JP4722534B2 - Anti trivalent chromium monoclonal antibodies and methods of use thereof - Google Patents

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和裕 佐々木
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直也 大村
均 宮坂
眞 野村
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財団法人電力中央研究所
関西電力株式会社
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本発明は、重金属を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにその使用方法に関する。 The present invention relates to a monoclonal antibody specifically recognizing and methods of use thereof with heavy metals. さらに詳述すると、本発明は、3価クロム錯体を特異的に認識しうるモノクローナル抗体および該抗体を用い6価クロムを定性的または定量的に検出する方法に関する。 In more detail, the present invention relates to a method for qualitative or quantitative detection of hexavalent chromium using a specific monoclonal antibody capable of recognizing and antibody trivalent chromium complexes.

近年、環境保全などの社会的な環境意識や健康に対する影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。 In recent years, the growing interest in the social awareness of environmental issues and the impact on health, such as environmental protection, trends in emissions and accumulation of environmental pollutants have been gazing in various situations associated with the industry and life. 環境汚染物質の中でも環境汚染が問題となっている水銀、カドミウム、鉛、6価クロム、ヒ素等の重金属については公的機関により飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。 Mercury environmental pollution among the environmental pollutants has become a problem, cadmium, lead, hexavalent chromium, water quality standards in drinking water and groundwater by public institutions for heavy metals such as arsenic, environmental standards in the soil, emissions to the environment criteria are provided. さらに、平成15年2月に土壌汚染対策法が施行され、水質汚濁防止法と併せて、土壌に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある他の重金属についても法的規準が設けられつつある。 In addition, the Soil Contamination Countermeasures Law was enacted in February 2003, in conjunction with the Water Pollution Control Law, the law also for other heavy metals there is a risk of causing a damage relating to human health due to be included in the soil It is being provided norms.

これら土壌や水等に対する重金属についての汚染調査の公定法分析には、従来、原子吸光度計や質量分析法などが用いられている。 The official method analysis contamination investigation of heavy metals for these soil or water, conventionally, atomic absorption spectrometer, mass spectrometry and the like have been used.

一方、特定物質に対する簡易な測定法としては、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ(EIAまたはELISA)などの免疫反応を利用した方法が知られている。 On the other hand, the simple measurement method for a particular substance, radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), immunofluorescence assays, methods utilizing immunological reactions such as enzyme immunoassay (EIA or ELISA) have been known. また、微量物質の測定法としては、間接蛍光抗体法、競合アッセイ法の他に蛍光センサーを利用する方法(非特許文献1)などがあり、その応用範囲は広い。 As the method for measuring trace substances, indirect fluorescent antibody technique, in addition to a method utilizing fluorescent sensors competition assay (Non-Patent Document 1) it includes, its application range is wide.

しかしながら、公定法分析には、多大な時間と費用を要する。 However, the official method analysis, takes a lot of time and money. 一方で、汚染調査が必要とされる土壌などの大幅な増加が見込まれることから分析時間と費用の削減のためには、特定物質が環境基準値以上存在している高濃度エリアを絞り込んだ後に、該高濃度エリアのみを公定法分析することが望ましく、高濃度エリアを絞り込むための簡易分析法が望まれる。 On the other hand, in order to reduce the analysis time and money because the significant increase in soil contamination survey is needed is expected, after narrowing down the high concentration area which a particular substance is present or environmental standards it is desirable to official method analyzes only the high density area, a simple analytical method for narrowing the high density area is desired. 例えば、6価クロムに関しては、その水質基準および環境基準における規制値は50ppbであり、50ppbの6価クロムを検出可能な簡易測定法が求められる。 For example, for hexavalent chromium, regulation value at the water quality standards and environmental standards are 50 ppb, detectable simple measurement method is required hexavalent chromium 50 ppb.

また、免疫反応を利用した測定法において、測定すべき検出物質が金属元素やそのイオンの場合、一般的にはそれ自体が抗原性を持たないため、金属を検出しうる抗体を作製することは困難である。 Further, in the measurement method utilizing immune reaction, when the test substance to be measured is a metal element or its ion, since in general themselves no antigenicity, to generate antibodies capable of detecting metal Have difficulty. このため重金属測定用の抗体は一部の金属についてしか作製されていない(非特許文献2)ため、未だ作製されていない重金属測定用の抗体の作製が望まれている。 Therefore antibodies for heavy metals measurements are only for not produced (Non-Patent Document 2), yet the generation of antibodies for the heavy metal is not produced is measured is desired that the part of the metal.

本発明は、かかる要望に応えるものであって、環境汚染物質としての重金属である6価クロムを簡易に検出・定量しうる方法およびその方法において使用されるモノクローナル抗体を提供するものである。 The present invention has been made to meet such a demand, there is provided a monoclonal antibody used in the methods and method capable of detecting and quantifying hexavalent chromium is a heavy metal as an environmental pollutant easily.

そこで、本発明者等が鋭意研究を行ったところ、3価クロムのEDTA錯体(以下、Cr(III)−EDTAと標記)と結合性をもつモノクローナル抗体を作製しうることを見出した。 Accordingly, the present inventors or the like intensively studied, trivalent EDTA complexes of chromium (hereinafter, Cr (III) the title and-EDTA) was found to be capable of producing a monoclonal antibody having binding properties and. 6価クロムは還元することで3価クロムとすることが可能であるので、6価クロムを還元することで得られる3価クロムをCr(III)−EDTAとすることにより6価クロムを定性的または定量的に測定することが可能であることを知見した。 Since hexavalent chromium may be a trivalent chromium by reducing qualitative hexavalent chromium by trivalent chromium Cr (III) -EDTA obtained by reducing hexavalent chromium or with knowledge that it is possible to quantitatively measure.

従って、本発明は、 Accordingly, the present invention is,
[1] 受託番号FERM P−20379として受託されたハイブリドーマにより産生され、EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)と錯体を形成した 3価クロムを特異的に認識するモノクローナル抗体; [1] accession number FERM P-20 379 produced by accession hybridoma as trivalent chromium monoclonal antibodies that specifically recognize the formation of the complex with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid);
[2] 受託番号FERM P−20379として受託されたハイブリドーマ [2] the hybridoma accession an accession number FERM P-20379;
[3] 試料中の3価クロムを定性的または定量的に測定する免疫学的手法において、3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させて[1]に記載のモノクローナル抗体を用いる方法 [3] In qualitatively or quantitatively immunological techniques for measuring the trivalent chromium in a sample, the method of the trivalent chromium is coordinated to EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) using the monoclonal antibody according to [1] ;
[4] [1]に記載のモノクローナル抗体を含む、試料中の3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させて定性的または定量的に測定するためのキット [4] a kit for measuring the including monoclonal antibodies, trivalent chromium in a sample is coordinated to EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) qualitatively or quantitatively described in [1];
[5] 前処理として、試料中の3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させる前に、試料中の6価クロムを3価クロムに還元するものである[3]に記載の方法 [5] as a pretreatment method according to prior to coordinate the trivalent chromium in the sample EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) is for reducing the hexavalent chromium in the sample trivalent chromium [3] ;
[6] 試料中の6価クロムを3価クロムに還元する前に、試料をキレート樹脂にて前処理する、[3]に記載の方法 [6] Before the reduction of hexavalent chromium in the sample trivalent chromium, pretreatment of the sample with the chelating resin, the method described in [3];
[7] 検査対象試料を還元剤にて前処理した後にEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を加えた第1の試料と、前記前処理を行わずにEDTAを加えた第2の試料とを、[1]に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法により測定し、前記第1の試料の測定結果と前記第2の試料の測定結果とを比較して、前記検査対象試料に含まれる3価クロムおよび6価クロムを定性的または定量的に分析する方法 [7] and the first sample was added EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) after pretreatment of the sample to be examined by a reducing agent, and a second sample plus EDTA without the pretreatment, [1 ] measured by immunological technique using a monoclonal antibody according to, by comparing the measurement result of the second sample and the measurement result of the first sample, the trivalent chromium contained in the sample to be inspected how to qualitatively or quantitatively analyze and hexavalent chromium;
に関する。 On.

