JP2007507218A - 選択用オートマトンとバイオリアクター容器のカップリングによる生細胞の培養用プロセス及び装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、基質を連続的、半連続的又は不連続的に処理するための方法において、バイオリアクター容器(1)内に前記基質を設置する段階及び該基質上で反応(R1)を実施できるようにしかつそれに対し前記反応を改善する生細胞(C1)を用いて培地が定期的に接種される生細胞(C1)の培養の作用に付す段階から成る方法に関する。前記生細胞(C2)は、バイオリアクター容器(1)と同じ基質(24)による供給を受け当初バイオリアクター容器(1)のタンク内に収納された生細胞(C1)による接種を受けている自動選択装置(2)及び操作装置により実施される非静止生細胞の集合からの選択によって得ることができる。
Description
本発明は、選択用オートマトンとバイオリアクター容器のカップリングによる生細胞の培養用プロセス及び装置に関する。
廃棄物処理は、住民と行政にとって恒常性の増々高まる関心事となっている。処理の一つの重要な部分は、細菌叢が接種された槽を利用してプラント内で実施される。しかしながら、細菌叢は、経時的に進化し、この進化は往々にして、槽内で発生することが望まれる反応にとって不利なものである。
細菌培養のドリフトの問題は、例えば製薬業界において見られる一般的な問題である。この業界においては、無菌で作業することによりこのドリフトを回避している。
しかし、例えば廃棄物処理プラントではこのような条件で作業することは経済的に考えられない。
商業的に有利な代謝産物の産生又は例えば廃棄物又は汚水の生物分解のための、該業界で利用されているような培養装置は、外部環境に由来する種による汚染問題に直面している。機器の完全な封じ込めを意味する無菌条件下にある培養の導管は、外部種による汚染の問題に対する1つの解決法であるが、廃棄物の生物分解といったような利用分野における処理コストを理由として考慮が困難であるか又は例えばラグーン池法などにおける微生物集団の広範な利用において実施することは不可能でさえある。
なお国際公開第00/34433号は、懸濁状態の生細胞の選択及び増殖の加速化を可能にする1つの技術について記述している。従って、無限の期間にわたり恒常な細胞濃度(タービドスタット)を維持することにより、記述された装置は、生細胞の静止変異体すなわち導管と容器の間で滞留している生細胞を除去すると同時に培養条件に対し一段と良好に適合されていく懸濁状態にとどまっている非静止変異体を優先する自動化された選択プロセスとしての挙動を示す。
数m3ひいては数十又は数百m3の体積を処理するためのかかる装置の工業化は、単なる相似変換によって考慮され得るが、その作動は、以下の理由からコストのかかるものとなる;
− 1つの槽からもう1つの槽への定期的移送ならびに殺菌及び洗い流し用流体及び培養用添加剤の定期的移送のために利用される手段はエネルギーを消費する、
− 殺菌及び洗い流し用流体の消費量が多い、
− 一度に1つの槽しか利用されず、もう一方は待機状態にあり、従ってプロセスにとって無用である。それでも、この槽は培養の発達に必要な全ての機器すなわち温度調節、殺菌システム、攪拌システムなどを有していなくてはならない。
− 高い培養密度で大きなサイズのバイオリアクター容器中の混濁度を連続的に読みとるのが困難である。
− 1つの槽からもう1つの槽への定期的移送ならびに殺菌及び洗い流し用流体及び培養用添加剤の定期的移送のために利用される手段はエネルギーを消費する、
− 殺菌及び洗い流し用流体の消費量が多い、
− 一度に1つの槽しか利用されず、もう一方は待機状態にあり、従ってプロセスにとって無用である。それでも、この槽は培養の発達に必要な全ての機器すなわち温度調節、殺菌システム、攪拌システムなどを有していなくてはならない。
− 高い培養密度で大きなサイズのバイオリアクター容器中の混濁度を連続的に読みとるのが困難である。
これらの理由から、汚水の生物分解には現在、その性質を作業員が掌握しきれないさまざまな細菌集団が利用されており、その性能又は効能が、基質すなわち汚水中に存在する分解すべき化合物に向けて選択された種のみを利用することはできていない。
従って、汚水中に存在する分解すべき化合物に対するその性能又はその効能のために選択された種を基本的に使用できるようにする、特に汚水の生物分解の技術を入手することが望まれる。
ところで、長い間の研究の後、出願人は、大きなサイズのバイオリアクター容器内又は例えばラグーン池又は水域といった自然環境内の増殖条件を再現し制御することができかつ、封じ込め及び殺菌を援用する必要なく又培養条件に一段と良好に適合された生細胞の非静止変異体を優先させて、連続、半連続又は連続的に機能するプロセスを発見した。
このプロセスは基本的に、バイオリアクター容器と生細胞の自動選択装置の間の協働に基づいている。
このような理由から、当該出願は、基質の連続、半連続又は不連続処理プロセスにおいて、バイオリアクター容器内に設置された前記基質が、その上で反応R1を実施できるようにする生細胞C1の培養の作用に付され、前記反応を改善する生細胞C1を用いて培地に定期的にそして好ましくは規則的に接種するプロセスであって(なおここで前記生細胞C2は、非静止生細胞集合の好ましくは専ら懸濁状態での自動選択装置によって実施された選択に由来し、前記生細胞自動選択装置はバイオリアクター容器と異なる基質又は同じ基質による補給を受けており、当初はバイオリアクター容器の槽内に存在する生細胞C1の接種を受けている)、そして、有利にはバイオリアクター容器の槽内で生細胞を採取してそれを自動選択装置内に移送するプロセスを目的としている。
望ましい場合には、選択装置又はバイオリアクター容器に対しいつでも、例えば細胞濃度を増大させるため又は新規の種を導入するために、その他の生細胞を添加することができる。
