JP2007300866A

JP2007300866A - 平面パッチクランプ用支持体の製造方法

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Publication number: JP2007300866A
Application number: JP2006133193A
Authority: JP
Inventors: Keiji Naruse; 恵治成瀬
Original assignee: Okayama University NUC
Current assignee: Okayama University NUC
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2026-05-12
Also published as: JP4899051B2

Abstract

【課題】均一な形状の孔を有する平面パッチクランプ用支持部材の製造方法を提供し、安定した測定に寄与することを目的とする。
【解決手段】凹条部を有する第１基材を作成する第１ステップと、
前記第１基材の前記凹条部を覆うように前記第１基材に第２基材を当着して、中空部を有する複合基材を作成する第２ステップと、
前記中空部の軸線と交わる面で前記複合基材をスライスする第３ステップと、
からなる平面パッチクランプ用支持体の製造方法。
【選択図】図５

Description

本発明は、平面パッチクランプ用の支持体の作成方法に関する。また、高アスペクトレシオの細孔を有するプレートの作成方法に関する。

現在、医学、生物学の分野でパッチクランプ法を用いた研究が行われている。パッチクランプ法によれば、生体膜が有するイオンチャネルの電気生理学的特性を調べることができる。通常、パッチクランプ法では、先端の開口部が直径数１００ｎｍという微小のピペットを使用して、その先端と生体膜とを密着させてギガシールを形成して測定を行う。しかし、ギガシールの形成には熟練が要され、熟練者であっても作業に時間がかかる。そこで、ギガシールの形成が容易な方法として、ピペットの代わりに微小な孔を有する平板状の支持体を使用する平面（プラナー）パッチクランプ法が提案されている。たとえば、特許文献１には、成形型によって形成された孔を有するＰＤＭＳ製平板を、生体膜とギガシールを形成する支持体として用いる平面パッチクランプ法が開示されている。

米国特許出願番号１０／６９８，９３６

特許文献１に記載の支持体の孔は、シリコン製の鋳型によりＰＤＭＳ製樹脂に錐状の凹部を形状した後、当該凹部の底部の一部を切り取ることにより形成される。かかる方法では、孔の形状にバラつきが生じやすく、均一な孔を作成することが困難であった。このような支持体を使用すれば、安定した測定を行うことが困難であった。
そこで本発明は、均一な形状の孔を有する平面パッチクランプ用支持部材の製造方法を提供し、安定した測定に寄与することを目的とする。

以上の目的を達成するため本発明の平面パッチクランプ用支持体の製造方法は以下のステップからなる。即ち、
凹条部を有する第１基材を作成する第１ステップと、
前記第１基材の前記凹条部を覆うように前記第１基材に第２基材を当着して、中空部を有する複合基材を作成する第２ステップと、
前記中空部の軸線と交わる面で前記複合基材をスライスする第３ステップと、
からなる平面パッチクランプ用支持体の製造方法である。

本発明の平面パッチクランプ用支持体の製造方法では、中空部の軸線に交わる面で複合基材をスライスして平面パッチクランプ用支持体が作製される。これにより、平面パッチクランプ用支持体は複合基材の中空部に由来する孔を備える。この製造方法によれば、均一な形状の孔を備える平面パッチクランプ用支持体を複数作成することが容易となる。かかる均一な孔を備える平面パッチクランプ用支持体によれば、安定した測定を行うことができる。さらに、複合部材を所望の厚さでスライスすることにより所望の厚さの平面パッチクランプ用支持体を作成することができるが、かかる厚みを大きくしても孔の形状は厚み方向に一定とすることができる。これにより、孔の奥行きに比べて孔の開口部の幅が十分小さい（高アスペクトレシオな）孔を有する平面パッチクランプ用支持体を作成することができる。

