JP2007119445A - Monoclonal antibody having high specificity to n1,n8-diacetylspermidine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体に関する。 The present invention relates to a monoclonal antibody against diacetylspermidine.
ポリアミンは2個以上のアミノ基をもつアルキルアミンの総称であり、ヒトの体内には、プトレッシン(H2N(CH2)4NH2)、カダベリン(H2N(CH2)5NH2)、スペルミジン(H2N(CH2)4NH(CH2)3NH2)及びスペルミン(H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2)の4種類のポリアミンとそれらのアセチル体が存在することが知られていた。 Polyamine is a general term for alkylamines having two or more amino groups, and putrescine (H 2 N (CH 2 ) 4 NH 2 ), cadaverine (H 2 N (CH 2 ) 5 NH 2 ) in the human body. , Spermidine (H 2 N (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NH 2 ) and spermine (H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NH 2 ) It was known that polyamines and their acetylated bodies exist.
近年になって、わずかな量ではあるがN1,N8-ジアセチルスペルミジン（以下「ジアセチルスペルミジン」、「DiAcSpd」ともいう）、N1,N12-ジアセチルスペルミン（以下「DiAcSpm」ともいう）という2種類のジアセチルポリアミンが尿中に排泄されていることが見出された。健常者の尿中では、これらの成分はそれぞれ総ポリアミンの1.4%、0.6%を占めるにすぎないが、癌患者においては、他のポリアミン成分と比較して増加の割合が際立って高く、また、その他にも腫瘍マーカーとしての特性を示す物質であることが示されてきた（非特許文献1、2）。 In recent years, N 1 , N 8 -diacetylspermidine (hereinafter also referred to as “diacetylspermidine” and “DiAcSpd”) and N 1 , N 12 -diacetylspermine (hereinafter also referred to as “DiAcSpm”), although in small quantities Two diacetylpolyamines were found excreted in the urine. In healthy people's urine, these components only account for 1.4% and 0.6% of the total polyamines respectively, but in cancer patients, the rate of increase is significantly higher compared to other polyamine components, In addition, it has been shown to be a substance exhibiting characteristics as a tumor marker (Non-patent Documents 1 and 2).
DiAcSpd及びDiAcSpmは、当初はHPLCによる分画測定系と酵素法による検出系を組み合わせた方法（非特許文献3）によって定量されたが、その後簡便な測定法の開発が進められ、特に、DiAcSpmの測定に関しては、特異的抗体を利用したELISA法が開発された（非特許文献4）。 DiAcSpd and DiAcSpm were initially quantified by a method combining a fractionation measurement system by HPLC and a detection system by an enzymatic method (Non-patent Document 3), but development of a simple measurement method has been promoted. Regarding the measurement, an ELISA method using a specific antibody has been developed (Non-patent Document 4).
近年、濱沖らによってDiAcSpdに対するモノクローナル抗体が作製された（特許文献１）。これらの抗体は、当該抗体とDiAcSpdとの免疫反応に対するDiAcSpdによる結合阻害活性が、N8-アセチルスペルミジン（以下「N8-AcSpd」ともいう）による結合阻害活性の20倍程度である。健常者の尿中のN8-AcSpdは、DiAcSpdの量のおよそ8倍存在するため、測定値の約40%がN8-AcSpdに由来するものとなり、DiAcSpdの測定法として最適であるとは言えない。濱沖らは、測定サンプルを一級アミン修飾酵素で処理することでN8-AcSpdの測定に及ぼす影響を100分の1程度にまで改善している。しかしながら、測定工程における酵素処理の過程が簡便な測定系を開発するには妨げになることが予想される。従って、より簡便な測定系を提供する為にはN8-AcSpdに対する交差反応性の低いDiAcSpdに特異的なモノクローナル抗体が必要である。
本発明は、DiAcSpdに対する特異的モノクローナル抗体、当該抗体を産生する細胞株を提供することを目的とする。また本発明は、上記抗体と生体試料とを、前工程として酵素処理を必要とせずに反応させることを特徴とするDiAcSpdを検出する方法、DiAcSpdの検出用試薬を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a specific monoclonal antibody against DiAcSpd and a cell line producing the antibody. Another object of the present invention is to provide a DiAcSpd detection method and a DiAcSpd detection reagent characterized by reacting the antibody with a biological sample as a previous step without requiring an enzyme treatment.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、抗原を動物に免疫して抗体価を上昇させた後、抗体価が下がるまで動物を放置し、その後に抗体産生細胞を調製することにより、又はGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物に抗原を免疫することにより、DiAcSpdと抗体との免疫反応に対するDiAcSpdによる結合阻害活性が、N8-アセチルスペルミジンによる結合阻害活性と比較して少なくとも180倍以上であるモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. Then, after immunizing the animal with the antigen to increase the antibody titer, the animal is allowed to stand until the antibody titer decreases, and then the antibody-producing cells are prepared, or the GANP transgenic non-human mammal is immunized with the antigen. As a result, the present inventors succeeded in obtaining a monoclonal antibody whose binding inhibitory activity by DiAcSpd against the immune reaction between DiAcSpd and an antibody is at least 180 times that of N 8 -acetylspermidine. It came to be completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体であって、ジアセチルスペルミジンと当該モノクローナル抗体との免疫反応が阻害されるように検体ジアセチルスペルミジン又は検体N8-アセチルスペルミジン若しくはアセチルプトレッシンを存在させる反応系において、当該検体ジアセチルスペルミジンによる前記免疫反応の阻害活性が、当該検体N8-アセチルスペルミジン又はアセチルプトレッシンによる前記免疫反応の阻害活性と比較して少なくとも180倍以上となる測定条件を満たす、前記モノクローナル抗体。
（２）反応系中の検体ジアセチルスペルミジンの濃度が200nM以下である上記（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）受託番号がFERM P-20668である細胞株により産生される、ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体。
（４）受領番号がFERM AP-20847である細胞株により産生される、ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体。
（５）上記（１）記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
（６）受託番号がFERM P-20668である、ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株。
（７）受領番号がFERM AP-20847である、ジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株。
（８）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、ジアセチルスペルミジン検出用試薬。
（９）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と生体試料とを反応させて、ジアセチルスペルミジンを検出することを特徴とする、ジアセチルスペルミジンの検出方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A monoclonal antibody against diacetylspermidine, in which a sample diacetylspermidine or a sample N 8 -acetylspermidine or acetylputrescine is present so that an immune reaction between diacetylspermidine and the monoclonal antibody is inhibited, The monoclonal antibody that satisfies the measurement condition in which the inhibition reaction of the immune reaction by the sample diacetylspermidine is at least 180 times or more compared to the inhibition activity of the immune reaction by the sample N 8 -acetylspermidine or acetylputrescine .
(2) The monoclonal antibody according to (1) above, wherein the concentration of the sample diacetylspermidine in the reaction system is 200 nM or less.
(3) A monoclonal antibody against diacetylspermidine produced by a cell line with the accession number FERM P-20668.
(4) A monoclonal antibody against diacetylspermidine produced by a cell line with the receipt number FERM AP-20847.
(5) A cell line that produces the monoclonal antibody according to (1) above.
(6) A cell line producing a monoclonal antibody against diacetylspermidine, whose accession number is FERM P-20668.
(7) A cell line producing a monoclonal antibody against diacetylspermidine, the receipt number of which is FERM AP-20847.
(8) A reagent for detecting diacetylspermidine, comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above.
(9) A method for detecting diacetylspermidine, comprising detecting diacetylspermidine by reacting the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above and a biological sample.
ここで、生体試料としては、尿又は血清が挙げられる。 Here, the biological sample includes urine or serum.
また、上記（１）のモノクローナル抗体を、GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物に抗原を免疫することにより調製する場合、ジアセチルスペルミジンによる阻害活性が、N8-アセチルスペルミジン又はアセチルプトレッシンによる阻害活性の少なくとも180倍以上、好ましくは1500倍以上、より好ましくは1700倍以上となる上記測定条件を満たす抗体を作製することができる。このとき、反応系中の検体ジアセチルスペルミジンの濃度は、例えば、200 nM以下、好ましくは50 nM以下である。 When the monoclonal antibody of (1) above is prepared by immunizing a GANP transgenic non-human mammal with an antigen, the inhibitory activity by diacetylspermidine is the inhibitory activity by N 8 -acetylspermidine or acetylputrescine. An antibody that satisfies the above measurement conditions can be produced that is at least 180 times or more, preferably 1500 times or more, more preferably 1700 times or more. At this time, the concentration of the sample diacetylspermidine in the reaction system is, for example, 200 nM or less, preferably 50 nM or less.
このようなモノクローナル抗体は、例えば上記（４）に記載のジアセチルスペルミジンに対するモノクローナル抗体であり、上記（７）に記載の受領番号が、FERM AP-20847である細胞株により産生される。 Such a monoclonal antibody is, for example, a monoclonal antibody against diacetylspermidine described in the above (4), and is produced by a cell line whose receipt number described in the above (7) is FERM AP-20847.
また、本発明は、以下に関する。
（１０）上記（９）記載の方法により検出された結果を指標として腫瘍の状態を評価する方法。
（１１）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む腫瘍診断薬。
（１２）モノクローナル抗体の製造方法であって、以下の工程：
(a) 免疫された動物の抗体価が上昇した段階で該動物を放置し、
(b) 抗体価が吸光度レベルで0.05〜1のレベルまで低下したときに、再免疫し、あるいは、２〜６ヶ月間放置後に再免疫し、
(c) 再免疫された動物から抗体産生細胞を採取し、
(d) 採取された抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞株を作製し、
(e) 得られる細胞株からモノクローナル抗体を産生すること
を含む、前記方法。
（１３）GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物に抗原を免疫し、得られる動物から抗体を採取することを特徴とする、抗DiAcSpd抗体の製造方法。
The present invention also relates to the following.
(10) A method for evaluating the state of a tumor using the result detected by the method according to (9) above as an index.
(11) A tumor diagnostic agent comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above.
(12) A method for producing a monoclonal antibody, comprising the following steps:
(a) leaving the animal at the stage where the antibody titer of the immunized animal has increased,
(b) Re-immunize when the antibody titer drops to a level of 0.05-1 in the absorbance level, or re-immunize after standing for 2-6 months,
(c) collecting antibody-producing cells from the reimmunized animal;
(d) preparing a fused cell line of the collected antibody-producing cells and myeloma cells,
(e) producing said monoclonal antibody from the resulting cell line.
(13) A method for producing an anti-DiAcSpd antibody, comprising immunizing a GANP transgenic non-human mammal with an antigen and collecting the antibody from the obtained animal.
本発明により、DiAcSpdに対する特異的な抗体、および当該抗体を産生する細胞株が提供される。また、本発明により、上記抗体と生体試料とを、前処理としての酵素処理を必要とせずに反応させることを特徴とするDiAcSpdを検出する方法およびジアセチルスペルミジンを検出するための試薬が提供される。 The present invention provides a specific antibody against DiAcSpd and a cell line that produces the antibody. In addition, the present invention provides a method for detecting DiAcSpd and a reagent for detecting diacetylspermidine, which comprises reacting the antibody with a biological sample without requiring enzyme treatment as a pretreatment. .
本発明のDiAcSpdと反応するモノクローナル抗体は、尿等の検体中のDiAcSpdを高感度かつ特異的に測定でき、好ましくは癌の診断に有用である。 The monoclonal antibody that reacts with DiAcSpd of the present invention can measure DiAcSpd in a sample such as urine with high sensitivity and specificity, and is preferably useful for diagnosis of cancer.
１．本発明の概要
本発明の抗体は、以下の(i)〜(iii)：
(i) DiAcSpdと抗DiAcSpdモノクローナル抗体との免疫反応が50%阻害されるときの、競合物質としてのDiAcSpdの濃度が200nM以下、好ましくは50 nM以下、
(ii) DiAcSpdの類似構造物質として尿中に約8倍多く存在するN8-AcSpdとの交差反応性（KiDiAcSpd/Ki"N 8 -AcSpd"）が0.7%以下、好ましくは0.06%以下、及び
(iii)尿中に存在するDiAcSpd類似構造物質の交差反応性の総和が20%以下、好ましくは4％以下
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有するものである。
1. Summary of the Invention The antibody of the present invention comprises the following (i) to (iii):
(i) When the immune reaction between DiAcSpd and anti-DiAcSpd monoclonal antibody is inhibited by 50%, the concentration of DiAcSpd as a competitor is 200 nM or less, preferably 50 nM or less,
(ii) The cross-reactivity with N 8 -AcSpd (Ki DiAcSpd / Ki "N 8 -AcSpd" ) present in the urine about 8 times more as a similar structure substance of DiAcSpd is 0.7% or less, preferably 0.06% or less, as well as
(iii) The total cross-reactivity of DiAcSpd-like structural substances present in urine has at least one property selected from the group consisting of 20% or less, preferably 4% or less.