本出願内そして以下の論述において、「非静止生細胞」というのは、懸濁状態で増殖し定方向選択に付された生細胞を意味する(逆に「静止生細胞」は、容器及び導管の表面に付着し、かくして選択を免れた生細胞を意味する)。有利には定期的に、静止生細胞を除去する。
一般に、生細胞C2として、懸濁状態で増殖し有効選択に付された生細胞が利用される。いくつかの利用分野においては、生細胞C2として、非静止生細胞ではなく静止生細胞が利用されることになる。
基質は、生細胞C1、C2などの培養の維持を可能にする。
本発明の好ましい実施条件下では、非静止生細胞の自動選択装置は、
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器、
− 殺菌、清浄又は中和用流体をこれらの容器に別々に補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に気体を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器の中味をもう1つの容器の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を有する。
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器、
− 殺菌、清浄又は中和用流体をこれらの容器に別々に補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に気体を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器の中味をもう1つの容器の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を有する。
実施の開始時点で、生細胞C1が、バイオリアクター容器の槽内及び自動選択装置内に存在している。経時的に、選択装置は、培養条件につねにより良好に適合した非静止生細胞C2の変異体の出現及び増殖を優先させ(選択し)、適合度の低い生細胞C1を対向選択する。生細胞C2はバイオリアクター容器内に移送され、そこで生細胞C1と競合し、それらに取って代わる。最後に、生細胞C1の集団が生細胞C2により置換されたことが確認される。好ましくは、並行して、バイオリアクター容器の槽内で生細胞が採取されて自動選択装置内に移送される。
非静止生細胞の自動選択装置は特に、
(a)1つの培養を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器、
(b)気体供給源、
(c)培地供給源、
(d)殺菌剤用供給源、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器のうちの一方を選好により培地供給源に連結するためならびに2つの培養容器を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源に対し選好によりもう1つの培養容器を連結するための手段を含む導管系、
を有する。
(a)1つの培養を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器、
(b)気体供給源、
(c)培地供給源、
(d)殺菌剤用供給源、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器のうちの一方を選好により培地供給源に連結するためならびに2つの培養容器を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源に対し選好によりもう1つの培養容器を連結するための手段を含む導管系、
を有する。
利用される気体は、好気性又は嫌気性生細胞に適合させることができる。
本発明のその他の好ましい実施形態においては、2つの培養容器の間には、共通の導管区間を有する2本の連絡用導管が具備されている。
本発明のその他の好ましい実施形態においては、共通導管区間上には、培養容器の培養を採取できる排出用導管が具備されている。反応を改善する生細胞C2は好ましくはこの導管を通して採取される。
本発明のさらにその他の好ましい実施形態においては、
− バイオリアクター容器及び自動選択装置には同じ基質が補給されている、
− バイオリアクターは連続的に作動するため、基質の取込みライン上に適用される基質補給流量は、培地の排出ラインに適用されるものと同一である。
− バイオリアクター容器及び自動選択装置には同じ基質が補給されている、
− バイオリアクターは連続的に作動するため、基質の取込みライン上に適用される基質補給流量は、培地の排出ラインに適用されるものと同一である。
利用可能な生細胞C2の遺伝子的自動選択装置は、特に、国際出願第00/34433号中に記述された、バイオリアクター容器内に維持された培養条件に一段と良好に適合されるいわゆる「非静止」変異体生細胞を選択装置がつねに優先させるような培養条件に従って作動し得る装置である。
バイオリアクターの作動と並行して自動選択装置内に存在する培養の全部又は一部をバイオリアクター容器に向かって定期的に移送する。
従って本発明においては、予め設定されバイオリアクター容器に課せられた培養条件に一段と良好に適合される非静止変異体生細胞の貯蔵をつねに備えている。
選択装置により選択される高い成長率をもつ非静止変異体生細胞は、バイオリアクター容器内に定期的に接種され、ここで、槽内に存在するより低い成長率をもつ静止生細胞に取って代わる。
槽内に存在する生細胞の成長率と選択装置が選択した増大した成長率の生細胞の成長率の比から、選択装置に由来する生細胞がバイオリアクターの槽内に存在する生細胞に急速にとって代ることになる。
実際、選択装置由来の生細胞の成長率はつねに、バイオリアクター容器内に存在する生細胞の最大成長率以上となる。
要約すると、連続的培養中に、選択用オートマトンに由来する生細胞の成長率がバイオリアクター容器内に存在する生細胞の成長率と等しい場合には、生細胞全体が同時に進化することになり;それが上回っている場合には、選択用オートマトンに由来する生細胞はバイオリアクター容器内にすでに存在するものを圧倒することになる。