以下に本発明の平面パッチクランプ用支持体の製造方法について詳細に説明する。
本発明の平面パッチクランプ用支持体の製造方法における第１ステップでは、凹条部を有する第１基材を作成する。凹条部を作成する方法は、鋳造、エッチング、切削などを公知の方法を採用することができる。鋳造により行う場合は、凸条部を有する鋳型部材を使用する。このとき鋳型部材はシリコンウェハーであることが好ましい。シリコンウェハーはリソグラフィやプラズマ照射などのシリコン微細加工技術により、高精度の微細加工を施すことができるため、高精度の鋳型とすることができるからである。また、直線状の切込みにより凹条部を形成することもできる。この方法によれば、簡易に凹条部を作成することができる。凹条部の形状は、任意の形状を採用することができる。例えば、その横断面において、四角形、三角形、円形、楕円形、又はこれらを組み合わせた形状、或いはこれらの一部の形状とすることができる。凹条部はそれが連続する方向に一定の形状であってもよいし、その一部の領域の断面形状が他の領域の断面形状と異なっていてもよい。凹条部の大きさは特に限定されないが、単一チャネルのコンダクタンスを測定することを考慮すれば、0.05〜50μｍ、好ましくは0.05〜10μｍ、さらに好ましくは0.05〜5μｍとする。なお、第１基材は複数の凹条部を備えていても良い。

第２ステップでは、第１基材の凹条部を覆うように第２基材を当着して、中空部を有する複合基材を作成する。当着する方法としては、接着剤による接着、熱、プラズマもしくは高周波による溶融接着など公知の方法を採用できる。第２基材の形状は、第１基材の凹条部を覆って中空部が形成される形状であれば、特に限定されない。例えば、平板状とすることができる。第２基材の形状を第１基材の形状と同一の形状としてもよい。このとき第１基材の凹条部と第２基材の凹条部が対向するように第１基材に第２基材を当着してもよい。

第３ステップでは、複合基材をその中空部の軸線と交わる面でスライスして、平面パッチクランプ用支持体を作成する。ここでいう中空部の軸線とは、中空部の中心を通り、中空部が連続する方向に平行な仮想線を指す。かかる軸線と交わる面で複合基材をスライスすれば、そのスライス面には中空部に由来する孔が存在することとなる。スライスする角度は特に限定されない。例えば、スライス面と中空部の軸線とが垂直となるようにスライスしてもよいし、スライス面が中空部の軸線に対して傾斜するようにスライスしてもよい。スライスする幅（厚さ）は任意に設定することができる。例えば、スライスする幅を10〜500μｍ、好ましくは50〜250μｍ、より好ましくは100〜200μｍである。なお、生体膜の孔へのギガシール形成を促進する目的で、平面パッチクランプ用支持体表面全域又は孔付近に、生体膜と親和性の高い材料をコーティングするなどの表面処理を行っても良い。表面処理としては、フィブロネクチン処理、プラズマ放電、コロナ放電など公知の表面処理を採用することができる。もちろん、表面処理を施さなくとも、陰圧をかけて生体膜を孔へ密着させてギガシールを形成させても良い。

