JP5850508B2 - Method for detecting cancer using soluble CD155 protein - Google Patents

Method for detecting cancer using soluble CD155 protein Download PDF

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和子 渋谷
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Description

本発明は、可溶型CD155タンパク質を指標として癌を検出する方法に関する。   The present invention relates to a method for detecting cancer using soluble CD155 protein as an index.

CD155は、ポリオウイルスのレセプターとして同定された免疫グロブリンスーパーファ
ミリーに属する接着分子であり(非特許文献1)、細胞外に免疫グロブリン様ドメインを
3個有する分子量70kDaの糖タンパク質である。CD155は、消化管上皮、パイエル板のM細胞
と胚中心、血球系ではミエロイド系細胞に発現しており(非特許文献2、3)、この発現
パターンから抗原提示細胞における機能が期待されるが、その機能はいまだ明らかにされ
ていない。
CD155 is an adhesion molecule belonging to the immunoglobulin superfamily that has been identified as a poliovirus receptor (Non-patent Document 1), and has an immunoglobulin-like domain outside the cell.
It is a glycoprotein with a molecular weight of 70 kDa that has three. CD155 is expressed in myeloid cells in the gastrointestinal epithelium, Peyer's patch M cells and germinal centers, and blood cells (Non-Patent Documents 2 and 3), and this expression pattern is expected to function in antigen-presenting cells. The function has not yet been revealed.

CD155は、ヒトにおいてはCD155α、CD155β、CD155γ及びCD155δの4つのアイソフォー
ムを持つことが知られている(非特許文献4)。αとδは膜貫通領域を持つ膜結合型(膜
型)であり、βとγは膜貫通領域を欠失することにより細胞外に分泌される可溶型である

可溶型CD155のmRNAは、ヒトの肝、肺、腎などの正常組織において発現している。また
、可溶型CD155タンパク質は、健常人の血清中で検出される(非特許文献5)。しかしな
がら、可溶型CD155のmRNAが種々の癌で発現されるかどうかはほとんど明らかになってお
らず、大腸癌において膜型CD155と可溶型CD155のmRNAの発現が認められるという報告が1
編あるのみである(非特許文献6)。また、マウスのCD155は膜型のみであり、可溶型の
アイソフォームが存在するという報告はない。
CD155 is known to have four isoforms of CD155α, CD155β, CD155γ and CD155δ in humans (Non-patent Document 4). α and δ are membrane-bound types (membrane types) having a transmembrane region, and β and γ are soluble types secreted outside the cell by deleting the transmembrane region.
Soluble CD155 mRNA is expressed in normal tissues such as human liver, lung and kidney. Soluble CD155 protein is detected in the serum of healthy individuals (Non-patent Document 5). However, it is hardly clear whether soluble CD155 mRNA is expressed in various cancers, and there is a report that expression of membrane CD155 and soluble CD155 mRNA is observed in colorectal cancer.
There is only a knitting (Non-Patent Document 6). In addition, mouse CD155 has only a membrane type, and there is no report that a soluble isoform exists.

また、CD155は、DNAM-1(CD226)のリガンドであることが明らかとなっている(非特許
文献7〜9)。DNAM-1は、本発明者らにより同定された免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属する接着分子である(非特許文献10)。DNAM-1は、細胞傷害性T細胞(CTL)やNK
細胞に発現し、癌細胞などに発現している膜型CD155等のDNAM-1リガンドを認識して接着
し、CTL及びNK細胞に細胞傷害活性を誘導することが明らかとなっている(非特許文献1
0、11)。しかしながら、可溶型のCD155の機能は明らかになっておらず、可溶型CD155
が腫瘍免疫(癌細胞に対する免疫機構)にどのように関与するかも明らかになっていない

さらに、可溶型CD155を標的とした癌の検出方法、治療方法等はこれまで報告されてい
ない。
Moreover, it has been clarified that CD155 is a ligand of DNAM-1 (CD226) (Non-Patent Documents 7 to 9). DNAM-1 is an adhesion molecule belonging to the immunoglobulin superfamily identified by the present inventors (Non-patent Document 10). DNAM-1 is a cytotoxic T cell (CTL) or NK
It has been revealed that DNAM-1 ligands such as membrane-type CD155 expressed on cells and cancer cells are recognized and adhered, and induce cytotoxic activity on CTL and NK cells (non-patented) Reference 1
0, 11). However, the function of soluble CD155 has not been clarified, and soluble CD155
It is also unclear how it participates in tumor immunity (immune mechanism against cancer cells).
Furthermore, no cancer detection method or treatment method targeting soluble CD155 has been reported so far.

Mendelsohn, C. L.et al., Cell 56, 855-865 (1989)Mendelsohn, C. L. et al., Cell 56, 855-865 (1989) Iwasaki, A. et al., J. Infect. Dis. 186, 585-592 (2002)Iwasaki, A. et al., J. Infect. Dis. 186, 585-592 (2002) Freistadt, M. S. et al., Virology 195, 798-803 (1993)Freistadt, M. S. et al., Virology 195, 798-803 (1993) Koike, S. et al., EMBO J. 9, 3217-3224 (1990)Koike, S. et al., EMBO J. 9, 3217-3224 (1990) Baury, B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 309, 175-182 (2003)Baury, B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 309, 175-182 (2003) Masson, D. et al., Gut 49, 236-240 (2001)Masson, D. et al., Gut 49, 236-240 (2001) Bottino, C. et al., J. Exp. Med. 198, 557-567 (2003)Bottino, C. et al., J. Exp. Med. 198, 557-567 (2003) Tahara-Hanaoka, S. et al., Int. Immunol. 16, 533-8 (2004)Tahara-Hanaoka, S. et al., Int.Immunol. 16, 533-8 (2004) Tahara-Hanaoka, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 996-1000 (2005)Tahara-Hanaoka, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 996-1000 (2005) Shibuya, A. et al., Immunity 4, 573-581 (1996)Shibuya, A. et al., Immunity 4, 573-581 (1996) Shibuya, A. et al., J. Immunol. 161, 1671-1676 (1998)Shibuya, A. et al., J. Immunol. 161, 1671-1676 (1998)

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明は、可溶型CD155タンパ
ク質を指標とした癌の検出方法を提供することを目的とする。
The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a cancer detection method using soluble CD155 protein as an index.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヒト癌細胞株、癌組織及び
癌患者血清を用いて、種々の癌における可溶型CD155の発現を解析し、さらに癌の病態と
の相関について検討した。その結果、進行癌患者の血清において可溶型CD155タンパク質
濃度が高値を示すことを見出した。また、生体内での可溶型CD155の機能を解析した結果
、可溶型CD155が癌細胞の腫瘍免疫逃避に関与することを見出した。本発明者らは、これ
らの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)採取された生体試料中の可溶型CD155タンパク質量又は可溶型CD155タンパク質をコ
ードする遺伝子の発現量を測定し、当該測定結果と癌の可能性とを関連づけることを特徴
とする、癌の検出方法。
(2)可溶型CD155タンパク質量の測定が、可溶型CD155タンパク質に対する抗体を用いて
行われるものである、上記(1)に記載の方法。
(3)生体試料が組織又は血液由来のものである、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)癌が、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、乳癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、
胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、肝癌、胆道癌、膵癌、腎癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌
、副腎癌、精巣癌、前立腺癌、悪性軟部腫瘍、悪性骨腫瘍、脳腫瘍、皮膚悪性腫瘍、白血
病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される少なくとも1種の癌である、上記(1)〜
(3)のいずれかに記載の方法。
(5)可溶型CD155タンパク質に対する抗体を含む、癌の治療用医薬組成物。
(6)抗体が、可溶型CD155タンパク質を中和する抗体である、上記(5)に記載の医薬
組成物。
(7)可溶型CD155タンパク質に対する抗体を含む、癌の検出用試薬。
(8)可溶型CD155タンパク質に対する抗体を含む、癌の検出用キット。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors conducted intensive research, analyzed the expression of soluble CD155 in various cancers using human cancer cell lines, cancer tissues and cancer patient sera, and further analyzed cancers. The correlation with the disease state was examined. As a result, it was found that the soluble CD155 protein concentration was high in the serum of patients with advanced cancer. Moreover, as a result of analyzing the function of soluble CD155 in vivo, it was found that soluble CD155 is involved in escape of tumor immunity of cancer cells. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
That is, the present invention is as follows.
(1) Measuring the amount of soluble CD155 protein or the expression level of a gene encoding soluble CD155 protein in the collected biological sample, and correlating the measurement result with the possibility of cancer, Cancer detection method.
(2) The method according to (1) above, wherein the amount of soluble CD155 protein is measured using an antibody against soluble CD155 protein.
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein the biological sample is derived from tissue or blood.
(4) Cancer is ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, lung cancer, esophageal cancer,
Gastric cancer, duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, renal cancer, renal pelvis / ureter cancer, bladder cancer, adrenal cancer, testicular cancer, prostate cancer, malignant soft tissue tumor, malignant bone tumor, brain tumor, skin (1) to (1) above, which are at least one cancer selected from the group consisting of malignant tumors, leukemias and malignant lymphomas.
The method according to any one of (3).
(5) A pharmaceutical composition for treating cancer comprising an antibody against soluble CD155 protein.
(6) The pharmaceutical composition according to (5) above, wherein the antibody is an antibody that neutralizes soluble CD155 protein.
(7) A reagent for detecting cancer, comprising an antibody against soluble CD155 protein.
(8) A cancer detection kit comprising an antibody against soluble CD155 protein.