DiAcSpdは、ポリアミンの一種であるが、ポリアミンとは低分子、具体的には、2個以上のアミノ基をもつアルキルアミンの総称であり、ヒトの体内に存在する４つのポリアミンのうちの一つ、スペルミジン(H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2)のアセチル体である。近年、DiAcSpdは、癌患者の尿中に高濃度に存在することが見出されている。 DiAcSpd is a kind of polyamine. Polyamine is a general term for low molecular weight, specifically alkylamines having two or more amino groups, and one of four polyamines existing in the human body. , An acetyl form of spermidine (H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH 2 ). Recently, DiAcSpd has been found to be present in high concentrations in the urine of cancer patients.
しかし、生体試料、特に尿中には、N1-AcSpdやN8-AcSpdに代表されるDiAcSpdの類似構造物質が多量に存在するため、DiAcSpdを定量し、又はDiAcSpdを特異的に検出するには、類似構造物質による妨害を考慮する必要がある。すなわち、DiAcSpdを酵素免疫法によって正確に定量等するための測定キットの確立には、DiAcSpdに対して高度の特異性を示すモノクローナル抗体を得ることが最も重要である。本発明は、このような課題を解決するために完成されたものである。 However, biological samples, especially urine, contain a large amount of DiAcSpd-like structural substances typified by N 1 -AcSpd and N 8 -AcSpd, so that DiAcSpd can be quantified or specifically detected. It is necessary to consider interference caused by similar structural materials. That is, to establish a measurement kit for accurately quantifying DiAcSpd by enzyme immunization, it is most important to obtain a monoclonal antibody having a high degree of specificity for DiAcSpd. The present invention has been completed to solve such problems.
本発明のモノクローナル抗体は、動物への免疫方法について、従来とは異なる方法を採用することにより得ることができる。すなわち、抗原を免疫して抗体価が吸光度レベルで2以上のレベルまで上昇した段階で免疫された動物をしばらく放置し、やがて抗体価が吸光度レベルで0.05〜1、好ましくは0.05〜0.5、より好ましくは0.05のレベルに下がった後にさらに免疫を行い、その後抗体産生細胞を調製することを特徴とする。 The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by adopting a method different from the conventional method for immunizing animals. That is, after immunizing an antigen and leaving the immunized animal at a stage where the antibody titer has risen to an absorbance level of 2 or higher, leave the immunized animal for a while, and eventually the antibody titer is at an absorbance level of 0.05 to 1, preferably 0.05 to 0.5, more preferably Is characterized by further immunization after lowering to a level of 0.05, and then preparing antibody-producing cells.
抗体価の上昇レベルは、吸光度レベルで2以上である。 The increase level of the antibody titer is 2 or more in the absorbance level.
「放置」とは、免疫を施さずに動物を飼うことを意味し、その期間としては2〜6ヶ月、好ましくは4〜6ヶ月、より好ましくは6ヶ月である。 “Left” means keeping an animal without immunization, and the period is 2 to 6 months, preferably 4 to 6 months, more preferably 6 months.
抗体価の下降レベルは、吸光度レベルで0.05〜1、好ましくは0.05〜0.5、より好ましくは0.05である。 The decreasing level of the antibody titer is 0.05 to 1, preferably 0.05 to 0.5, more preferably 0.05 in terms of absorbance level.
あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、免疫する動物にGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることにより得ることができる。 Alternatively, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using a GANP transgenic non-human mammal as the animal to be immunized.
本発明のモノクローナル抗体（以下、「抗DiAcSpd抗体」ともいう）を得る方法としては、まず、ウシ血清アルブミンのアセチルスペルミジン誘導体を用いてGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物などの動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばB細胞）を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。 As a method for obtaining the monoclonal antibody of the present invention (hereinafter also referred to as “anti-DiAcSpd antibody”), first, an immunized animal such as a GANP transgenic non-human mammal is immunized with an acetylspermidine derivative of bovine serum albumin. Antibody-producing cells (for example, B cells) are collected from the cells, and the antibody-producing cells and myeloma cells are fused to produce a hybridoma (fusion cell line). And the target monoclonal antibody can be obtained by extract | collecting the antibody produced from this hybridoma.
抗DiAcSpd抗体は、いわゆるハプテン抗体と呼ばれるものであるが、そのようなハプテン抗体を作製する場合、ハプテン-キャリア複合体の分子構造デザインは、特異抗体の性能に対して非常に大きな影響を与える。グルタルアルデヒドによってBSAに結合させたスペルミンをハプテンとして用いて作製した抗体では、競合ELISAにおけるスペルミンやスペルミジンに対する反応性がアセチルポリアミンに対する反応性よりもむしろ高いことが報告されている。従って、ハプテン-キャリア複合体の中にアシルアミド結合が存在することは、DiAcSpdなどのアセチルポリアミンと優先的に反応する抗体を作る上で特に有効である。 The anti-DiAcSpd antibody is a so-called hapten antibody. When such a hapten antibody is produced, the molecular structure design of the hapten-carrier complex has a great influence on the performance of the specific antibody. Antibodies produced using spermine conjugated to BSA with glutaraldehyde as a hapten have been reported to be more reactive to spermine and spermidine in a competitive ELISA than to acetylpolyamine. Therefore, the presence of an acylamide bond in the hapten-carrier complex is particularly effective in producing an antibody that reacts preferentially with acetylpolyamines such as DiAcSpd.
ここで、DiAcSpdに対する特異性が担保されていれば、DiAcSpdに対するポリクローナル抗体をDiAcSpdの定量又は検出に使用することも可能である。しかし、ポリクローナル抗体の場合は、アセチルポリアミンなどの他の類似構造物質との交差反応性の高い抗体を多く含む場合が多く、その場合は数段階の精製過程を経て、DiAcSpdに対する特異性の高い抗体を調製しなければならない。特に、免疫に使用するハプテン-キャリア複合体の性質上、N8-AcSpdやアセチルプトレッシン（以下「AcPut」ともいう）との交差反応性の高い抗体ができやすいことは避けられない事実である。このような様々な特異性をもった抗体が産生されやすい状況において、DiAcSpdに対して特異性が高く、かつ、安定的で、容易に精製可能な抗体を得るためには、モノクローナル抗体を作製することが重要である。 Here, if the specificity to DiAcSpd is ensured, a polyclonal antibody against DiAcSpd can be used for quantification or detection of DiAcSpd. However, polyclonal antibodies often contain a lot of antibodies that are highly cross-reactive with other similar structural substances such as acetylpolyamine. In this case, antibodies with high specificity to DiAcSpd are obtained through several purification steps. Must be prepared. In particular, due to the nature of the hapten-carrier complex used for immunization, it is inevitable that antibodies that are highly cross-reactive with N 8 -AcSpd and acetylputrescine (hereinafter also referred to as “AcPut”) are easily generated. is there. In order to obtain antibodies with high specificity to DiAcSpd in a situation where antibodies with various specificities are likely to be produced, monoclonal antibodies are prepared in order to obtain stable, easily purifiable antibodies. This is very important.
本発明により、DiAcSpd特異的なモノクローナル抗体が提供される。このモノクローナル抗体により、DiAcSpdと当該抗体との免疫反応を50%阻害するDiAcSpd（検体DiAcSpd)の濃度として200 nM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは50nM以下となる測定条件を選択することが可能になる。その結果、類似構造物質が多量に存在する尿検体中に微量に含まれるDiAcSpdを、類似構造物質による妨害を避けて酵素免疫法によって正確に定量することができる。
２．抗原の調製
DiAcSpdは、低分子量のアルキルアミンであるため、これを直接マウスに免疫してもDiAcSpdに特異的な抗体を得ることはできない。そこで、キャリア蛋白質であるウシ血清アルブミンとN8-AcSpdとをアシルアミド結合させ、DiAcSpd類似物質を側鎖として多数持つ免疫抗原を作製する。
According to the present invention, a DiAcSpd-specific monoclonal antibody is provided. With this monoclonal antibody, it is possible to select measurement conditions that give a concentration of DiAcSpd that inhibits the immune reaction between DiAcSpd and the antibody by 50% (specimen DiAcSpd) of 200 nM or less, preferably 100 nM or less, more preferably 50 nM or less. become. As a result, DiAcSpd contained in a trace amount in a urine sample containing a large amount of a similar structural substance can be accurately quantified by an enzyme immunoassay while avoiding interference by the similar structural substance.
2. Antigen preparation
Since DiAcSpd is a low molecular weight alkylamine, an antibody specific for DiAcSpd cannot be obtained by directly immunizing mice. Thus, bovine serum albumin, which is a carrier protein, and N 8 -AcSpd are acylamide-bonded to produce an immune antigen having many DiAcSpd-like substances as side chains.
本発明において免疫抗原は、公知の方法に準じて作製することができる（Kunio Fujiwara. et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217-226(1983)）。まず、キャリア蛋白質であるBSAと無水アセチルメルカプトコハク酸（以下「AMS」ともいう）を反応させ、反応生成物であるAMS-BSA複合体を作製する。さらにAMS-BSAに二価性架橋試薬であるGMBS（N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide）を介して、N8-AcSpdをアシルアミド結合させ、免疫抗原N8-AcSpd -GMB-AMS-BSAを作製する。但し、抗原の作製に関してはこれに限定するものではない。 In the present invention, an immunizing antigen can be prepared according to a known method (Kunio Fujiwara. Et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217-226 (1983)). First, BSA, which is a carrier protein, is reacted with acetylmercaptosuccinic anhydride (hereinafter also referred to as “AMS”) to produce an AMS-BSA complex which is a reaction product. Furthermore, N 8 -AcSpd is acylamide-bonded to AMS-BSA via GMBS (N- (4-Maleimidobutyryloxy) succinimide), a bivalent cross-linking reagent, to produce immune antigen N 8 -AcSpd -GMB-AMS-BSA To do. However, the production of the antigen is not limited to this.
キャリア蛋白質は、BSAの他、例えば、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、OVA（Ovalbumin）等を使用することができる。当業者であれば、免疫抗原を公知の方法によって作製することができる。 As the carrier protein, for example, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), OVA (Ovalbumin) and the like can be used in addition to BSA. Those skilled in the art can prepare immunizing antigens by known methods.
また、上記のように、アセチルポリアミンに特異的な抗体を作製するためには、ハプテン-キャリア複合体の中にアシルアミド結合が存在することが好ましい。
３．抗原の免疫と抗体価の測定
免疫する動物としては、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギなどが挙げられる。また、GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物（WO2004/040971）、例えばGANPトランスジェニックマウスを免疫する動物に用いることもできる。抗原の動物1匹あたりの投与量は、全体で10〜2000μgである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜3週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。
Further, as described above, in order to produce an antibody specific for acetylpolyamine, it is preferable that an acylamide bond is present in the hapten-carrier complex.
3. Antigen immunization and antibody titer measurement Examples of animals to be immunized include mammals such as mice, rats, and rabbits. Moreover, it can also be used for the animal which immunizes a GANP transgenic non-human mammal (WO2004 / 040971), for example, a GANP transgenic mouse. The total dose of the antigen per animal is 10 to 2000 μg. When immunizing an antigen, an adjuvant and an antigen solution are generally mixed. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously into the footpad, or the like. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times, at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 3 weeks.
免疫により抗体価が吸光度レベルで2以上上昇したのち、抗体価が吸光度レベルで0.05〜1、好ましくは0.05〜0.5、より好ましくは0.05まで低下するまで、2〜6ヶ月間、好ましくは4〜6ヶ月間、より好ましくは6ヶ月間動物を放置する。なお、上記吸光度レベルを示す血清の希釈率は、例えば27,000倍である。 After the antibody titer has increased by 2 or more at the absorbance level due to immunization, the antibody titer is decreased to 0.05 to 1, preferably 0.05 to 0.5, more preferably 0.05 to the absorbance level for 2 to 6 months, preferably 4 to 6 Leave the animal for months, more preferably 6 months. In addition, the dilution rate of the serum which shows the said light absorbency level is 27,000 times, for example.
ただし、GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する場合は、吸光度レベルの低下を必要とせず、一般的なモノクローナル抗体作製法の免疫間隔に従って、最終免疫まで行えばよい。 However, when immunizing a GANP transgenic non-human mammal, it is not necessary to decrease the absorbance level, and it is sufficient to carry out the final immunization according to the immunization interval of a general monoclonal antibody production method.