第１基材及び第２基材の材質は特に限定されない。例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンエラストマー、熱硬化樹脂、光硬化樹脂などを採用できる。中でも、ＰＤＭＳを第１基材及び第２基材の材質として採用することが好ましい。ＰＤＭＳは成形性、安定性が高いことに加え、形状弾性を有する。ＰＤＭＳ製の平面パッチクランプ用支持体とすれば、その形状弾性を利用して、支持体に引張力又は圧縮力をかけることにより、孔を変形させることができる。生体膜がギガシールされている孔を変形させれば、その生体膜自体に引張力又は圧縮力をかけることができる。ギガシールされた生体膜内に機械受容チャネル（メカノセンシティブチャネル）が存在すれば、かかる支持体に引張力又は圧縮力をかけることにより、そのチャネル活性の変化を観測することができる。さらに、従来のピペットを使用するパッチクランプ法では、ピペット内に陰圧を加えることでギガシールされた生体膜に引張力をかけることはできるが、実際に生体膜にかかる引張力を定量的に記録することが極めて困難であった。一方、本発明の支持体によれば、支持体にかけた引張力又は圧縮力から、生体膜にかかる引張力又は圧縮力を定量的に記録することが可能となる。これにより、機械受容チャネルのチャネル活性をより詳細に測定することができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。図１に本発明の一の実施例である平面パッチクランプ用支持体の製造方法のフロー図を示す。図１に示すように本実施例の製造方法はステップＳ１〜３を備える。図１に示すように、凹条部を有する第１基材を作成する（ステップＳ１）。次に、第１基材の凹条部を覆うように第２基材を第１基材に当着して、中空部を有する複合基材を作成する（ステップＳ２）。その後、中空部の軸線と交わる面で複合基材をスライスする（ステップ３）。各ステップにおける詳細は以下の通りである。
ステップＳ１において、第１基材１１は鋳型１２を使用して成型する。第１基材１１と鋳型１２の模式図を図２に示す。第１基材１１の材質はＰＤＭＳである。鋳型１２はシリコンウェハー製である。鋳型１２の上面には凸条部１２ａが一般的なエッチングプロセスによって成形されている。凸条部１２ａは幅８００ｎｍ、高さ８００ｎｍである。第１基材１１の成形は、未重合のＰＤＭＳを鋳型１２の上に流し込み６５℃に加熱して重合を促進させて固化させる。このとき、鋳型１２の周囲には第１基材１１の側壁を規定するケース（図示せず）が設けられているも者とする。これにより、鋳型１２を鋳型として凹条部１１ａを有する第１基材１１が形成される。
ステップＳ２において使用する第２基材１３の材質は、第１基材１１と同様にＰＤＭＳである。第１基材１１と第２基材の模式図を図３に示す。第１基材１１と第２基材１３との対向面にはそれぞれプラズマ処理され、汎用的な接着材で接着される。これにより複合基材１４が作成される。図４に複合基材１４の模式図を示す。第２基材１３の第１基材１１側の面１３ａは平面となっており、これと凹条部１１ａとにより複合基材１４の中空部１４ａが形成される。
ステップＳ３において、複合基材１４は、中空部１４の軸線１４ｃ（図４において破線で示す）に垂直な方向に、２００μｍの厚さにスライスされ、平面パッチクランプ用支持体１５が作成される。平面パッチクランプ用支持体１５（以下、「支持体１５」ともいう）は、中空部１４に由来する孔１５ａを備える。図７に孔１５ａの顕微鏡写真を示す。孔１５ａの形状は、約８００ｎｍ四方の正方形で、深さが２００μｍである。孔１５ａの断面形状は、深さ（奥行き）にかかわらず約８００ｎｍ四方の正方形で一定であって、そのアスペクトレシオは２５０である。

本製造方法によれば、均一な形状の孔１５ａを有する平面パッチクランプ用支持体１５を作成することができる。かかる支持体１５を使用すれば、安定した測定を行うことができる。さらに、孔１５ａは高いアスペクトレシオを有する。即ち、孔１５ａは約８００ｎｍ四方の正方形という微小な開口の形状に対して、２００μｍという大きな深さを有する。この深さは、ステップＳ３においてスライスする際の厚みであり、厚みは実質的に任意の値とすることができる。即ち、より高いアスペクトレシオを有する孔を作成することも可能である。即ち、本発明の製造方法によれば、従来は難しかったμｍオーダーでの高アスペクトレシオの孔１５ａを作成することができる。さらに、本発明の製造方法によれば、一定形状の孔１５ａを作成することができ、かつその形状を正確にコントロールすることができる。正確にコントロールされた一定形状の孔１５ａを有する支持体１５を使用すれば、支持体１５に引張力（ストレッチ）をかけて孔１５ａを変形させたときの変形量を定量的に計測することができる。