本発明により、癌の検出方法を提供することができる。本発明は、被験者から採取され
た生体試料中の可溶型CD155タンパク質の量又は遺伝子の発現量が高確率で癌と関連する
ため、可溶型CD155を癌のマーカーとして利用することができる。従って、本発明の方法
は癌の検査に有用である。
According to the present invention, a method for detecting cancer can be provided. In the present invention, since the amount of soluble CD155 protein or gene expression level in a biological sample collected from a subject is associated with cancer with high probability, soluble CD155 can be used as a cancer marker. Therefore, the method of the present invention is useful for cancer screening.

DNAM-1(CD226)とDNAM-1リガンド(CD155及びCD112)の構造を示す図である。A: DNAM-1を示す。B: DNAM-1リガンド(CD155及びCD112)を示す。It is a figure which shows the structure of DNAM-1 (CD226) and a DNAM-1 ligand (CD155 and CD112). A: Shows DNAM-1. B: DNAM-1 ligand (CD155 and CD112) is shown. 腫瘍免疫におけるDNAM-1とDNAM-1リガンドの機能を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the function of DNAM-1 and DNAM-1 ligand in tumor immunity. 4種類のヒトCD155アイソフォームの構造を示す図である。It is a figure which shows the structure of four types of human CD155 isoform. 癌細胞株の可溶型CD155 mRNAの発現を解析した結果を示す図である。A: 設計したForwardプライマー及びReverseプライマーの結合位置を示す。B: 癌細胞株からmRNAを抽出してcDNAを合成し、PCRにてCD155の発現解析を行った結果を示す。It is a figure which shows the result of having analyzed the expression of soluble type CD155 mRNA of a cancer cell line. A: Shows the binding position of the designed forward primer and reverse primer. B: The result of extracting mRNA from a cancer cell line, synthesizing cDNA, and analyzing the expression of CD155 by PCR. 癌細胞株の可溶型CD155タンパク質の発現をsandwitch ELISAにより解析した結果を示す図である。A:ヒトCD155-ヒトIgG Fc融合タンパク質による標準曲線を示す。B: HeLa細胞株の培養上清における可溶型CD155タンパク質濃度を解析した結果を示す。It is a figure which shows the result of having analyzed the expression of soluble type CD155 protein of a cancer cell line by sandwitch ELISA. A: Standard curve with human CD155-human IgG Fc fusion protein. B: shows the result of analyzing the concentration of soluble CD155 protein in the culture supernatant of HeLa cell line. 癌組織の可溶型CD155 mRNAの発現を解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having analyzed the expression of soluble type | mold CD155 mRNA of a cancer tissue. 種々の癌患者の血清における可溶型CD155タンパク質濃度をsandwitch ELISAにより解析した結果を示す図である。図中の「Stage」とは、癌の進行度を示す。It is a figure which shows the result of having analyzed the soluble type | mold CD155 protein concentration in the serum of various cancer patients by sandwitch ELISA. “Stage” in the figure indicates the degree of progression of cancer. 癌患者の血清における可溶型CD155タンパク質の濃度を、手術前と後とで比較した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having compared the density | concentration of soluble CD155 protein in the serum of a cancer patient before and after an operation. 可溶型CD155産生腫瘍細胞の解析結果を示す図である。A: sandwitch ELISAにより、可溶型CD155タンパク質(CD155-FLAG融合タンパク質)の産生を解析した結果を示す。B: 作製した腫瘍細胞における膜型DNAM-1リガンドの発現をFACSにて解析した結果を示す。C: BrdUを用いて細胞増殖ELISAを行った結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result of a soluble type | mold CD155 production tumor cell. A: The result of analyzing the production of soluble CD155 protein (CD155-FLAG fusion protein) by sandwitch ELISA is shown. B: shows the results of FACS analysis of membrane-type DNAM-1 ligand expression in the prepared tumor cells. C: It is a figure which shows the result of having performed cell proliferation ELISA using BrdU. 生体内における可溶型CD155産生癌細胞の腫瘍免疫逃避を検討した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having examined the tumor immune escape of the soluble type | mold CD155 production cancer cell in the living body. 可溶型CD155による腫瘍免疫逃避に関する模式図である。It is a schematic diagram regarding tumor immune escape by soluble CD155.

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示で
あり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱
しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to this embodiment alone. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.

1.概要
本発明は、可溶型CD155タンパク質量又は遺伝子の発現量を測定し、可溶型CD155タンパ
ク質量又は遺伝子発現量を指標として、当該測定結果を癌と関連づけることにより、癌を
検出する方法である。また、本発明は、可溶型CD155タンパク質に対する抗体を含む、癌
の治療用医薬組成物等に関する。
可溶型CD155は、ヒトの正常組織においてそのmRNAの発現が認められ、また、健常人の
血清においてそのタンパク質の発現が認められているが、従来、ヒトの種々の癌によって
産生されるかどうかは明らかとなっていなかった。従って、生体試料中の可溶型CD155タ
ンパク質を測定したとしても、その測定結果が癌とどのように関係するかについては不明
であった。
本発明者らは、種々の癌患者の血清において、可溶型CD155のタンパク質量(濃度)が
健常人と比較して増加していることを見出した。また、可溶型CD155のタンパク質濃度は
、進行癌の患者において特に高い値を示すことを見出した。
また、本発明者らは、これまで不明であった可溶型CD155タンパク質の機能に着目し、
検討を行った結果、癌が腫瘍免疫により排除されることを回避(腫瘍免疫逃避)する上で
、可溶型CD155タンパク質が重要な役割を果たすことを見出した。そして、可溶型CD155を
抗体などで中和することにより、癌を腫瘍免疫により排除し、癌を治療し得ることを見出
した。
1. Outline The present invention is a method for detecting cancer by measuring the amount of soluble CD155 protein or gene expression, and using the amount of soluble CD155 protein or gene expression as an index and associating the measurement result with cancer. is there. The present invention also relates to a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an antibody against soluble CD155 protein.
Soluble CD155 has its mRNA expressed in normal human tissues, and its protein expression in healthy human serum, but has it been produced by various human cancers in the past? Was not clear. Therefore, even if soluble CD155 protein in a biological sample was measured, it was unclear how the measurement result was related to cancer.
The present inventors have found that the amount of protein (concentration) of soluble CD155 is increased in the sera of various cancer patients as compared to healthy individuals. Further, the present inventors have found that the protein concentration of soluble CD155 shows a particularly high value in patients with advanced cancer.
In addition, the present inventors focused on the function of soluble CD155 protein that has been unknown so far,
As a result of the examination, it was found that soluble CD155 protein plays an important role in avoiding cancer being excluded by tumor immunity (tumor immune escape). It was found that by neutralizing soluble CD155 with an antibody or the like, the cancer can be eliminated by tumor immunity and the cancer can be treated.