抗体価は、免疫した動物から採取した血液を用いて調べることができる。採取した血液は、採血後低温下で保管せずに、速やかに遠心し血清を分離することが好ましい。得られた血清を段階希釈し、酵素免疫測定法（ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)又はEIA(enzyme immunoassay)）、放射性免疫測定法(RIA(radioimmuno assay))等で抗体価を測定することができる。ELISA又はEIAで抗体価を測定する場合、吸光度は、分光光度計で測定することができる。本発明において示す吸光度レベルとは、採取した血液から既知の方法で得られた血清について、後述の＜実験例１＞で示すELISA法で抗体価を測定したときに得られるシグモイドカーブのうち、直線性のある部分の中点の吸光度とする。具体的には、例えば濃度を1000倍希釈した血清から×3倍希釈系列（7濃度）で示されたS字曲線（シグモイドカーブ）の示す吸光度のうち直線性のある部分の中点が、例えば27,000倍希釈した血清の吸光度であり、OD=1.0であれば、吸光度レベルは「希釈倍率27,000倍でOD=1.0」を意味する（光路長10mm）。 The antibody titer can be examined using blood collected from the immunized animal. The collected blood is preferably centrifuged at a low temperature after blood collection, and quickly centrifuged to separate serum. The obtained serum can be serially diluted, and the antibody titer can be measured by enzyme immunoassay (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA (radioimmuno assay)), etc. it can. When the antibody titer is measured by ELISA or EIA, the absorbance can be measured with a spectrophotometer. The absorbance level shown in the present invention is a straight line of the sigmoid curves obtained when the antibody titer is measured by ELISA shown in <Experimental Example 1> described below for serum obtained from a collected blood by a known method. The absorbance at the midpoint of the characteristic part. Specifically, for example, the midpoint of the linear part of the absorbance indicated by the S-shaped curve (sigmoid curve) indicated by a x3 dilution series (7 concentrations) from serum diluted 1000 times, for example, The absorbance of the serum diluted 27,000 times. If OD = 1.0, the absorbance level means “OD = 1.0 at a dilution factor of 27,000 times (optical path length 10 mm)”.
測定の結果、DiAcSpdに対する抗体価の高いマウスに最終免疫を施す。但し、抗原の免疫と抗体価の測定に関しては上記測定法に限定するものではない。 As a result of the measurement, a mouse having a high antibody titer against DiAcSpd is subjected to final immunization. However, the immunity of the antigen and the measurement of the antibody titer are not limited to the above measurement methods.
その後、最終免疫日から数日後に、好ましくは3〜5日後に免疫担当細胞（脾臓細胞等）を摘出する。また、動物の足蹠皮下に抗原を注入した場合には、最終免疫の回数は1回で、免疫から7〜13日後に、好ましくは8〜10日後に脾臓細胞などの免疫担当細胞又は所属リンパ節を摘出する。採血の間隔は、免疫して1〜4週間後、好ましくは1〜2週間後に行う。
４．DiAcSpdに対する抗体の作製
以下に、DiAcSpdに対する抗体の作製方法について説明するが、これに限定するものではない。
（１）抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫したGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物等の動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。リンパ節は、例えば鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節などがあげられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが望ましい。また、抗体産生細胞を調製する際には、組織の残骸や赤血球をできる限り除いておくことが好ましい。赤血球除去の方法は、一般的に市販されている赤血球除去液を使用するか、塩化アンモニウムとトリスで調製した中性の緩衝液を作製して使用する方法が好ましく採用される。調製した抗体産生細胞は、調製後直ちに次の作業に取りかからないと細胞の状態が悪化する場合があるので、調製後次の作業までに時間がかかる場合は、氷上に静置させておくことが好ましい。
（２）細胞融合
細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製するために行う作業である。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、HAT選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3X63-Ag.8.U1(P3U1)やP3/NS I/1-Ag4-1(NS I)等が挙げられる。
Thereafter, immunocompetent cells (such as spleen cells) are removed several days after the final immunization day, preferably 3 to 5 days later. In addition, when an antigen is injected subcutaneously into the footpad of an animal, the number of final immunization is one, 7-13 days after immunization, preferably 8-10 days later, immunocompetent cells such as spleen cells or regional lymph Remove the knot. The interval between blood collections is 1 to 4 weeks, preferably 1 to 2 weeks after immunization.
4). Preparation of antibody against DiAcSpd A method for producing an antibody against DiAcSpd will be described below, but is not limited thereto.
(1) Preparation of antibody-producing cells Antibody-producing cells are prepared from spleen cells or the like of the immunized GANP transgenic non-human mammal or the like, or regional lymph nodes. Examples of lymph nodes include inguinal lymph nodes and mediastinal lymph nodes. Although it is not necessary to separate the antibody-producing cells from the collected cell population, it is desirable to separate only antibody-producing cells from the cell population. In preparing antibody-producing cells, it is preferable to remove tissue debris and erythrocytes as much as possible. As a method of removing erythrocytes, a method of using a commercially available erythrocyte removal solution or a method of preparing and using a neutral buffer prepared with ammonium chloride and Tris is preferably employed. The prepared antibody-producing cells may deteriorate if the next operation is not started immediately after preparation, so if it takes time until the next operation after preparation, it should be left on ice. preferable.
(2) Cell fusion Cell fusion is an operation performed to fuse the antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) to produce cells (hybridomas) that continue to grow semipermanently while producing antibodies. . As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line to be used is preferably one that has the property that it cannot survive in a HAT selective medium (medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin) and can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Examples of myeloma cells include P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) and P3 / NS I / 1-Ag4-1 (NS I).
細胞融合は、ウシ胎児血清（FCS）等を含まないDMEMやRPMI1640培地などの一般に市販されている培地で、1×106〜1×107個/mLの脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞と1×105〜1×106個/mLのミエローマ細胞とを混合し（脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比は5：1が好ましい）、細胞融合促進剤存在下で融合を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量200〜20000ダルトンのポリエチレングリコールを使用することができる。 Cell fusion is a commercially available medium such as DMEM or RPMI1640 medium that does not contain fetal calf serum (FCS), etc., and 1 × 10 6 to 1 × 10 7 cells / mL of spleen cells and / or lymph node cells 1 × 10 5 to 1 × 10 6 cells / mL myeloma cells are mixed (the ratio of spleen cells and / or lymph node cells to myeloma cells is preferably 5: 1) in the presence of a cell fusion promoter. Perform fusion. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 200 to 20,000 daltons can be used.
また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、融合させることもできる。さらに、センダイウイルスを用いて細胞を融合させることもできる。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることができる。 Moreover, it can also fuse | melt using the commercially available cell fusion apparatus using electrical stimulation (for example, electroporation). Furthermore, cells can be fused using Sendai virus. A person skilled in the art can fuse the antibody-producing cells and myeloma cells using a known cell fusion method.
融合後、例えば10〜20%（好ましくは20%）FCS含有RPMI1640培地などで作製したHAT培地で細胞を希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.5〜3×105個ずつ細胞を播き込み、CO2インキュベーターで培養する。
（３）ハイブリドーマの樹立
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から10〜14日後に、前記したようにHAT培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性96穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、DiAcSpdに対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法（ELISA）や放射性免疫測定法（RIA）等で行う。このとき、細胞から産生される抗体にはキャリア蛋白質であるBSAに対する抗体も含まれるので、BSAに対する抗体価を測定することで、BSAに対する抗体価の高いBSA抗体陽性ウェルを除くことができる。DiAcSpdに対する抗体産生陽性ウェルを確認できたら、24穴や12穴培養プレートに細胞を移す。
After the fusion, for example, dilute the cells with HAT medium made with 10-20% (preferably 20%) FCS-containing RPMI1640 medium, and then inoculate 0.5- 3 x 10 5 cells into each well of a 96-well culture plate. Incubate in a CO 2 incubator.
(3) Establishment of hybridoma Next, a hybridoma producing the target antibody is selected from the cells after cell fusion treatment. Ten to 14 days after cell fusion, cells selected in HAT medium as described above form colonies. The culture supernatant of each well of the colony-positive 96-well culture plate is collected and the antibody titer against DiAcSpd is confirmed. As a confirmation method, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or the like is performed. At this time, since the antibody produced from the cell includes an antibody against BSA which is a carrier protein, BSA antibody positive wells having a high antibody titer against BSA can be excluded by measuring the antibody titer against BSA. After confirming antibody production positive wells against DiAcSpd, transfer the cells to 24-well or 12-well culture plates.
ここで、培地はアミノプテリンを除いたHT培地（ヒポキサンチン、チミジン含有培地）におき換えることが好ましい。その理由は、アミノプテリンは細胞のDNA複製を阻害する物質であるため、培地中のアミノプテリンを除いても、細胞内にアミノプテリンが残っていると、ヒポキサンチンとチミジン非存在下では、細胞中のDNA複製が起こらなくなるからである。HT培地中でしばらく培養後、再度培養上清中の抗体価を確認する。ハイブリドーマは融合細胞であるために不安定であり、すぐに抗体産生が消失する可能性が高いので、2度目の抗体価の確認を行っておくことが好ましい。前記したように、本発明においてはDiAcSpdに対して高い特異性を有するハイブリドーマを取得することが必要であるため、ここで重要なことは、培養上清レベルで他のDiAcSpd類似物質との交差反応性をELISAやRIA等で確認することである。 Here, the medium is preferably replaced with an HT medium (a medium containing hypoxanthine and thymidine) excluding aminopterin. The reason for this is that aminopterin is a substance that inhibits cell DNA replication, so if aminopterin remains in the cell even if aminopterin in the medium is removed, cells in the absence of hypoxanthine and thymidine This is because there is no DNA replication inside. After culturing in HT medium for a while, the antibody titer in the culture supernatant is confirmed again. Since the hybridoma is unstable because it is a fused cell, and there is a high possibility that antibody production will soon disappear, it is preferable to confirm the antibody titer for the second time. As described above, since it is necessary to obtain a hybridoma having high specificity for DiAcSpd in the present invention, what is important here is cross-reaction with other DiAcSpd-like substances at the culture supernatant level. It is to confirm sex by ELISA or RIA.
本発明において、DiAcSpd類似物質は、例えば、N8-AcSpd、AcPut、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、DiAcSpmなどが挙げられる。 In the present invention, examples of the DiAcSpd-like substance include N 8 -AcSpd, AcPut, putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, and DiAcSpm.
最終的に選択されたウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を10〜20%のFCS含有（好ましくは20%）RPMI1640培地などで適当に希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.3〜2個入るように細胞を播き込む。96穴培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、1つのウェルに入る細胞が1個である確率が高くなるようにするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く。細胞播き込み後、7〜10日後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。このとき、3〜5日後にシングルコロニーであることを確認することが好ましい。回収した培養上清は、抗体価を確認する。ここでもDiAcSpdに対して高い特異性を有し、かつDiAcSpd類似物質に対する交差反応性が低いクローンを選択する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。
（４）モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマ株から以下の方法でDiAcSpd特異的なモノクローナル抗体を精製して調製する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を0.1〜4×105個/mLで調製し、1〜2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを0.1〜１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。
The cells in the final selected well are cloned to make a single cell. For cloning, for example, after appropriately diluting the cell suspension with RPMI1640 medium containing 10 to 20% FCS (preferably 20%), seed the cells so that 0.3 to 2 cells are added to each well of a 96-well culture plate. . In order to increase the probability that the number of cells in each well of the 96-well culture plate is one cell, it is preferable to seed one cell in each well. After cell seeding, the culture supernatant of the colony-positive well is collected 7 to 10 days later. At this time, it is preferable to confirm that it is a single colony after 3 to 5 days. The collected culture supernatant is checked for antibody titer. Again, clones are selected that have high specificity for DiAcSpd and low cross-reactivity to DiAcSpd analogs. Further, the number of cells in the selected well is increased to some extent to establish a hybridoma strain. Cloning may be performed several times as necessary.
(4) Preparation of monoclonal antibody DiAcSpd-specific monoclonal antibody is purified from the established hybridoma strain and prepared by the following method. That is, a method of preparing an antibody from a culture supernatant cultured in a medium with reduced serum concentration, a method of preparing an antibody from a culture supernatant cultured in a commercially available serum-free medium, or injecting a hybridoma into the abdominal cavity of an animal. There is a method of collecting ascites and preparing antibodies from the ascites. The culture supernatant is collected from cells prepared at 0.1-4 × 10 5 cells / mL and cultured for 1-2 weeks. In the case of ascites, 0.1 to 1 × 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and the same type of animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. And ascitic fluid is collected after 1-2 weeks.
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。抗体の精製方法は、プロテインGアフィニティカラム又はプロテインAアフィニティカラムで精製する方法、DiAcSpdアフィニティカラムで精製する方法、硫安塩析分画からゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法等があり、これら公知の方法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。なお、プロテインAアフィニティカラムを用いてマウスのIgG1を精製する場合は、結合条件を至適化したバッファーなどを用いることが有効であり、当業者であれば至適条件を適宜選択して、精製することができる。 Examples of the culture method include a method using a culture flask, a method using a spinner flask, a method using a shaker flask, and a method using a bioreactor. Antibody purification methods include protein G affinity column or protein A affinity column purification method, DiAcSpd affinity column purification method, ammonium sulfate salting-out fraction purification method using gel filtration chromatography, ion exchange chromatography purification method There are methods and the like, and these known methods can be appropriately selected or purified by combining them. When purifying mouse IgG 1 using a protein A affinity column, it is effective to use a buffer or the like in which binding conditions are optimized, and those skilled in the art appropriately select the optimal conditions, Can be purified.