本発明においては、6価クロムを検出する際に、その法的規準(例えば環境基準、水質基準など)以下の検出限界を有することで環境基準濃度の測定が可能であることが好ましく、すなわち、本発明のモノクローナル抗体が3価クロムに対して50ppb以下の検出限界を有することで、それが実現される。 In the present invention, when detecting the hexavalent chromium is preferably capable of measuring environmental standard concentrations by having the legal standards (e.g. environmental standards, quality standards, etc.) following the detection limit, i.e., by monoclonal antibody of the present invention has the following detection limits 50ppb respect trivalent chromium, which is achieved.

また、本発明のモノクローナル抗体は、マグネシウム、カドミウム、亜鉛、鉛などの3価クロム以外の金属のEDTA錯体とはほとんどまたは全く交差反応を起こさず、その親和性は3.5%以下である。 Moreover, the monoclonal antibody of the present invention, magnesium, without causing cadmium, zinc, little or no cross-react with a trivalent metal EDTA complexes other than chromium such as lead, its affinity is 3.5% or less. 従って、正確に3価クロムのEDTA錯体を定性的または定量的に測定することができる。 Therefore, it is possible to accurately measure the EDTA complex of trivalent chromium qualitatively or quantitatively.

本発明の抗モノクローナル抗体としては、 EDTAと錯体を形成した3価クロムを特異的に認識するG b3G12が挙げられる。 Anti monoclonal antibodies of the invention include G B3G12 you specifically recognizing the trivalent chromium forming the EDTA complexes. モノクローナル抗体Gb3G12を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成17年1月27日付けで受託番号FERM P−20379として受託されている。 The hybridoma producing the monoclonal antibody Gb3G12 has been deposited as accession number FERM P-20379 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary in January 2005 27 dated.

本発明のモノクローナル抗体を用いて3価クロムを定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、3価クロムはキレート剤(EDTA)に配位させ、形成された錯体を本発明のモノクローナル抗体により検出・測定する。 In qualitatively or quantitatively immunological method of measuring the trivalent chromium using a monoclonal antibody of the present invention, the trivalent chromium monoclonal antibodies of the present invention is coordinated to a chelating agent (EDTA), formed complexes detected and measured by. 故に、本発明は、(i)検査対象試料にキレート剤(EDTA)を添加して錯体を形成させ、(ii)該錯体を特異的に認識する抗体を用いる免疫学的手法により3価クロムを定性的または定量的に測定する方法に関する。 Thus, the present invention is added to form a complex with the trivalent chromium by an immunological method using an antibody that specifically recognizes (ii) the complex chelating agent (EDTA) to (i) the sample to be inspected to a method of qualitatively or quantitatively measured. 本発明のモノクローナル抗体は、前述のように3価クロムのEDTA錯体に対して親和性が高く、且つ他の金属のEDTA錯体との交差反応性が低いため、検査対象試料中の3価クロムをより正確に測定することができる。 Monoclonal antibodies of the present invention has high affinity for EDTA complexes of trivalent chromium as described above, and has a low cross-reactivity with EDTA complex of other metals, trivalent chromium inspection subject sample it can be more accurately measured. その中でも、本発明のモノクローナル抗体Gb3G12は、3価クロムのEDTA錯体に対して非常に高い親和性・特異性を有している。 Among them, a monoclonal antibody Gb3G12 of the present invention has a very high affinity, specificity for EDTA complexes of trivalent chromium.
また、本発明は、検査対象試料中の6価クロムを還元処理して3価クロムに還元し、次いで、 検査対象試料にキレート剤(EDTA)を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Gb3G12を用いて3価クロムのEDTA錯体の濃度を測定することで、検査対象試料中の6価クロム濃度を知り得るものである。 Further, the present invention is that the hexavalent chromium to be tested in the sample was reduced to reduction to trivalent chromium and then to form a complex with a chelating agent (EDTA) sample to be examined, a monoclonal antibody Gb3G12 by measuring the concentration of EDTA complex of trivalent chromium with, but has known hexavalent chromium concentration of the test subject sample.
さらに、本発明は、検査対象試料中に3価クロムが混入している場合、3価クロムを例えばキレート樹脂に吸着させる等の方法で除去し、次いで、6価クロムを還元処理することで検査対象試料中に存在する6価クロム由来の3価クロムを得ることができ、この検査対象試料にキレート剤(EDTA)を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Gb3G12を用いて測定することで、検査対象試料中の6価クロムの濃度を知り得るものである。 Furthermore, the present invention, when the trivalent chromium in the inspected sample is mixed, removed by a method such as the adsorption of trivalent chromium, for example, the chelate resin, then examined by reduction treatment of hexavalent chromium can be obtained trivalent chromium hexavalent chromium from that present in a subject sample, the sample to be inspected and to form a complex with a chelating agent (EDTA) on, by measuring using a monoclonal antibody Gb3G12, it is intended to obtain know the concentration of hexavalent chromium in the inspection subject sample. 従って、本発明は、検査対象試料中に3価クロムが混入している場合、3価クロムを除去後に、6価クロムを還元処理により3価クロムに還元し、次いで、 この検査対象試料にキレート剤(EDTA)を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Gb3G12を用いて3価クロムのEDTA錯体の濃度を測定し、その測定結果から検査対象試料中の6価クロム濃度を測定する方法に関する。 Accordingly, the present invention is, if contaminated with trivalent chromium in the sample to be inspected, after removal of the trivalent chromium was reduced trivalent chromium by reduction of hexavalent chromium, then chelate the inspected sample agent (EDTA) and allowed to form a complex addition of the concentration of EDTA complex of trivalent chromium with monoclonal antibodies Gb3G12 measured, relates to a method for measuring the hexavalent chromium concentration of the test subject sample from the measurement results.
もしくは、検査対象試料中に3価クロムが混入している場合、 検査対象試料を還元剤にて前処理した後にEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を加えた第1の試料と、前記前処理を行わずにEDTAを加えた第2の試料とを、モノクローナル抗体Gb3G12を用いて免疫学的手法により測定し、前記第1の試料の測定結果と前記第2の試料の測定結果とを比較して、前記検査対象試料に含まれる3価クロムおよび6価クロムを定性的または定量的に分析する方法に関する。 Or, if the trivalent chromium in the inspected sample is mixed, first a sample plus EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) after pretreatment of the sample to be examined by a reducing agent, without the pretreatment in a second sample plus EDTA, using a monoclonal antibody Gb3G12 measured by immunological methods, by comparing the measurement result of the second sample and the measurement result of the first sample, the trivalent chromium and hexavalent chromium contained in a sample to be inspected to a method of qualitatively or quantitatively analyze.