2.CD155
(1)CD155
CD155は、ポリオウイルスのレセプターとして同定された免疫グロブリンスーパーファ
ミリーに属する接着分子であり、細胞外に免疫グロブリン様ドメインを3個有する分子量7
0kDaの糖タンパク質である(図1B)。
CD155は、DNAM-1(CD226)のリガンドである。DNAM-1(図1A)は、細胞傷害性T細胞
(CTL)やNK細胞に発現し、癌細胞などに発現しているDNAM-1リガンド(膜型CD155等)を
認識して接着し、CTL及びNK細胞に細胞傷害活性を誘導する(図2)。
CD155は、ヒトにおいてはCD155α、CD155β、CD155γ及びCD155δの4つのアイソフォー
ムが知られており、CD155α(配列番号2)とCD155δ(配列番号8)は膜貫通領域を持つ
膜結合型(膜型)であり、CD155β(配列番号4)とCD155γ(配列番号6)は膜貫通領域
を欠失することにより細胞外に分泌される可溶型である(図3)。
マウスにおいては、膜型のCD155(配列番号10)のみが知られている。これらのタン
パク質をコードする遺伝子の塩基配列について、GenBankアクセッション番号を以下に示
す。
ヒトCD155α:NM006505(配列番号1)
ヒトCD155β:NM001135768(配列番号3)
ヒトCD155γ:NM001135769(配列番号5)
ヒトCD155δ:NM001135770(配列番号7)
マウスCD155(膜型):NM027514(配列番号9)
2. CD155
(1) CD155
CD155 is an adhesion molecule belonging to the immunoglobulin superfamily identified as a poliovirus receptor, and has a molecular weight of 7 having three immunoglobulin-like domains outside the cell.
It is a 0 kDa glycoprotein (FIG. 1B).
CD155 is a ligand for DNAM-1 (CD226). DNAM-1 (FIG. 1A) is expressed on cytotoxic T cells (CTL) and NK cells, and recognizes and adheres to DNAM-1 ligands (membrane type CD155, etc.) expressed on cancer cells. And induces cytotoxic activity in NK cells (FIG. 2).
CD155 is known to have four isoforms, CD155α, CD155β, CD155γ and CD155δ in humans, and CD155α (SEQ ID NO: 2) and CD155δ (SEQ ID NO: 8) are membrane-bound (membrane type) having a transmembrane region. CD155β (SEQ ID NO: 4) and CD155γ (SEQ ID NO: 6) are soluble forms secreted outside the cell by deleting the transmembrane region (FIG. 3).
In mice, only membrane-type CD155 (SEQ ID NO: 10) is known. GenBank accession numbers are shown below for the base sequences of the genes encoding these proteins.
Human CD155α: NM006505 (SEQ ID NO: 1)
Human CD155β: NM001135768 (SEQ ID NO: 3)
Human CD155γ: NM001135769 (SEQ ID NO: 5)
Human CD155δ: NM001135770 (SEQ ID NO: 7)
Mouse CD155 (membrane type): NM027514 (SEQ ID NO: 9)

(2)可溶型CD155タンパク質及び遺伝子
本発明において、可溶型CD155タンパク質とは、上記のCD155タンパク質の4つのアイソ
フォームのうち、膜貫通領域(膜型タンパク質のアミノ酸配列のうち344番目のアミノ酸
残基(アラニン)〜367番目のアミノ酸残基(トリプトファン)の領域)を欠失すること
により細胞外に分泌されるCD155β及びCD155γを意味し、可溶型CD155タンパク質をコー
ドする遺伝子とは、これらCD155β及びCD155γのタンパク質をコードする遺伝子を意味す
る。なお、遺伝子にはゲノムDNA、cDNA、mRNAが含まれる。これらのタンパク質及び遺伝
子の発現量又は濃度を、本発明において癌のマーカーとして利用する。
(2) Soluble CD155 protein and gene In the present invention, the soluble CD155 protein refers to the transmembrane region (the 344th amino acid of the amino acid sequence of the membrane protein) among the four isoforms of the CD155 protein. It means CD155β and CD155γ secreted extracellularly by deleting residues (alanine) to 367th amino acid residue (tryptophan), and these genes encoding soluble CD155 protein are these It means the gene encoding the protein of CD155β and CD155γ. The gene includes genomic DNA, cDNA, and mRNA. The expression levels or concentrations of these proteins and genes are used as cancer markers in the present invention.

3.可溶型CD155タンパク質の測定
(1)被験試料
本発明において使用される被験試料は、CD155タンパク質の測定に用いられる生体試料
であり、被験者から採取された生体試料であることが好ましい。このような生体試料とし
ては、例えば、被験者から採取された血液、腹水、組織、細胞、該細胞の培養上清等が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウ
ス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が
挙げられ、好ましくはヒトである。「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば
早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば胃癌、
大腸癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細
胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出
を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清
がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含ま
れ、そのような組織としては、例えば、卵巣、子宮、乳房、甲状腺、脳、食道、舌、肺、
膵臓、胃、小腸及び十二指腸、大腸、膀胱、腎臓、肝臓、前立腺、胆嚢、咽頭、筋肉並び
に皮膚等が挙げられる。細胞とは、前記被験者から採取された血液又は組織などの生体試
料に含まれる細胞及びこれを培養した細胞を意味する。なお、細胞の培養上清とは、前記
細胞の培養上清及び遠心上清を意味する。
3. Measurement of soluble CD155 protein (1) Test sample The test sample used in the present invention is a biological sample used for measurement of CD155 protein, and is preferably a biological sample collected from a subject. Examples of such biological samples include, but are not limited to, blood collected from a subject, ascites, tissue, cells, culture supernatant of the cells, and the like.
Examples of the “subject” in the present invention include mammals such as humans, rabbits, guinea pigs, rats, mice, hamsters, cats, dogs, goats, pigs, sheep, cows, horses, monkeys, and preferably humans. . When the “subject” is a human, the subject includes cancer patients, for example, patients with early cancer, patients with advanced cancer, and healthy individuals. Here, the early cancer is, for example, stomach cancer,
In the case of colorectal cancer and the like, the cancer cells remain in the mucosa layer or the submucosa, and the advanced cancer is distinguished from the patient based on the cancer cells reaching the intrinsic muscle layer or deeper layers. It is also possible to perform detection. Moreover, peripheral blood is preferable as the blood sample, and serum derived from peripheral blood is more preferable. In addition, tissues include cancerous tissues and normal tissues where cancer can occur, such as ovary, uterus, breast, thyroid, brain, esophagus, tongue, lungs,
Examples include pancreas, stomach, small intestine and duodenum, large intestine, bladder, kidney, liver, prostate, gallbladder, pharynx, muscle and skin. The cell means a cell contained in a biological sample such as blood or tissue collected from the subject and a cell obtained by culturing the cell. The cell culture supernatant means the cell culture supernatant and the centrifugal supernatant.

