JP2007277184A - Anti-lead monoclonal antibody - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、抗鉛モノクローナル抗体に関する。さらに詳述すると、本発明は、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体、該抗体を用いて鉛を定性的または定量的に検出する方法及び抗体を作製する方法に関する。 The present invention relates to anti-lead monoclonal antibodies. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes lead, a method for qualitatively or quantitatively detecting lead using the antibody, and a method for producing an antibody.
近年、人体への健康障害を引き起こす重金属による環境汚染が新たな環境問題として指摘されている。このような重金属としては、例えば鉛が挙げられる。鉛は人体に蓄積すると、神経障害、胃腸障害、腎臓障害、脳疾患、貧血、血圧上昇、出産以上などを引き起こす人体に有害な物質であるが、一方で、産業上の有用性の高さから、現在まで様々な用途に使用されてきた物質であり、その環境汚染は広域に拡散している。そこで、公的機関により飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。さらに、平成１５年２月に土壌汚染対策法が施行され、水質汚濁防止法と併せて、土壌の汚染についても法的規準が設けられつつある。 In recent years, environmental pollution due to heavy metals causing health problems to human bodies has been pointed out as a new environmental problem. Examples of such heavy metals include lead. When lead accumulates in the human body, it is a harmful substance to the human body that causes neurological disorders, gastrointestinal disorders, kidney disorders, brain diseases, anemia, increased blood pressure, births, etc. It is a substance that has been used for various purposes until now, and its environmental pollution is widespread. Therefore, water quality standards for drinking water and groundwater, environmental standards for soil, and discharge standards for the environment are established by public institutions. Furthermore, the Soil Contamination Countermeasures Law was enacted in February 2003, and in addition to the Water Pollution Control Law, legal standards for soil contamination are being established.
これら土壌や水などに対する鉛についての汚染調査の公定法分析には、従来、ＩＣＰ発光分析法やＩＣＰ質量分析法などが用いられている。しかし、公定法分析には多大な時間と費用を要すると共に、汚染調査が必要とされる土壌は今後さらに拡大することが予想される。したがって、分析時間と費用の削減のためには、鉛が環境基準値以上存在している高濃度エリアを絞り込んだ後に、該高濃度エリアのみを公定法分析することが望ましいため、高濃度エリアを絞り込むための簡便・迅速な分析法の確立が望まれている。 Conventionally, ICP emission analysis, ICP mass spectrometry, and the like have been used for official analysis of contamination investigations regarding lead to soil and water. However, official analysis requires a lot of time and money, and the soil that needs to be polluted is expected to expand further in the future. Therefore, in order to reduce the analysis time and cost, it is desirable to narrow down the high concentration area where lead is present above the environmental standard value and then perform official analysis only on the high concentration area. Establishment of a simple and quick analysis method for narrowing down is desired.
簡便・迅速な鉛の分析法としては、硫化ナトリウム比色法やエオシンＹ−クラウンエーテル会合体比色法などが知られているが、これらの方法は測定感度が低く、低濃度の鉛を分析することが困難である。 Sodium sulfide colorimetric method and eosin Y-crown ether aggregate colorimetric method are known as simple and rapid lead analysis methods, but these methods have low measurement sensitivity and analyze low concentration lead. Difficult to do.
そこで、特定物質を簡便・迅速で高感度に分析する測定法として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）などの免疫反応を利用した方法が知られている。また、微量物質の測定法として、間接蛍光抗体法、競合アッセイ法の他に蛍光センサーを利用する方法（非特許文献１）などが知られており、その応用範囲は広い。 Therefore, as a measurement method for analyzing a specific substance simply, rapidly and with high sensitivity, a method utilizing an immunoreaction such as radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (EIA or ELISA), etc. It has been known. In addition to the indirect fluorescent antibody method and the competitive assay method, a method using a fluorescent sensor (Non-Patent Document 1) is known as a trace substance measurement method, and its application range is wide.
ここで、免疫反応を利用した測定法を鉛の分析に用いる場合、鉛を抗原として認識しうる抗体が必要である。このような抗体としては、例えば、錯体を形成した鉛を認識するモノクローナル抗体が知られている（非特許文献２）。 Here, when a measurement method using an immune reaction is used for analysis of lead, an antibody capable of recognizing lead as an antigen is required. As such an antibody, for example, a monoclonal antibody that recognizes complexed lead is known (Non-patent Document 2).
しかしながら、非特許文献２に示されているモノクローナル抗体は、Ｐｂ−ＤＴＰＡ（鉛−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体）に対する平衡解離定数Ｋｄが１×１０−５Ｍ、Ｃａ−ＤＴＰＡ（カルシウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体）に対する平衡解離定数Ｋｄが２．８×１０−６Ｍであり、鉛よりもむしろカルシウムを認識しやすい。カルシウムは環境中に普遍的に存在する元素であるため、環境中の鉛の測定に非特許文献２のモノクローナル抗体を用いた場合、その測定結果は信頼性に欠けるものとなり、実用には適さない。したがって、カルシウム等の環境中に存在する元素やイオンとの交差反応性が低く、鉛を特異的に認識する実用性の高いモノクローナル抗体の作製が望まれる。 However, the monoclonal antibody shown in Non-Patent Document 2 has an equilibrium dissociation constant Kd of 1 × 10 −5 M for Pb-DTPA (lead-diethylenetriaminepentaacetic acid complex) and Ca-DTPA (calcium-diethylenetriaminepentaacetic acid complex). the equilibrium dissociation constant K d for) is 2.8 × 10 -6 M, easy to recognize the calcium rather than lead. Since calcium is an element that exists universally in the environment, when the monoclonal antibody of Non-Patent Document 2 is used to measure lead in the environment, the measurement results are unreliable and are not suitable for practical use. . Therefore, it is desired to produce a monoclonal antibody that has low cross-reactivity with elements and ions present in the environment such as calcium and has high practicality for specifically recognizing lead.
また、鉛の環境基準値は０．０１ｍｇ／Ｌ以下と定められているが、非特許文献２のモノクローナル抗体は、Ｐｂ−ＣＨＸＤＴＰＡ（鉛−シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体）に対する平衡解離定数Ｋｄが８．４×１０−９Ｍ（鉛の重量濃度に換算した場合は１．７×１０−３ｍｇ／Ｌ）、Ｐｂ−ＤＴＰＡ（鉛−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体）に対する平衡解離定数Ｋｄが１×１０−５Ｍ（鉛の重量濃度に換算した場合は２．１ｍｇ／Ｌ）である。つまり、非特許文献２のモノクローナル抗体は、環境基準値濃度の鉛を検出するために、ＣＨＸＤＴＰＡ（シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸）という特殊なキレート剤を用いる必要がある。したがって、非特許文献２のモノクローナル抗体を用いる際には、ＣＨＸＤＴＰＡを入手するための手間やコストの問題が生じる。 Moreover, although the environmental standard value of lead is set to 0.01 mg / L or less, the monoclonal antibody of Non-Patent Document 2 has an equilibrium dissociation constant Kd of 8 for Pb-CHXTDTA (lead-cyclohexyldiethylenetriaminepentaacetic acid complex). 4 × 10 −9 M (1.7 × 10 −3 mg / L when converted to lead weight concentration), the equilibrium dissociation constant K d for Pb-DTPA (lead-diethylenetriaminepentaacetic acid complex) is 1 × 10 -5 M (2.1 mg / L when converted to weight concentration of lead). That is, the monoclonal antibody of Non-Patent Document 2 needs to use a special chelating agent called CHXDTPA (cyclohexyldiethylenetriaminepentaacetic acid) in order to detect lead at an environmental standard value concentration. Therefore, when using the monoclonal antibody of Non-Patent Document 2, there are problems of labor and cost for obtaining CHXDTPA.
そこで、本発明は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）のような一般的なキレート剤を用いた場合にも、環境基準値濃度の鉛を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a monoclonal antibody capable of specifically recognizing lead at an environmental standard concentration even when a general chelating agent such as DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) is used. Objective.
また、本発明は、当該モノクローナル抗体を用いて免疫学的手法により環境中の鉛濃度を測定する方法及びモノクローナル抗体の作製方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a method for measuring the lead concentration in the environment by an immunological technique using the monoclonal antibody and a method for producing the monoclonal antibody.