なお、自動選択装置に向かってのバイオリアクター容器の生細胞を定期的に移送することにより、2つの生細胞集団を競合状態に置き、バイオリアクター容器由来の場合によって得られる変異体及び自動選択装置のものの中からバイオリアクターの条件に最も良好に適合した生細胞を選択するという確信が得られる。
従ってバイオリアクター容器内で行なわれる生物転換又は生物分解プロセスの性能は、最悪でも維持されており、通常は、つねに培養条件により良好に適合させられているためつねにより性能が高いものである自動選択装置由来の活性な生細胞によってバイオリアクター容器内に存在する活性生細胞が定期的に置換されているおかげで常時改善されている。
なお、接種は定期的にひいては培養条件に一段と良好適合させられた生細胞を用いて反復されており、自動選択装置は、バイオリアクター容器内に存在する基質に対する最も活性の高い生細胞の優位性を保証する。
例えば25mlの培養容器しか備わっていない小さいサイズの自動選択装置で、100m3の汚水処理場のエアレーションタンクといったようなバイオリアクター容器を効率良く機能させるのに充分である。当然のことながら、例えば1リットルといったより大きな体積の培養容器を利用することも可能である。
生物転換反応を改善する利用された生細胞C2は特に、
(a)少なくとも1つの第1の培養容器内への培養の提供、
(b)気体供給源からの気体を用いた第1の培養容器内への培養の連続的補給及び培地供給源からの液体の規則的再供給、
(c)適切な導管回路を用いた少なくとも1つの培養容器内への結合用導管を介した第1の培養容器からの培養の移送、
(d)第1の培養容器を殺菌するための、殺菌剤用供給源と第1の培養容器の接続、
(e)第1の培養容器からの殺菌剤の除去、
(f)気体供給源からの気体を用いた第2の培養容器内への培養の連続的補給及び培地供給源からの液体の規則的再供給、
(g)適切な導管回路を用いた第1の培養容器内の供給用導管による第2の培養容器の培養の戻り、
(h)第2の培養容器を殺菌するための、殺菌剤用供給源と第2の培養容器の接続、及び
(i)第2の培養容器の殺菌剤の除去、
という段階を含むプロセスを実施することによって産生される。
(a)少なくとも1つの第1の培養容器内への培養の提供、
(b)気体供給源からの気体を用いた第1の培養容器内への培養の連続的補給及び培地供給源からの液体の規則的再供給、
(c)適切な導管回路を用いた少なくとも1つの培養容器内への結合用導管を介した第1の培養容器からの培養の移送、
(d)第1の培養容器を殺菌するための、殺菌剤用供給源と第1の培養容器の接続、
(e)第1の培養容器からの殺菌剤の除去、
(f)気体供給源からの気体を用いた第2の培養容器内への培養の連続的補給及び培地供給源からの液体の規則的再供給、
(g)適切な導管回路を用いた第1の培養容器内の供給用導管による第2の培養容器の培養の戻り、
(h)第2の培養容器を殺菌するための、殺菌剤用供給源と第2の培養容器の接続、及び
(i)第2の培養容器の殺菌剤の除去、
という段階を含むプロセスを実施することによって産生される。
上述のプロセスの好ましい実施条件においては、段階(b)〜(h)が少なくとも一回反復される。
本出願及び以下の記述において、「バイオリアクター容器」という語は、例えば浄水場のエアレーションタンク、嫌気性生物学的処理プラントのメタン化タンク、ラグーン池、水域、例えば0.5リットル〜100m3特に1リットル〜100m3、特に5リットルから50m3そして特に10リットル〜50m3の槽又は例えば0.5リットル〜100m3、特に1リットル〜100m3、特に5リットル〜50m3そして特に10リットル〜50m3の発酵装置を意味する。
本出願及び以下の記述において、「基質」という語は、代謝的転換が考慮されている化合物を含有する培地、特に例えば炭化水素貯蔵槽の洗浄用水、薬学的中間体の生産施設の洗浄用水、ろ過ケークの洗い流し用水、化学薬品生産に由来する煙の洗浄用水、航空機の除霜に由来する廃水、例えば家庭排水といったような都市由来の水、例えば海中のそれぞれ石油タンカー又はケミカルタンカーの難破に由来する炭化水素又はその他の化学薬品の層の存在といったような環境の偶発的汚染物質、(道路又は鉄道の)輸送用タンク車が関与する事故の後に土壌の上に広がった化学廃水、重金属又はダイオキシンで汚染された土壌を意味する。
「基質」という用語は同様に、例えばリジンといった工業的に有利な生体分子の生産に役立つグルコース、キサンタン、アルギナート、グリセロールといったポリオール、ハイグロマイシン、酢酸発酵による酢の生産に役立つエタノール、生物湿式治金の利用分野に利用されるシュウ酸、ペクチン及びカラギナンといった、代謝的転換を考慮されている化合物をも意味している。
「基質」という用語は、さらに、例えば都市又は工業廃水の活性汚泥、製紙工業由来のリグノセルロース誘導体、農産物加工業由来の固体又はペースト状副産物例えば植物バイオマス特に切取られた草)、ビールかす、酵母、糖蜜さらには例えばカニ又はエビの甲殻に由来するものといったキチン質誘導体といった漁業副産物などの、代謝的転換が考慮されている生きた又は死んだ細胞を含有する培地をも意味する。
「基質」という用語は同様に、揮発性有機塩素系化合物(例えば塩素系溶剤及びCFC)、有機塩素系殺虫剤(例えばDDT);ハロゲン化多環式芳香族炭化水素(例えばPCB、ダイオキシン及びフラン);溶剤(例えばベンゼン、トルエン、キシレン)、有機塩素系又は有機リン系殺菌殺虫剤化合物といった汚染性分子をも意味する。
「生細胞」という用語は、例えば(ダイオキシンの生物転換の触媒として作用する)Sphingomonas wittichii、(シアン化物及びシアン酸塩の生物転換の触媒として作用する)Pseudomonas putida、(プロモオキニルといった殺虫剤の生物転換の触媒として作用する)Agrobacterium radiobacter、(数多くの脂肪族炭化水素を生物分解する能力をもつ)或る種のAlcanivorax又はAcinetobacter菌株、(キサンタンの生合成に関与する)Xanthomonas campestris又は(ゲランの生合成に関与する)Spingomonas paucimobilisといったような単数又は複数の細菌叢を意味する。