(2)可溶型CD155タンパク質量及び可溶型CD155タンパク質をコードする遺伝子の発現量
の測定
生体試料中の可溶型CD155タンパク質量の測定は、当分野において採用される任意のタ
ンパク質測定手法を用いて行うことができる。例えば、酵素免疫測定法(ELISA)、蛍光
免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫
比濁法又はウエスタンブロット法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、生体試料中の可溶型CD155タンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定は、例
えばRT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)法、定量RT-PCR法、
サザンブロット法、ノーザンブロット法などの公知の方法により行うことができる。サザ
ン又はノーザンブロット法により遺伝子の発現量を測定したときは、電気泳動後にデンシ
トメーターを用いてバンドの濃淡を数値に換算してもよい。
(2) Measurement of soluble CD155 protein amount and expression level of gene encoding soluble CD155 protein The measurement of the soluble CD155 protein amount in a biological sample can be performed by any protein measurement method employed in this field. Can be used. For example, enzyme immunoassay (ELISA), fluorescent immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunoturbidimetric method, Western blot method, etc. It is not limited to these.
In addition, measurement of the expression level of a gene encoding soluble CD155 protein in a biological sample can be performed by, for example, RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) method, quantitative RT-PCR method,
It can be performed by a known method such as Southern blotting or Northern blotting. When the gene expression level is measured by Southern or Northern blotting, the density of the band may be converted to a numerical value using a densitometer after electrophoresis.

可溶型CD155タンパク質量の測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定
法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンド
イッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合には固相化抗体及び標
識抗体のうち少なくとも1種が可溶型CD155タンパク質に対する抗体であればよい。
標識抗体とは、標識物質で標識された抗体を意味し、これらの標識抗体は、生体試料中
に含まれる抗原を検出または定量するために用いることができる。
本発明で用いることができる標識物質は、抗体に物理的結合又は化学的結合等により結
合させることによりそれらの存在を検出可能にするものであれば特に限定されるものでは
ない。標識物質の具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン
あるいは放射性同位体等が挙げられ、より具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−6−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、カタラー
ゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイ
ソチオシアネート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート等の蛍光物質、3H、14C、125I若しくは131I等の放射性同位体、ビオチン、アビ
ジン、または化学発光物質が挙げられる。標識物質と抗体との結合法は、グルタルアルデ
ヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用い
ることができる。
When measuring the amount of soluble CD155 protein by immunoassay using labeled antibodies such as enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay or luminescence immunoassay, sandwich method or competition In the sandwich method, at least one of the immobilized antibody and the labeled antibody may be an antibody against soluble CD155 protein.
The labeled antibody means an antibody labeled with a labeling substance, and these labeled antibodies can be used for detecting or quantifying an antigen contained in a biological sample.
The labeling substance that can be used in the present invention is not particularly limited as long as the presence of the labeling substance can be detected by binding to the antibody by physical binding or chemical binding. Specific examples of labeling substances include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin or radioisotopes, and more specifically, peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose -6
Phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, enzyme such as catalase, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate, 3 H, 14 C, 125 A radioactive isotope such as I or 131 I, biotin, avidin, or a chemiluminescent substance. A known method such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method or periodic acid method can be used for the method of binding the labeling substance and the antibody.

ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができ
るが、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをも
たらすことができないため、さらに1種以上の他の物質と反応することにより検出可能な
シグナルを生じる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測
定する方法(比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等)に依存して種々の基質
が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジン
を反応させるのが一般的である。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が
用いられる。
Here, radioisotopes and fluorescent materials can provide a detectable signal alone, but enzymes, chemiluminescent materials, biotin and avidin cannot provide a detectable signal by themselves, and therefore one more kind. Reaction with these other substances produces a detectable signal. For example, in the case of an enzyme, at least a substrate is required, and various substrates are used depending on a method for measuring enzyme activity (colorimetric method, fluorescence method, bioluminescence method, chemiluminescence method, etc.). In the case of biotin, at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted. Various color-developing substances depending on the substrate are used as necessary.

固定化抗体は、生体試料中に含まれる可溶型CD155タンパク質を検出、定量、分離又は
精製するために用いることができる。
抗体を固定化するために使用できる不溶性担体としては、例えば、(i)ポリスチレン
樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂又はナイロン樹脂等、(ii) ガラス、(iii)
セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体
、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔
性シリカ系担体等が挙げられる。これらの担体は、ビーズ、フィルター又はメンブレン等
の形態で、あるいはアフィニティークロマトグラフィー用の担体として使用することがで
きる。
The immobilized antibody can be used for detecting, quantifying, separating or purifying soluble CD155 protein contained in a biological sample.
Examples of insoluble carriers that can be used to immobilize antibodies include (i) polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, etc. (ii) glass, (iii)
Examples thereof include cellulose-based carriers, agarose-based carriers, polyacrylamide-based carriers, dextran-based carriers, polystyrene-based carriers, polyvinyl alcohol-based carriers, polyamino acid-based carriers, and porous silica-based carriers. These carriers can be used in the form of beads, filters, membranes or the like, or as carriers for affinity chromatography.

4.癌の検出方法
(1)癌の種類
本発明において検出の対象となる癌は、特に限定されるものではなく、例えば、卵巣癌
、子宮頚癌、子宮体癌、乳癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、
小腸癌、大腸癌、肝癌、胆道癌、膵癌、腎癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、副腎癌、精巣癌、
前立腺癌、悪性軟部腫瘍、悪性骨腫瘍、脳腫瘍、皮膚悪性腫瘍、白血病及び悪性リンパ腫
が挙げられる。
4). Cancer Detection Method (1) Types of Cancer The cancer to be detected in the present invention is not particularly limited. For example, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, thyroid cancer, head and neck cancer , Lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer,
Small intestine cancer, colon cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, renal cancer, renal pelvis / ureter cancer, bladder cancer, adrenal cancer, testicular cancer,
Examples include prostate cancer, malignant soft tissue tumor, malignant bone tumor, brain tumor, skin malignant tumor, leukemia and malignant lymphoma.

(2)癌の検出方法
可溶型CD155タンパク質は、種々の癌患者、特に進行癌の患者の血清において発現が増
加する。また、癌の手術後の可溶型CD155タンパク質量(濃度)は、癌の手術前と比較し
て有意に低下する。従って、生体試料中の可溶型CD155タンパク質又はこれをコードする
遺伝子は、癌を検出するための腫瘍マーカーとして用いることができる。すなわち、本発
明は、生体試料中の可溶型CD155タンパク質の量又は可溶型CD155タンパク質をコードする
遺伝子の発現量(以下、「可溶型CD155タンパク質量等」とも称する)を測定することを
含む、癌の検出方法を提供する。この場合、可溶型CD155タンパク質量等を指標として、
測定結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
(2) Cancer Detection Method Soluble CD155 protein increases in the sera of various cancer patients, particularly advanced cancer patients. In addition, the amount (concentration) of soluble CD155 protein after cancer surgery is significantly lower than that before cancer surgery. Therefore, soluble CD155 protein or a gene encoding the same in a biological sample can be used as a tumor marker for detecting cancer. That is, the present invention is to measure the amount of soluble CD155 protein in a biological sample or the expression level of a gene encoding soluble CD155 protein (hereinafter also referred to as “soluble CD155 protein amount”). A method for detecting cancer is provided. In this case, using the soluble CD155 protein amount as an index,
It is preferable to associate the measurement result with the possibility of cancer.