本発明において用いる免疫学的手法としては、本発明のモノクローナル抗体を用いればいずれでも良いが、例えば免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ(EIAまたはELISA)、CLEIA(化学発光酵素免疫測定法)、免疫比濁法(TIA)、ラテックス免疫比濁法(LTIA)、蛍光センサー法などの方法が挙げられる。 The immunological technique used in the present invention may be either the use of the monoclonal antibodies of the present invention, for example, immunochromatography, radioimmunoassays (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), immunofluorescence assays, enzyme immunoassay (EIA or ELISA), CLEIA (chemiluminescent enzyme immunoassay), turbidimetric immunoassay (TIA), a latex turbidimetric immunoassay (LTIA), and a method such as fluorescent sensor method.

本発明の試料中の3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させて 3価クロムを定性的または定量的に測定するためのキットは、本発明のモノクローナル抗体のみから構成されていてもよいが、他の試薬例えばキレート剤、キレート剤−タンパク質複合体、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料などを包含してもよい。 Kit for qualitative or quantitative determination of trivalent chromium EDTA trivalent chromium is coordinated to (ethylenediaminetetraacetic acid) in a sample of the present invention may be composed of only the monoclonal antibodies of the present invention good, other reagents e.g. chelating agents, chelating agents - protein complex, positive control samples, may encompass such negative control samples. また、モノクローナル抗体、キレート剤−タンパク質複合体のいずれか、または両方が標識されていてもよい。 Also, monoclonal antibodies, chelating agents - either protein complex or both, may be labeled. さらに、本発明のキットは、モノクローナル抗体を含め必要な試薬がフィルターなどに吸着されている免疫クロマトグラフィー装置(例えば、試験紙)の形態でもよい。 Furthermore, the kit of the present invention, immunochromatography apparatus necessary reagents including monoclonal antibodies are adsorbed such as a filter (e.g., paper) may be in the form of.

本発明によれば、 EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)と錯体を形成した 3価クロムを特異的に認識するモノクローナル抗体および該抗体を用いる免疫学的方法、該方法に用いるキット(装置)が提供される。 According to the present invention, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and immunological methods using a monoclonal antibody specifically recognizing and antibody trivalent chromium to form a complex, kit for use in the method (apparatus) is provided . 本発明のモノクローナル抗体はEDTAと錯体を形成した 3価クロムに対して高い親和性・特異性を有するため微量の3価クロムを検出することができる。 Monoclonal antibodies of the present invention can detect the trivalent chromium traces has a high affinity, specificity for trivalent chromium forming the EDTA complexes. また、6価クロムを3価クロムに還元してから該キットを用いることで6価クロムの定量が可能であることから、環境への排出基準のみならず、高い検出感度が要求される水質基準や環境基準に対する判定にも用いることができる。 Moreover, since the by reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium are possible determination of hexavalent chromium in the use of the kit, not only emission standards to environmental water quality standards high detection sensitivity is required it can also be used to determine relative and environmental standards.

以下、本発明の構成を図面に示す一実施形態に基づいて詳細に説明する。 Hereinafter will be described in detail with reference to an embodiment shown in the drawings the arrangement of the present invention.
<抗原> <Antigen>
6価クロムおよび3価クロム単独では抗原性を持たない。 The hexavalent chromium and trivalent chromium alone no antigenicity. そこで、本発明は、3価クロムをキレート剤に配位させ、形成された金属錯体を抗原として用いた。 Accordingly, the present invention is used is coordinated to trivalent chromium chelating agent, the formed metal complex as an antigen. 尚、6価クロムは通常、クロム酸塩や二クロム酸塩といった陰イオンとして存在しており、キレート剤に配位させることが困難であるため、用いなかった。 Incidentally, the hexavalent chromium usually is present as an anion such as chromate or dichromate, since it is difficult to coordinate the chelating agent was not used. キレート剤としては、3価クロムを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、テトラエチレントリアミン(TET)、エチレンジアミン(EDA)、ジエチレントリアミン(DETA)、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、好ましくはEDTAである。 The chelating agent, trivalent but chromium may be any chelating agent as long as it can coordinate, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), tetraethylene triamine (TET), ethylenediamine (EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ethers, Nitorirotetora acetate, edetate disodium, sodium edetate, sodium edetate trisodium, penicillamine, pentenoyl Tate calcium trisodium, pentetic acid, Sukushimeru and it can be mentioned edetate trientine, preferably EDTA.

また、Cr(III)−EDTAは免疫応答を誘導するには分子として小さすぎるため、キャリアとなる高分子量物質に結合させ、これを抗原または免疫源として用いる。 Further, since Cr (III) -EDTA is too small as a molecule to induce an immune response, it is bound to high molecular weight material as a carrier, using this as an antigen or immunogen. キャリアとして用いることができる高分子量物質の例としては多糖類、タンパク質などが挙げられるが、タンパク質が好ましい。 Polysaccharides Examples of high molecular weight material can be used as the carrier, although such proteins include, proteins are preferred. アルブミン、オバルブミン、ヘモシアニン、グロブリン、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Albumin, ovalbumin, hemocyanin, globulins, gelatin, such as collagen, but are not limited thereto.

これら金属錯体とタンパク質の複合体を作製するには、タンパク質と結合しうる官能基を有するキレート剤または該官能基を導入したキレート剤を用いるか、あるいはリンカーを介してタンパク質とキレート剤を結合させることができる。 To prepare a composite of these metal complexes and proteins, or using a chelating agent to introduce a chelating agent or a functional group having a functional group capable of binding with proteins, or to bind the protein and a chelating agent via a linker be able to. そのようなキレート剤は市販されており、例えばイソチオシアノベンジル−EDTA(同仁化学)が挙げられる。 Such chelating agents are commercially available, for example, be mentioned isothiocyanate cyanobenzyl-EDTA (Dojin Kagaku) ​​is. 複合体の形成は常法により行うことができる。 Complex formation can be carried out by a conventional method.