かかる課題を解決するため、本願発明者らは、鉛錯体にタンパク質を結合させた複合体を抗原としてマウスに免疫することによりモノクローナル抗体の作製を試みたが、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができなかった。この原因について検討した結果、マウスへの抗原免疫時に使用していたアジュバントに含まれている亜鉛の影響により鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体が作製できないことを知見した。そこで、アジュバントに含まれる亜鉛の影響を排除すべく、検討を行った結果、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体が得られ、本願発明に至った。 In order to solve this problem, the inventors of the present application have attempted to prepare a monoclonal antibody by immunizing a mouse with a complex in which a protein is bound to a lead complex as an antigen, but the monoclonal antibody specifically recognizes lead. Could not get. As a result of examining this cause, it was found that a monoclonal antibody that specifically recognizes lead could not be produced due to the influence of zinc contained in an adjuvant used for antigen immunization of mice. Therefore, as a result of studies to eliminate the influence of zinc contained in the adjuvant, a monoclonal antibody that specifically recognizes lead was obtained, and the present invention was achieved.
したがって、本発明のモノクローナル抗体は、鉛を特異的に認識するものである。尚、本明細書中における、「特異的」とは、鉛（Ｐｂ）以外の金属元素やそのイオンが存在する環境下、例えば、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）が存在するような環境下であっても、これら金属元素やそのイオンに影響されることなく、鉛（Ｐｂ）を認識することを意味している。 Therefore, the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes lead. In the present specification, “specific” means, for example, calcium (Ca), magnesium (Mg), copper (Cu), zinc in an environment where metal elements other than lead (Pb) and ions thereof exist. Even in an environment where (Zn), cadmium (Cd), manganese (Mn), and iron (Fe) are present, lead (Pb) is recognized without being affected by these metal elements and their ions. It means that.
ここで、鉛はキレート剤に配位させて錯体を形成することにより、鉛に抗原性を持たせて本発明のモノクローナル抗体に認識させる。つまり、本発明のモノクローナル抗体は、環境試料をキレート剤と反応させることにより、当該環境試料中の鉛を特異的に認識する。キレート剤としては、鉛を配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＤＴＰＡである。 Here, lead is coordinated to a chelating agent to form a complex, whereby lead is made antigenic and recognized by the monoclonal antibody of the present invention. That is, the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes lead in the environmental sample by reacting the environmental sample with a chelating agent. As the chelating agent, any chelating agent capable of coordinating lead can be used. For example, diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetraethylenetriamine (TET), ethylenediamine ( EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotetraacetic acid, disodium edetate, sodium edetate, trisodium edetate, penicillamine, trisodium pentetate calcium, pentetate, succil and edetate Trientine can be mentioned, and DTPA is preferable.
ここで、本発明のモノクローナル抗体であるＹｊ２Ｈ７抗体は、錯体を形成した鉛との平衡解離定数Ｋｄが２×１０−８Ｍ（鉛の重量濃度に換算した場合は４×１０−３ｍｇ／Ｌ）以下であり、Ｙｊ１Ａ３抗体は、錯体を形成した鉛に対する平衡解離定数Ｋｄが１．８×１０−９Ｍ（鉛の重量濃度に換算した場合は３．８×１０−４ｍｇ／Ｌ）以下である。したがって、環境基準値である０．０１ｍｇ／Ｌ以下の濃度の鉛を検出することが可能である。 Here, the Yj2H7 antibody, which is a monoclonal antibody of the present invention, has an equilibrium dissociation constant Kd of 2 × 10 −8 M (4 × 10 −3 mg / kg in terms of weight concentration of lead) with complexed lead. L) or less, and the Yj1A3 antibody has an equilibrium dissociation constant Kd of 1.8 × 10 −9 M (3.8 × 10 −4 mg / L when converted to the weight concentration of lead) with respect to complexed lead. ) Therefore, it is possible to detect lead having a concentration of 0.01 mg / L or less, which is an environmental standard value.
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマＦＥＲＭ Ｐ−２０７４５（Ｙｊ１Ａ３株）、あるいはＦＥＲＭ Ｐ−２０７４６（Ｙｊ２Ｈ７株）により産生される。これらのハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年１２月２２日付けで受託されている。 The monoclonal antibody of the present invention is produced, for example, by hybridoma FERM P-20745 (Yj1A3 strain) or FERM P-20746 (Yj2H7 strain). These hybridomas are entrusted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on December 22, 2005.
ハイブリドーマＦＥＲＭ Ｐ−２０７４５（Ｙｊ１Ａ３株）から産生されるモノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３は、錯体を形成した鉛に対する平衡解離定数Ｋｄが１．８×１０−９Ｍであり、錯体を形成したカルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）との交差反応性は最大でもマンガン（Ｍｎ）の０．５５％である。ハイブリドーマＦＥＲＭ Ｐ−２０７４６（Ｙｊ２Ｈ７株）から産生されるモノクローナル抗体Ｙｊ２Ｈ７は、錯体を形成した鉛に対する平衡解離定数Ｋｄが２×１０−８Ｍであり、錯体を形成したカルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）との交差反応性は最大でもカルシウム（Ｃａ）の０．００３％である。つまり、本発明のモノクローナル抗体は錯体を形成した鉛に対する特異性が非常に高い。 Monoclonal antibody Yj1A3 produced from hybridoma FERM P-20745 (Yj1A3 strain) has an equilibrium dissociation constant Kd for complexed lead of 1.8 × 10 −9 M, and complexed calcium (Ca), The cross-reactivity with magnesium (Mg), copper (Cu), zinc (Zn), cadmium (Cd), manganese (Mn), and iron (Fe) is at most 0.55% of manganese (Mn). Monoclonal antibody Yj2H7 produced from hybridoma FERM P-20746 (Yj2H7 strain) has an equilibrium dissociation constant Kd of 2 × 10 −8 M for complexed lead, and complexed calcium (Ca), magnesium ( The cross-reactivity with Mg), copper (Cu), zinc (Zn), cadmium (Cd), manganese (Mn), and iron (Fe) is at most 0.003% of calcium (Ca). That is, the monoclonal antibody of the present invention has a very high specificity for complexed lead.
尚、ハイブリドーマは、上述したモノクローナル抗体を産生するものであれば、これらに限定されるものではない。 The hybridoma is not limited to these as long as it produces the above-described monoclonal antibody.
本発明のモノクローナル抗体は、試料中の鉛を定性的または定量的に測定する免疫学的手法に用いることができる。免疫学的手法としては、例えば、免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、蛍光センサー法などの方法が挙げられる。 The monoclonal antibody of the present invention can be used in an immunological technique for qualitatively or quantitatively measuring lead in a sample. Examples of immunological techniques include immunochromatography, radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (EIA or ELISA), CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), immunological ratio Examples thereof include a turbidity method (TIA), a latex immunoturbidimetric method (LTIA), and a fluorescence sensor method.
さらに、本発明の鉛を定性的または定量的に測定するためのキットは本発明のモノクローナル抗体を含むものであるが、他の試薬例えばキレート剤、キレート剤−タンパク質複合体、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料などを包含してもよい。また、モノクローナル抗体、キレート剤−タンパク質複合体のいずれか、または両方が標識されていてもよい。さらに、本発明のキットは、モノクローナル抗体を含め必要な試薬がフィルターなどに吸着されている免疫クロマトグラフィー装置（例えば、試験紙）の形態でもよい。 Furthermore, the kit for qualitatively or quantitatively measuring lead of the present invention contains the monoclonal antibody of the present invention, but other reagents such as a chelating agent, a chelating agent-protein complex, a positive control sample, and a negative control sample. Etc. may be included. In addition, either the monoclonal antibody, the chelating agent-protein complex, or both may be labeled. Furthermore, the kit of the present invention may be in the form of an immunochromatography apparatus (for example, a test paper) in which necessary reagents including a monoclonal antibody are adsorbed on a filter or the like.
次に、本発明のモノクローナル抗体の作製方法は、哺乳動物の腫瘍細胞と免疫抗原で免役した哺乳動物の抗体生産細胞とのハイブリドーマを作製し、当該ハイブリドーマをスクリーニング後に培養してモノクローナル抗体を作製する方法において、哺乳動物への初回免疫時にはアジュバントを併用して抗原物質を免疫し、二回目以降の免疫時にはアジュバントを併用せずに抗原物質を免疫するようにしている。または、抗原物質に含まれる金属元素以外の金属元素をアジュバントから除去して哺乳動物への免疫に供するようにしている。 Next, in the method for producing a monoclonal antibody of the present invention, a hybridoma of a mammalian tumor cell and a mammalian antibody-producing cell immunized with an immune antigen is produced, and the hybridoma is cultured after screening to produce a monoclonal antibody. In the method, an antigen substance is immunized together with an adjuvant at the first immunization of a mammal, and the antigen substance is immunized without using an adjuvant at the second and subsequent immunizations. Alternatively, a metal element other than the metal element contained in the antigen substance is removed from the adjuvant to be used for immunization to mammals.