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「Anti-DiAcSpd MAb 19C10」と称し、2005年9月27日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託した。その受託番号（受託証に記載）は、「FERM P-20668」である。「FERM P-20668」は、実施例１で「19C10」として樹立したクローンである。 The cell line (hybridoma) producing the monoclonal antibody of the present invention is referred to as “Anti-DiAcSpd MAb 19C10” and, on September 27, 2005, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center (305-8566) Deposited at Chuo 6th 1-1-1 Higashi Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. The deposit number (described on the deposit certificate) is “FERM P-20668”. “FERM P-20668” is a clone established as “19C10” in Example 1.
また、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「Anti DiAcSpd MAb Clone:20D7」と称し、平成18年3月17日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託した。その受付番号を示す受領番号（受領書に記載）は、「FERM AP-20847」である。「FERM AP-20847」は、免疫したGANPトランスジェニックマウスの脾臓を用いて作製した細胞株であり、後述の実施例２で「20D7」として樹立したクローンである。
（５）モノクローナル抗体の性質
本発明のモノクローナル抗体は、抗原の競合阻害アッセイ系、すなわち、ジアセチルスペルミジンと当該ジアセチルスペルミジンに対する特異的モノクローナル抗体との免疫反応が阻害されるように競合物質を存在させる反応系において、以下の(i)〜(iii)からなる群から選択される少なくとも１つの性質を備える。なお、上記競合阻害アッセイ系は固相化ジアセチルスペルミジンを用いた系であることが好ましい。
A cell line (hybridoma) that produces the monoclonal antibody of the present invention is called “Anti DiAcSpd MAb Clone: 20D7”, and on March 17, 2006, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Deposited with 6th Central 1-1-1 Tsukuba City, Ibaraki 305-8566. The receipt number indicating the receipt number (described in the receipt) is “FERM AP-20847”. “FERM AP-20847” is a cell line prepared using the spleen of an immunized GANP transgenic mouse, and is a clone established as “20D7” in Example 2 described later.
(5) Properties of Monoclonal Antibody The monoclonal antibody of the present invention is an antigen competitive inhibition assay system, that is, a reaction in which a competitive substance is present so that an immune reaction between diacetylspermidine and a specific monoclonal antibody against the diacetylspermidine is inhibited. The system has at least one property selected from the group consisting of the following (i) to (iii). The competitive inhibition assay system is preferably a system using solid-phased diacetylspermidine.
抗原の競合阻害アッセイ系における競合物質は、ジアセチルスペルミジン、N8-AcSpdおよびAcPutなどが挙げられる。競合物質はこれらのうちの１種類を用いてもよいし、複数種類を混合したものを用いてもよい。混合する場合は、例えば、ヒト尿中の存在比をもとに各濃度を設定してもよい。なお、明細書中、競合物質として反応系に添加するこれらの物質に「検体」の語をつけて表すことがある。 Examples of competing substances in the antigen competitive inhibition assay system include diacetylspermidine, N 8 -AcSpd, and AcPut. One of these may be used as the competitive substance, or a mixture of a plurality of kinds may be used. When mixing, for example, each concentration may be set based on the abundance ratio in human urine. In the specification, these substances added to the reaction system as competing substances may be indicated with the word “specimen”.
(i) 反応系中のDiAcSpdによる上記免疫反応の阻害活性は、当該反応系中のN8-AcSpdおよびAcPutによる上記免疫反応の阻害活性と比較して少なくとも180倍以上、好ましくは1500倍以上、より好ましくは1700倍以上の阻害活性を有する。 (i) The inhibitory activity of the immune reaction by DiAcSpd in the reaction system is at least 180 times or more, preferably 1500 times or more compared to the inhibitory activity of the immune reaction by N 8 -AcSpd and AcPut in the reaction system, More preferably, it has an inhibitory activity of 1700 times or more.
ここで、プレートの底にDiAcSpdを固定して固相化し、これにDiAcSpdに対するモノクローナル抗体を添加してDiAcSpdと抗体とを反応させる系を考える。競合物質が存在しない反応系では、当該モノクローナル抗体は固相化されたDiAcSpdと反応する。この反応系に、遊離のDiAcSpdを検体として存在させる。この遊離のDiAcSpdは固相化されたDiAcSpdと競合して抗体と反応する。固相のDiAcSpdと抗体との結合が、50％阻害されたとき、つまり、検体DiAcSpdを添加したときの上記モノクローナル抗体と固相DiAcSpdとの結合量が、遊離の検体DiAcSpdが存在しないときの上記モノクローナル抗体と固相DiAcSpdとの結合量と比較して50％まで低下するときの当該検体DiAcSpdの量の逆数又は濃度（50％阻害濃度、IC50）の逆数を免疫反応の「阻害活性」又は「結合阻害活性」として定義することができる。 Here, a system is considered in which DiAcSpd is immobilized on the bottom of the plate and immobilized, a monoclonal antibody against DiAcSpd is added thereto, and DiAcSpd reacts with the antibody. In a reaction system in which no competing substance exists, the monoclonal antibody reacts with the immobilized DiAcSpd. In this reaction system, free DiAcSpd is present as a specimen. This free DiAcSpd reacts with the antibody by competing with the immobilized DiAcSpd. When the binding between the solid-phase DiAcSpd and the antibody is inhibited by 50%, that is, when the sample DiAcSpd is added, the amount of binding between the monoclonal antibody and the solid-phase DiAcSpd is the above when there is no free sample DiAcSpd. The reciprocal of the amount of the sample DiAcSpd or the reciprocal of the concentration (50% inhibitory concentration, IC50) when the amount is reduced to 50% compared to the amount of binding between the monoclonal antibody and the solid phase DiAcSpd is “inhibitory activity” or “ It can be defined as “binding inhibition activity”.
遊離の検体DiAcSpd並びにN8-AcSpdおよびAcPutのそれぞれについて、上記阻害活性を測定し、遊離のDiAcSpdを用いたときの阻害活性が、尿中に多く遊離しているN8-AcSpd又はAcPutを用いたときの阻害活性と比較して180倍以上、好ましくは1500倍以上、より好ましくは1700倍以上となるような反応条件を満たす抗体を、本発明の抗体として選択することができる。別の言い方をすれば、本発明の抗体は、上記反応系において、検体DiAcSpdの50%阻害濃度が、検体N8-AcSpd又はAcPutの50%阻害濃度と比較して、180分の１以下、好ましくは1500分の１以下、より好ましくは1700分の１以下となるような反応条件を満たす抗体であるともいえる。このことは、本発明のモノクローナル抗体がN8-AcSpd及びAcPut等と交差反応が低く、DiAcSpdに特異的であることを意味する。 For each of the free specimens DiAcSpd and N 8 -AcSpd and AcPut, the above inhibitory activity was measured, and when using free DiAcSpd, N 8 -AcSpd or AcPut, which is largely released in urine, was used. An antibody that satisfies the reaction condition such that it is 180 times or more, preferably 1500 times or more, more preferably 1700 times or more compared to the inhibitory activity of the present invention can be selected as the antibody of the present invention. In other words, in the above reaction system, the antibody of the present invention has a 50% inhibitory concentration of the sample DiAcSpd of 1/180 or less compared to the 50% inhibitory concentration of the sample N 8 -AcSpd or AcPut, It can also be said that the antibody satisfies the reaction condition such that it is preferably 1/500 or less, more preferably 1/700 or less. This means that the monoclonal antibody of the present invention has low cross-reactivity with N 8 -AcSpd, AcPut and the like, and is specific for DiAcSpd.
上記条件を満たすときの反応系中のDiAcSpdの濃度は、200 nM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは50 nM以下である。あるいは、DiAcSpdの濃度は、好ましくは10〜200 nM以下、好ましくは10〜100nMである。 The concentration of DiAcSpd in the reaction system when the above conditions are satisfied is 200 nM or less, preferably 100 nM or less, more preferably 50 nM or less. Alternatively, the concentration of DiAcSpd is preferably 10 to 200 nM or less, preferably 10 to 100 nM.
(ii) DiAcSpdの類似構造物質として尿中に約8倍多く存在するN8-AcSpdとの交差反応性は0.7%以下であり、好ましくは0.06％以下である。 (ii) The cross-reactivity with N 8 -AcSpd present in the urine as a similar structural substance of DiAcSpd is 0.7% or less, preferably 0.06% or less.
(iii) 尿中に存在するDiAcSpd類似構造物質に対する交差反応性の総和は20%以下であり、好ましくは18％以下であり、より好ましくは12％以下、最も好ましくは4%以下である。 (iii) The total cross-reactivity with respect to the DiAcSpd-like structural substance present in urine is 20% or less, preferably 18% or less, more preferably 12% or less, and most preferably 4% or less.
本発明において、「交差反応性」は、DiAcSpd以外の物質に対する抗DiAcSpd抗体の反応性を意味する。 In the present invention, “cross-reactivity” means the reactivity of an anti-DiAcSpd antibody to a substance other than DiAcSpd.
(ii)および(iii)において、抗DiAcSpd抗体のDiAcSpd類似構造物質に対する交差反応性は、以下のように算出することができる。
(a) 縦軸を吸光度、横軸を競合物質濃度（検体濃度）で示した各ポリアミンに対する競合ELISAの結果グラフの吸光度を吸光度（％）に変更する。具体的には『（各吸光度−ブランクウェルの平均吸光度）÷(アッセイコントロールの平均吸光度−ブランクウェルの平均吸光度)×100』で算出される値（%）で吸光度/競合物質のグラフを再作成する。
(b) (a)の各ポリアミンのグラフにおいて得られるS字曲線（シグモイドカーブ）において50%阻害活性の値を含む直線領域の吸光度を選択し、それらの吸光度を通るような対数近似曲線を得る。
(c) (b)で得られた対数近似曲線を元にY=50、つまり阻害活性が−50%（50％）となるような検体濃度（Ki：反応を50%阻害する競合物質濃度(μM)）を算出する。この時の検体濃度はLAN関数の逆数を返すEXP関数によって導かれる。
(d) (c)で算出されたKiを用いて交差反応性（%）を算出する。この際DiAcSpdの交差性は100%として値を算出する。交差反応性はDiAcSpdに対するその他のポリアミンによって算出される。具体的には『KiDiAcSpd/Ki"S"(%)＝KiDiAcSpd÷"各競合物質Ki×100 (%)』の数式で導かれる。（Sはポリアミン）
(e) 場合によっては、最後にDiAcSpdに対する各ポリアミンの尿中存在比を元にした交差反応性の総和を求める。交差反応性の総和は、具体的には表1あるいは表2に示されるDiAcSpdに対する尿中存在比に交差反応性を掛けた値の総和で示され、「KiDiAcSpd/Ki"S"×DiAcSpdに対する各ポリアミンの尿中比（％）」の数式で導かれた値を総和したものである。
５．腫瘍の検出方法
DiAcSpdは、癌の臨床マーカー（腫瘍マーカー）として利用することができるため、本発明の抗体を生体試料と反応させ、生体試料中のDiAcSpdを測定することにより、その測定結果を指標として腫瘍を検出することができる。DiAcSpdの測定は、一般に行われるハプテン免疫測定法として知られている方法のいずれの方法（例えば、ELISA、EIA）によっても行うことができ、特に限定されない。
In (ii) and (iii), the cross-reactivity of the anti-DiAcSpd antibody to a DiAcSpd-like structural substance can be calculated as follows.
(a) The absorbance in the competitive ELISA results graph for each polyamine, with the vertical axis representing absorbance and the horizontal axis representing competitor concentration (analyte concentration), is changed to absorbance (%). Specifically, the absorbance / competitor graph is re-created with the value (%) calculated by “(each absorbance−average absorbance of blank wells) ÷ (average absorbance of assay control−average absorbance of blank wells) × 100”. To do.
(b) In the sigmoid curve (sigmoid curve) obtained in each polyamine graph of (a), select the absorbance in the linear region containing the value of 50% inhibitory activity, and obtain a logarithmic approximation curve that passes through those absorbances. .
(c) Based on the logarithmic approximation curve obtained in (b), Y = 50, that is, the analyte concentration at which the inhibitory activity is −50% (50%) (Ki: the concentration of competitor that inhibits the reaction by 50% ( μM)). The analyte concentration at this time is derived by the EXP function that returns the inverse of the LAN function.
(d) Cross reactivity (%) is calculated using Ki calculated in (c). At this time, the value is calculated assuming that the crossing property of DiAcSpd is 100%. Cross reactivity is calculated with other polyamines against DiAcSpd. Specifically, “Ki DiAcSpd / Ki” S ”(%) = Ki DiAcSpd ÷“ each competitor Ki × 100 (%) ”(S is a polyamine).
