化合物は、メタドヘリンに優先的に結合するモノクローナル抗体である、請求項17に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体は、メタドヘリンの肺結合ドメインに結合する、請求項18に記載の方法。
- 前記化合物は、前記メタドヘリンの発現を阻害するアンチセンス分子である、請求項17に記載の方法。
- 前記化合物は、前記メタドヘリンの発現を阻害するsiRNA分子である、請求項17に記載の方法。
- 前記化合物は、メタドヘリン受容体への結合に関して競合するメタドヘリン又はそのフラグメントである、請求項17に記載の方法。
- 作用物質を患者の肺血管系へ送達する方法であって、
作用物質をメタドヘリンタンパク質に連結させて、メタドヘリン標的作用物質を創出すること、及び
前記メタドヘリン標的組成物を患者へ投与して、作用物質を患者の肺血管系へ送達することを含む方法。 - 前記メタドヘリンは、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する、請求項23に記載の方法。
- 作用物質を患者の肺血管系へ送達する方法であって、
作用物質をメタドヘリンの肺結合ドメインへ連結させて、メタドヘリン標的作用物質を創出すること、及び
前記メタドヘリン標的作用物質を患者へ投与して、作用物質を前記患者の肺血管系へ送達することを含む方法。 - 前記肺結合ドメインは、配列番号17に示されるアミノ酸配列を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記肺結合ドメインは、前記配列番号17に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記メタドヘリン標的作用物質を投与することは、前記メタドヘリン標的作用物質の静脈内投与を含む、請求項23又は25に記載の方法。
- 腫瘍転移に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法であって、
第1の試験化合物を選択すること、
メタドヘリンの存在下、前記第1の試験化合物とメタドヘリンポリペプチド受容体とを接触させること、及び
前記第1の化合物が、前記メタドヘリンポリペプチドの、前記受容体に対する結合に影響を及ぼすかどうかを決定することを含み、結合に影響を及ぼす化合物は、腫瘍転移に影響を及ぼす化合物であると決定され、それにより腫瘍転移に影響を及ぼす化合物をスクリ
ーニングする方法。 - 前記メタドヘリンポリペプチドは、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する、請求項29に記載の方法。
- 前記メタドヘリンポリペプチドの前記結合フラグメントは、配列番号17に示されるアミノ酸配列を有する、請求項29に記載の方法。
- 前記メタドヘリンポリペプチドは、メタドヘリンタンパク質の肺結合ドメインであり、前記肺結合ドメインは、前記配列番号17に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一である、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の試験化合物は、メタドヘリンに優先的に結合するモノクローナル抗体である、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の試験化合物はペプチドである、請求項29に記載の方法。
- 前記受容体は、肺血管系上に位置する、請求項29に記載の方法。
- 癌を有する疑いがある被験体における癌の診断画像を決定する方法であって、
検出可能な作用物質に結合されたメタドヘリン又はそのバリアントからなる、結合体を有効量患者へ投与すること、及び
前記検出可能な作用物質を観察することを含み、前記結合体の集中した領域は、癌の徴候を示し、それにより被験体における癌の診断画像を決定する方法。 - 前記検出可能な作用物質はインジウムである、請求項36に記載の方法。
- 前記検出可能な作用物質は蛍光分子である、請求項36に記載の方法。
- 前記検出可能な作用物質はローダミンである、請求項36に記載の方法。
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