したがって、抗原物質に含まれる金属元素以外の金属元素の影響を排除しつつ、抗原物質に含まれる金属元素を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することができる。例えば、本発明のように、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製する場合、アジュバントに含まれる鉛以外の金属元素、例えば、亜鉛の影響を上記方法により排除することにより、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体を確実に作製することが可能となる。 Therefore, a monoclonal antibody that specifically recognizes the metal element contained in the antigen substance can be produced while eliminating the influence of the metal element other than the metal element contained in the antigen substance. For example, when producing a monoclonal antibody specifically recognizing lead as in the present invention, the effect of metallic elements other than lead, for example, zinc, contained in an adjuvant is excluded by the above-described method to specifically lead. Thus, it is possible to reliably produce a monoclonal antibody that recognizes the above.
しかして、本発明のモノクローナル抗体は、鉛（Ｐｂ）以外の金属元素やそのイオンが存在する環境下、例えば、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）が存在するような環境下であっても、これら金属元素やそのイオンに影響されることなく、鉛（Ｐｂ）を認識することができるので、環境中の鉛の濃度を測定するために非常に実用的な抗体であるといえる。また、ＣＨＸＤＴＰＡ（シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸）のような特殊なキレート剤を用いずとも、ＤＴＰＡのような一般的なキレート剤を用いることで環境基準値濃度の鉛を検出することができるので、特殊なキレート剤を入手するための手間やコストの問題が解消される。 Thus, the monoclonal antibody of the present invention can be used in environments where metal elements other than lead (Pb) and ions thereof exist, such as calcium (Ca), magnesium (Mg), copper (Cu), zinc (Zn), and cadmium. Even in an environment where (Cd), manganese (Mn), and iron (Fe) exist, lead (Pb) can be recognized without being affected by these metal elements and ions thereof. It can be said that this is a very practical antibody for measuring the concentration of lead in the environment. In addition, it is possible to detect environmental standard concentration lead by using a general chelating agent such as DTPA without using a special chelating agent such as CHXDTPA (cyclohexyldiethylenetriaminepentaacetic acid). The trouble of obtaining a chelating agent and the problem of cost are eliminated.
また、本発明のモノクローナル抗体を免疫学的方法や該方法に用いるキットに供することで、高い検出感度が要求される環境基準値に対する判定を環境調査の現場において行うことが可能となり、鉛が環境基準値以上存在している高濃度エリアを迅速且つ簡便に絞り込むことが可能になる。 In addition, by using the monoclonal antibody of the present invention in an immunological method or a kit used in the method, it is possible to make a determination for an environmental reference value that requires high detection sensitivity at the site of environmental investigation, and lead is used in the environment. It is possible to quickly and easily narrow down high density areas that exist above the reference value.
さらに、本発明のモノクローナル抗体の作製方法によれば、初回免疫時のみアジュバントを併用する、あるいは、アジュバントから抗原物質に含まれる金属元素以外の金属元素を除去することで、抗原物質に含まれる金属元素以外の金属元素の影響を排除しつつ、抗原物質に含まれる金属元素を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することができる。また、アジュバントを初回免疫時のみに用いる場合、従来のように免疫毎にアジュバントを併用していた場合と比較して、アジュバント使用量を大幅に節約でき、モノクローナル抗体作製にかかるコストを大幅に削減することができる。 Furthermore, according to the method for producing a monoclonal antibody of the present invention, a metal contained in an antigenic substance can be obtained by using an adjuvant only at the time of the first immunization, or removing a metal element other than the metal element contained in the antigenic substance from the adjuvant. A monoclonal antibody that specifically recognizes a metal element contained in an antigen substance can be produced while eliminating the influence of a metal element other than the element. In addition, when using an adjuvant only at the time of the first immunization, the amount of adjuvant used can be saved significantly compared to the case where an adjuvant is used for each immunization as in the past, and the cost for producing monoclonal antibodies is greatly reduced. can do.
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。 The best mode for carrying out the present invention will be described below in detail with reference to the drawings.
本発明のモノクローナル抗体は、鉛を特異的に認識するモノクローナル抗体であり、免疫抗原で免疫した哺乳動物の抗体生産細胞と哺乳動物の腫瘍細胞とを細胞融合してハイブリドーマを得て、当該ハイブリドーマをスクリーニングした後に培養することにより作製することができる。 The monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody specifically recognizing lead, and a hybridoma is obtained by fusing a mammalian antibody-producing cell immunized with an immunizing antigen with a mammalian tumor cell. It can be prepared by culturing after screening.
免疫抗原としては、鉛を特異的に認識させるために鉛を用いる必要がある。しかし、鉛は単独では抗原性を持たないので、鉛を単独で哺乳動物に免疫しても抗体生産細胞を得ることができない。そこで、鉛をキレート剤に配位させ、形成された鉛錯体を免疫抗原として用いる。キレート剤としては、鉛を配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＤＴＰＡである。 As an immunizing antigen, it is necessary to use lead in order to specifically recognize lead. However, since lead alone does not have antigenicity, antibody-producing cells cannot be obtained even when immunizing mammals alone with lead. Therefore, lead is coordinated to a chelating agent, and the formed lead complex is used as an immunizing antigen. As the chelating agent, any chelating agent capable of coordinating lead can be used. For example, diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetraethylenetriamine (TET), ethylenediamine ( EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotetraacetic acid, disodium edetate, sodium edetate, trisodium edetate, penicillamine, trisodium pentetate calcium, pentetate, succil and edetate Trientine can be mentioned, and DTPA is preferable.
また、鉛錯体は免疫応答を誘導するには分子として小さすぎるため、キャリアとなる高分子量物質に結合させ、これを抗原または免疫源として用いる。キャリアとして用いることができる高分子量物質の例としては多糖類、タンパク質などが挙げられるが、タンパク質が好ましい。例えば、ヘモシアニン、アルブミン、オバルブミン、グロブリン、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Moreover, since a lead complex is too small as a molecule for inducing an immune response, it is bound to a high molecular weight substance serving as a carrier and used as an antigen or an immunogen. Examples of the high molecular weight substance that can be used as the carrier include polysaccharides and proteins, and proteins are preferred. Examples include, but are not limited to, hemocyanin, albumin, ovalbumin, globulin, gelatin, collagen and the like.
鉛錯体とタンパク質の複合体を作製するには、タンパク質と結合しうる官能基を有するキレート剤または該官能基を導入したキレート剤を用いるか、あるいはリンカーを介してタンパク質とキレート剤を結合させることができる。そのようなキレート剤は市販されており、例えばイソチオシアノベンジル−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社）が挙げられる。複合体の形成は常法により行うことができる。 In order to prepare a complex of a lead complex and a protein, a chelating agent having a functional group capable of binding to the protein or a chelating agent into which the functional group is introduced is used, or the protein and the chelating agent are bound via a linker. Can do. Such chelating agents are commercially available, for example, isothiocyanobenzyl-DTPA (Macrocyclics). The formation of the complex can be performed by a conventional method.
免疫抗原を免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用する腫瘍細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウスやラットが用いられる。 The mammal to be immunized with the immunizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the tumor cells used for cell fusion, and mice and rats are generally used.