「生細胞」という用語は同様に、組換え型タンパク質又は(細胞Sf9といった)昆虫病原性ウイルス粒子の生産のための昆虫細胞成長細胞因子である、モノクローナル抗体産生のための哺乳動物細胞(例えば細胞HEK−293)といったような動物細胞をも意味する。
「生細胞」という用語は同様に、トロパンアルカロイド(アトロピン、ヒヨスチアミン、及びスコポラミン)の産生のためのDatura植物細胞といった植物細胞、(ジャガイモによるでんぷんの過剰産生といったような)工業用分子の産生のための遺伝子組換え植物細胞をも意味する。
「生細胞」という用語は又、反応性黄色22号といったような着色剤を含有する廃液の生物学的処理に関与するSpirogyra種に属する緑色海藻といった海藻、プロゲステロンの生物転換に役立つ微細藻類Scenedesmus qudricaudaの培養、p−クロロフェノールの生物分解に介入する微細藻類Cholorella Vulgaris及びCoenochloris pyrenoidosa、鉛を除去する能力をもつ巨大藻類Microsporaをも意味する。
「生細胞」という用語は同様に、グルコースからバイオエタノールを生産すること又はグルコースからキシリトールを生産することに役立つSaccharomyces cerevisiaeといった酵母、(オリーブ油の生産に由来する)フェノール系化合物の生物分解に役立つCandida tropicalis YMEC14、ニトリル系化合物の生物分解に役立つCandida famataをも意味する。
「生細胞」という語は、キシランを解重合する酵素であるキシラナーゼを産生する能力をもつPenicillium janthinellum、唯一の炭素供給源としてグルコースからセファロスポリンCを産生する能力をもつStreptomyces clavuligerus、又は二塩化及び四塩化ダイオキシンを生物分解する能力をもつPhanerochaete chrysosporiumといったキノコをも同様に意味する。
「生細胞」という用語は同様に、ヒ素の生物転換に関与するEuglena mutabilis(好酸性原生動物)といった原生動物をも意味する。
「生細胞」という用語は又、以上で援用したあらゆるタイプの生細胞の混合物をも意味する。
生細胞の自動選択装置に由来する定期的接種は、例えば48時間毎、好ましくは一週間に少なくとも1回、特に少なくとも1ヵ月に1回そして特に生細胞C2の成長率の著しい改善が見られた後に行なわれる。
本発明の目的である基質の連続、半連続又は不連続処理プロセスは、非常に興味深い長所を有している。これらのプロセスは特に、例えばバイオリアクター容器中に存在する生細胞のものよりも低い成長率をもつ汚染物質といった培地に対する適合度の最も低い生細胞を除去することによって、存在する生細胞の制御を実施して従来の設計のバイオリアクターの機能を生物学的に制御することを可能にする。従って、無菌性の制約条件から解放されることが可能である。
例えば1リットルのバイオリアクター容器の備わった小サイズの選択装置で、4000m2の体積の水域といったような容器を効率良く機能させるのに充分である。
該発明は同様に、利用されている装置を作り直すことなく、該プロセスにおいて利用される生細胞の活性を増大させることにより従来の設計の培養プロセスの効率を改善できるようにする。かくして、問題の分子の産生収率及び/又は基質の分解速度を増大させることができる。
これらの長所は、以下の実験の部で例示されている。
これらの長所は、例えば取扱いにくい化合物の生物分解における上述のプロセスの利用を正当化するものである。実際、今日、化学工業に由来する多数の廃棄物はコストの高い焼却によって破壊されているが、これは、人間及びその環境にとって危険な組成物の大気内放出のリスクに関連する重要な環境上の危険性を孕んでいる。これらの廃棄物(又は生物転換)の生物学的処理は、必要な処理時間によってか又は廃棄物内に存在する化合物を代謝する能力を生細胞がもたないことによって、又さらには細菌活性全体に対する或る種の化合物の阻害効果によって、往々にして不可能となっている。
該発明の装置は、廃棄物の生物転換専用のバイオリアクター容器の中に、廃棄物中に存在する化合物に対し特異的に適合され高い性能を示す生細胞を維持し、従来焼却により破壊されていた廃棄物の生物転換を可能にする。
選択装置のおかげで培地に一段と良好に適合された生細胞を選択することにより、該発明は、実施用装置を作り直すことなく該プロセスにおいて利用される生細胞の活性を増大させて、従来の設計の培養プロセスの効率を改善できるようにする。
これらの長所は同様に、廃液の生物学的処理場の作動の改善における上述のプロセスの利用を正当化する。実際、都市又は工業廃液の浄水場の良好な機能は、存在する生細胞にとって取扱いにくい化合物が廃液中に偶発的に存在することによって影響され得る。以上で記述されているような装置の付加によりこの問題を改善するよう考慮することができる。
この場合、バイオリアクター容器は、浄水場の既存のエアレーションタンクという形で具体化される。自動選択装置の補給は、例えば一次デカンテーションタンク中のエアレーションシステムの上流側にある分岐によって実現され得る。選択装置とバイオリアクター容器の相互の接種は、以下の図1に例示されている通りに実現される。同様に、エアレーションタンクの上流側で採取された培地との関係において修正された基質をオートマトンに補給するため外部接続ラインを利用することもできる。この装置は、廃液中に場合によって存在する取扱いにくい化合物の生物分解に適合された生細胞をエアレーションタンク内で富化するためにも利用できる。
これらの長所は同様に、例えば生合成性能の改善における上述のプロセスの利用をも正当化する。本発明はこの目的で、生体触媒反応による工業的合成プロセスの性能(収率、成長時間)の改善のために利用可能である。