可溶型CD155タンパク質量等の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するため
には、血液試料中の可溶型CD155タンパク質量の臨界値(cut-off値)を定めることが望ま
しい。
可溶型CD155タンパク質量のcut-off値は、例えば、次のようにして求めることができる
。まず、癌患者由来の生体試料における可溶型CD155タンパク質量を測定する。このとき
対象となる患者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、100例
以上である。また、2例以上の健常者由来の生体試料における可溶型CD155タンパク質量も
測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は2例以上であり、例えば、5例以
上、10例以上、50例以上、100例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者
由来の生体試料群の両方を含む全体から、可溶型CD155タンパク質量のcut-off値を、統計
処理により求める。統計処理としては、例えば、Kaplan-Meier解析等が挙げられる。統計
解析を行うための症例は、癌の種類(例えば、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌、甲状
腺癌)、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さら
に、統計処理は、健常者の可溶型CD155タンパク質量の測定値と、癌患者において癌の種
類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときの可溶型CD155タン
パク質量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
In order to detect cancer by correlating the measurement results such as soluble CD155 protein amount with the possibility of cancer, it is necessary to determine the critical value (cut-off value) of soluble CD155 protein amount in the blood sample desirable.
The cut-off value of the soluble CD155 protein amount can be determined, for example, as follows. First, the amount of soluble CD155 protein in a biological sample derived from a cancer patient is measured. At this time, the number of patients to be targeted is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more. In addition, it is preferable to measure the amount of soluble CD155 protein in biological samples derived from two or more healthy subjects, and the number of healthy subjects to be tested is two or more, for example, five or more, 10 More than 50 cases, more than 100 cases, more than 100 cases. Then, the cut-off value of the soluble CD155 protein amount is obtained by statistical processing from the whole including both the biological sample group derived from cancer patients and the biological sample group derived from healthy individuals. Examples of statistical processing include Kaplan-Meier analysis. Cases for statistical analysis should be classified according to the type of cancer (eg, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, thyroid cancer), stage, presence / absence of recurrence, presence / absence of metastasis, and before / after surgery. You can also. Furthermore, statistical processing is based on the measurement of the amount of soluble CD155 protein in healthy subjects and soluble CD155 when classified by cancer type, stage, presence / absence of recurrence, presence / absence of metastasis, before and after surgery in cancer patients. It can also be performed by appropriately combining the measurement value of the protein amount.

本発明において、血液試料中の可溶型CD155タンパク質量の臨界値(cut-off値)は、血
清中濃度で、例えば、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、
16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、21 ng/ml、22 ng/ml、23 ng/ml、
24 ng/ml、25 ng/ml、26 ng/ml、27 ng/ml、28 ng/ml、29 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、
40 ng/ml、45 ng/ml、50 ng/ml、55 ng/ml、60 ng/ml、65 ng/mlである。
In the present invention, the critical value (cut-off value) of the amount of soluble CD155 protein in the blood sample is a serum concentration, for example, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml,
16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml, 20 ng / ml, 21 ng / ml, 22 ng / ml, 23 ng / ml,
24 ng / ml, 25 ng / ml, 26 ng / ml, 27 ng / ml, 28 ng / ml, 29 ng / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml,
40 ng / ml, 45 ng / ml, 50 ng / ml, 55 ng / ml, 60 ng / ml, 65 ng / ml.

上記条件下で可溶型CD155タンパク質量を測定した場合において、測定した可溶型CD155
タンパク質量が上記cut-off値以上であるときに、癌が検出されたと判定できる。本発明
においては、前記判定のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各
cut-off値以上であって、かつ所定上限値以下(例えば、200 ng/ml以下、190 ng/ml以下
、180 ng/ml以下、170 ng/ml以下、160 ng/ml以下、150 ng/ml以下、145 ng/ml以下、140
ng/ml以下、135 ng/ml以下、130 ng/ml以下)であるときに、癌を検出することができる
When the amount of soluble CD155 protein was measured under the above conditions, the measured soluble CD155
It can be determined that cancer has been detected when the amount of protein is equal to or greater than the cut-off value. In the present invention, an upper limit may be provided for the value of serum concentration for the determination.
Cut-off value or more and not more than a predetermined upper limit value (for example, 200 ng / ml or less, 190 ng / ml or less, 180 ng / ml or less, 170 ng / ml or less, 160 ng / ml or less, 150 ng / ml or less, 145 ng / ml or less, 140
Cancer can be detected when it is ng / ml or less, 135 ng / ml or less, 130 ng / ml or less).

本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ(確率)は、60%以上
、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、好ましくは99%以上である。
In the present invention, the probability (probability) of the detection result when cancer is detected is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, preferably 99% or more.

ここで、「検出」とは、可溶型CD155タンパク質量又は可溶型CD155タンパク質をコード
する遺伝子(例えばmRNA)の発現量を指標として、測定結果と癌とを関連づけることを意
味する。そして、このような測定結果は、(a)癌である可能性、(b)再発のリスク、(c)癌
の転移、(d)5年生存及び10年生存の可能性などの判断に結びつけるものである。従って、
検出の内容は、目的に応じて適宜使い分けることができる。例えば、被験者が健康診断を
目的とした場合は、上記(a)項目が主な判断の対象になり、被験者が癌の患者である場合
は、その予後を観察するために上記(b)、(c)、(d)項目が主な判断の対象になる。但し、
これらの内容は例示であり限定されるものではない。
Here, “detection” means associating a measurement result with cancer using as an index the amount of soluble CD155 protein or the expression level of a gene encoding soluble CD155 protein (eg, mRNA). These measurement results are linked to decisions such as (a) the possibility of cancer, (b) the risk of recurrence, (c) the metastasis of cancer, (d) the possibility of 5-year survival and 10-year survival. Is. Therefore,
The content of detection can be properly used according to the purpose. For example, when the subject is for the purpose of health checkup, the item (a) is a main judgment target, and when the subject is a cancer patient, the above (b), ( Items c) and (d) are subject to main judgment. However,
These contents are illustrative and are not limited.

さらに、本発明の別の態様において、一人の患者のサンプルから測定された可溶型CD15
5タンパク質量を上記cut-off値と比較することで癌との関連性を検出するほかに、複数の
患者由来の生体試料を用いて可溶型CD155タンパク質量等を測定する場合がある。従って
、上記cut-off値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団(1
次母集団)において上記可溶型CD155タンパク質量等を測定して統計解析処理し、これら
の集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能で
ある。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他
の集団(2次母集団)における検出の対象となる個々の被験者由来の試料における可溶型
CD155タンパク質量等とを比較することができる。
Furthermore, in another embodiment of the present invention, soluble CD15 measured from a single patient sample
In addition to detecting the relevance to cancer by comparing the amount of 5 protein with the above cut-off value, the amount of soluble CD155 protein or the like may be measured using biological samples derived from a plurality of patients. Therefore, in the same manner as the method for determining the cut-off value, a group including a predetermined number of healthy persons and patients (1
It is also possible to measure the amount of soluble CD155 protein and the like in the next population) and perform statistical analysis processing to divide into groups in which cancer is detected and groups in which subjects are not detected in subjects belonging to these groups. Furthermore, using the measurement values thus obtained as basic data, the soluble data in samples derived from individual subjects to be detected in this basic data and other populations (secondary population)
The amount of CD155 protein and the like can be compared.

あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んで可溶型CD155タンパ
ク質量等を再度データ処理し、対象となる患者(母集団)の例数を増やすこともできる。
例数を増やすことにより、可溶型CD155タンパク質量等の臨界値の精度を高め、これによ
り1人又は複数人の被験者における検出又は診断精度を高めることができる。
Alternatively, the data of each patient can be incorporated into the value of the population, and the amount of soluble CD155 protein and the like can be processed again to increase the number of target patients (population).
By increasing the number of examples, it is possible to increase the accuracy of critical values such as the amount of soluble CD155 protein, thereby increasing the detection or diagnosis accuracy in one or more subjects.

本発明においては、(i)被験者の生体試料における可溶型CD155タンパク質量等と、(ii)
健常者の生体試料における可溶型CD155タンパク質量等との比較を行うことも可能である

そして、前記(i)の場合の可溶型CD155タンパク質量等が、前記(ii)の場合の可溶型CD15
5タンパク質量等と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料における可溶型CD155タ
ンパク質量等の約10%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%
以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約100%以上高い場合に、癌が検出された
と判断できる。なお、ここで使用する「検出」の用語の意味は、前記と同様である。
In the present invention, (i) the amount of soluble CD155 protein in a biological sample of a subject, and (ii)
It is also possible to compare the amount of soluble CD155 protein in a biological sample of a healthy person.
And the amount of soluble CD155 protein in the case of (i) is the soluble CD155 protein in the case of (ii)
5 If the amount is higher than the amount of protein, for example, about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% of the amount of soluble CD155 protein in a biological sample of a healthy person About 60%
As mentioned above, it can be judged that cancer is detected when it is about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more. The meaning of the term “detection” used here is the same as described above.