哺乳動物への免疫は、マウスを用いる場合を例に挙げると、１〜３週間毎に３〜６回程度、免疫抗原を哺乳動物の皮下、筋肉、尾部静脈または腹腔内に注射等により投与することにより行う。ここで、本発明においては、初回の免疫時のみアジュバントを併用し、二回目以降の免疫時にはアジュバントを併用しないようにしている。これにより、アジュバントに含まれる金属成分、例えば亜鉛の影響が排除され、且つ抗体価が十分に上昇して所望のモノクローナル抗体を得ることが可能になる。例えば、ＲＩＢＩアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ、Ｃｏｒｉｘａ社）には４０ｐｐｂの亜鉛が含まれており、ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社製）には１ｐｐｂの亜鉛が含まれている。したがって、これらのアジュバントのように金属元素が含まれている場合、その金属元素が抗原に含まれている金属以外の金属元素であれば、当初の抗原中の金属が他の金属に置換されることによって抗原が別の物質に変化してしまう影響で所望の抗体が得られない虞がある。本発明のモノクローナル抗体の作製方法のように、初回免疫時にのみアジュバントを併用するようにすれば、アジュバントに含まれる金属成分の影響を受けることなく所望の抗体をより確実に得ることができる。ここで、アジュバントを全く併用しない場合には抗体価が上昇せず、所望のモノクローナル抗体を得ることができない。また、二回目以降の免疫時にアジュバントを用いると、アジュバントに含まれる金属成分の影響を排除しきれず、所望のモノクローナル抗体を得ることが困難である。つまり、このようにアジュバントを初回免疫時のみに用いてモノクローナル抗体を作製すれば、アジュバントに含まれる金属成分の影響を十分に排除できると共に抗体価も上昇するので、アジュバントに含まれる金属成分の影響を考慮する必要が無くなる。したがって、本発明の抗鉛モノクローナル抗体に限らず、アジュバントに含まれる金属の影響により作製することが困難であったモノクローナル抗体の作製が可能となる。また、従来のように免疫毎にアジュバントを併用しなくても、モノクローナル抗体の作製が可能であるから、アジュバントの使用量を減らして、モノクローナル抗体作製のコストを大幅に低減することができる。 In the case of immunization to mammals, for example, in the case of using a mouse, an immunizing antigen is administered to a mammal subcutaneously, intramuscularly, tail vein, or intraperitoneally about 3 to 6 times every 1 to 3 weeks. By doing. Here, in the present invention, an adjuvant is used together only during the first immunization, and no adjuvant is used during the second and subsequent immunizations. Thereby, the influence of the metal component contained in the adjuvant, such as zinc, is eliminated, and the antibody titer can be sufficiently increased to obtain a desired monoclonal antibody. For example, RIBI adjuvant (MPL + TDM Emulsion, Corixa) contains 40 ppb zinc, and TiterMax Gold (CytRx) contains 1 ppb zinc. Therefore, when a metal element is contained like these adjuvants, if the metal element is a metal element other than the metal contained in the antigen, the metal in the original antigen is replaced with another metal. As a result, the desired antibody may not be obtained due to the effect that the antigen changes to another substance. If an adjuvant is used together only during the first immunization as in the method for producing a monoclonal antibody of the present invention, a desired antibody can be obtained more reliably without being affected by the metal component contained in the adjuvant. Here, when no adjuvant is used in combination, the antibody titer does not increase and a desired monoclonal antibody cannot be obtained. In addition, when an adjuvant is used during the second and subsequent immunizations, the influence of the metal component contained in the adjuvant cannot be completely eliminated, and it is difficult to obtain a desired monoclonal antibody. In other words, if a monoclonal antibody is produced using an adjuvant only at the time of the first immunization in this way, the influence of the metal component contained in the adjuvant can be sufficiently eliminated and the antibody titer can be increased. Need not be considered. Therefore, it is possible to produce not only the anti-lead monoclonal antibody of the present invention but also a monoclonal antibody that has been difficult to produce due to the influence of the metal contained in the adjuvant. Moreover, since it is possible to produce monoclonal antibodies without using an adjuvant for each immunization as in the prior art, the amount of adjuvant used can be reduced, and the cost of producing monoclonal antibodies can be greatly reduced.
尚、アジュバントを併用する際には、免疫用抗原と等量のアジュバントを十分に混合してエマルジョンとしてから哺乳動物に投与する。ここで、アジュバントに含まれる金属をキレート樹脂等により除去してから使用に供することで、アジュバントを二回目以降の免疫時に併用しても所望のモノクローナル抗体を得ることが可能である。また、この場合にも初回の免疫時にのみアジュバントを併用すれば、所望のモノクローナル抗体を得ることが可能であり、アジュバントの使用量を減らしてモノクローナル抗体作製にかかるコストを減らすことができる。 When an adjuvant is used in combination, it is administered to a mammal after thoroughly mixing an antigen for immunization with an equal amount of adjuvant to form an emulsion. Here, by removing the metal contained in the adjuvant with a chelate resin or the like and then using it, it is possible to obtain a desired monoclonal antibody even when the adjuvant is used together for the second and subsequent immunizations. In this case as well, if an adjuvant is used in combination only at the time of the first immunization, a desired monoclonal antibody can be obtained, and the amount of adjuvant used can be reduced to reduce the cost for production of the monoclonal antibody.
哺乳動物への免疫終了後、当該哺乳動物から抗体生産細胞の採取を行う。採取源としては、脾臓、リンパ節、末梢血液などが挙げられるが、一般的には、脾臓が用いられる。 After completion of immunization to the mammal, antibody-producing cells are collected from the mammal. Examples of the collection source include spleen, lymph node, peripheral blood and the like, but generally the spleen is used.
抗体生産細胞と腫瘍細胞との細胞融合を行う際に使用する腫瘍細胞は特に限定されないが、抗体生産細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。細胞融合は重合度が１５００〜６０００のポリエチレングリコールを用いて常法により行うことができる。得られたハイブリドーマは、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む動物培養細胞の選択培地）により培養し、ハイブリドーマのみを選択的に生育させる。 The tumor cells used when cell fusion between antibody-producing cells and tumor cells is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with antibody-producing cells. Cell fusion can be performed by a conventional method using polyethylene glycol having a polymerization degree of 1500 to 6000. The obtained hybridoma is cultured, for example, in a HAT medium (selection medium for animal cultured cells containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine), and only the hybridoma is selectively grown.
抗体生産細胞のスクリーニングには一般的にはＥＬＩＳＡ法を用いるが、より少ない抗体量でスクリーニングが可能であるため、非特許文献１の蛍光センサー法を用いるのが好ましい。蛍光センサー法の原理図を図１に示す。この方法は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなり、一次スクリーニングは担体（Ｂｅａｄ）に固定化した抗原（鉛錯体−タンパク質複合体）に抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を添加し、固定化抗原に結合した抗体を蛍光ラベルされた二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を用いて蛍光センサーで検出する（図１中の「抗原無し」の場合の蛍光強度）。二次スクリーニングでは、培養上清に適当量（例えば１０μＭ）の鉛錯体を添加して平衡化した後、錯体と結合しなかった抗体の固定化抗原との結合を一次スクリーニングと同様に測定する（図１中の「抗原有り」の場合の蛍光強度）。一次スクリーニングと二次スクリーニングの差から鉛錯体と特異的に結合する抗体を特定する。 In general, ELISA is used for screening antibody-producing cells. However, since screening is possible with a smaller amount of antibody, it is preferable to use the fluorescence sensor method of Non-Patent Document 1. The principle diagram of the fluorescence sensor method is shown in FIG. This method consists of a primary screening and a secondary screening. In the primary screening, a hybridoma culture supernatant containing an antibody is added to an antigen (lead complex-protein complex) immobilized on a carrier (Bead), and the immobilized antigen is added to the immobilized antigen. The bound antibody is detected with a fluorescence sensor using a fluorescently labeled secondary antibody (anti-mouse IgG antibody) (fluorescence intensity in the case of “no antigen” in FIG. 1). In the secondary screening, an appropriate amount (for example, 10 μM) of a lead complex is added to the culture supernatant to equilibrate, and then the binding of an antibody that has not bound to the complex to the immobilized antigen is measured in the same manner as in the primary screening ( Fluorescence intensity when “antigen present” in FIG. 1). The antibody that specifically binds to the lead complex is identified from the difference between the primary screening and the secondary screening.
特定したクローンを培養し、単離したコロニーは徐々に培地量を増やしながら継代する。得られた培地は、脱塩カラムを用いて培地自体に含まれる若干の重金属を除去するのが好ましい。さらに、培地中に含まれる他のタンパク質の影響を除くため、例えばプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより抗体を精製するのが好ましい。 The identified clone is cultured, and the isolated colony is subcultured while gradually increasing the amount of the medium. It is preferable that the obtained medium removes some heavy metals contained in the medium itself using a desalting column. Furthermore, in order to remove the influence of other proteins contained in the medium, it is preferable to purify the antibody by, for example, protein A affinity column chromatography.