今日、バッチ式であれ連続式であれ発酵に基づく生合成の性能の改善は、培地の組成及び培養の物理化学的パラメータ(温度、酸素処理、pHなど)の最適化によって行なわれている。
これらの開発は、時間と費用がかかり、いずれにせよ存在する生細胞の代謝によって制限される。
該発明は、存在する生細胞の代謝に作用することで、技術経済的必要性によって課せられる条件に前記生細胞を適合させ、その成長率を増大させ、ひいては生合成の包括的性能を増大させることができる。
例えば、ポリオール(ソルビトール、マンニトール、キシリトール…)の産生に介入するいわゆる高稠耐性の酵母の場合、30g/lに近いグルコース濃度上で、4〜5日の培養時間が観察される。
該発明によると、その成長率を増大させながら、すなわち培養に必要な時間を削減することにより、所望の細胞外又は細胞内代謝産物の産生へとその天然の代謝を方向づけるような形でさらに上昇する濃度のグルコースと酵母を接触させることができる。
この改善は、利用される機器の生産性の増大及び生合成の原価の低下という形で現われる。
該発明に従ったプロセスは、長期間にわたり、又さらに無限に利用することができる。
本出願は同様に、
−A: 好ましくは、
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器、
− 殺菌、清浄又は中和用流体をこれらの容器に別々に補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に気体を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器の中味をもう1つの容器の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ、
− 任意には、これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を含んで成る選択装置、
−B: バイオリアクター容器
−C: 選択装置とバイオリアクター容器の間で生細胞を移送するための手段系、
−D: 任意にはデカンタといったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器を連結するための手段を有する導管、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る生細胞の培養装置をも目的としている。
−A: 好ましくは、
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器、
− 殺菌、清浄又は中和用流体をこれらの容器に別々に補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に気体を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器の中味をもう1つの容器の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ、
− 任意には、これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を含んで成る選択装置、
−B: バイオリアクター容器
−C: 選択装置とバイオリアクター容器の間で生細胞を移送するための手段系、
−D: 任意にはデカンタといったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器を連結するための手段を有する導管、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る生細胞の培養装置をも目的としている。
1つの容器の中味をもう1つの容器に及びその逆に移送するための手段は、導管といったような物理的手段又は一方の中で採取を実施してもう一方の中にそれらを移送する人的手段であり得る。
本出願はより特定的には、
−A:(a)1つの培養を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器、
(b)気体供給源、
(c)培地(基質)供給源、
(d)殺菌剤用供給源、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器のうちの一方を選好により培地供給源に連結するためならびに2つの培養容器を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源に対し選好によりもう1つの培養容器を連結するための手段を含む導管系;
を含んで成る生細胞の選択装置、
−B: バイオリアクター容器、
−C: 選択装置をバイオリアクター容器の間で生細胞を移送するための手段系、
−D: 任意にはデカンタといったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器を連結するための手段を有する導管、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る生細胞の選択用オートマトンとのカップリングによる生細胞の培養装置を目的としている。
−A:(a)1つの培養を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器、
(b)気体供給源、
(c)培地(基質)供給源、
(d)殺菌剤用供給源、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器のうちの一方を選好により培地供給源に連結するためならびに2つの培養容器を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源に対し選好によりもう1つの培養容器を連結するための手段を含む導管系;
を含んで成る生細胞の選択装置、
−B: バイオリアクター容器、
−C: 選択装置をバイオリアクター容器の間で生細胞を移送するための手段系、