本実施例の平面パッチクランプ用支持体の製造方法によって作成された支持体１５の使用形態を以下に説明する。図８に使用形態の模式図を示す。所定のパッチクランプ用溶液に静置した支持体１５の孔１５ａ上に試料細胞１６を滴下する。その後、孔１５ａの下方から陰圧をかけて孔１５ａへ、試料細胞１６の生体膜を密着させてギガシールを形成させる。ここで、孔１５ａの大きさは、試料細胞１６の大きさに比べて十分小さいため、ギガシールされた生体膜上には１〜数分子のイオンチャネル１７が存在することとなる。かかるイオンチャネル１７は、平面パッチクランプの常法により、そのシングルチャネルレコーディングが可能となる。
イオンチャネル１７が機械受容イオンチャネルであれば、そのチャネル活性の変化を詳細に測定することができる。支持体１５に引張力（ストレッチ）をかけると、これに伴って生体膜にストレッチがかかる。これにより、イオンチャネル１７のチャネル活性が変化する。これをパッチクランプにより電気生理学的に測定することができる。図９に孔１５ａ付近の拡大模式図を示す。支持体１５に引張力がかかると、孔１５ａは例えば、図９の紙面左右方向（矢印で示した方向）に広がることとなる。これにより、ギガシールを形成している生体膜１６ａへも同様に引張力がかかる。この引張力はイオンチャネル１７に連結されたアクチンフィラメント１８により、シグナルとしてイオンチャネル１７に伝えられる。かかるシグナルを受けたイオンチャネル１７はそのチャネル活性が変化し、例えば、そのチャネルポアが開き特定のイオンが取り込まれることとなる。なお、本実施例では、測定対象として機械受容イオンチャネルを挙げたが、これに限定されず、様々イオンチャネルを測定対象とすることができる。

以上、平面パッチクランプ用支持体の製造方法について述べたが、本発明の他の局面では、以下のように展開することもできる。即ち、
凹条部を有する第１基材を作成する第１ステップと、
前記第１基材の前記凹条部を覆うように前記第１基材に第２基材を当着して、５０μｍ以下の径の中空部を有する複合基材を作成する第２ステップと、
前記中空部の軸線と交わる面で前記複合基材を、前記中空部の径の１０倍以上の幅でスライスする第３ステップと、
からなる高アスペクトレシオの細孔を有するプレートの製造方法である。

上記プレートの製造方法の第２ステップにおいて、中空部の径は、５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下、さらに好ましくは５μｍ以下である。また、第３ステップにおいてスライスする幅は中空部の径の１０倍以上であり、例えば、５０μｍ以上、好ましくは１００μｍ以上、さらに好ましくは５００μｍ以上である。かかる製造法によれば、孔の奥行き（即ちプレートの幅）に比べて、孔の開口部の幅が十分小さい（高アスペクトレシオな）孔を有するプレートを作成することができる。

本発明は、医療又は生物分野における、試験、研究、開発にその利用が図られる。より詳しくは、薬剤等のスクリーニング、薬剤耐性試験等にその利用が図られる。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明の一の実施例である平面パッチクランプ用支持体の製造方法のフロー図である。ステップＳ１における第１基材１１と鋳型１２の模式図である。ステップＳ２における第１基材１１と第２基材の模式図である。ステップＳ２における複合基材１４の模式図である。ステップＳ３における支持体１５の模式図である。ステップＳ３における支持体１５の模式図である。支持体１５の孔１５ａの電子顕微鏡写真である。支持体１５の使用形態を示す模式図である。イオンチャネル１７のシングルチャネルレコーディングの模式図である。

符号の説明

１１第１基材
１１ａ凹条部
１２鋳型
１２ａ凸条部
１３第２基材
１４複合基材
１４ａ中空部
１５平面パッチクランプ用支持体
１５ａ孔

Claims

凹条部を有する第１基材を作成する第１ステップと、
前記第１基材の前記凹条部を覆うように前記第１基材に第２基材を当着して、中空部を有する複合基材を作成する第２ステップと、
前記中空部の軸線と交わる面で前記複合基材をスライスする第３ステップと、
からなる平面パッチクランプ用支持体の製造方法。
前記第１基材及び前記第２基材が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、請求項１に記載の平面パッチクランプ用支持体の製造方法。
前記第１ステップにおいて、前記第１基材の前記凹条部は、凸条部を有する鋳型部材を鋳型として作成する、請求項１に記載の平面パッチクランプ用支持体の製造方法。
前記鋳型部材はシリコンウェハーからなる、請求項３に記載の平面パッチクランプ用支持体の製造方法。
凹条部を有する第１基材を作成する第１ステップと、
前記第１基材の前記凹条部を覆うように前記第１基材に第２基材を当着して、５０μｍ以下の径の中空部を有する複合基材を作成する第２ステップと、
前記中空部の軸線と交わる面で前記複合基材を、前記中空部の径の１０倍以上の厚さでスライスする第３ステップと、
からなる高アスペクトレシオの細孔を有するプレートの製造方法。