上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は
補助資料とすることができる。
前述の通り、可溶性CD155タンパク質は各種癌患者において発現するため、健康診断等
において可溶性CD155タンパク質が検出されてもどの癌であるのか特定することができな
い。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌
種の特定や進行度を決定する(精密検査を行う)ための補助資料として使用することがで
きる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いて可溶性CD155タンパク質が
検出されたときは、癌種の主要資料(確定診断等)に利用することができる。なお、癌種
の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
The detection result can be, for example, main data or auxiliary data when performing a cancer test or a definitive diagnosis of a therapeutic effect.
As described above, since soluble CD155 protein is expressed in various cancer patients, it is not possible to identify which cancer it is even if soluble CD155 protein is detected in a health checkup or the like. Therefore, it can be used as an auxiliary material for evaluation of “suspected cancer” at a health checkup conducted in a group, etc., and later determining the type of cancer and determining the degree of progression (performing a close examination). In addition, when soluble CD155 protein is detected using a sample derived from a patient whose cancer type is suspected to some extent, it can be used for the main data (such as definitive diagnosis) of the cancer type. In addition, other tumor markers, image diagnosis, pathological diagnosis, and the like can be used for specifying the cancer type.

5.可溶型CD155タンパク質に対する抗体
(1)可溶型CD155タンパク質に対する抗体
本発明の抗体は、可溶型CD155タンパク質と特異的に結合する抗体を意味し、ポリクロ
ーナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、より具体的には、以下の(a)又は(b)の可溶型タンパク質に対する抗体
である。
(a)配列番号4又は6に示されるアミノ酸配列からなる可溶型タンパク質
(b)配列番号4又は6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつCD155受容体のタンパク質に結合
する活性を有する可溶型タンパク質
5. Antibody to soluble CD155 protein (1) Antibody to soluble CD155 protein The antibody of the present invention means an antibody that specifically binds to soluble CD155 protein, and even a polyclonal antibody is a monoclonal antibody. Also good.
More specifically, the antibody of the present invention is an antibody against the following soluble protein (a) or (b).
(a) A soluble protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6
(b) a soluble form comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6, and having an activity of binding to a protein of CD155 receptor protein

上記のとおり、本発明の可溶型CD155タンパク質には、配列番号4又は6に示されるア
ミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそ
れらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ、CD155受容体のタンパク質
に結合する活性を有する可溶型タンパク質も含まれる。
配列番号4又は6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠
失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列として
は、例えば、
(i) 配列番号4又は6で示されるアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ま
しくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失し
たアミノ酸配列、
(ii) 配列番号4又は6で示されるアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好
ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号4又は6で示されるアミノ酸配列に1〜9個(例えば、1〜5個、好ま
しくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加し
たアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
As described above, in the soluble CD155 protein of the present invention, one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6, or mutated by a combination thereof. A soluble protein having an amino acid sequence and having an activity of binding to a protein of CD155 receptor is also included.
In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6, as an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or mutated by a combination thereof, for example,
(i) 1 to 9 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 An amino acid sequence in which is deleted,
(ii) 1-9 (for example, 1-5, preferably 1-3, more preferably 1-2, still more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 An amino acid sequence substituted with other amino acids,
(iii) 1-9 (for example, 1-5, preferably 1-3, more preferably 1-2, still more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 Added amino acid sequence,
(iv) Amino acid sequences mutated by the combination of (i) to (iii) above.

本発明において、「CD155受容体のタンパク質に結合する活性」とは、CD155受容体のタ
ンパク質と特異的に結合する活性を意味する。当該結合活性の有無については、公知の方
法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、EIA(enzyme immunoassay)、ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay)などの免疫学的手法やプルダウンアッセイ等の方
法を用いることにより測定することができる。CD155受容体としては、限定されるもので
はないが、例えばDNAM-1(CD226)などが挙げられる。また、「CD155受容体のタンパク質
に結合する活性を有する」とは、配列番号4又は6に示されるアミノ酸配列からなる可溶
型タンパク質の活性を100としたときと比較して、少なくとも10%以上、20%以上、30%以
上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有する
ことを意味する。
In the present invention, the “activity to bind to a protein of CD155 receptor” means an activity to specifically bind to a protein of CD155 receptor. Regarding the presence or absence of the binding activity, known methods such as immunoprecipitation, Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), ELISA
It can be measured by using an immunological technique such as (enzyme-linked immunosorbent assay) or a method such as a pull-down assay. Examples of the CD155 receptor include, but are not limited to, DNAM-1 (CD226). Further, “having an activity of binding to the protein of CD155 receptor” means that at least 10% or more compared to when the activity of the soluble protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6 is 100 , 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more.

上記の変異を有するタンパク質を調製するためにDNAに変異を導入するには、Kunkel法
やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQ
uikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社製)、GeneTailorTM Sit
e-Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社製)、TaKaRa Site-Directed Muta
genesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて
行うことができる。
In order to introduce a mutation into DNA in order to prepare a protein having the above mutation, a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, such as Q
uikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Sit
e-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Muta
It can be performed using genesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.

本明細書においては、CD155タンパク質と特異的に結合する抗体を「抗CD155抗体」とも
称する。抗CD155抗体には、膜型CD155タンパク質に結合する抗体及び可溶型CD155タンパ
ク質に結合する抗体の両者が含まれるが、膜型CD155タンパク質には結合せず、可溶型CD1
55タンパク質に特異的に結合する抗体がより好ましい。
In the present specification, an antibody that specifically binds to CD155 protein is also referred to as “anti-CD155 antibody”. The anti-CD155 antibody includes both an antibody that binds to the membrane CD155 protein and an antibody that binds to the soluble CD155 protein, but does not bind to the membrane CD155 protein.
More preferred are antibodies that specifically bind to 55 protein.

また、本発明の抗体には、本発明の抗体が結合する抗原決定基(エピトープ)と結合す
る抗体も含まれる。抗原決定基はCD155タンパク質の全部又は一部の領域である。
本発明において、「特異的に結合する」とは、CD155タンパク質若しくはCD155ペプチド
には結合する(反応する)が、CD155タンパク質若しくはCD155ペプチド以外には結合しな
い(反応しない)ことを意味する。結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手
法、例えばELISA法、ウエスタンブロット法、又は免疫組織学的染色等によって確認する
ことができる。
The antibody of the present invention also includes an antibody that binds to an antigenic determinant (epitope) to which the antibody of the present invention binds. Antigenic determinants are all or part of the CD155 protein.
In the present invention, “specifically binds” means that it binds (reacts) to CD155 protein or CD155 peptide, but does not bind (reacts) other than CD155 protein or CD155 peptide. Confirmation of whether the binding is specific or not can be confirmed by immunological techniques such as ELISA, Western blotting, or immunohistological staining.

(2)抗体の製造
以下、抗CD155抗体の調製方法について説明する。
(2−1)抗原の調製
CD155は、本発明の抗体を作製するための免疫原として使用される。
本明細書において、「CD155」には膜型CD155及び可溶型CD155の両者が含まれるが、好
ましくは可溶型CD155である。また、免疫原としてCD155を用いる場合、膜型若しくは可溶
型CD155の全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することもできる。
ここで、抗原又は免疫原として用いられる可溶型CD155タンパク質及びその製造方法、
変異の導入方法等の説明については、上記「(1)可溶型CD155タンパク質に対する抗体
」に記載した通りである。
(2) Production of antibody Hereinafter, a method for preparing an anti-CD155 antibody will be described.
(2-1) Preparation of antigen
CD155 is used as an immunogen to generate the antibodies of the present invention.
In this specification, “CD155” includes both membrane-type CD155 and soluble-type CD155, preferably soluble-type CD155. When CD155 is used as an immunogen, a peptide containing a partial amino acid sequence of the full-length sequence of membrane-type or soluble-type CD155 can also be used.
Here, soluble CD155 protein used as an antigen or immunogen and a method for producing the same,
The explanation of the method for introducing the mutation and the like is as described in “(1) Antibody to soluble CD155 protein” above.