−D: 任意にはデカンタといったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器を連結するための手段を有する導管、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る生細胞の選択用オートマトンとのカップリングによる生細胞の培養装置を目的としている。
該発明の好ましい実施条件においては、
− 自動選択装置の中で進化させるべくバイオリアクター容器内に存在する生細胞を採取することを可能にするため、バイオリアクター容器と自動選択装置の間に抜き出し用ラインが設置される、
− 自動選択装置の中で進化した生細胞を反復的かつ規則的にバイオリアクター容器に植えつけできるようにするため自動選択装置とバイオリアクター容器の間に接種ラインが設置される、
− 補足的ラインが単数又は複数の添加剤でオートマトンの培地を富化できるようにする。
− 洗い流し用及び殺菌用廃液収集タンクが、自動選択装置の殺菌及び洗い流し用流体の収集を可能にする、
− ポンプアセンブリが異なる流体の移送を可能にする。
− 自動選択装置の中で進化させるべくバイオリアクター容器内に存在する生細胞を採取することを可能にするため、バイオリアクター容器と自動選択装置の間に抜き出し用ラインが設置される、
− 自動選択装置の中で進化した生細胞を反復的かつ規則的にバイオリアクター容器に植えつけできるようにするため自動選択装置とバイオリアクター容器の間に接種ラインが設置される、
− 補足的ラインが単数又は複数の添加剤でオートマトンの培地を富化できるようにする。
− 洗い流し用及び殺菌用廃液収集タンクが、自動選択装置の殺菌及び洗い流し用流体の収集を可能にする、
− ポンプアセンブリが異なる流体の移送を可能にする。
上述のプロセスの好ましい実施条件は、同様に、上述の該発明のその他の目的、特にそれらの実施用装置にもあてはまる。
図1では、復路5及び往路6の導管システムにより自動培養選択装置2に連結されたバイオリアクター容器1が見られる。これらの導管の上にはポンプ13、14が具備されている。
外部的に基質が補給され、導管系4により一方では自動培養選択装置2に又他方ではバイオリアクター容器1に連結されている基質緩衝タンク11も見える。これらの導管上にはポンプ9、10が具備されている。
自動非静止生細胞S2の洗い流し及び殺菌用廃液収集タンク8が具備されている。
自動非静止生細胞S2内に付加するための、添加物取込み導管12が具備されている。
該装置は特に以下のように機能し得る;
バイオリアクター容器1及び自動選択装置2は、経路3及び4を通ってそれぞれ同じ基質の補給を受ける。
バイオリアクター容器1及び自動選択装置2は、経路3及び4を通ってそれぞれ同じ基質の補給を受ける。
バイオリアクター1は連続的に機能しており、ライン3上に適用される基質補給流量は、培地の抜き出しに対応するライン7に適用されるものと同一である。ライン7は、デカンタといったような図示されていない固体−液体分離装置へと導くことができる。
自動選択装置2とバイオリアクター容器1の間に設置された接種ライン5が、自動選択装置2内で進化した生細胞を反復的かつ規則的にバイオリアクター容器1に植菌することを可能にする。
バイオリアクター容器1と自動選択装置2の間に設置された抜き取りライン6が、バイオリアクター容器1内に存在する生細胞を採取してそれらを自動選択装置2内で進化させることを可能にする。
補足的ライン12が、オートマトンの培地を単数又は複数の添加物で富化できるようにする。
ゴミ箱8が、自動選択装置の殺菌及び洗い流し用流体の収集を可能にする。
ポンプアセンブリ9、10、13及び14が、異なる流体の移送を可能にする。
図2には、汚水の生物学的浄化装置が見られる。
上述の要素の一部分、すなわちエアレーションタンクであるバイオリアクター容器1とそれぞれ経路3及び4により同じ基質の補給を受けている自動選択装置、バイオリアクター容器1と自動選択装置2の間に設置された接種及び抜き出し用ライン5及び6、及びこの場合デカンタ16である固体−液体分離装置にバイオリアクター容器1を連結するための手段を有する導管15、が見られる。
図3には、培養22を収容するための第1及び第2の培養容器20、21、気体供給源23、培地供給源24、殺菌剤用供給源25及び、ゲート弁といったような、2つの培養容器20又は21のうちの一方を選好により培地供給源24に連結するためならびに2つの培養容器20、21を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源25に対し選好によりもう1つの培養容器20又は21を連結するための手段を含む導管系が見られる。太線は、プロセスの実施段階の1つの際に活動状態にある導管を表わしている。
この装置は、少なくとも1つの第1の培養容器20内への培養22の提供、気体供給源23からの気体を用いた第1の培養容器20内への培養22の連続的補給及び基質供給源24からの液体の規則的再供給、適切な導管回路を用いた少なくとも1つの培養容器21内への結合用導管28〜31を介した第1の培養容器20からの培養22の移送、第1の培養容器20を殺菌するための、殺菌剤用供給源25と第1の培養容器20の接続、第1の培養容器20からの殺菌剤の除去、気体供給源23からの気体を用いた第2の培養容器22内への培養22の連続的補給及び培地供給源24からの液体の規則的再供給、適切な導管回路を用いた第1の培養容器20内の供給用導管28〜31による第2の培養容器21の培養22の戻り、第2の培養容器21を殺菌するための、殺菌剤用供給源25と第2の培養容器21の接続、及び第2の培養容器21の殺菌剤の除去を可能にする。
以下の実施例は、本出願を例示している。
例1:殺菌剤生産に由来する廃棄物の生物転換