<抗金属モノクローナル抗体の作製> <Preparation of Anti-metal monoclonal antibody>
マウスの免疫、ハイブリドーマの作製およびその培養などモノクローナル抗体の作製は、常法に従って、例えばモノクローナル抗体作製マニュアル、多田ら著、学際企画発行、1995年(ISBN 4-906514-19-7)参照して適宜行うことができ、免疫するマウスの系統、脾臓細胞と融合させるミエローマなども特に限定されない。 Immunization of mice, the production of monoclonal antibodies, such as the production of the hybridoma and its culture, according to a conventional method, for example, monoclonal antibody production manual, Tada et al., Interdisciplinary planning issues, see 1995 (ISBN 4-906514-19-7) can be done appropriately, there is no particular limitation, such as myeloma to be fused strains of mice immunized with spleen cells.

<抗体生産細胞のスクリーニング> <Screening of antibody-producing cells>
抗体生産細胞のスクリーニングには一般的にはELISA法を用いるが、より少ない抗体量でスクリーニングが可能であるため、蛍光センサー法(特許文献1)を用いるのが好ましい。 The screening of antibody-producing cells are generally used ELISA method. However, since it is possible to screening a smaller amount of antibody is preferably used fluorescence sensor method (Patent Document 1). この方法は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなり、一次スクリーニングは担体に固定化した抗原(3価クロム錯体−タンパク質複合体)に抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を添加し、固定化抗原に結合した抗体を蛍光標識した二次抗体(抗マウスIgG抗体)を用いて蛍光センサーで検出する。 This method consists of the primary screening and secondary screening, primary screening antigen immobilized on a carrier - adding the hybridoma culture supernatants containing antibodies (trivalent chromium complex protein complexes), bind to the immobilized antigen detected by fluorescence sensor with a fluorescently labeled secondary antibody (anti-mouse IgG antibody) antibody. 二次スクリーニングでは、培養上清に適当量(例えば10μM)の3価クロム錯体を添加して平衡化した後、錯体と結合しなかった抗体の固定化抗原との結合を一次スクリーニングと同様に測定する。 In the secondary screening, trivalent After equilibration by addition of chromium complex, measuring the binding of the immobilized antigen antibody did not bind to the complex similar to the primary screening an appropriate amount to the culture supernatant (e.g., 10 [mu] M) to. 一次スクリーニングと二次スクリーニングの差から3価クロム錯体と特異的に結合する抗体を特定する。 Identifying a trivalent chromium complex and an antibody that specifically binds to the difference in the primary screening and secondary screening.

<モノクローナル抗体の産生および精製> <Production and purification of monoclonal antibody>
特定したクローンを培養し、単離したコロニーは徐々に培地量を増やしながら継代する。 Culturing the identified clones isolated colonies passaged incrementally medium amount. 得られた培地は、脱塩カラムを用いて培地自体に含まれる若干の重金属を除去するのが好ましい。 The resulting medium is preferably removed some heavy metals contained in a medium itself with the desalting column. さらに、培地中に他のタンパク質の影響を除くために、抗体を精製する方法、例えばプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより抗体を精製するのが好ましい。 Furthermore, in order to eliminate the influence of other proteins in the medium, the method of purifying antibodies, for example to purify the antibody by protein A affinity column chromatography preferable.

<モノクローナル抗体の評価> <Evaluation of monoclonal antibodies>
得られたモノクローナル抗体は、3価クロム錯体および他の金属の錯体に対する親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。 The resulting monoclonal antibody evaluates the affinity and specificity for antigen of the antibody by comparing affinity for trivalent chromium complexes and other metal complexes. 親和性は、抗体の抗原との結合を50%阻害する抗原濃度(IC 50 )により評価する。 Affinity is assessed by antigen concentration which inhibits 50% binding of the antigen antibody (IC 50). そして、特異性は、3価クロムに対するIC 50と他の金属に対するIC 50を比較することにより評価する。 The specificity is assessed by comparing an IC 50 and IC 50 for the other metal to trivalent chromium. IC 50はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア(例えばOrigin Version 6.0など)により解析して求めてもよい。 IC 50 but may also be calculated by either method, may be obtained by the measurement results were analyzed by software (e.g., Origin Version 6.0). 例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を100%として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式: For example, the measured values ​​obtained by the fluorescent sensor method, after converted into a relative value to the measured value when not added antigen as 100%, the approximate expression of the binding curve of antibodies and antigens:
y=99/(1+(x/P1) P2 )+0.5 y = 99 / (1+ (x / P1) P2) +0.5
[式中、xは抗体量であり、yは抗体と抗原の結合量(%)であり、P1およびP2は近似のパラメーターである]に導入する。 Wherein, x is an antibody amount, y is the amount of binding of the antibody and antigen (%), the P1 and P2 at which parameters of the approximation] introduced into. また、P1およびP2はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、y=50になるときのxの値(=P1)をIC 50とする。 Also, P1 and P2 are determined by the soft Fair, from the resulting binding curves and IC 50 values (= P1) of x that causes the y = 50. また、抗体の特異性は3価クロムに対するIC 50と他の金属に対するIC 50との比を交差反応性として求める。 Moreover, specificity of an antibody determining the ratio of the IC 50 for IC 50 with other metals to trivalent chromium as a cross-reactive.

<免疫クロマトグラフィー> <Immune chromatography>
抗体を用いた免疫学的測定法の一例として免疫クロマトグラフィーを挙げる。 It mentioned immunochromatography as an example of the immunoassay method using the antibody. この方法は、試料を試験紙上に滴下するだけで目的物質の有無を数分から数十分の間に判定できるため簡便性に優れ、かつ特別な機械装置を必要としないため非常に安価である。 This method is excellent in convenience for by simply dropping the sample into the test paper can be determined whether the target substance between a few minutes to several tens of minutes, and is very inexpensive since it does not require special machinery. 本発明において、免疫クロマトグラフィーは、キレート剤−タンパク質複合体を利用することにより、所望の金属を効果的に検出するものである。 In the present invention, immunochromatography, the chelating agent - by utilizing a protein complex, is to effectively detect the desired metal. 図3にその実施形態の一例を示す。 Figure 3 shows an example of the embodiment. プラスチックバッキングシート1の上に、メンブレン2と吸収パッド3を一部で重なるように配置し、メンブレン2の先端の試料滴下位置5に試料を滴下すると試料が吸収パッド3に向かってメンブレン2上を流動し、標識された抗金属EDTAモノクロナール抗体あるいは標識されたEDTA−タンパク質複合体が固定化された領域4を通過する際に、金属EDTA錯体が抗体に捕捉されあるいは抗金属EDTAモノクロナール抗体がEDTA−タンパク質複合体のEDTAと錯体を形成してその錯体に抗金属EDTAが捕捉されて、固定化領域4が目視可能となることで検出対象物の有無を簡易に検出可能としている。 On a plastic backing sheet 1, positioned so as to overlap a part of the membrane 2 and the absorbent pad 3, the samples added dropwise and the sample to the sample dropping position 5 of the tip of the membrane 2 on the membrane 2 toward the absorbent pad 3 flow and, when the labeled anti-metal EDTA monoclonal antibody or labeled EDTA- protein complex passes through the region 4 immobilized metal EDTA complex is captured on the antibody or anti-metal EDTA monoclonal antibody anti metal EDTA to the complex is captured to form EDTA complexes of EDTA- protein complex, immobilization region 4 is capable of detecting the presence or absence of the detection object easily by the visible. なお、EDTAなどのキレート剤を直接標識することは困難であるため、キレート剤にタンパク質を付加する前または後に、タンパク質に色素粒子を付加することで間接的にキレート剤を標識するのが好ましい。 Since it is difficult to directly label the chelating agents such as EDTA, before or after the addition of protein to chelating agent, preferably labeled indirectly chelating agent by adding the pigment particles to the proteins. あるいは、モノクローナル抗体自体を標識することもできる。 Alternatively, it is also possible to label the monoclonal antibody itself. これらタンパク質の標識は通常行われている手法によって行うことができる。 Labeling of these proteins can be carried out by methods that are common practice.