(e) In some cases, the sum of cross-reactivity is finally determined based on the urinary ratio of each polyamine to DiAcSpd. Specifically, the sum of the cross-reactivity is shown as the sum of values obtained by multiplying the urinary abundance ratio for DiAcSpd shown in Table 1 or Table 2 by cross-reactivity, and it is expressed as “Ki DiAcSpd / Ki” S ”× DiAcSpd. It is the sum of the values derived from the formula “ratio of polyamines in urine (%)”.
5. Tumor detection method
DiAcSpd can be used as a cancer clinical marker (tumor marker), so the antibody of the present invention is reacted with a biological sample, and DiAcSpd is measured in the biological sample, and the tumor is detected using the measurement result as an index. can do. DiAcSpd can be measured by any method (for example, ELISA, EIA) known as a hapten immunoassay that is generally performed, and is not particularly limited.
腫瘍としては、特に限定されるものではないが、例えば脳腫瘍、食道癌、咽頭癌、舌癌、肺癌、胃癌、小腸又は十二指腸癌、大腸癌、尿路悪性腫瘍（例えば前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍）、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆道癌、肉腫（例えば骨肉種、筋肉種など）及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。検出対象となる癌の種類は、1種類でもよく2種類以上が併発したものでもよい。 The tumor is not particularly limited, but for example, brain tumor, esophageal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, lung cancer, gastric cancer, small intestine or duodenal cancer, colon cancer, urinary tract malignant tumor (for example, prostate cancer, renal cancer, bladder) Cancer, testicular cancer), liver cancer, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, sarcoma (eg osteosarcoma, muscle species, etc.) and at least one selected from the group consisting of melanoma Is mentioned. The type of cancer to be detected may be one, or two or more types may be combined.
癌患者、癌が疑われる患者、あるいは健康診断受診者から生体試料を採取し、DiAcSpd測定試料を調製する。生体試料としては、血液、尿、組織等が挙げられる。血液は、採取した後に遠心して血清を分離し、得られた血清を用いることが好ましい。また、取り扱いが容易で患者への負担が少ない点で尿がより好ましい。 A biological sample is collected from a cancer patient, a patient suspected of having cancer, or a medical examination recipient, and a DiAcSpd measurement sample is prepared. Examples of the biological sample include blood, urine, tissue and the like. It is preferable that blood is collected and centrifuged to separate serum, and the obtained serum is used. Moreover, urine is more preferable in terms of easy handling and less burden on the patient.
次いで、前記測定試料と本発明の抗体とを反応させる。DiAcSpdの検出は、一般に行われるELISAにより行うことができる。ここでは、説明の便宜上、本発明の抗体にはマウス由来の抗体を用いる。 Next, the measurement sample is reacted with the antibody of the present invention. DiAcSpd can be detected by a commonly used ELISA. Here, for convenience of explanation, a mouse-derived antibody is used as the antibody of the present invention.
ELISAで測定するには、まず、マイクロプレートに抗原（DiAcSpd）をコートしておく。一方、あらかじめ生体試料（検体）又は標準液中のDiAcSpdと抗DiAcSpd特異抗体とを反応させた後、この反応液をプレート上のウェルに添加する。未反応のまま残った抗体はプレート上のDiAcSpdと結合する。そして、プレートを洗浄した後、2次抗体であるHRP標識抗マウスIgG抗体をプレートに添加して、プレート上のDiAcSpdに結合した抗体と反応させる。最後に、HRPにより触媒される発色反応により生体試料中のDiAcSpdを定量する。2次抗体で用いる標識酵素はHRP（ペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼなどを用いることもできる。競合アッセイでは、生体試料中のDiAcSpd量が多いほど、発色量、蛍光量、発光量などの値は小さく測定される。
６．腫瘍の評価方法
本発明においては、前記５に示す検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価することができる。検出結果が所定の基準値を超えるものをDiAcSpd陽性、所定の基準値以下のものをDiAcSpd陰性とし、陽性の場合には、癌を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。所定の基準値は、腫瘍の種類によって適宜設定される。
To measure by ELISA, first, an antigen (DiAcSpd) is coated on a microplate. On the other hand, after DiAcSpd in a biological sample (specimen) or standard solution is reacted with an anti-DiAcSpd specific antibody in advance, this reaction solution is added to a well on the plate. The unreacted antibody binds to DiAcSpd on the plate. Then, after washing the plate, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody, which is a secondary antibody, is added to the plate and reacted with the antibody bound to DiAcSpd on the plate. Finally, DiAcSpd in the biological sample is quantified by a color reaction catalyzed by HRP. In addition to HRP (peroxidase), alkaline phosphatase, malate dehydrase, α-glucosidase, α-galactosidase, and the like can be used as the labeling enzyme used in the secondary antibody. In a competitive assay, as the amount of DiAcSpd in a biological sample increases, values such as color development amount, fluorescence amount, and luminescence amount are measured to be smaller.
6). Tumor Evaluation Method In the present invention, the state of a tumor can be evaluated using the detection result obtained by the detection method shown in 5 above as an index. If the detection result exceeds the predetermined reference value, DiAcSpd is positive, and if the detection result is less than the predetermined reference value, DiAcSpd is negative.If it is positive, it is determined that there is a possibility of developing cancer, and the state of the tumor is determined. Can be evaluated. The predetermined reference value is appropriately set depending on the type of tumor.
腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの腫瘍の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、病期(Stage)を分類して評価を行ったり、いわゆる早期癌、進行癌を分類して評価することも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。
７．本発明の抗体を含むキット、試薬
本発明においては、DiAcSpdに対するモノクローナル抗体をDiAcSpdの検出用キット又は試薬として使用することができる。本発明のキット又は試薬は、上記腫瘍の検出等に使用することができる。
The state of a tumor means the presence or absence or progression of a tumor, and includes the presence or absence of onset of cancer, the progression of cancer, the malignancy of cancer, the presence or absence of cancer metastasis, and the presence or absence of cancer recurrence. In the above evaluation, one of these tumor states may be selected, or a plurality may be selected in appropriate combination. To evaluate the presence or absence of cancer, it is determined whether or not the patient is afflicted with cancer. Cancer malignancy is an indicator of how far the cancer has progressed, and it is evaluated by classifying the stage (Stage), or by classifying so-called early cancer and advanced cancer It is also possible. Cancer metastasis is evaluated by whether or not a neoplasm has appeared at a site distant from the location of the primary lesion. Recurrence is assessed by whether the cancer reappears after an intermittent period or remission.
7). Kits and Reagents Containing the Antibody of the Present Invention In the present invention, a monoclonal antibody against DiAcSpd can be used as a detection kit or reagent for DiAcSpd. The kit or reagent of the present invention can be used for the detection of the tumor.
従来から一般生化学検査としてポリアミン類を測定する場合は、尿中のポリアミン類は類似構造体としての数種類がひとまとまりに測定され、類似構造体のそれぞれと各種病態との関連の検討は皆無に等しかった。これまでに、ポリアミン測定法の中でも、尿中のポリアミン量について構造体を区別して測定する方法がいくつか確立されており、特にポリアミンの一種であるDiAcSpdは良性疾患患者では上昇せず、悪性疾患患者においてのみ高値を示すこと、および治療後の再発時に高値になることが確認されている。このことはDiAcSpdなどのジアセチルポリアミンを簡便かつ正確に測定する方法を開発することができれば、DiAcSpdを新規の腫瘍マーカーとして癌診療の臨床において用いることができ、DiAcSpdの検出試薬による腫瘍の検査は大きな需要が見込まれることを示している。 Conventionally, when measuring polyamines as a general biochemical test, several types of polyamines in urine are measured together as similar structures, and there is no examination of the relationship between each similar structure and various pathologies. It was equal. To date, several methods have been established for measuring the amount of polyamine in the urine by distinguishing the structures among polyamine measurement methods. In particular, DiAcSpd, a type of polyamine, does not increase in patients with benign diseases and malignant diseases. It has been confirmed that the value is high only in patients, and that the value is high upon recurrence after treatment. This means that if a simple and accurate method for measuring diacetylpolyamines such as DiAcSpd can be developed, DiAcSpd can be used as a novel tumor marker in the clinical practice of cancer treatment, and the examination of tumors using a DiAcSpd detection reagent is significant. It shows that demand is expected.
本発明により、DiAcSpdの検出システムとして抗DiAcSpd抗体を用いた、競合ELISA法によるDiAcSpdの測定系が提供される。 The present invention provides a measurement system for DiAcSpd by a competitive ELISA method using an anti-DiAcSpd antibody as a DiAcSpd detection system.
この測定系では、固相化抗原として、N8-アセチルスペルミンを配し、アシルアミド結合によりDiAcSpd類似構造体を持つもの（N8-AcSpd-EMC-AMS-BSA）を使用することができる。この固相化抗原は、免疫抗原の方法に準じて作製することができる。まず、キャリア蛋白質であるBSAとAMSを反応させ、反応生成物であるAMS-BSA複合体を作製する。さらにAMS-BSAに二価性架橋試薬であるEMCS（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）を介して、N8-AcSpdをアシルアミド結合させ、固相化抗原N8-AcSpd-EMC-AMS-BSAを作製する。但し、抗原の作製に関してはこれに限定するものではない。 In this measurement system, N 8 -acetylspermine can be used as a solid-phased antigen and a DiAcSpd-like structure (N 8 -AcSpd-EMC-AMS-BSA) can be used by an acylamide bond. This solid-phased antigen can be prepared according to the method of immune antigen. First, BSA, which is a carrier protein, is reacted with AMS to produce an AMS-BSA complex, which is a reaction product. Furthermore, N 8 -AcSpd is acylamide-bonded to AMS-BSA via EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide), a bivalent cross-linking reagent, and immobilized antigen N 8 -AcSpd-EMC-AMS-BSA Is made. However, the production of the antigen is not limited to this.
本発明において、動物免疫時に使用する抗原、ハイブリドーマのスクリーニング抗原、DiAcSpd検出用のプレート固相化抗原には、DiAcSpdを用いてもよいし、N8-AcSpd-EMC-AMS-BSAを用いてもよい。N8-AcSpdとBSAとを二価性架橋試薬を用いて結合させると、構造的にDiAcSpdに類似するためである。 In the present invention, DiAcSpd or N 8 -AcSpd-EMC-AMS-BSA may be used as the antigen used at the time of animal immunization, the screening antigen for hybridoma, and the plate-immobilized antigen for detecting DiAcSpd. Good. This is because N 8 -AcSpd and BSA are structurally similar to DiAcSpd when bound using a bivalent cross-linking reagent.
本発明のキット又は試薬は、DiAcSpdを特異的に測定可能であるが、癌診療の臨床において用いるためには、好ましくは、再現性も要求される。そこで、本発明においては、腫瘍診断薬として本発明のキットを用いる際の、好ましいDiAcSpd測定条件を提供する。 Although the kit or reagent of the present invention can specifically measure DiAcSpd, it is preferably required to be reproducible for use in clinical practice of cancer. Therefore, the present invention provides preferable DiAcSpd measurement conditions when using the kit of the present invention as a tumor diagnostic agent.
本発明のキット又は試薬を腫瘍診断薬として用いる際は、健常者の尿中DiAcSpd排泄量の平均が301nmol/g creatinine（Hiramatsu,K. et al., J. Biochem., 117, 107-112(1995)）であることから、キットに含有するスタンダード領域を600nM〜9.375nMに設定することが好ましい。固相化抗原濃度としては、0.01〜0.05μg/mL、好ましくは0.03μg/mLである。その結果、尿中DiAcSpdを測定するのに、十分な感度及び測定精度を達成することができる。 When the kit or reagent of the present invention is used as a tumor diagnostic agent, the average urinary DiAcSpd excretion in healthy subjects is 301 nmol / g creatinine (Hiramatsu, K. et al., J. Biochem., 117, 107-112 ( 1995)), the standard region contained in the kit is preferably set to 600 nM to 9.375 nM. The concentration of the immobilized antigen is 0.01 to 0.05 μg / mL, preferably 0.03 μg / mL. As a result, sufficient sensitivity and measurement accuracy can be achieved for measuring urinary DiAcSpd.
測定精度とは、同一の試料を複数の試験管又はウェルの分けて1回のアッセイを行ったときに、それぞれの測定値がどの程度ばらつくかを示す指標となるものであり、統計学的には、変動係数（CV：Coefficient of variation）、すなわち測定の平均値に対する標準偏差の割合（％）として表現される。本発明においては、この変動係数（CV）を再現性という。再現性は15%以下であり、10%以下であることが好ましく、5%以下であることがさらに好ましい。 Measurement accuracy is an index that shows how much each measured value varies when a single assay is performed with multiple test tubes or wells divided into the same sample. Is expressed as a coefficient of variation (CV), that is, as a ratio (%) of the standard deviation to the average value of the measurement. In the present invention, this coefficient of variation (CV) is called reproducibility. The reproducibility is 15% or less, preferably 10% or less, and more preferably 5% or less.