殺菌剤生産に由来する廃棄物を含む基質を有効5リットル入りバイオリアクター容器に0.75mL/分の定流量で連続補給する。この廃棄物の分析は、以下の化学的化合物を明らかにしている:アルコール(例:2−ブトキシエタノール)、アルカン(例:プロパン−2,2−ジメトキシ)、クロロフェノール(例:2,4−ジクロロフェノール)、芳香族(例:1.1’−ビフェニル、1−メチルナフタレン、2−メチルナフタレン、2−エチルナフタレン)、臭素化化合物(例:ベンゾニトリン−3,3−ジブロモ−4−ヒドロキシ)及び殺菌剤(例:2,4−D−ブトキシエチルエステル、MCP及びMCPP)。この廃棄物の化学的酵素要求量は2450mg/Lである。バイオリアクター容器には、異なる生態的地位(ニッチ)及び浄水場の活性汚泥に由来する採取標本から単離された微生物の生細胞の混合物10mLが接種される。これらの生細胞は、廃棄物を分解する能力を有することを理由に選択される。
殺菌剤生産に由来する廃棄物を含む基質を有効5リットル入りバイオリアクター容器に0.75mL/分の定流量で連続補給する。この廃棄物の分析は、以下の化学的化合物を明らかにしている:アルコール(例:2−ブトキシエタノール)、アルカン(例:プロパン−2,2−ジメトキシ)、クロロフェノール(例:2,4−ジクロロフェノール)、芳香族(例:1.1’−ビフェニル、1−メチルナフタレン、2−メチルナフタレン、2−エチルナフタレン)、臭素化化合物(例:ベンゾニトリン−3,3−ジブロモ−4−ヒドロキシ)及び殺菌剤(例:2,4−D−ブトキシエチルエステル、MCP及びMCPP)。この廃棄物の化学的酵素要求量は2450mg/Lである。バイオリアクター容器には、異なる生態的地位(ニッチ)及び浄水場の活性汚泥に由来する採取標本から単離された微生物の生細胞の混合物10mLが接種される。これらの生細胞は、廃棄物を分解する能力を有することを理由に選択される。
59.18%の安定した生物転換収率を表わす1000mg/Lという残留CODを固定することで、連続的作動状態を維持する。
なお、25mLの培養容器を備えた国際出願第00/34433号の図1に記述されたタイプの自動選択装置にも、前述のものと同じ基質を補給し、同じ生細胞混合物を接種する。従って、当初2つの容器内には同じ生細胞がある。
選択システム(タービスタットでの検出)について混濁度の基準値が達成された時点で直ちに、自動選択装置中に存在する培地10mLでのバイオリアクター容器の接種が自動的に開始される。
9週間の作動の後、この期間に成長率が倍増した(0.009から0.018h-1となった)自動選択装置に由来する生細胞が、バイオリアクター容器内にもともと存在していた生細胞集団に置き換わったことが確認される。この最終段階で、2つの微生物のみを、Delftia acidovorans及びPseudomonas putida Aとして同定することができた。
このことから、同じ生物転換収率を維持しながら、発酵装置の補給流量を100%増大することが可能であった。
該発明は、以下の図を含む添付図面を参照することにより、さらによく理解することができる。
該発明の装置の概略図を表わす。
汚水の生物学的浄化装置の概略図を表わす。
国際公開第00/34433号中に記述された自動選択装置の概略図を表わす。
Claims (12)
- 基質(24)の連続、半連続又は不連続処理プロセスにおいて、バイオリアクター容器(1)内に設置された前記基質(24)が、その上で反応R1を実施できるようにする生細胞C1の培養の作用に付され、前記反応を改善する生細胞C1を用いて培地に定期的に接種するプロセスであって(なおここで前記生細胞C2は、非静止生細胞集団の自動選択装置(2)によって実施された選択に由来し、前記生細胞自動選択装置(2)はバイオリアクター容器(1)と異なる基質又は同じ基質(24)による補給を受けており、当初はバイオリアクター容器(1)の槽内に存在する生細胞C1の接種を受けている)、さらにバイオリアクター容器(1)の槽内で生細胞を採取してそれを自動選択装置(2)内に移送するプロセス。
- 非静止生細胞の自動選択装置(2)が、
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器(20、21)、
− 殺菌、清浄又は中和用流体(25)をこれらの容器に別々に補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に気体(23)を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質(24)を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器(20)の中味をもう1つの容器(21)の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ(28〜31)、
− これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器(1)といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器(20、21)の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を有することを特徴とする請求項1に記載のプロセス。 - 非静止生細胞の自動選択装置が特に、
(a)1つの培養(22)を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器(20、21)、
(b)気体供給源(23)、
(c)培地(基質)供給源(24)、
(d)殺菌剤用供給源(25)、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器(20又は21)のうちの一方を選好により培地供給源(24)に連結するためならびに2つの培養容器(20、21)を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源(25)に対し選好によりもう1つの培養容器(20又は21)を連結するための手段を含む導管系、