得られたモノクローナル抗体は、鉛錯体および他の金属の錯体に対する親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。親和性は、抗体の抗原との結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０）により評価する。そして、特異性は、鉛に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０を比較することにより評価する。ＩＣ５０はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア（例えばOrigin Version 6.0など）により解析して求めてもよい。例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を１００％として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式：
ｙ＝９９／（１＋（ｘ／Ｐ１）Ｐ２）＋０.５
（式中、ｘは抗体量であり、ｙは抗体と抗原の結合量（％）であり、Ｐ１およびＰ２は近似のパラメーターである）に導入する。また、Ｐ１およびＰ２はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、ｙ＝５０になるときのｘの値（＝Ｐ１）をＩＣ５０とする。また、抗体の特異性は鉛に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０との比を交差反応性として求める。
The resulting monoclonal antibody evaluates the affinity and specificity of the antibody for antigen by comparing its affinity for lead complexes and other metal complexes. Affinity is evaluated by the antigen concentration (IC 50 ) that inhibits the binding of an antibody to an antigen by 50%. Specificity is evaluated by comparing the IC 50 for lead with the IC 50 for other metals. The IC 50 may be calculated by any method, but the measurement result may be obtained by analyzing with software (for example, Origin Version 6.0). For example, the measurement value obtained by the fluorescence sensor method or the like is converted into a relative value with the measurement value when no antigen is added as 100%, and then an approximate expression of an antibody-antigen binding curve:
y = 99 / (1+ (x / P1) P2 ) +0.5
(Where x is the amount of antibody, y is the amount of antibody-antigen binding (%), and P1 and P2 are approximate parameters). Further, P1 and P2 are determined by software, and the value of x (= P1) when y = 50 is determined as IC 50 from the obtained binding curve. The specificity of the antibody is determined as the cross-reactivity by the ratio of the IC 50 for lead to the IC 50 for other metals.
尚、上記により得られた、抗鉛モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、凍結保存し、必要なときに解凍して用いる。得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を大量に産生するためには、例えば、ハイブリドーマを培養容器で培養したり、あるいは、マウスの腹腔内にハイブリドーマを注射してハイブリドーマを増殖させることにより、その腹水からモノクローナル抗体を得ることができる。 The hybridoma producing the anti-lead monoclonal antibody obtained as described above is stored frozen and thawed when necessary. In order to produce a large amount of monoclonal antibody from the obtained hybridoma, for example, the hybridoma is cultured in a culture vessel, or by injecting the hybridoma into the abdominal cavity of a mouse and growing the hybridoma, Antibodies can be obtained.
次に、抗体を用いた免疫学的測定法の一例として免疫クロマトグラフィーを挙げる。この方法は、試料を試験紙上に滴下するだけで目的物質の有無を数分から数十分の間に判定できるため簡便性に優れ、かつ特別な機械装置を必要としないため非常に安価である。本発明において、免疫クロマトグラフィーは、キレート剤−タンパク質複合体を利用することにより、所望の金属を効果的に検出するものである。図２にその実施形態の一例を示す。プラスチックバッキングシート１の上に、メンブレン２と吸収パッド３を一部で重なるように配置し、メンブレン２の先端の試料滴下位置５に試料を滴下すると試料が吸収パッド３に向かってメンブレン２上を流動し、標識された抗鉛ＤＴＰＡモノクロナール抗体あるいは標識されたＤＴＰＡ−タンパク質複合体が固定化された領域４を通過する際に、金属ＤＴＰＡ錯体が抗体に捕捉されあるいは抗鉛ＤＴＰＡモノクロナール抗体がＤＴＰＡ−タンパク質複合体のＤＴＰＡと錯体を形成してその錯体に抗鉛ＤＴＰＡが捕捉されて、固定化領域４が目視可能となることで検出対象物の有無を簡易に検出可能としている。なお、ＤＴＰＡなどのキレート剤を直接標識することは困難であるため、キレート剤にタンパク質を付加する前または後に、タンパク質に色素粒子を付加することで間接的にキレート剤を標識するのが好ましい。あるいは、モノクローナル抗体自体を標識することもできる。これらタンパク質の標識は通常行われている手法によって行うことができる。 Next, immunochromatography is given as an example of an immunological assay using antibodies. This method is excellent in convenience because the presence or absence of the target substance can be determined within a few minutes to several tens of minutes simply by dropping a sample on a test paper, and is very inexpensive because no special mechanical device is required. In the present invention, immunochromatography effectively detects a desired metal by using a chelating agent-protein complex. FIG. 2 shows an example of the embodiment. When the membrane 2 and the absorption pad 3 are arranged so as to partially overlap on the plastic backing sheet 1 and the sample is dropped onto the sample dropping position 5 at the tip of the membrane 2, the sample moves on the membrane 2 toward the absorption pad 3. When flowing and passing through the region 4 where the labeled anti-lead DTPA monoclonal antibody or the labeled DTPA-protein complex is immobilized, the metal DTPA complex is captured by the antibody or the anti-lead DTPA monoclonal antibody is A complex with DTPA of the DTPA-protein complex is formed, and anti-lead DTPA is captured by the complex, and the immobilization region 4 can be visually observed, so that the presence or absence of the detection target can be easily detected. Since it is difficult to directly label a chelating agent such as DTPA, it is preferable to indirectly label the chelating agent by adding dye particles to the protein before or after adding the protein to the chelating agent. Alternatively, the monoclonal antibody itself can be labeled. These proteins can be labeled by a commonly used technique.
ここで、免疫クロマトグラフィーを用いた、鉛の第一の検出方法について説明する。本発明のモノクローナル抗体を試験紙の一部分に試料の流れを横切るように帯状に固定化する。次いで、検査対象試料中にキレート剤−タンパク質−色素粒子（キレート剤−標識タンパク質）複合体を添加して、鉛と結合させたのち試験紙に滴下させる（図３（Ａ）、（Ｂ）参照）。鉛が存在する場合には、鉛−キレート剤錯体が形成され、金属錯体と標識タンパク質複合体が試験紙上に帯状に固定化したモノクローナル抗体によって補足され、その結果として色素粒子が帯状に密集して試料中の鉛が可視化する（図３（Ｃ）、（Ｄ）参照）。試料中に鉛が存在しない場合は、キレート剤−タンパク質−色素粒子複合体は試験紙上に固定化されたモノクローナル抗体に補足されないため、色素粒子により可視化されない。 Here, the first lead detection method using immunochromatography will be described. The monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a part of the test paper in a strip shape so as to cross the sample flow. Next, a chelating agent-protein-dye particle (chelating agent-labeled protein) complex is added to the sample to be examined, and is combined with lead and then dropped onto a test paper (see FIGS. 3A and 3B). ). When lead is present, a lead-chelator complex is formed and the metal complex and the labeled protein complex are captured by the monoclonal antibody immobilized in a band on the test paper. As a result, the pigment particles are concentrated in a band. The lead in the sample is visualized (see FIGS. 3C and 3D). If lead is not present in the sample, the chelator-protein-dye particle complex is not captured by the dye particles because it is not captured by the monoclonal antibody immobilized on the test strip.
次に、免疫クロマトグラフィーを用いた、鉛の第二の検出方法について説明する。キレート剤−タンパク質複合体を利用して鉛を検出する免疫クロマトグラフィーとして次の方法がある。まず、試験法１における抗体の代わりにキレート剤−タンパク質を試験紙上に帯状に固定化する（図４（Ｂ）参照）。色素粒子はモノクローナル抗体に付加する。この標識抗体と検査対象試料をともに試験紙に滴下させると（図４（Ａ）、（Ｂ）参照）、鉛が試験紙上のキレート剤−タンパク質複合体に補足され、鉛−キレート剤錯体が形成され、結果として標識されたモノクローナル抗体が鉛−キレート剤錯体を介して試験紙上に補足され、帯状に密集した色素粒子により試料中の鉛が可視化される（図４（Ｃ）、（Ｄ）参照）。 Next, a second method for detecting lead using immunochromatography will be described. There is the following method as an immunochromatography for detecting lead using a chelating agent-protein complex. First, instead of the antibody in Test Method 1, a chelating agent-protein is immobilized in a strip shape on a test paper (see FIG. 4B). Dye particles are added to the monoclonal antibody. When both the labeled antibody and the sample to be examined are dropped on the test paper (see FIGS. 4A and 4B), lead is captured by the chelating agent-protein complex on the test paper, and a lead-chelating agent complex is formed. As a result, the labeled monoclonal antibody is captured on the test paper via the lead-chelator complex, and the lead in the sample is visualized by the densely packed pigment particles (see FIGS. 4C and 4D). ).