本発明のキット又は試薬の好ましい性能は、限定されるわけではないが、最低検出域は18.75nM、検体測定検出感度：37.5nM（18.75×2）である。また、同時再現性は10%以下、好ましくは5%前後であり、日間再現性は10%以下、好ましくは約5％前後である。いずれの再現性もCV=10%以下であることが好ましい。 The preferable performance of the kit or reagent of the present invention is not limited, but the minimum detection range is 18.75 nM, and the analyte measurement detection sensitivity is 37.5 nM (18.75 × 2). The simultaneous reproducibility is 10% or less, preferably around 5%, and the daily reproducibility is 10% or less, preferably around 5%. Any reproducibility is preferably CV = 10% or less.
本発明のモノクローナル抗体を診断薬として用いる場合には、このモノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、モノクローナル抗体を酵素標識し、使用することができる。標識酵素として、HRP（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。 When the monoclonal antibody of the present invention is used as a diagnostic agent, the monoclonal antibody can be combined with another solvent or solute to form a composition. For example, distilled water, pH buffer reagent, salt, protein, surfactant and the like can be combined. Monoclonal antibodies can be used after enzyme labeling. As a labeling enzyme, in addition to HRP (horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, malate dehydrase, α-glucosidase, α-galactosidase, colloidal gold, and the like can be used.
本発明のキットには、本発明の抗体の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、抗原固相化マイクロプレート、DiAcSpd標準品（スタンダード）、抗体希釈溶液、OPD（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液、説明書などを含めることができる。また、反応の至適条件を与える緩衝液、反応生成物質の安定化に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などの反応媒体も本発明のキットに含まれ得る。
以下、実施例および実験例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例および実験例に限定されるものではない。
In the kit of the present invention, in addition to the antibody of the present invention, the above solvent, solute, enzyme labeling reagent, antigen-immobilized microplate, DiAcSpd standard (standard), antibody dilution solution, OPD (orthophenylenediamine) tablet , Substrate solution, reaction stop solution, concentrated washing solution, instructions and the like. In addition, a reaction medium such as a buffer solution that gives optimum conditions for the reaction, a buffer solution that is useful for stabilizing the reaction product, and a stabilizer for the reaction material may be included in the kit of the present invention.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and experimental examples. However, the present invention is not limited to these examples and experimental examples.
ジアセチルスペルミジン（以下DiAcSpd）に特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製
免疫抗原は、公知方法に準じて以下の通り作製した（Kunio Fujiwara. et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217-226(1983)）。DiAcSpdは、低分子のアルキルアミンであり、これを直接マウスに免疫してもDiAcSpdに特異的な抗体を得ることができない。そこで、キャリア蛋白質であるウシ血清アルブミン（以下「BSA」とする）とN8-AcSpdをアシルアミド結合させ、DiAcSpd類似構造物を側鎖として多数もつ免疫抗原N8-AcSpd -GMB-AMS-BSAを以下のように作製した。
Preparation of monoclonal antibody specific for diacetylspermidine (hereinafter referred to as DiAcSpd) (1) Preparation of antigen An immune antigen was prepared according to a known method as follows (Kunio Fujiwara. Et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217). -226 (1983)). DiAcSpd is a low molecular weight alkylamine, and an antibody specific for DiAcSpd cannot be obtained even if the mouse is directly immunized. Therefore, bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”), which is a carrier protein, and N 8 -AcSpd are acylamide-linked, and an immune antigen N 8 -AcSpd -GMB-AMS-BSA having many DiAcSpd-like structures as side chains is obtained. It produced as follows.
まず、キャリア蛋白質となるBSAとAMSとを反応させ、Sephadex G-25ゲルろ過カラムにて精製し、AMS-BSAを作製した。一方でAMS-BSAに二価性架橋試薬であるGMBSを介して、N8-AcSpdをアシルアミド結合させるために、GMB- N8-AcSpdを作製した。さらに、AMS-BSAとGMB- N8-AcSpdを反応させ、免疫抗原であるN8-AcSpd -GMB-AMS-BSAを作製した。
（２）マウスへの免疫
マウスへの免疫は2通りの方法で行った。免疫方法の概略は、図１に示す。一つ目の方法は、以下の方法で行った。すなわち、免疫1：2mg/mLに調製した免疫抗原をFCAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを100μLずつマウスの背部皮下に投与し、その後2週間間隔で1mg/mLの免疫抗原とFIAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを100μLずつマウスの背部皮下に投与した。合計3回抗原を投与し、ELISAにより抗体価を確認し、抗体価の高かったものに対して、1mg/mLの免疫抗原100μLをマウスの腹腔内に最終投与し、その3日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。二つ目の方法は、以下の方法で行った。すなわち、免疫2：一つ目の方法の3回目までの抗原投与までは同じだが、その後半年間抗体価が下がるまでマウスを放置し、再度1mg/mLの免疫抗原とIFAのエマルジョンをマウスの背部皮下に投与し、その2週間後に1mg/mLの免疫抗原100μLをマウスの腹腔内に最終投与し、その3日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
摘出した脾臓をすりつぶし、抗DiAcSpd抗体産生細胞を含む脾臓細胞を調製した。両免疫方法共に、1匹あたり約１×108個の脾臓細胞を調製できた。一方で、ミエローマ細胞であるP3U1を培養し、細胞融合当日に生細胞率が95%以上のP3U1を調製した。これら脾臓細胞とP3U1を5：1で混ぜ、50%濃度の分子量1,450のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、培地で洗浄し、HAT培地に懸濁したものを、96穴培養プレートの各ウェルに1×105個/ウェルとなるように細胞を播きこんだ。
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、12日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを後述の実験例1の方法で行った。免疫1の方法では、3872ウェル中115ウェルでDiAcSpd陽性であった。免疫2の方法では、2584ウェル中114ウェルでDiAcSpd陽性であった。これらの選択したウェルの細胞を24 ウェルプレートに移し、1〜2日間培養し、再度実験例1の方法でスクリーニングをしたところ、最終的に、免疫1の方法では、75ウェル分、免疫2の方法では90ウェル分がDiAcSpd陽性であった。
（５）抗体産生陽性ウェルの交差反応性試験
上記のDiAcSpd陽性ウェル165クローンに関して、これまでの研究で尿中に多く存在し、比較的交差反応しやすいと考えられるN8-AcSpdに対する交差反応性試験を後述の実験例2の方法で行った。その結果、N8-AcSpdの50%阻害濃度がDiAcSpdの50%阻害濃度の約180倍以上であったものが2ウェル分あり、それ以外は0〜100倍であった。
（６）クローニング
DiAcSpdに対する特異性の高かった2ウェル分を限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を20%のFCSを含むRPMI培地で2.5個/mLに調製し、96穴培養プレート2枚分の各ウェルに200μLずつ添加した。10日後、実験例1の方法で培養上清中のDiAcSpdに対する抗体価を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。その後さらに培養し、実験例2の方法でAcSpm、N1-AcSpd、N8-AcSpd、DiAcSpd、AcPutに対する交差反応性試験を行ったところ、2クローンともにDiAcSpdの阻害活性がN8-AcSpd又はAcPutの阻害活性の約180倍以上となり、本発明において目的とする特異性を十分に備えた抗体であった。それぞれの樹立クローンを「19C10」、「15C5」とした（図２および図３）。
First, BSA serving as a carrier protein was reacted with AMS and purified with a Sephadex G-25 gel filtration column to prepare AMS-BSA. On the other hand, GMB-N 8 -AcSpd was prepared in order to bind N 8 -AcSpd to AMS-BSA via GMBS, which is a bivalent crosslinking reagent. Furthermore, AMS-BSA and GMB-N 8 -AcSpd were reacted to prepare N 8 -AcSpd -GMB-AMS-BSA, which is an immunizing antigen.
(2) Immunization to mice Immunization to mice was performed by two methods. An outline of the immunization method is shown in FIG. The first method was performed by the following method. That is, immunity 1: Immunized antigen prepared at 2 mg / mL was mixed with FCA in an equal amount, and 100 μL of the emulsion formed was administered subcutaneously to the back of the mouse, and then 1 mg / mL of immunizing antigen was administered every 2 weeks. 100 μL of an equal amount mixed with FIA to form an emulsion was subcutaneously administered to the back of the mouse. Antigen titer was administered 3 times in total, and antibody titer was confirmed by ELISA. For those with high antibody titer, 100 μL of 1 mg / mL of immunizing antigen was finally administered intraperitoneally to mice, and 3 days later for cell fusion The spleen was removed. The second method was performed as follows. In other words, immunization 2: the same procedure up to the third administration of antigen in the first method, but the mice were left until the antibody titer decreased in the latter half of the year, and then an emulsion of 1 mg / mL of immunizing antigen and IFA was added to the back of the mice. Two weeks later, 100 μL of 1 mg / mL immunoantigen was finally administered intraperitoneally to the mice, and 3 days later, the spleen was removed for cell fusion.
(3) Preparation and cell fusion of spleen cells The extracted spleen was ground to prepare spleen cells containing anti-DiAcSpd antibody-producing cells. In both immunization methods, approximately 1 × 10 8 spleen cells per mouse could be prepared. On the other hand, P3U1, which is a myeloma cell, was cultured, and P3U1 having a viable cell ratio of 95% or more was prepared on the day of cell fusion. These spleen cells and P3U1 were mixed at 5: 1, and cell fusion was performed with polyethylene glycol having a molecular weight of 1,450 at a concentration of 50%. After the fusion, the cells were washed with a medium and suspended in HAT medium, and cells were seeded at 1 × 10 5 cells / well in each well of a 96-well culture plate.
(4) Screening of antibody production positive wells After cell fusion, the culture supernatant on the 12th day was collected, and antibody production positive wells were screened by the method of Experimental Example 1 described later. In the immunization 1 method, 115 out of 3872 wells were positive for DiAcSpd. In the immunization 2 method, 114 out of 2584 wells were positive for DiAcSpd. Cells in these selected wells were transferred to a 24-well plate, cultured for 1-2 days, and screened again using the method of Experimental Example 1. In the method, 90 wells were positive for DiAcSpd.
(5) Cross-reactivity test of antibody-producing positive wells Regarding the above-mentioned 165 clones of DiAcSpd positive wells, cross-reactivity to N 8 -AcSpd, which is present in urine and is considered to be relatively easy to cross-react in previous studies. The test was performed by the method of Experimental Example 2 described later. As a result, there were two wells in which the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd was about 180 times or more of the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd, and the other was 0-100 times.
(6) Cloning
Two wells with high specificity for DiAcSpd were cloned by limiting dilution. That is, cells were prepared at 2.5 cells / mL with RPMI medium containing 20% FCS, and 200 μL was added to each well of two 96-well culture plates. Ten days later, the antibody titer against DiAcSpd in the culture supernatant was measured by the method of Experimental Example 1 to confirm that it was positive, and clones derived from each well were obtained. Then further cultured, AcSpm in Experimental Example 2 method, N 1 -AcSpd, N 8 -AcSpd , DiAcSpd, was subjected to cross-reactivity test for AcPut, N 8 both 2 clones inhibitory activity of DiAcSpd is -AcSpd or AcPut This antibody was about 180 times or more of the inhibitory activity and sufficiently provided with the target specificity in the present invention. The respective established clones were designated as “19C10” and “15C5” (FIGS. 2 and 3).
図２において、DiAcSpdの50%阻害濃度は約0.037μM、またN8-AcSpdの50%阻害濃度は約8.08μMであり、それぞれの阻害活性を比較した結果、その差は約218倍であった。 In FIG. 2, the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd was about 0.037 μM, and the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd was about 8.08 μM. As a result of comparing each inhibitory activity, the difference was about 218 times. .
また、図３において、DiAcSpdの50%阻害濃度は約0.026μM、またN8-AcSpdの50%阻害濃度は約5.169μMであり、それぞれの阻害活性を比較した結果、その差は約198倍であった。
（７）樹立クローンの基礎データ
実験例2の条件において、樹立クローンの産生する抗体について、尿検体中におけるDiAcSpd類似構造物質に対する交差反応性を調べた。すなわち、DiAcSpd、N8-AcSpd、AcPut 、N1-AcSpd 、AcSpmの50%阻害濃度を調べ、尿中におけるDiAcSpdに対する他の類似構造物質の交差反応性を算出した。その結果、樹立クローン19C10では、N8-AcSpdに対する交差反応性が3.668%、その他AcPutが13.655%、N1-AcSpdが0.078%、AcSpmが0.000%であり、交差反応性の総和は17.401%であった。一方、樹立クローン15C5では、尿中におけるN8-AcSpdに対する交差反応性が4.029%、その他AcPutが7.608%、N1-AcSpdが0.113%、AcSpmが0.000%であり、交差反応性の総和は11.750%であった(表１)。
In FIG. 3, the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd is about 0.026 μM, and the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd is about 5.169 μM. As a result of comparing each inhibitory activity, the difference is about 198 times. there were.