さらに、上記タンパク質は、マウス、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のCD15
5でもよいし、遺伝子工学的に生産されたCD155でもよい。例えば、CD155が認められる生
体試料を各種界面活性剤、例えばTriton-X、Sarkosylなどを用い、可溶性画分と不溶性画
分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例
えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりCD155を得ることができる
。また、抗原として用いるCD155は、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法な
どの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもでき
る。合成したペプチドは、Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)又はThyroglobulinなどの
担体タンパク質と結合させ、免疫原として用いることができる。
Furthermore, the above protein is a natural CD15 purified from tissues and cells such as mice and humans.
5 or CD155 produced by genetic engineering may be used. For example, a biological sample in which CD155 is observed is fractionated into a soluble fraction and an insoluble fraction using various surfactants such as Triton-X and Sarkosyl. Further, CD155 can be obtained by dissolving the insoluble fraction in urea, guanidine hydrochloride or the like and binding it to various columns such as a heparin column or a binding resin. In addition, CD155 used as an antigen can be synthesized using a known protein synthesis method such as a solid phase method or a commercially available protein synthesizer by designating its amino acid sequence. The synthesized peptide can be combined with a carrier protein such as Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) or Thyroglobulin and used as an immunogen.

(2−2)ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したCD155又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈
剤と共に温血動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与す
ることにより免疫する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないとき
は0.1〜10 mgであり、アジュバントを用いるときは0.1〜10 mgである。アジュバントとし
ては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水
酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔
内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週
間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜5回免疫を行う。免疫の間
隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3回〜4回皮下
免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の
測定は、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、EIA(enzyme immunoassay)、
放射性免疫測定法(RIA; radioimmuno assay)等によって行うことができる。抗体価が十
分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製するこ
とができる。例えば、目的の抗体を含有する血清を、CD155以外のタンパク質を結合した
カラムに通し、素通り画分を採取することにより、CD155、特に可溶型CD155に対する特異
性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
(2-2) Production of polyclonal antibody CD155 or partial peptide produced as described above is administered to a warm-blooded animal such as rabbit, dog, guinea pig, mouse, rat, goat, etc. by itself or together with a carrier and diluent. To immunize. The dose of the antigen per animal is 0.1 to 10 mg when no adjuvant is used, and 0.1 to 10 mg when an adjuvant is used. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 2 to 10 times, preferably 3 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 1 to 2 weeks. The interval between immunizations can be set in consideration of the antibody titer obtained by those skilled in the art. It is preferable to sample blood samples at the time of performing 3 to 4 subcutaneous immunizations and measure the antibody titer. The antibody titer in serum is measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay),
It can be performed by radioimmunoassay (RIA) or the like. After confirming that the antibody titer has risen sufficiently, whole blood is collected, and the antibody can be separated and purified by a conventional method. For example, a polyclonal antibody with improved specificity for CD155, particularly soluble CD155, can be obtained by passing serum containing the antibody of interest through a column bound with a protein other than CD155 and collecting the flow-through fraction. Can do.

(2−3)モノクローナル抗体の作製
(i) 抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したCD155又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希
釈剤と共に温血動物に投与することにより免疫する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、
アジュバントを用いないときは0.1〜10 mgであり、アジュバントを用いるときは0.1〜10
mgである。用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体
の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の
認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リ
ンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
(2-3) Preparation of monoclonal antibody
(i) Collection of antibody-producing cells CD155 or a partial peptide prepared as described above is immunized by administration to warm-blooded animals by itself or together with a carrier and a diluent. The dose of antigen per animal is
0.1-10 mg when no adjuvant is used, 0.1-10 when adjuvant is used
mg. The type of adjuvant used, the immunization method, and the immunization interval are the same as in the production of polyclonal antibodies. After 1 to 30 days, preferably 2 to 5 days after the final immunization day, an individual with an antibody titer is selected and antibody-producing cells are collected. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, with spleen cells or lymph node cells being preferred.

(ii) 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合
操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させる
ミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することが
できる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(
ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合
した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例え
ばPAI、P3U1、NSI/1-Ag4-1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミ
エローマ細胞株などが挙げられる。
(ii) Cell fusion Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed to obtain hybridomas. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler et al. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line used has drug selectivity, and in an unfused state, a HAT selection medium (
Those having the property of not being able to survive hypoxanthine, aminopterin and thymidine) and capable of surviving only in a state fused with antibody-producing cells are preferable. Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as PAI, P3U1, NSI / 1-Ag4-1, and NSO / 1, and rat myeloma cell lines such as YB2 / 0.

上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640
培地などの動物細胞培養用培地中で、1×108〜5×108個の抗体産生細胞と2×107〜10×10
7個のミエローマ細胞とを混合し(抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比10:1〜1:1
)、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量10
00〜6000ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することがで
きる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置
を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
Cell fusion between the above myeloma cells and antibody-producing cells is performed using serum-free DMEM, RPMI-1640.
1 × 10 8 to 5 × 10 8 antibody-producing cells and 2 × 10 7 to 10 × 10 in animal cell culture media such as media
Mix 7 myeloma cells (cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells 10: 1 to 1: 1)
), The fusion reaction is carried out in the presence of a cell fusion promoter. Average molecular weight of 10 as cell fusion promoter
00-6000 Dalton polyethylene glycol or Sendai virus can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).

(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細
胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイ
クロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3 個/well程度まき、各ウエルにHAT培
地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培
地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができ
る。
(iii) Selection and cloning of hybridoma The target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment. As the method, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, 10 to 20% fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then spread on a microtiter plate by a limiting dilution method to calculate about 0.3 cells / well. A selective medium such as HAT medium is added to the well, and then the selective medium is appropriately exchanged and cultured. As a result, cells that grow from about 10 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.

次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのス
クリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイ
ブリドーマを培養したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射
性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、96ウエルプレ
ートに抗原を吸着させた後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上
清を固相化した抗原に37℃で1時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgG
を37℃で1時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸
で反応を停止させた後、490nmの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニ
ングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、CD155、好
ましくは可溶型CD155に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイ
ブリドーマを樹立する。
Next, the grown hybridoma is further screened. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma is cultured can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Specifically, the antigen is adsorbed on a 96-well plate and then blocked with calf serum. Anti-mouse IgG labeled with peroxidase after reacting the hybridoma cell culture supernatant with the immobilized antigen at 37 ° C for 1 hour
Is allowed to react at 37 ° C. for 1 hour, and color is developed using orthophenylenediamine as a substrate. After stopping the reaction with an acid, screening can be performed by measuring the absorbance at a wavelength of 490 nm. A hybridoma producing a monoclonal antibody that is positive by the above-described measurement method is cloned by a limiting dilution method or the like. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that specifically binds to CD155, preferably soluble CD155, is established.

(iv) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培
養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマ
を10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中
で、通常の培養条件(例えば37℃、5% CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から
抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例
えばマウス(BALB/c)の腹腔内にハイブリドーマを約5×106 〜2×107個投与し、ハイブ
リドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方
法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又
はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
(iv) Collection of monoclonal antibody As a method of collecting a monoclonal antibody from an established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for 7 to 14 days and obtain antibody from the culture supernatant. In the case of the ascites formation method, about 5 × 10 6 to 2 × 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal, for example, a mouse (BALB / c). Let And ascitic fluid is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.

なお、ヒト型化抗体は、免疫原(抗原)をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳
動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。ヒト型化抗
体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公
知である(Nature Genetics 7: 13-21(1994); Nature Genetics 15: 146-156(1997)
等)。
A humanized antibody can be obtained by immunizing a human antibody-producing transgenic non-human mammal with an immunogen (antigen) and using an existing general antibody production method. Methods for producing humanized antibody-producing non-human mammals, particularly humanized antibody-producing transgenic mice are known (Nature Genetics 7: 13-21 (1994); Nature Genetics 15: 146-156 (1997)
etc).