を有することを特徴とする請求項1又は2に記載のプロセス。 - 生細胞C2が専ら懸濁状態の非静止生細胞の1集団内で行なわれた選択に由来することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロセス。
- バイオリアクター容器(1)が浄水場のエアレーションタンク、嫌気性生物学的処理プラントのメタン化タンク、ラグーン池、水域、0.5リットル〜100m3の槽又は発酵装置であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のプロセス。
- 生物転換反応を改善する利用された生細胞C2が特に、
(a)少なくとも1つの第1の培養容器(20)内への培養(22)の提供、
(b)気体供給源(23)からの気体を用いた第1の培養容器(20)内への培養(22)の連続的補給及び基質供給源(24)からの液体の規則的再供給、
(c)適切な導管回路を用いた少なくとも1つの培養容器(21)内への結合用導管(28〜31)を介した第1の培養容器(20)からの培養(22)の移送、
(d)第1の培養容器(20)を殺菌するための、殺菌剤用供給源(25)と第1の培養容器(20)の接続、
(e)第1の培養容器(20)からの殺菌剤の除去、
(f)気体供給源(23)からの気体を用いた第2の培養容器(21)内への培養(22)の連続的補給及び培地供給源(24)からの液体の規則的再供給、
(g)適切な導管回路を用いた第1の培養容器(20)内の供給用導管(28〜31)による第2の培養容器(21)の培養(22)の戻り、
(h)第2の培養容器(21)を殺菌するための、殺菌剤用供給源(25)と第2の培養容器(21)の接続、及び
(i)第2の培養容器(21)の殺菌剤の除去、
という段階を含むプロセスを実施することによって産生されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のプロセス。 - 基質(24)が、
− 例えば工業用水、例えば家庭排水といった都市用水、例えば海中の炭化水素又はその他の化学製品層の存在といった環境の偶発的汚染物質、土壌上に広がった化学廃水、重金属又はダイオキシンで汚染された土壌などの、代謝転換が考慮されている化合物を含有する培地、又は
− 例えばグルコース、エタノール又はしゅう酸といった代謝転換が考慮されている化合物、又は
− 揮発性有機塩素系化合物、有機塩素系農薬、水素化多環式芳香族炭化水素又は溶剤、
であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載のプロセス。 - 生細胞が単数又は複数の細菌種、動物又は植物細胞、海草、酵母菌又はキノコを含んで成ることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロセス。
- 生細胞の自動選択装置(2)に由来する定期的接種が少なくとも1週間に1回実施されることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- −A: 基質(24)の生物転換反応R1を改善する生細胞C2の選択装置であって、前記生細胞C2が生細胞C1から派生した変異体であり、前記生細胞C2が生細胞C1によって産生された細胞に比べ改善された1つの反応を生成する、選択装置、
−B: バイオリアクター容器(1)
−C: 選択装置(2)からバイオリアクター容器(1)に向かう移送を操作するための手段を有する導管系(5)及びバイオリアクター容器(1)から選択装置(2)に向かう移送を操作するための手段を有する導管系(6)、
−D: 任意にはデカンタ(16)といったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器(1)を連結するための手段を有する導管(15)、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る生細胞の培養装置。 - 選択装置(2)が、
− 生細胞培養を収容し維持できるようにする2つ以上の容器(20、21)、
− これらの容器に気体(23)を補給できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器に基質(24)を補給できるようにする手段アセンブリ、
− 1つの容器(20)の中味をもう1つの容器(21)の中に及びその逆に移送できるようにする手段アセンブリ(28〜31)、
− これらの容器の中味の全部又は一部をバイオリアクター容器(1)といったようなもう1つの装置へと排出できるようにする手段アセンブリ、
− これらの容器(20、21)の中味の全部又は一部をゴミ箱へと排出できるようにする手段アセンブリ、
を含んで成ることを特徴とする請求項10に記載の生細胞の培養装置。 - −A: 1つの培養(22)を収容するための少なくとも1つの第1の及び少なくとも1つの第2の培養容器(20、21)、
(b)気体供給源(23)、
(c)培地(基質)供給源(24)、
(d)殺菌剤用供給源(25)、及び
(e)ゲート弁といったような、2つの培養容器(20又は21)のうちの一方を選好により培地供給源(24)に連結するためならびに2つの培養容器(20、21)を互いに連結するための手段及び殺菌剤供給源(25)に対し選好によりもう1つの培養容器(20又は21)を連結するための手段を含む導管系;
を含んで成る生細胞の培養装置(2)、
−B: バイオリアクター容器(1)
−C: 選択装置をバイオリアクター容器(1)に連結するための手段を有する導管系(5、6)、
−D: 任意にはバイオリアクター容器(1)がデカンタ(16)といったような固体−液体分離装置にバイオリアクター容器(1)を連結するための手段を有する導管(15)、
−E: 任意には処理された流体(例えば水)の排出用導管(7)、
−F: 任意には、温度調節装置、
を含んで成る請求項11に記載の生細胞の選択用オートマトンとのカップリングによる生細胞の培養装置。
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