これら２つの試験法の利点は、タンパク質を介することでキレート剤を帯状に試験紙に固定することが容易になること、およびタンパク質１分子当たりに複数のキレート剤を付加するすることができ、単純に試験紙上にキレート剤を固定した場合に比べて表面積を大きく取ることが可能になり、結果として検出感度を上げることができることである。 The advantage of these two test methods is that it is easy to fix the chelating agent in strips through the protein, and multiple chelating agents can be added per protein molecule. In addition, it is possible to increase the surface area as compared with the case where the chelating agent is fixed on the test paper, and as a result, the detection sensitivity can be increased.
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。 The above-described embodiment is an example of a preferred embodiment of the present invention, but is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the scope of the present invention.
本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited thereto.
（１）抗原の作製
免疫抗原は以下のようにして作製した。まず、１ｍｇのイソチオシアノベンジル−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社）を１０ｍｇのスカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略す、シグマアルドリッチジャパン社）と３ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９.５）中で３７℃、４時間反応させ、アミノ基を介してＤＴＰＡをＫＬＨに結合させた。次いで、脱塩カラム（バイオラッド製、１０ＤＧパックドカラム）を用いて５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（同仁化学）ｐＨ６．５にバッファー置換した。この溶液に対して最終的に０．５ｍＭになるように塩化鉛（和光純薬）を添加して、鉛錯体を形成させ、Ｐｂ−ＤＴＰＡ−ＫＬＨ複合体を抗原として作製した。また、ヘモシアニンの代わりにニワトリ卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す、シグマアルドリッチジャパン社）を用いて同様な操作を行ってＰｂ−ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
(1) Preparation of antigen An immune antigen was prepared as follows. First, 1 mg of isothiocyanobenzyl-DTPA (Macrocyclics) was added at 37 ° C. in 10 mg of mussel hemocyanin (hereinafter abbreviated as KLH, Sigma-Aldrich Japan) and 3 ml of 50 mM borate buffer (pH 9.5), The reaction was performed for 4 hours, and DTPA was bound to KLH via an amino group. Subsequently, the buffer was replaced with 50 mM MES buffer (Dojindo) pH 6.5 using a desalting column (Biorad, 10DG packed column). Lead chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to this solution to a final concentration of 0.5 mM to form a lead complex, and a Pb-DTPA-KLH complex was produced as an antigen. In addition, a similar procedure was performed using chicken ovalbumin (hereinafter abbreviated as OVA, Sigma-Aldrich Japan) instead of hemocyanin to prepare a Pb-DTPA-OVA complex, which was used as a screening antigen.
（２）モノクローナル抗体の作製
ａ）マウスの免疫
ＢＡＬＢ／Ｃ近交系のマウス（雌、５週齢、日本クレア）を１週間程度飼育環境に慣らしたのち、１回目の免疫を行った。１回目の免疫の際には、免疫用抗原であるＰｂ−ＤＴＰＡ−ＫＬＨ複合体（タンパク質量にして１ｍｇ）をアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ：ＣｙｔＲｘ社）に混合後、皮下注射によりマウスに投与した。２回目以降の免疫は、初回免疫時から２週間後と４週間後に、初回と同量の抗原をアジュバントと混合せずに皮下注射によりマウスに投与した。その後、１週間以上経過した後、同量の抗原を腹腔または尾部静脈にアジュバントと混合せずにそのまま注射し、４〜５日経過したマウスから、脾臓を摘出した。
(2) Preparation of monoclonal antibody a) Immunization of mice BALB / C inbred mice (female, 5 weeks old, Japan Claire) were acclimated to the breeding environment for about 1 week, and then the first immunization was performed. In the first immunization, Pb-DTPA-KLH complex (protein amount: 1 mg), which is an antigen for immunization, was mixed with an adjuvant (TiterMax Gold: CytRx) and then administered to mice by subcutaneous injection. The second and subsequent immunizations were administered to mice by subcutaneous injection 2 weeks and 4 weeks after the first immunization without mixing the same amount of antigen with the adjuvant. Thereafter, after a lapse of 1 week or more, the same amount of antigen was injected directly into the abdominal cavity or tail vein without mixing with an adjuvant, and the spleen was removed from the mice after 4 to 5 days.
ｂ）ハイブリドーマの作製
免疫したマウスから取り出した脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で洗浄した後、マウス骨髄腫（８−アザグアニン耐性ＩｇＧ非分泌）細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４株（大日本住友製薬）と重合度１５００のポリエチレングリコール（日本ロシュ）溶液中で３７℃、２分間混合して細胞融合させた。ここで用いたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）は凍結保存されていたものを細胞融合実験の約１０日前に解凍し、約４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、含１０％牛胎児血清）で培養したものである。細胞融合実験の前日には培地交換をおこなって、状態の良いミエローマ細胞を調整した。得られたハイブリドーマは、約１２０ｍｌのＨＡＴ培地（含２０％牛胎児血清）に懸濁後、９６穴マイクロプレート６枚に２００μＬずつ分注した。細胞融合の翌日及び５日後に１００μＬの培養液を新しいＨＡＴ培地（含２０％牛胎児血清）に交換した。それ以後はほぼ４日に一度の頻度で１００μＬの培養液を新しいＨＴ培地（含１０％牛胎児血清）に交換した。培養は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。尚、ＨＡＴ培地とＨＴ培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にＨＡＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）またはＨＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を適量加えて作製した。
b) Preparation of hybridoma Spleen cells removed from the immunized mouse were washed with RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), and then mouse myeloma (8-azaguanine resistant IgG non-secretory) cell Sp2 / 0-Ag14 strain (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) The cells were mixed in a polyethylene glycol (Nippon Roche) solution having a polymerization degree of 1500 at 37 ° C. for 2 minutes for cell fusion. The mouse myeloma cells (myeloma cells) used here were frozen and thawed about 10 days before the cell fusion experiment and cultured in about 40 ml of RPMI1640 medium (Invitrogen, containing 10% fetal bovine serum). Is. On the day before the cell fusion experiment, the medium was changed to prepare myeloma cells in good condition. The obtained hybridoma was suspended in about 120 ml of HAT medium (containing 20% fetal calf serum) and then dispensed in 200 μL aliquots onto six 96-well microplates. The next day and 5 days after cell fusion, 100 μL of the culture solution was replaced with fresh HAT medium (containing 20% fetal bovine serum). Thereafter, 100 μL of the culture solution was replaced with fresh HT medium (containing 10% fetal bovine serum) almost once every four days. The culture was performed under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . The HAT medium and HT medium were prepared by adding an appropriate amount of HAT supplement (manufactured by Invitrogen) or HT supplement (manufactured by Invitrogen) to RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen).
ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合から２週間以上経過した培養上清を用いて目的の抗体を分泌するハイブリドーマを蛍光センサー法によりスクリーニングした。蛍光センサー法に用いる抗原ビーズは以下のようにして作製した。アガロースビーズ（ファマルシア製）に上記（１）で作製したＰｂ−ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体を固定化した。１ｍｌのアガロースビーズ懸濁液に対して、約０．１ｍｇのＰｂ−ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体を固定化した後、１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を１ｍｌ用いてビーズ表面をブロッキングした。
c) Screening of hybridomas Hybridomas secreting the antibody of interest were screened by a fluorescence sensor method using a culture supernatant that had passed 2 weeks or more after cell fusion. Antigen beads used in the fluorescence sensor method were prepared as follows. The Pb-DTPA-OVA complex prepared in (1) above was immobilized on agarose beads (manufactured by Famalcia). After immobilizing about 0.1 mg of Pb-DTPA-OVA complex to 1 ml of agarose bead suspension, 1 ml of 10 mg / ml bovine serum albumin (BSA) solution was used to block the bead surface.