(7) Basic Data of Established Clones Under the conditions of Experimental Example 2, the antibodies produced by the established clones were examined for cross-reactivity with DiAcSpd-like structural substances in urine samples. That is, the 50% inhibitory concentrations of DiAcSpd, N 8 -AcSpd, AcPut, N 1 -AcSpd, and AcSpm were examined, and the cross-reactivity of other similar structural substances to DiAcSpd in urine was calculated. As a result, in the established clone 19C10, the cross-reactivity to N 8 -AcSpd is 3.668%, other AcPut is 13.655%, N 1 -AcSpd is 0.078%, AcSpm is 0.000%, and the total cross-reactivity is 17.401% there were. On the other hand, in the established clone 15C5, the cross-reactivity to N 8 -AcSpd in urine is 4.029%, other AcPut is 7.608%, N 1 -AcSpd is 0.113%, AcSpm is 0.000%, and the total cross-reactivity is 11.750. % (Table 1).
表１ 尿中DiAcSpd類似構造物質のDiAcSpdに対する交差反応性 Table 1 Cross-reactivity of urinary DiAcSpd-like structural substances to DiAcSpd
以上のことから、本発明のモノクローナル抗体は、DiAcSpdに対する特異性が極めて高く、交差反応性も極めて低いことから、従来から知られている抗DiAcSpd抗体と比較して極めて有用である。
＜実験例1＞
抗体のスクリーニング法
96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、固相化抗原としてPBS（pH7.0）で0.1μg/mLに調製したN8-AcSpd -HMC-peptideを50μLずつ添加し、25℃で1時間放置した。次に、0.05% Tween20を含むPBS（pH7.0）（PBST）で3回洗浄後、0.5%ゼラチンを含むPBST（ブロッキング液）を各ウェルに200μLずつ添加し、25℃で1時間静置した。洗浄後、培養上清を原液のまま各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で40分静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに2500倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（ZYMED社）を50μLずつ添加し、25℃で40分静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに0.02%の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH5.0）で0.5mg/mLに調製したo-フェニレンジアミン溶液100μLを添加し、25℃で10分間静置した後に、1M硫酸溶液100μLを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後490nmの吸光度をELISAリーダーによって測定した。
＜実験例2＞
交差反応性試験
希釈した培養上清中の抗体価を実験例1の方法で測定した。その結果で490nmにおける吸光度が1となる希釈倍率を設定した（図４および図５）。希釈用プレートに上記で設定した希釈倍率で希釈した培養上清70μLと、各濃度に段階的に調製したDiAcSpd溶液又はその類似構造物質（N8-AcSpd 、AcSpm、N1-AcSpd、DiAcSpm等）を各濃度に段階的に調製したもの70μLとを各ウェルに混合して添加し、25℃で1時間静置しプレ反応を行った。次に、実験例1と同じ方法でブロッキング処理したプレートの各ウェルにプレ反応した反応液50μLを各ウェルに添加し、25℃で1時間静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに2500倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（ZYMED社）を50μLずつ添加し、25℃で1時間静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに0.02%の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH5.0）で0.5mg/mLに調製したo-フェニレンジアミン溶液100μLを添加し、25℃で10分間静置した後に、1M硫酸溶液100μLを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後490nmの吸光度をELISAリーダーによって測定した。
From the above, the monoclonal antibody of the present invention has extremely high specificity for DiAcSpd and extremely low cross-reactivity, so that it is extremely useful as compared with conventionally known anti-DiAcSpd antibodies.
<Experimental example 1>
Antibody screening method
To each well of a 96-well microtiter plate, 50 μL each of N 8 -AcSpd -HMC-peptide prepared to 0.1 μg / mL with PBS (pH 7.0) was added as a solid-phased antigen and left at 25 ° C. for 1 hour. . Next, after washing 3 times with PBS (pH 7.0) (PBST) containing 0.05% Tween20, 200 μL of PBST (blocking solution) containing 0.5% gelatin was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. . After washing, 50 μL of the culture supernatant was added to each well as the stock solution and allowed to stand at 25 ° C. for 40 minutes. Next, after washing 3 times with PBST, 50 μL each of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (ZYMED) diluted 2500-fold was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 40 minutes. Next, after washing 3 times with PBST, 100 μL of o-phenylenediamine solution prepared to 0.5 mg / mL with 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) containing 0.02% hydrogen peroxide is added to each well. After standing at 25 ° C. for 10 minutes, 100 μL of 1M sulfuric acid solution was added to each well to stop the color reaction. The absorbance at 490 nm was then measured with an ELISA reader.
<Experimental example 2>
Cross-reactivity test The antibody titer in the diluted culture supernatant was measured by the method of Experimental Example 1. As a result, the dilution factor at which the absorbance at 490 nm was 1 was set (FIGS. 4 and 5). 70 μL of culture supernatant diluted at the dilution rate set above on the dilution plate, DiAcSpd solution prepared stepwise for each concentration, or similar structural substances (N 8 -AcSpd, AcSpm, N 1 -AcSpd, DiAcSpm, etc.) 70 μL prepared stepwise to each concentration was added to each well, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour for pre-reaction. Next, 50 μL of the reaction solution pre-reacted in each well of the plate subjected to the blocking treatment in the same manner as in Experimental Example 1 was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBST, 50 μL each of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (ZYMED) diluted 2500-fold was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBST, 100 μL of o-phenylenediamine solution prepared to 0.5 mg / mL with 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) containing 0.02% hydrogen peroxide is added to each well. After standing at 25 ° C. for 10 minutes, 100 μL of 1M sulfuric acid solution was added to each well to stop the color reaction. The absorbance at 490 nm was then measured with an ELISA reader.
ジアセチルスペルミジン（以下DiAcSpd）に特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製
実施例１（１）の方法と同様の方法に従って、免疫抗原N8-AcSpd-GMB-AMS-BSAを作製した。
（２）GANPトランスジェニックマウスへの免疫
マウスへの免疫は以下の方法で行った。2mg/mLに調製した免疫抗原をFCAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを100μLずつマウスの背部皮下に投与し、その後2週間間隔で1mg/mLの免疫抗原とFIAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを100μLずつマウスの背部皮下に投与した。合計3回抗原を投与し、ELISAにより抗体の力価を確認し、抗体価の高かったものに対して、1mg/mLの免疫抗原100μLをマウスの腹腔内に最終投与し、その3日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
摘出した脾臓をすりつぶし、抗DiAcSpd抗体産生細胞を含む脾臓細胞を調製した。1匹あたり約2×108個の脾臓細胞を調製できた。ミエローマ細胞P3U1の調製および脾臓細胞とP3U1との細胞融合は、実施例１（３）に記載の方法と同様に行った。
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、12日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを実験例1の方法で行った。2208ウェル中110ウェルでDiAcSpd陽性であった。これらの選択したウェルの細胞を24 ウェルプレートに移し、1〜2日間培養し、再度実験例1の方法でスクリーニングをしたところ、最終的に97ウェル分がDiAcSpd陽性であった。
（５）抗体産生陽性ウェルの交差反応性試験
上記のDiAcSpd陽性ウェル97クローンに関して、実施例１と同様に、N8-AcSpdに対する交差反応性試験を実験例2の方法で行った。その結果、N8-AcSpdの50%阻害濃度がDiAcSpdの50%阻害濃度の約1700倍以上であったものが4ウェル分あり、それ以外は100〜1500倍であった。
（６）クローニング
DiAcSpdに対する特異性の高かった4ウェル分を限界希釈法で、実施例１（６）の方法と同様にクローニングを行った。すなわち、2.5個/mLで培養した後、実験例1の方法で培養上清中のDiAcSpdに対する抗体価を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。その後さらに培養し、実験例2の方法でAcSpm、N1-AcSpd、N8-AcSpd、DiAcSpd、AcPutに対する交差反応性試験を行った。その結果、3クローンがDiAcSpdの阻害活性がAcPutの阻害活性の約1500倍以上、N8-AcSpdの阻害活性の約1700倍以上となり、本発明において目的とする特異性を十分に備えた抗体であった。3つの樹立クローンをそれぞれ「5D1」、「15D4」、「20D7」とした。
（７）抗体の精製
上記3クローンから目的のモノクローナル抗体を以下の方法で精製した。まず、樹立クローンを市販の無血清培地（Hybridoma SFM：Invitrogen社）に懸濁し、4×105個/mLになるように調製した。T225フラスコにその細胞懸濁液を50mL入れ、37℃、5.0% CO2環境下で約１週間培養した。培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清をプロテインGカラムにアプライし、グリシンバッファー（pH3.0）で溶出し、モノクローナル抗体を精製した。その後、再度実験例2の方法でAcSpm、N1-AcSpd、N8-AcSpd、DiAcSpd、AcPut、DiAcSpmに対する交差反応性試験を行った。その結果培養上清での結果と同様な結果が得られた（図６、図７および図８）。
Preparation of Monoclonal Antibody Specific to Diacetylspermidine (hereinafter DiAcSpd) (1) Preparation of Antigen An immune antigen N 8 -AcSpd-GMB-AMS-BSA was prepared according to the same method as in Example 1 (1).
(2) Immunization to GANP transgenic mice Immunization to mice was performed by the following method. 100 μL of the immunizing antigen prepared at 2 mg / mL mixed with FCA and the emulsion formed is administered subcutaneously to the back of the mouse in 100 μL aliquots, and then 1 mg / mL of immunizing antigen and FIA are mixed at equal intervals every 2 weeks. Then, 100 μL of the emulsion formed was administered subcutaneously to the back of the mouse. The antigen was administered three times in total, and the antibody titer was confirmed by ELISA. For those with high antibody titers, 100 μL of 1 mg / mL of immunizing antigen was finally administered intraperitoneally to the mice, and 3 days later The spleen was removed for fusion.
(3) Preparation and cell fusion of spleen cells The extracted spleen was ground to prepare spleen cells containing anti-DiAcSpd antibody-producing cells. Approximately 2 × 10 8 spleen cells could be prepared per mouse. Preparation of myeloma cells P3U1 and cell fusion between spleen cells and P3U1 were performed in the same manner as described in Example 1 (3).
(4) Screening of antibody production positive wells After cell fusion, the culture supernatant on the 12th day was collected, and antibody production positive wells were screened by the method of Experimental Example 1. 110 out of 2208 wells were positive for DiAcSpd. Cells in these selected wells were transferred to a 24-well plate, cultured for 1-2 days, and screened again by the method of Experimental Example 1. Finally, 97 wells were positive for DiAcSpd.
(5) Cross-reactivity test of antibody production positive well As with Example 1, the cross-reactivity test with respect to N 8 -AcSpd was performed by the method of Experimental Example 2 for the above-mentioned DiAcSpd positive well 97 clone. As a result, there were 4 wells in which the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd was about 1700 times or more of the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd, and the others were 100-1500 times.
(6) Cloning
Four wells having high specificity for DiAcSpd were cloned by limiting dilution in the same manner as in Example 1 (6). That is, after culturing at 2.5 cells / mL, the antibody titer against DiAcSpd in the culture supernatant was measured by the method of Experimental Example 1 to confirm that it was positive, and clones derived from each well were obtained. Thereafter, the cells were further cultured, and cross-reactivity tests for AcSpm, N 1 -AcSpd, N 8 -AcSpd, DiAcSpd, and AcPut were performed by the method of Experimental Example 2. In result, 3 clones of about 1500 times more inhibitory activity of DiAcSpd of inhibitory activity of AcPut, is approximately 1700-fold more inhibitory activity of N 8 -AcSpd, antibodies replete with specificity of interest in the present invention there were. The three established clones were designated as “5D1”, “15D4”, and “20D7”, respectively.
(7) Purification of antibody The target monoclonal antibody was purified from the above three clones by the following method. First, established clones were suspended in a commercially available serum-free medium (Hybridoma SFM: Invitrogen) and prepared to 4 × 10 5 cells / mL. 50 mL of the cell suspension was placed in a T225 flask and cultured in a 37 ° C., 5.0% CO 2 environment for about one week. After culturing, the culture supernatant was collected. The collected culture supernatant was applied to a protein G column and eluted with glycine buffer (pH 3.0) to purify the monoclonal antibody. Thereafter, a cross-reactivity test for AcSpm, N 1 -AcSpd, N 8 -AcSpd, DiAcSpd, AcPut, and DiAcSpm was performed again by the method of Experimental Example 2. As a result, the same results as in the culture supernatant were obtained (FIGS. 6, 7 and 8).