(1)試験法1 (1) Test Method 1
本発明のモノクローナル抗体を試験紙の一部分に試料の流れを横切るように帯状に固定化する。 Monoclonal antibodies of the present invention to a portion of the test strip is immobilized in a strip across the flow of the sample. 次いで、検査対象試料中にキレート剤−タンパク質−色素粒子(キレート剤−標識タンパク質)複合体を添加して、3価クロムと結合させたのち試験紙に滴下させる(図4(A),(B)参照)。 Then, the chelating agent in the sample to be inspected - protein - pigment particles (chelator - labeled protein) was added to complex is added dropwise to the test paper after coupled with trivalent chromium (Fig. 4 (A), (B )reference). 目的の金属イオンが存在する場合には、金属−キレート剤錯体が形成され、金属錯体と標識タンパク質複合体が試験紙上に帯状に固定化したモノクローナル抗体によって補足され、その結果として色素粒子が帯状に密集して試料中の金属イオンが可視化する(図4(C),(D)参照)。 If the purpose of the metal ions are present, a metal - chelator complexes are formed, metal complex and the labeled protein conjugate is supplemented by a monoclonal antibody immobilized on the strip in the test paper, as a result pigment particles in a strip dense metal ions in the sample is visualized (FIG. 4 (C), the reference (D)). 試料中に金属イオンが存在しない場合は、キレート剤−タンパク質−色素粒子複合体は試験紙上に固定化されたモノクローナル抗体に補足されないため、色素粒子により可視化されない。 If the metal ion is not present in the sample, a chelating agent - protein - for the pigment particles complex is not captured by the monoclonal antibody immobilized on the test strip, it is not visualized by pigment particles.

(2)試験法2 (2) Test Method 2
キレート剤−タンパク質複合体を利用して金属イオンを検出する免疫クロマトグラフィーとして次の方法がある。 Chelating agents - there are the following methods as an immune chromatography using a protein complex to detect the metal ions. まず、試験法1における抗体の代わりにキレート剤−タンパク質を試験紙上に帯状に固定化する(図5(B)参照)。 First, a chelating agent in place of antibodies in test method 1 - immobilized on a strip of proteins in paper test (see FIG. 5 (B)). 色素粒子はモノクローナル抗体に付加する。 Color particles is added to the monoclonal antibody. この標識抗体と検査対象試料をともに試験紙に滴下させると(図5(A),(B)参照)、金属イオンが試験紙上のキレート剤−タンパク質複合体に補足され、金属−キレート剤錯体が形成され、結果として標識されたモノクローナル抗体が金属−キレート剤錯体を介して試験紙上に補足され、帯状に密集した色素粒子により試料中の金属イオンが可視化される(図5(C),(D)参照)。 When to drop the inspected sample with the labeled antibody are both the test paper (FIG. 5 (A), (B) refer), metal ion chelators on the test strip - is supplemented to the protein complex, metal - chelating agent complexes is formed, labeled monoclonal antibodies metal as a result - is captured by the test paper through a chelating agent complexes, metal ions in the sample is visualized by the color particles were densely in a band (Fig. 5 (C), (D )reference).
これら2つの試験法の利点は、タンパク質を介することでキレート剤を帯状に試験紙に固定することが容易になること、およびタンパク質1分子当たりに複数のキレート剤を付加するすることができ、単純に試験紙上にキレート剤を固定した場合に比べて表面積を大きく取ることが可能になり、結果として検出感度を上げることができることである。 The advantage of these two test methods, it is easy to fix the test paper chelating agent in a strip by passing through a protein, and protein 1 can be added a plurality of chelating agents per molecule, simple it is possible to obtain a large surface area as compared with the case of fixing the chelating agent on the paper test is that it is possible to increase the detection sensitivity as a result.

本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described examples specifically described below, but the present invention is not limited thereto. なお、本実施例では抗原として3価クロムとEDTAの錯体(Cr(III)−EDTA)、キャリアタンパク質としてヘモシアニンもしくはオバルブミンを用いて、3価クロムとしてCr(III)−EDTAを特異的に認識する抗体を作製した。 Incidentally, the complex of trivalent chromium and EDTA as an antigen in the present embodiment (Cr (III) -EDTA), using hemocyanin or ovalbumin as a carrier protein, specifically recognizes the Cr (III) -EDTA trivalent chromium the antibodies were produced.

実施例1:抗3価クロムモノクローナル抗体の作製(1)抗原の作製 1mgのイソチオシアノベンジル−EDTA(同人化学)を10mgのスカシ貝ヘモシアニン(KLH)と3mlの50mMシュウ酸緩衝液(pH9.5)中で37℃、4時間反応させた。 Example 1: Anti trivalent Preparation of chromium monoclonal antibody (1) isothiourea cyanobenzyl-EDTA (Dojin Chemical) was keyhole limpet hemocyanin (KLH) and 3 ml 50 mM oxalic acid buffer of 10mg of Preparation 1mg of antigen (pH 9. 5) 37 ° C. in, allowed to react for 4 hours. 次いで、脱塩カラム(バイオラッド製、10DGパックドカラム)を用いて50mM MES緩衝液pH6.5に置換した。 Then, a desalting column (Bio-Rad, 10DG packed column) was replaced with 50 mM MES buffer pH6.5 using. この溶液に5mMになるように硫酸亜鉛を添加して、亜鉛錯体を形成させてCr(III)−EDTA−ヘモシアニン複合体を抗原として精製した。 This solution was added zinc sulfate in a 5 mM, was allowed to form a zinc complex Cr (III) -EDTA- hemocyanin conjugates were purified as an antigen. また、ヘモシアニンの代わりにニワトリ卵白アルブミン(OVA)を用いて同様な操作を行ってCr(III)−EDTA−オバルブミン複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。 Further, to prepare by performing the same operation with chicken ovalbumin (OVA) Cr (III) -EDTA- ovalbumin complexes in place of hemocyanin, was screened for antigen it.