抗原に結合した抗体量を蛍光光度計キネクサ３０００（ＫｉｎＥｘＡ３０００、Ｓａｐｉｄｙｎｅ社）を用いて測定した。９６穴プレートの培養液の上清約１０μｌずつ取り、１本の試験管にまとめ（約１．０ｍｌ）、これを測定試料とした。測定試料のうち０．５ｍｌを一次スクリーニングに供した。まず、測定試料を０．２５ｍｌ／分の流速で２分間抗原ビーズに作用させた。さらにビーズを０．２５ｍｌ／分の流速で３０秒間、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（インビトロジェン社）で洗浄し、５ｎＭの二次抗体（Ｃｙ５標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を０．２５ｍｌ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍｌ）作用させた。最後にＰＢＳによるビーズの洗浄を０．２５ｍｌ／分の流速で３０秒間、１．５ｍｌ／分の流速で９０秒間行った。二次抗体には蛍光物質（Ｃｙ５）が結合しており、洗浄後ビーズ上に残った蛍光の強度は、ビーズ上の抗原に結合した抗体の量を反映している。次に、上記測定試料の残分を二次スクリーニングに供した。測定試料にＰｂ−ＤＴＰＡを１００μＭとなるように加え、平衡化したのち、Ｐｂ−ＤＴＰＡと結合しなかった抗体のビーズへの結合を同様に測定した。二次スクリーニングによって、Ｐｂ−ＤＴＰＡと特異的に結合する抗体を含むと判定されたプレートについては、１本の試験管にまとめる培養上清を１２穴分〜１穴分と段階的に絞り込みながら、一次スクリーニング同様、上清中の抗体のビーズへの結合を測定し、目的の抗体を産生するハイブリドーマの特定を行った結果、Ｐｂ−ＤＴＰＡと特異的に結合する抗体を産生する培養画分が２つ見出された。これらの培養画分は、限界希釈法およびメチルセルロース培地を用いた培養によるコロニー形成によって単一のクローンに単離され、これらをＹｊ１Ａ３株とＹｊ２Ｈ７産生株と命名した。これらの株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７４５（Ｙｊ１Ａ３株）、ＦＥＲＭ Ｐ−２０７４６（Ｙｊ２Ｈ７株）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年１２月２２日付けで受託された。 The amount of antibody bound to the antigen was measured using a fluorimeter Kinexa 3000 (KinExA3000, Sapidyne). About 10 μl of the supernatant of the culture solution in a 96-well plate was taken and collected in one test tube (about 1.0 ml), which was used as a measurement sample. 0.5 ml of the measurement sample was subjected to primary screening. First, the measurement sample was allowed to act on the antigen beads at a flow rate of 0.25 ml / min for 2 minutes. Further, the beads were washed with PBS (Phosphate Buffer saline) buffer (Invitrogen) at a flow rate of 0.25 ml / min for 30 seconds, and a secondary antibody of 5 nM (Cy5-labeled goat anti-mouse IgG antibody, manufactured by ImmunoResearch Laboratories) was added to the beads. It was allowed to act for 96 seconds (total 0.4 ml) at a flow rate of 25 ml / min. Finally, the beads were washed with PBS at a flow rate of 0.25 ml / min for 30 seconds and at a flow rate of 1.5 ml / min for 90 seconds. A fluorescent substance (Cy5) is bound to the secondary antibody, and the intensity of the fluorescence remaining on the beads after washing reflects the amount of antibody bound to the antigen on the beads. Next, the remainder of the measurement sample was subjected to secondary screening. After adding Pb-DTPA to the measurement sample to 100 μM and equilibrating, the binding of the antibody that did not bind to Pb-DTPA to the beads was measured in the same manner. For the plate determined to contain an antibody that specifically binds to Pb-DTPA by the secondary screening, the culture supernatant collected in one test tube is squeezed stepwise from 12 to 1 well, As in the primary screening, the binding of the antibody in the supernatant to the beads was measured, and the hybridoma producing the target antibody was identified. As a result, 2 culture fractions producing an antibody that specifically binds to Pb-DTPA were obtained. One was found. These culture fractions were isolated into single clones by the limiting dilution method and colony formation by culture using methylcellulose medium, and these were designated as Yj1A3 strain and Yj2H7 producing strain. These strains were entrusted to the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Deposit numbers FERM P-20745 (Yj1A3 strain) and FERM P-20746 (Yj2H7 strain) on December 22, 2005. .
ｄ）抗体の精製
単離されたコロニーを９６穴プレート、２４穴プレート、２５ｃｍ２フラスコの順に培地量を増やしながら継代した。継代の後３〜５日の間に培養上清中の抗体量を蛍光センサーにて測定し、抗体量の多いものを次の培地に移した。なお、９６穴プレートの培地量は２００μｌ、２４穴プレートの培地量は１０００μｌ、２５ｃｍ２フラスコの培地量は１０ｍｌである。次に、１ｍｌのプロテインＡを固定した樹脂（アフイゲルプロテインＡ、日本バイオ・ラッド）を充填したカラムに、抗体を含む１０ｍｌの培養上清を流した。その後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．０）を３ｍｌ加えて、抗体を溶出させた。抗体を含む溶出液３ｍｌは、脱塩カラム（エコノパック１０ＤＧカラム、日本バイオ・ラッド）を用いてＰＢＳ緩衝液に置換した。
d) Purification of antibody The isolated colonies were subcultured in the order of 96-well plate, 24-well plate, and 25 cm 2 flask while increasing the amount of medium. Between 3 and 5 days after the passage, the amount of antibody in the culture supernatant was measured with a fluorescence sensor, and the one with a large amount of antibody was transferred to the next medium. The medium volume of the 96-well plate is 200 μl, the medium volume of the 24-well plate is 1000 μl, and the medium volume of the 25 cm 2 flask is 10 ml. Next, 10 ml of the culture supernatant containing the antibody was applied to a column packed with a resin (Affigel protein A, Nippon Bio-Rad) on which 1 ml of protein A had been immobilized. Thereafter, 3 ml of 0.1 M sodium citrate solution (pH 3.0) was added to elute the antibody. 3 ml of the eluate containing the antibody was replaced with a PBS buffer solution using a desalting column (Econopack 10DG column, Nippon Bio-Rad).
（３）モノクローナル抗体の性質評価
Ｐｂ−ＤＴＰＡおよび他の金属とＤＴＰＡの錯体に対する親和性を測定・比較することで、得られた抗鉛抗体Ｙｊ１Ａ３とＹｊ２Ｈ７を評価した。結果を図５、図６に示す。鉛以外の金属として、カルシウム（Ｃａ−ＤＴＰＡ）、マグネシウム（Ｍｇ−ＤＴＰＡ）、銅（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）、亜鉛（Ｚｎ−ＤＴＰＡ）、カドミウム（Ｃｄ−ＤＴＰＡ）、マンガン（Ｍｎ−ＤＴＰＡ）、および鉄（Ｆｅ−ＤＴＰＡ）を用い、フリーのＤＴＰＡをコントロールとした。なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい（１０分の１以下の）場合にＩＣ５０値と平衡解離定数Ｋｄがほぼ一致することが知られているため、本実施例では平衡解離定数Ｋｄを評価に用いた。尚、図５、図６において、Ｍｅｔａｌ ｆｒｅｅ ＤＴＰＡは金属を配位していないＤＴＰＡ、他は表示金属とＤＴＰＡとの錯体を示す。また、蛍光強度は蛍光光度計キネクサ３０００により測定し、抗体溶液に抗原を加えずにそのままビーズに作用させたときの蛍光強度をα、抗体溶液に各種濃度の抗原を加えた場合の蛍光強度をβとし、α＝１００とした場合のβの値を計算し、この値を各種抗原の濃度に対してプロットした。
(3) Property Evaluation of Monoclonal Antibody The anti-lead antibodies Yj1A3 and Yj2H7 obtained were evaluated by measuring and comparing the affinity for Pb-DTPA and other metal / DTPA complexes. The results are shown in FIGS. As metals other than lead, calcium (Ca-DTPA), magnesium (Mg-DTPA), copper (Cu-DTPA), zinc (Zn-DTPA), cadmium (Cd-DTPA), manganese (Mn-DTPA), and iron (Fe-DTPA) was used, and free DTPA was used as a control. Since the antibody concentration is known to an IC 50 value and the equilibrium dissociation constant K d is substantially coincident when sufficiently small (less than one tenth) relative to an IC 50 value, the equilibrium in this embodiment The dissociation constant Kd was used for evaluation. In FIGS. 5 and 6, Metal free DTPA indicates DTPA in which no metal is coordinated, and the others indicate complexes of display metal and DTPA. The fluorescence intensity was measured with a fluorimeter Kinexa 3000. The fluorescence intensity when the antibody solution was allowed to act on the beads without adding the antigen was α, and the fluorescence intensity when various concentrations of antigen were added to the antibody solution. β was calculated when α = 100, and this value was plotted against the concentration of various antigens.