5D1クローン由来の精製抗体において、DiAcSpdの50%阻害濃度は約0.011μM、またN8-AcSpdの50%阻害濃度は約19.29μMであり、それぞれの阻害活性を比較した結果、その差は約1756倍であった（図６）。 In the purified antibody derived from the 5D1 clone, the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd was about 0.011 μM, and the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd was about 19.29 μM. As a result of comparing each inhibitory activity, the difference was about 1756. Doubled (Figure 6).
また、15D4クローン由来の精製抗体において、DiAcSpdの50%阻害濃度は約0.058μM、またN8-AcSpdの50%阻害濃度は約135.568μMであり、それぞれの阻害活性を比較した結果、その差は約2340倍であった（図７）。 In the purified antibody derived from the 15D4 clone, the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd was about 0.058 μM, and the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd was about 135.568 μM. It was about 2340 times (FIG. 7).
さらに20D7クローン由来の精製抗体において、DiAcSpdの50%阻害濃度は約0.025μM、またN8-AcSpdの50%阻害濃度は約75.561μMであり、それぞれの阻害活性を比較した結果、その差は約3000倍であった（図８）。
（８）樹立クローンの基礎データ
実施例１（７）の方法と同様に、樹立クローンの産生する抗体について、尿中における交差反応性を調べた。その結果、樹立クローン5D1では、尿中におけるN8-AcSpdに対する交差反応性が0.474%、その他AcPutが2.409%、N1-AcSpdが0.173%、AcSpmが0.000%であり、交差反応性の総和は3.057%であった。また、樹立クローン15D4では、尿中におけるN8-AcSpdに対する交差反応性が0.343%、その他AcPutが1.723%、N1-AcSpdが0.130%、AcSpmが0.000%であり、交差反応性の総和は2.196%であった。さらに、樹立クローン20D7では、N8-AcSpdに対する交差反応性が0.262%、その他AcPutが尿中における1.402%、N1-AcSpdが0.162%、AcSpmが0.000%であり、交差反応性の総和は1.827%であった（表２）。
Furthermore, in the purified antibody derived from the 20D7 clone, the 50% inhibitory concentration of DiAcSpd is about 0.025 μM, and the 50% inhibitory concentration of N 8 -AcSpd is about 75.561 μM. As a result of comparing each inhibitory activity, the difference is about It was 3000 times (FIG. 8).
(8) Basic data of established clones In the same manner as in Example 1 (7), urinary cross-reactivity of antibodies produced by established clones was examined. As a result, in the established clone 5D1, the cross-reactivity to N 8 -AcSpd in the urine is 0.474%, the other AcPut is 2.409%, N 1 -AcSpd is 0.173%, and AcSpm is 0.000%. It was 3.057%. In addition, in the established clone 15D4, the cross-reactivity to N 8 -AcSpd in urine is 0.343%, the other AcPut is 1.723%, N 1 -AcSpd is 0.130%, AcSpm is 0.000%, and the total cross-reactivity is 2.196. %Met. Furthermore, in the established clone 20D7, the cross-reactivity to N 8 -AcSpd is 0.262%, the other AcPut is 1.402% in urine, N 1 -AcSpd is 0.162%, AcSpm is 0.000%, and the total cross-reactivity is 1.827. % (Table 2).
表２ 尿中DiAcSpd類似構造物質のDiAcSpdに対する交差反応性 Table 2 Cross-reactivity of urinary DiAcSpd-like structural substances to DiAcSpd
以上のことから、本発明のモノクローナル抗体は、DiAcSpdに対する特異性が極めて高く、交差反応もないことから、従来から知られている抗DiAcSpd抗体と比較して極めて有用である。
From the above, the monoclonal antibody of the present invention is extremely useful compared to conventionally known anti-DiAcSpd antibodies because of its extremely high specificity to DiAcSpd and no cross-reactivity.
キットを用いたDiAcSpdの測定
（１）キット条件の確立
DiAcSpd測定キットとしては、固相化抗原にN8-AcSpd-EMC-AMS-BSAを用いた競合ELISA法を採用した。抗体は、実施例２で作製したモノクローナル抗体の内、最も尿中交差反応性の低かった20D7クローンを使用した。また、抗体は市販のHRP標識試薬Peroxidase Labeling Kit-SH（DOJINDO）を用いて、実施例２（７）で得られた抗DiAcSpd抗体をHRP標識抗体とした。スタンダード領域を600nM〜9.375nMに設定し、固相化抗原濃度は検討の結果0.03μg/mLとした。HRP標識抗DiAcSpdモノクローナル抗体の使用濃度については、N8-AcSpd-EMC-AMS-BSA固相化条件0.03μg/mLにおいて、最大反応効率の40%となる条件で定めた結果、最終濃度で5000倍希釈にて使用することとなった（図９）。
Measurement of DiAcSpd using kit (1) Establishment of kit conditions
As the DiAcSpd measurement kit, a competitive ELISA method using N 8 -AcSpd-EMC-AMS-BSA as the immobilized antigen was adopted. Among the monoclonal antibodies prepared in Example 2, the 20D7 clone having the lowest urinary cross-reactivity was used as the antibody. The antibody was a commercially available HRP labeling reagent Peroxidase Labeling Kit-SH (DOJINDO), and the anti-DiAcSpd antibody obtained in Example 2 (7) was used as the HRP-labeled antibody. The standard region was set to 600 nM to 9.375 nM, and the immobilized antigen concentration was 0.03 μg / mL as a result of the examination. The concentration of HRP-labeled anti-DiAcSpd monoclonal antibody used was determined to be 40% of the maximum reaction efficiency under N 8 -AcSpd-EMC-AMS-BSA immobilization conditions of 0.03 μg / mL. It was to be used at double dilution (FIG. 9).
この条件で標準曲線の再現性を確認したところ、600〜9.375nMにおいて再現性のある良好な曲線が得られた（図１０、表３）。 When the reproducibility of the standard curve was confirmed under these conditions, a good curve having reproducibility was obtained at 600 to 9.375 nM (FIG. 10, Table 3).
表３ 標準曲線の再現性 Table 3 Standard curve reproducibility
（２）キットの基礎データ
また、DiAcSpd測定ELISAの精密度及び性能を評価するため、異なる2種の管理検体（検体A、検体B）を用いて、日内再現性をN=10で、日間再現性をN=10で評価した。日内再現性は、異なる2濃度の尿検体を用い、同日中に、それぞれの濃度の検体をデュプリケート（n=2well=1）として、10回（n=10）以上DiAcSpd濃度測定試験を行った。日間再現性は、異なる2濃度の尿検体を用い、それぞれをデュプリケート（n=2well=1）として10回以上（10日以上）のDiAcSpd濃度測定試験を実施した。
(2) Basic data of kit In addition, in order to evaluate the precision and performance of the DiAcSpd measurement ELISA, two different types of control samples (Sample A and Sample B) were used, and the daily reproducibility was N = 10, and the values were reproduced daily. Sex was evaluated at N = 10. For intraday reproducibility, two different concentrations of urine samples were used, and during each day, each concentration sample was duplicated (n = 2 well = 1), and the DiAcSpd concentration measurement test was performed 10 times (n = 10) or more. For daily reproducibility, two different concentrations of urine samples were used, and each was duplicated (n = 2well = 1), and the DiAcSpd concentration measurement test was performed 10 times or more (10 days or more).
その結果、日内再現性は検体Aが変動係数（CV）=5.76%、検体BがCV=2.58%であり、日間再現性は検体AがCV=6.76%、検体BがCV=4.25%であった。このことから、本キットは、再現性においては十分信頼できるものであることが分かった（表４）。 As a result, intraday reproducibility was variability coefficient (CV) = 5.76% for sample A, CV = 2.58% for sample B, and daily reproducibility was CV = 6.76% for sample A and CV = 4.25% for sample B. It was. From this, it was found that this kit is sufficiently reliable in reproducibility (Table 4).
表４ 日内再現性と日間再現性 Table 4 Intraday and daily reproducibility
次に添加回収試験を行った。添加回収試験は、測定系の精度を評価するための試験である。例えば、作製しようとするDiAcSpd測定系において、測定しようとする検体に既知濃度のDiAcSpd（競合物質）を添加したものと、添加していないものの2種類を用意する。両者の濃度を比較し、得られたDiAcSpdの濃度差が実際の添加量と一致すれば、その結果から測定系が正確であると評価できる。 Next, an addition recovery test was conducted. The addition recovery test is a test for evaluating the accuracy of the measurement system. For example, in the DiAcSpd measurement system to be prepared, two types are prepared, one in which a known concentration of DiAcSpd (competitive substance) is added to the sample to be measured and the other in which no sample is added. If both concentrations are compared and the concentration difference of the obtained DiAcSpd matches the actual addition amount, it can be evaluated that the measurement system is accurate from the result.
本実施例で行った添加回収試験は、ELISA法で行い、標準曲線作成用のDiAcSpdの他に、測定試料として（A）既知濃度DiAcSpdを希釈したバッファーと尿検体の等量混合液、（Ｂ）既知濃度（200 nM）のDiAcSpd溶液と尿検体の等量混合液、（Ｃ）既知濃度（200 nM）のDiAcSpd溶液と希釈バッファーの等量混合液、の３種類を準備した。それぞれデュプリケート（n=2well＝1）としてn=3ずつ3濃度（尿検体×2倍希釈・×４倍希釈・×８倍希釈）で試験を実施した。（A）〜（C）のそれぞれの測定試料中のDiAcSpd濃度を算出した。回収率(%)は、算出したDiAcSpd濃度を用いて、（（B）−（A））÷C×100で求めた。 In addition to the DiAcSpd for preparing a standard curve, the addition recovery test performed in this example was performed by ELISA. (A) A mixed solution of an equal volume of a buffer diluted with a known concentration of DiAcSpd and a urine sample (B Three types were prepared: an equal mixture of a known concentration (200 nM) of DiAcSpd solution and a urine sample, and (C) an equal mixture of a DiAcSpd solution of known concentration (200 nM) and a dilution buffer. Each test was performed in duplicate (n = 2 well = 1), each with n = 3 in 3 concentrations (urine sample x 2-fold dilution, x 4-fold dilution, x 8-fold dilution). The DiAcSpd concentration in each measurement sample of (A) to (C) was calculated. The recovery rate (%) was calculated by ((B)-(A)) ÷ C × 100 using the calculated DiAcSpd concentration.
添加回収試験の結果、尿検体は2倍以上の希釈で回収率が96.3%〜108.4%と良好な試験結果が得られることが分かった（表５）。これにより、本発明の抗体を用いて、DiAcSpdを高い精度で測定できることが明らかになった。また、本発明の抗体を用いるDiAcSpd測定キットの精度は高いことが明らかになった。 As a result of the addition recovery test, it was found that the recovery rate of 96.3% to 108.4% of the urine sample was obtained at a dilution of 2 or more (Table 5). This revealed that DiAcSpd can be measured with high accuracy using the antibody of the present invention. It was also revealed that the DiAcSpd measurement kit using the antibody of the present invention has high accuracy.
表５ 添加回収試験 Table 5 Additive recovery test
また、本発明のキットの性能は、最低検出域は9.375 nM、好ましくは18.75nM、検体測定検出感度：37.5nM（18.75×2）となった。 The performance of the kit of the present invention was 9.375 nM, preferably 18.75 nM, and analyte measurement detection sensitivity: 37.5 nM (18.75 × 2).
さらに、DiAcSpd濃度の異なる2種の尿検体により、希釈性試験を行った。希釈性試験は、尿試料をスタンダード測定領域内の異なる濃度になるように2種類作製した（高濃度側と低濃度側の2種類にすることが望ましい。）。次に、作製した各尿検体の濃度をTop濃度とした尿検体の希釈を適宜行い（例えば6濃度）、その検体をデュプリケート（n=2well=1）として検体の測定を行った。縦軸：DiAcSpd濃度、横軸：希釈率でグラフを作成し、最後に得られた点を線形近似曲線によって結びR2値を算出した。 Furthermore, a dilution test was performed using two types of urine samples having different DiAcSpd concentrations. In the dilution test, two types of urine samples were prepared so as to have different concentrations in the standard measurement region (it is desirable to use two types of high concentration side and low concentration side). Next, the urine sample was diluted appropriately (for example, 6 concentrations) with the concentration of each prepared urine sample as the Top concentration, and the sample was measured using the sample as a duplicate (n = 2 well = 1). A graph was created with the vertical axis: DiAcSpd concentration and the horizontal axis: dilution rate, and the points obtained at the end were connected by a linear approximation curve to calculate the R 2 value.
その結果、いずれの検体においても良好な希釈曲線が得られた（図１１）。このことから、本発明のELISAキットが、尿中のDiAcSpdを高い精度で測定し得るものであることが示された。
As a result, a good dilution curve was obtained for any specimen (FIG. 11). From this, it was shown that the ELISA kit of the present invention can measure DiAcSpd in urine with high accuracy.
Claims (10)
The method according to claim 9, wherein the biological sample is urine or serum.
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