(2)モノクローナル抗体の作製 a)マウスの免疫 6匹のBALB/C近交系のマウス(雌、5週齢、日本クレア)を1週間程度飼育環境に慣らしたのち、1回目の免疫を行った。 (2) monoclonal antibody of manufacturing a) Immunization of mice Six BALB / C inbred mice (female, 5 weeks old, after the break-in the CLEA Japan) to 1 week about breeding environment, carried out the first immunization It was. 免疫は、実施例1の免疫用抗原と等量のアジュバントを十分に混合してエマルジョンとした。 Immunization was an emulsion by mixing thoroughly immunizing antigen and an equal amount of an adjuvant of Example 1. 1回の免疫につき、タンパク質量にして約0.3mgの抗原を用いて1回につき2カ所、100μlずつ皮下注射した。 Per immunization, two locations at a time with the antigen of approximately 0.3mg in the protein content, were injected subcutaneously by 100 [mu] l. 2回目以降の免疫は2週間程度おきに3回または4回行った。 The second and subsequent immunization was carried out three times or four times every two weeks. 3回目の免疫後、4〜7日間にマウスの尾部より数滴の血液を採取し、スクリーニング用抗原を用いて抗体価を測定し、抗体の産生を確認した。 After the third immunization, the blood of a few drops from the tail of the mouse were taken in 4-7 days, to measure the antibody titer by using the antigen for screening, to confirm the production of antibodies.

b)ハイブリドーマの作製 最後の免疫から4〜5日経過したマウスから、脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞(NS0株、理化学研究所)と融合させた。 From b) was passed 4-5 days from the formation last immunization hybridoma mice, the spleen was excised, spleen cells and myeloma cells (NS0 strain were fused with RIKEN). 細胞を融合する際は、重合度1500のポリエチレングリコールで脾臓細胞とミエローマを処理した。 When fusing cells were treated spleen cells and myeloma with polyethylene glycol having a degree of polymerization of 1500. 細胞融合に関する一連の操作は37℃にて行った。 A series of operations related to cell fusion was carried out at 37 ℃. 得られたハイブリドーマは96穴プレートに分注し、HAT培地中で37℃,5%CO の条件下で培養した。 The resulting hybridomas dispensed in 96-well plates, 37 ° C. in HAT medium and cultured under the conditions of 5% CO 2. ハイブリドーマは、融合後約2週間培養し、その間は3〜4日に1回培地を交換した。 Hybridomas, for about two weeks in culture after fusion, during which replaced the once medium in 3-4 days. なお、10日目前後まではHAT培地を用い、その後はHT培地を用いた。 In addition, up to 10 days before and after using HAT medium, and then was used as HT medium.

c)スクリーニング スクリーニングは、フロー式蛍光センサー(キネクサ3000)を用いて蛍光センサー法にて行った。 c) Screening was carried out by fluorescence sensor method using a flow-type fluorescence sensor (Kinekusa 3000). また、抗原を固定化する担体としてアガロースビーズ(NHS修飾済み,ファルマシア)を用いた。 Also, agarose beads (NHS-modified already, Pharmacia) as a carrier for immobilizing the antigen was used. 1mlのアガロースビーズ懸濁液に対して、実施例2で得たスクリーニング用抗原0.1mgを添加して抗原をビーズに固定化した。 Respect agarose bead suspension 1 ml, the antigen was added to antigen 0.1mg for screening obtained in Example 2 was immobilized on the beads.
96穴プレートの培養液の上清約10μlずつ取り、1本の試験管にまとめた(約1ml)。 Taken by the supernatant of about 10μl of the culture solution of a 96-well plate, were combined into one test tube (about 1 ml). 一次スクリーニングでは、この試験管に固定化抗原を添加し、固定化抗原に結合した抗体は蛍光物質Cy5にて標識された二次抗体(抗マウスIgGヤギ抗体)を用いて間接的に蛍光標識し、上清中の抗体と固定化抗原との結合を蛍光センサーにより検出した。 In the primary screen, was added to immobilized antigen in the test tube, the antibody bound to immobilized antigen is indirectly fluorescently labeled using a secondary antibody labeled with a fluorescent substance Cy5 (anti-mouse IgG goat antibody) , the binding of the antibody with the immobilized antigen in the supernatant was detected by fluorescence sensor. 二次スクリーニングでは、培養上清にCr(III)−EDTAを1μMとなるように加え、平衡化したのち、錯体と結合しなかった抗体のビーズへの結合を同様に測定した。 In the secondary screening, it was added such that Cr and (III)-EDTA and 1μM in the culture supernatant, after equilibration were measured similarly coupled to the beads of the antibodies did not bind to the complex. 二次スクリーニングによって、Cr(III)−EDTAと特異的に結合する抗体を含むと判定されたプレートについては,1本の試験管にまとめる培養上清を12穴分〜1穴分と段階的に絞り込みながら、一次スクリーニング同様、上清中の抗体のビーズへの結合を測定し、目的の抗体を産生するハイブリドーマとして、Gb3G12株を特定した。 By secondary screening, for the determined plate and containing Cr (III) -EDTA antibody that specifically binds to a stepwise culture supernatant combined into one tube 12 holes min to 1 hole min Refine while, similarly primary screening, the binding of the beads of the antibody in the supernatant was measured, as hybridomas producing antibodies of interest were identified Gb3G12 strain. スクリーニングによって陽性と判断されたこの抗体生産細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、コロニーを液体培地に移し培養を続けた。 The antibody-producing cells is determined positive by screening after using methylcellulose medium to form colonies derived from a single cell, continued transferred culturing colonies liquid medium.

d)モノクローナル抗体の生産 単離されたコロニーを96穴プレート、24穴プレート、25cm フラスコの順に培地量を増やしながら継代した。 d) production of monoclonal antibodies isolated colonies 96 well plates, 24-well plates, and passaged while increasing the volume of medium in the order of 25 cm 2 flasks. 継代の後3〜5日の間に培養上清中の抗体量を蛍光センサーにて測定し、抗体量の多いものを次の培地に移した。 The antibody in the culture supernatant during the 3-5 days after subculture were measured by fluorescent sensor and transferred ones with many antibody amount in the following medium. なお、96穴プレートの培地量は200μl、24穴プレートの培地量は1000μl、25cm フラスコの培地量は10mlである。 Incidentally, the culture medium of a 96-well plate 200 [mu] l culture medium of a 24-well plate 1000 .mu.l, medium amount of 25 cm 2 flasks is 10 ml. また、培養後の培地は脱塩カラムを用いて培地に含まれる若干の重金属を除去し、25mM HEPES緩衝液(pH7.0)に置換した。 Further, the medium after culturing to remove some heavy metals contained in the culture medium using desalting column was replaced with 25 mM HEPES buffer (pH 7.0). さらに、プロテインAアフィニティーカラムに供して、得られたモノクローナル抗体を精製した。 Moreover, subjected to protein A affinity column was purified monoclonal antibodies obtained.