表１にモノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３とＹｊ２Ｈ７の各種金属錯体との平衡解離定数Ｋｄ及び交差反応性を示す。尚、表１においては平衡解離定数Ｋｄを各種金属錯体のモル濃度で示し、交差反応性は下式により計算した。
交差反応性＝（Ｐｂ−ＤＴＰＡの平衡解離定数／金属−ＤＴＰＡの平衡解離定数）×１００
Table 1 shows the equilibrium dissociation constant Kd and cross-reactivity of monoclonal antibodies Yj1A3 and various metal complexes of Yj2H7. In Table 1, the equilibrium dissociation constant Kd is shown by the molar concentration of various metal complexes, and the cross-reactivity was calculated by the following equation.
Cross-reactivity = (equilibrium dissociation constant of Pb-DTPA / equilibrium dissociation constant of metal-DTPA) × 100
表２にモノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３とＹｊ２Ｈ７の各種金属との平衡解離定数Ｋｄ及び交差反応性を示す。尚、表２においては平衡解離定数Ｋｄを各種金属の重量％濃度に換算した濃度で示し、交差反応性は下式により計算した。
交差反応性＝（Ｐｂの重量濃度／金属の重量濃度）×１００
Table 2 shows the equilibrium dissociation constant Kd and cross-reactivity of monoclonal antibodies Yj1A3 and various metals of Yj2H7. In Table 2, the equilibrium dissociation constant Kd is shown as a concentration converted to the weight% concentration of various metals, and the cross-reactivity was calculated by the following equation.
Cross reactivity = (weight concentration of Pb / weight concentration of metal) × 100
表２に示すように、モノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３は、Ｐｂに対する平衡解離定数Ｋｄが０．０００３８ｍｇ／Ｌであった。また、モノクローナル抗体Ｙｊ２Ｈ７は、Ｐｂに対する平衡解離定数Ｋｄが０．００４２６ｍｇ／Ｌであった。したがって、これらのモノクローナル抗体により、環境基準値である０．０１ｍｇ／Ｌ以下の鉛の検出が十分に可能であることが確認された。 As shown in Table 2, the monoclonal antibody Yj1A3 had an equilibrium dissociation constant Kd for Pb of 0.00038 mg / L. Monoclonal antibody Yj2H7 had an equilibrium dissociation constant Kd for Pb of 0.00426 mg / L. Therefore, it was confirmed that these monoclonal antibodies can sufficiently detect lead at an environmental standard value of 0.01 mg / L or less.
次に、図５からＹｊ１Ａ３抗体のＰｂ−ＤＴＰＡに対する検出限界を決定した。錯体濃度と蛍光強度の間に直線的な関係のある範囲の下限をその錯体に対する検出下限とすると、Ｙｊ１Ａ３抗体のＰｂ−ＤＴＰＡに対する検出下限は蛍光強度が７２％のときであり、そのときの濃度は０．０００２２ｍｇ／Ｌ（１．０ｎＭ）であった。また、図６からＹｊ２Ｈ７抗体のＰｂ−ＤＴＰＡに対する検出限界を同様の方法により決定したところ、Ｙｊ２Ｈ７抗体のＰｂ−ＤＴＰＡに対する検出下限は蛍光強度が６７％のときであり、そのときの濃度は０．００２１ｍｇ／Ｌ（１０ｎＭ）であった。つまり、本発明のモノクローナル抗体によれば、環境基準値の鉛であれば確実に検出可能であり、環境基準値以下のさらに低濃度な鉛の検出も可能であることが明らかとなった。 Next, the detection limit for Pb-DTPA of the Yj1A3 antibody was determined from FIG. Assuming that the lower limit of the range having a linear relationship between the complex concentration and the fluorescence intensity is the detection lower limit for the complex, the detection lower limit for the Pb-DTPA of the Yj1A3 antibody is when the fluorescence intensity is 72%, and the concentration at that time Was 0.00022 mg / L (1.0 nM). Further, when the detection limit for Pb-DTPA of the Yj2H7 antibody was determined by the same method from FIG. 6, the detection limit for Pb-DTPA of the Yj2H7 antibody was when the fluorescence intensity was 67%, and the concentration at that time was 0. It was 0021 mg / L (10 nM). In other words, according to the monoclonal antibody of the present invention, it was clarified that lead having an environmental standard value can be reliably detected, and lead having a lower concentration below the environmental standard value can also be detected.
また、表１に示すように、モノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３は、Ｐｂ−ＤＴＰＡ以外の錯体に対する交差反応性は０．５５％以下であった。また、モノクローナル抗体Ｙｊ２Ｈ７は、Ｐｂ−ＤＴＰＡ以外の錯体に対する交差反応性は０．００３％以下であった。つまり、本発明のモノクローナル抗体はＰｂ−ＤＴＰＡに対して強い特異性を有しており、鉛（Ｐｂ）以外の金属元素やそのイオンが存在する環境下、例えば、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）が存在するような環境下であっても、これら金属元素やそのイオンに影響されることなく、鉛（Ｐｂ）を検出可能であることが確認された。 Moreover, as shown in Table 1, the monoclonal antibody Yj1A3 had a cross-reactivity with a complex other than Pb-DTPA of 0.55% or less. Further, the monoclonal antibody Yj2H7 had a cross-reactivity with a complex other than Pb-DTPA of 0.003% or less. That is, the monoclonal antibody of the present invention has a strong specificity for Pb-DTPA, and is in an environment where metal elements other than lead (Pb) and ions thereof exist, such as calcium (Ca), magnesium (Mg). ), Copper (Cu), zinc (Zn), cadmium (Cd), manganese (Mn), and iron (Fe) without being affected by these metal elements and their ions. It was confirmed that lead (Pb) can be detected.
尚、モノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３、Ｙｊ２Ｈ７共に金属を配位していないＤＴＰＡに対する交差反応性は低かった。したがって、ＤＴＰＡ自体は鉛の検出を行う際には影響を及ぼさないことが確認された。また、この結果から、ＤＴＰＡ自体は抗原として作用しないことが明らかとなったので、ＤＴＰＡに鉛が配位されることによって、モノクローナル抗体Ｙｊ１Ａ３、Ｙｊ２Ｈ７が鉛を認識することが明らかとなった。 The monoclonal antibodies Yj1A3 and Yj2H7 both had low cross-reactivity with DTPA in which no metal was coordinated. Therefore, it was confirmed that DTPA itself has no effect when lead is detected. Moreover, since it became clear from this result that DTPA itself does not act as an antigen, it became clear that monoclonal antibodies Yj1A3 and Yj2H7 recognize lead by coordination of lead to DTPA.
以上の結果より、Ｙｊ１Ａ３抗体とＹｊ２Ｈ７抗体共に環境基準値濃度の鉛を十分に検出しうることが確認された。尚、低濃度の鉛を測定するには、Ｙｊ１Ａ３抗体が好ましいことが明らかとなった。また、Ｙｊ１Ａ３抗体とＹｊ２Ｈ７抗体共に鉛以外の金属に対する交差反応性は十分に小さいことが確認され、Ｙｊ２Ｈ７抗体の方が交差反応性の観点からは優れた抗体であることが明らかとなった。以上、本発明のモノクローナル抗体は、鉛を特異的に認識し、土壌や水などの環境中の鉛の測定に適したものである。また、本発明のモノクローナル抗体を用いることで、高い検出感度が要求される環境基準値に対する判定を環境調査の現場において行うことができ、鉛が環境基準値以上存在している高濃度エリアを迅速且つ簡便に絞り込むことができることが明らかとなった。 From the above results, it was confirmed that both the Yj1A3 antibody and the Yj2H7 antibody can sufficiently detect lead at the environmental standard concentration. It was found that the Yj1A3 antibody is preferable for measuring low concentrations of lead. In addition, it was confirmed that both the Yj1A3 antibody and the Yj2H7 antibody had sufficiently low cross-reactivity with metals other than lead, and the Yj2H7 antibody was found to be an excellent antibody from the viewpoint of cross-reactivity. As described above, the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes lead and is suitable for measuring lead in the environment such as soil and water. In addition, by using the monoclonal antibody of the present invention, it is possible to make a judgment on the environmental standard value that requires high detection sensitivity at the site of the environmental survey, and quickly in a high concentration area where lead is present above the environmental standard value. And it became clear that it can narrow down simply.
Claims (9)
In a method of preparing a hybridoma of a mammalian tumor cell and a mammalian antibody-producing cell immunized with an immunizing antigen and culturing the hybridoma after screening to prepare a monoclonal antibody, a metal other than the metal element contained in the antigenic substance A method for producing a monoclonal antibody, comprising removing an element from an adjuvant and subjecting the mammal to immunization.
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