実施例2:抗3価クロムモノクローナル抗体の評価(1)重金属−EDTA錯体との結合性 Cr(III)−EDTAおよび他の金属とEDTAの錯体に対する親和性を測定・比較することで、得られた抗3価クロム抗体を評価した(図1)。 Example 2: By measuring and comparing the affinity for binding Cr (III) complexes of -EDTA and other metals and EDTA with anti trivalent chromium evaluation of monoclonal antibodies (1) heavy metal -EDTA complex, obtained and evaluate the anti-trivalent chromium antibody (Figure 1). なお、3価クロム以外の金属として、マグネシウム(Mg−EDTA)、カドミウム(Cd−EDTA)、亜鉛(Zn−EDTA)、および鉛(Pb−EDTA)を用い、フリーのEDTAをコントロールとした。 The metal other than trivalent chromium, magnesium (Mg-EDTA), cadmium (Cd-EDTA), zinc (Zn-EDTA), and using lead (Pb-EDTA), it was used as a control free of EDTA. なお、IC 50値に対して抗体濃度が十分に小さい(10分の1以下の)場合にIC 50値と結合解離定数がほぼ一致することが知られているため、本実施例では評価として結合解離定数を用いた。 Since the antibody concentration is known to bond dissociation constant as an IC 50 value coincides substantially if sufficiently small (less than one tenth) relative to an IC 50 value, binding as evaluated in this example with dissociation constants.
その結果、モノクローナル抗体Gb3G12は、Cr(III)−EDTA以外の錯体に対する交差反応性は3.5%以下であり、Gb3G12抗体がCr(III)−EDTAに対して強い特異性を有することが確認された。 As a result, the monoclonal antibodies Gb3G12 is, Cr (III) cross-reactivity to the complex other than -EDTA is below 3.5%, confirming that Gb3G12 antibody has a strong specificity for Cr (III) -EDTA It has been. これらの結果を下記の表1に示す。 The results are shown in Table 1 below. 尚、交差反応性は、下式で表される。 Note that cross-reactivity is expressed by the following expression.
交差反応性=(Cr(III)−EDTAの解離定数/金属−EDTAの解離定数)x 100 Cross-reactivity = (Cr (III) dissociation constant of the dissociation constant / metal -EDTA of -EDTA) x 100

(2)Gb3G12抗体の検出限界 図1のグラフからGb3G12抗体のCr(III)−EDTAに対する検出限界を決定した。 (2) Gb3G12 antibody detection limit Figure 1 of Gb3G12 antibody from graphs Cr (III) was determined detection limit for-EDTA. 錯体濃度と蛍光強度の間に直線的な関係のある範囲の下限をその錯体に対する検出下限とすると、Gb3G12抗体のCr(III)−EDTAに対する検出下限は20ppb(400nM)であった。 If the lower limit of the range of linear relationship between the complex concentration and the fluorescence intensity and the detection limit for the complex, the lower detection limit for Cr (III) -EDTA of Gb3G12 antibody was 20 ppb (400 nM).

実施例3:抗3価クロムモノクローナル抗体を用いた6価クロムの検出(1)6価クロムの還元 本発明の抗体を用いて規制の対象である6価クロムを測定するためには6価クロムを3価クロムに変換する必要がある。 Example 3: Anti trivalent chromium monoclonal antibody hexavalent chromium detection with (1) hexavalent chromium reducing hexavalent chromium to an antibody for measuring the hexavalent chromium which is regulated subject using the present invention it is necessary to convert the trivalent chromium. そこで、定法に従って、6価クロムの還元を行った。 Therefore, in accordance with a conventional method, it was carried out the reduction of hexavalent chromium. 500μLの6価クロム溶液に100μLのpH2.0希硫酸を加えてpHを2.0に調整した。 The pH was adjusted to 2.0 by addition of 100μL of pH2.0 dilute sulfuric acid to hexavalent chromium solution 500 [mu] L. これに還元剤である10%亜硫酸ナトリウムを120μL等量加え、よく撹拌し、6価クロムを3価クロムに還元した。 This 10% sodium sulfite as a reducing agent in a 120μL equal amount was added, stirred well, was reduced hexavalent chromium trivalent chromium.

(2)Gb3G12抗体を用いた6価クロムの検出 6価クロムを3価クロムに還元後に、EDTAを加えてCr(III)−EDTAを形成しイムノアッセイをおこなった(図2)。 (2) the detection hexavalent chromium hexavalent chromium with Gb3G12 antibody after reduction to trivalent chromium was performed by addition of EDTA to form a Cr (III)-EDTA immunoassay (Fig. 2). 図2において、横軸は還元処理を行う前の6価クロム溶液の濃度を示しており、縦軸は蛍光強度の相対値を示している。 2, the horizontal axis represents the concentration of the hexavalent chromium solution prior to the reduction treatment, and the vertical axis represents the relative value of the fluorescence intensity. 蛍光強度は、EDTA錯体の濃度が0の時(EDTA錯体を抗体に加えなかった時)の蛍光強度を100とした。 Fluorescence intensity, a fluorescent intensity when (when was not added to the antibody EDTA complex) concentration of EDTA complex is 0 to 100. 曲線は各データに対する近似曲線を示す。 Curve shows the approximate curve for each data.
その結果、6価クロム原液濃度と蛍光強度の間に直線的な関係のある範囲の下限をその錯体に対する検出下限とすると、50ppbであることが確認された。 As a result, when the lower limit of the range with a linear relationship between the hexavalent chromium stock concentration and the fluorescence intensity and the detection limit for the complex, it was confirmed that the 50 ppb. すなわち、Gb3G12抗体が6価クロムの環境基準および排出基準の判定に利用できることが確認された(図2)。 That is, it was confirmed that available to determine the environmental standards and emissions standards Gb3G12 antibody hexavalent chromium (Fig. 2).

(3)6価クロムと3価クロムの分離 検査対象試料中に3価クロムが混入している場合には、上記の還元処理を行うと、還元処理前から存在する3価クロムと6価クロムの還元物である3価クロムの区別ができず、上記のイムノアッセイ法では、もとの液中に存在した6価クロムの定量はできない。 (3) when the trivalent chromium is mixed in hexavalent chromium and trivalent separation inspection subject sample of chromium, when the above-mentioned reduction treatment, trivalent chromium and hexavalent chromium present before reduction treatment can not distinguish the trivalent chromium is a reduced product, in the immunoassay method described above, it can not be quantified hexavalent chromium present in the original liquid. そこで、以下の方法によって、3価クロムと6価クロムを分離する。 Therefore, by the following method, the separation of trivalent chromium and hexavalent chromium.
(i)3価クロムを含む一般的な金属イオン(例えばFe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Mg 2+ , Ca 2+など)は陽イオンであるが、6価クロムは通常、クロム酸塩や二クロム酸塩といった陰イオンとして存在する。 (i) general metal ions containing trivalent chromium (e.g. Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+ , Ni 2+, Zn 2+, Pb 2+, Mg 2+, etc. Ca 2+) but is a cation, hexavalent chromium It is usually present as anions such as chromate or dichromate. 一般的に、アルカリ土類や繊維金属イオンは、キレート樹脂(例えば、三菱化学のダイヤイオンキレート樹脂)に吸着する性質を持つが、6価クロムはキレート樹脂には吸着されない。 Generally, alkaline earth or fiber metal ions, chelating resins (e.g., Mitsubishi Chemical Diaion chelating resin), but has the property of adsorbing to hexavalent chromium is not adsorbed to the chelate resin. よって、3価クロムを含む一般的な金属イオンは、キレート樹脂に吸着させることにより、6価クロムを含む溶液から排除することが可能である。 Therefore, general metal ions containing trivalent chromium, by adsorbing to the chelate resin, it is possible to eliminate from the solution containing hexavalent chromium. すなわち、検査対象試料中に3価クロムが混入していたとしても、6価クロム濃度をイムノアッセイによって判定することができる。 That is, even trivalent chromium was contaminated in the sample to be inspected, it is possible to determine the hexavalent chromium concentration by immunoassay. また、キレート樹脂に吸着されたイオンは、酸により遊離するので、キレート樹脂に吸着された3価クロムの定量も可能である。 Further, ions adsorbed on the chelate resin, since liberated by acid, it is also possible to quantify the trivalent chromium adsorbed to the chelate resin.
(ii)検査対象試料を等量ずつ2つ用意して、一方には還元剤を添加してからイムノアッセイを行い(A)、他方には還元剤を添加しないでイムノアッセイを行う(B)ことでも、試料中の6価クロムを定量できる。 (Ii) a test target sample prepared two equal amounts, one for performs an immunoassay after the addition of the reducing agent (A), also by performing the immunoassay without the addition of the reducing agent (B) to the other , it can be quantified hexavalent chromium in the sample. この場合、(A)で測定される3価クロム濃度はもともと存在していた3価クロムに6価クロムが還元されて得られた6価クロム由来の3価クロムを加えた濃度となる。 In this case, the trivalent chromium concentration originally concentrations present trivalent chromium hexavalent chromium which has been the addition of trivalent chromium hexavalent chromium from the resulting been reduced as measured by (A). (B)で測定される3価クロム濃度は、検査対象試料中にもともと存在していた3価クロム濃度である。 (B) trivalent chromium concentration measured in a trivalent chromium concentration originally present in the sample to be inspected. よって、(A)で得られた3価クロム濃度と(B)で得られた3価クロム濃度を比較することで、還元された3価クロム濃度と6価クロム濃度が測定可能である。 Therefore, it is possible to measure the trivalent chromium concentration by comparing the trivalent chromium concentration obtained in (B), the reduced trivalent chromium concentration and the hexavalent chromium concentration was obtained in (A).

モノクローナル抗体Gb3G12とCr(III)−EDTA、Mg(II)−EDTA、Cd(II)−EDTA、Zn(II)−EDTAおよびPb(II)−EDTAとの結合曲線において、横軸を各重金属溶液濃度(μM)で表したグラフである。 Monoclonal antibodies Gb3G12 and Cr (III) -EDTA, Mg (II) -EDTA, Cd (II) -EDTA, in binding curves of Zn (II) -EDTA and Pb (II) -EDTA, the heavy metal solution abscissa is a graph showing concentrations ([mu] M). モノクローナル抗体Gb3G12と6価クロムを還元して得られたCr(III)−EDTAとの結合曲線において、横軸を還元前の6価クロム溶液濃度(ppb)にて表したグラフである。 In binding curves of Cr (III) -EDTA obtained by reduction monoclonal antibodies Gb3G12 and hexavalent chromium, which is a graph showing a horizontal axis at hexavalent chromium concentration of the solution before reduction (ppb). 免疫クロマトグラフィー装置の構成図である。 It is a configuration diagram of an immunochromatographic device. 本発明にかかる抗重金属モノクローナル抗体を用いた重金属の第1の検出方法の原理図である。 It is a principle diagram of a first method for detecting heavy metals with anti-heavy metal monoclonal antibody according to the present invention. 本発明にかかる抗重金属モノクローナル抗体を用いた重金属の第2の検出方法の原理図である。 It is a principle diagram of a second method for detecting heavy metals with anti-heavy metal monoclonal antibody according to the present invention.

Claims (7)

  1. 受託番号FERM P−20379として受託されたハイブリドーマにより産生され、EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)と錯体を形成した 3価クロムを特異的に認識するモノクローナル抗体。 Accession number FERM P-20 379 produced by accession hybridoma as, EDTA 3 chromium monoclonal antibodies that specifically recognize the formation of the (ethylenediaminetetraacetic acid) and complex.
  2. 受託番号FERM P−20379として受託されたハイブリドーマ Hybridoma and has been assigned the accession number FERM P-20379.
  3. 試料中の3価クロムを定性的または定量的に測定する免疫学的手法において、3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させて請求項1に記載のモノクローナル抗体を用いる方法 In qualitatively or quantitatively immunological techniques for measuring the trivalent chromium in a sample, a method using a monoclonal antibody according to claim 1 by coordinated trivalent chromium EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  4. 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含む、試料中の3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させて定性的または定量的に測定するためのキット Including monoclonal antibody of claim 1, the trivalent chromium EDTA by coordinated to (ethylenediaminetetraacetic acid) qualitatively or quantitatively kit for determining in a sample.
  5. 前処理として、試料中の3価クロムをEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)に配位させる前に、試料中の6価クロムを3価クロムに還元するものである請求項3に記載の方法 As a pretreatment method according to claim 3 prior to coordinate the trivalent chromium in the sample EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) is for reducing the hexavalent chromium in the sample trivalent chromium.
  6. 試料中の6価クロムを3価クロムに還元する前に、試料をキレート樹脂にて前処理する、請求項5に記載の方法 Before the reduction of hexavalent chromium in the sample trivalent chromium, pretreatment of the sample with the chelating resin, A method according to claim 5.
  7. 検査対象試料を還元剤にて前処理した後にEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を加えた第1の試料と、前記前処理を行わずにEDTAを加えた第2の試料とを、請求項1に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法により測定し、前記第1の試料の測定結果と前記第2の試料の測定結果とを比較して、前記検査対象試料に含まれる3価クロムおよび6価クロムを定性的または定量的に分析する方法 First a sample plus EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) the inspected sample was pretreated by a reducing agent, and a second sample plus EDTA without the pretreatment, according to claim 1 monoclonal antibodies was determined by an immunological method using, by comparing the measurement result of the second sample and the measurement result of the first sample, trivalent chromium and hexavalent contained in the sample to be inspected qualitatively or quantitatively method for analyzing chromium.
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