(3)遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組
換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体 及びヒト化
抗体等が挙げられる。
(3) Preparation of gene recombinant antibody As one of the preferable embodiments of the antibody of the present invention, a gene recombinant antibody can be mentioned. Examples of the recombinant antibody include, but are not limited to, chimeric antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies.

キメラ抗体(すなわちヒト型キメラ抗体)は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の
定常領域に連結(接合)した抗体であり(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-685
5, (1984) 等を参照)、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよ
う、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
A chimeric antibody (ie, human chimeric antibody) is an antibody in which a variable region of a mouse-derived antibody is linked (conjugated) to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-685).
5, (1984), etc.), in the case of producing a chimera, it can be easily constructed by genetic recombination techniques so as to obtain an antibody linked in such a manner.

ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング(CDR移植)と呼ばれる手
法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性
決定領域(CDR)をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のも
のでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に
、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒ
ト型化抗体の作製法は、当分野において周知である(Nature, 321, 522-525 (1986);J.
Mol. Biol., 196, 901-917 (1987);Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
10029-10033 (1989);特許第2828340号公報等を参照)。
When producing a humanized antibody, a so-called CDR grafting (CDR grafting) method can be employed. CDR grafting refers to transplanting the complementarity determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody into a human variable region, the framework region (FR) is derived from a human and the CDR is derived from a mouse. This is a method for producing a configured variable region. These humanized reshaped human variable regions are then linked to human constant regions. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (Nature, 321, 522-525 (1986);
Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
10029-10033 (1989); see Japanese Patent No. 2828340).

ヒト化抗体(完全ヒト抗体)は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域(Hyper
Variable region)、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構
造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を
作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によっ
て作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝
子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka, K.et al.
, Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)
26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspe
cts,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academ
ic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727
等を参照)や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗
体を取得する方法(Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Sc
ience., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomic
s and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (20
02)109 (3), 427-431 等を参照)により取得することができる。
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若
しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、
ヒト化抗体を作製することができる。
Humanized antibodies (fully human antibodies) are generally hypervariable regions (Hyper
Variable region), other parts of the V region and the structure of the constant region have the same structure as a human antibody. However, the hypervariable site may be derived from another animal. Techniques for producing humanized antibodies are also known, and methods for producing gene sequences common to humans by genetic engineering techniques have been established. The humanized antibody can be obtained by, for example, a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the H chain and L chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al.
, Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et.al., Nuc. Acids Res., (1998)
26, 3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspe
cts, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academ
ic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727
Etc.) and methods of obtaining phage display-derived human antibodies selected from human antibody libraries (Wormstone, IMet.al, Investigative Ophthalmology & Visual Sc
ience., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomic
s and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (20
02) 109 (3), see 427-431 etc.).
In the present invention, a hybridoma or a DNA or RNA extracted from the hybridoma as a raw material, a chimeric antibody, a humanized antibody, according to the well-known method described above,
Humanized antibodies can be made.

(2)中和抗体
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、可溶型CD155タンパク質を中和する抗体が
挙げられる。ここで、中和とは、可溶型CD155タンパク質がそのレセプター(例えばDNAM-
1)に結合するのを阻害することをいう。
(2) Neutralizing antibody One preferred embodiment of the antibody of the present invention is an antibody that neutralizes soluble CD155 protein. Here, neutralization means that soluble CD155 protein has its receptor (eg, DNAM-
Inhibiting binding to 1).

6.医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を含有するものであり、癌の治療に有効である。
本発明の抗体は、可溶型CD155タンパク質を標的とする。可溶型CD155は、癌細胞が腫瘍
免疫により排除されるのを回避するために重要な役割を果たす。膜型CD155のみ発現する
癌細胞は、CTLやNK細胞に発現するDNAM-1と結合し、細胞傷害の標的となって排除される
。これに対し、可溶型CD155を発現する癌細胞は、産生した可溶型CD155がCTLやNK細胞に
発現するDNAM-1と結合し、膜型CD155とDNAM-1との結合を競合阻害する結果、細胞傷害の
標的とならず、排除されない(図11)。
従って、可溶型CD155を中和することができれば、癌細胞をCTLやNK細胞による細胞傷害
の標的とすることができるため、癌細胞を傷害することができる。
よって、本発明の癌の治療用医薬組成物に使用される抗体としては、前述の可溶型CD15
5を中和する抗体がより好ましい。
6). Pharmaceutical Composition The pharmaceutical composition of the present invention contains the antibody of the present invention and is effective for the treatment of cancer.
The antibody of the present invention targets soluble CD155 protein. Soluble CD155 plays an important role in avoiding cancer cells being eliminated by tumor immunity. Cancer cells that express only membrane-type CD155 bind to DNAM-1 expressed in CTL and NK cells and are eliminated as targets for cytotoxicity. In contrast, cancer cells expressing soluble CD155 bind to DNAM-1 expressed in CTL and NK cells, and competitively inhibit the binding of membrane CD155 and DNAM-1. As a result, it is not a target for cytotoxicity and is not excluded (FIG. 11).
Therefore, if soluble CD155 can be neutralized, cancer cells can be targeted for cytotoxicity by CTLs and NK cells, and thus cancer cells can be damaged.
Therefore, the antibody used in the pharmaceutical composition for the treatment of cancer of the present invention includes the aforementioned soluble CD15.
More preferred are antibodies that neutralize 5.

さらに、本発明の医薬組成物に用いられる抗体としては、例えば、ヒトキメラ抗体また
はヒト化抗体が挙げられる。
本発明の医薬組成物に用いられる抗体は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体ま
たは希釈剤等と共に投与することができ、またその投与は1回または数回に分けて行うこ
とができる。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤
、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤ある
いはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠
剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁
剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医
薬組成物は、経口又は非経口的に投与することができる。
Furthermore, examples of the antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention include a human chimeric antibody or a humanized antibody.
The antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention can be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and the administration can be performed once or divided into several times. .
As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners. , Flavoring agents, solubilizers or other additives. By using one or more of such carriers, pharmaceuticals in the form of tablets, pills, powders, granules, injections, solutions, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups, etc. A composition can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.

経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジ
カリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができ
る。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤と
しては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる
In the case of oral administration, various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate and glycine can be used together with a disintegrant, a binder and the like. Examples of the disintegrant include starch, alginic acid, and certain types of silicate double salts. Examples of the binder include polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, and gum arabic.

また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤
形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必
要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリ
ン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
Further, lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are very effective for tablet formation. When an aqueous suspension or elixir is used for oral administration, an emulsifier and a suspending agent may be used in combination, if necessary, and used with water, ethanol, propylene glycol, glycerin, etc., and diluents that combine them. .

非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常
法により処方される注射剤などが含まれる。
注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容さ
れる担体中に0.1μg抗体/ml担体〜10mg抗体/ml担体の濃度となるように溶解または懸濁す
ることにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要と
するヒト患者に対し、1回の投与において1kg体重あたり、10μg〜50mgの割合で、好まし
くは100μg〜2mgの割合で、1日あたり1回〜数回投与することができる。但し、この範
囲に限定されるものではなく、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得
る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与
間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い
投与量が適当なこともある。
Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods.
In the case of an injection, it is dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection to a concentration of 0.1 μg antibody / ml carrier to 10 mg antibody / ml carrier. It can be produced by becoming cloudy. The thus-prepared injection is administered to a human patient in need of treatment at a rate of 10 μg to 50 mg per kg body weight, preferably at a rate of 100 μg to 2 mg per day in a single administration. Can be administered several times to several times. However, it is not limited to this range, and may vary depending on the weight and symptoms of the patient and individual administration routes. The dose may vary depending on the sensitivity of the patient to be treated, the way the drug is prescribed, the period of administration, and the interval between doses. In some cases, a dose lower than the lower limit of the above range may be appropriate. .

投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好ましく
は静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤(例えばプロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコー
ル類など)、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無
菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行う
ことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶
解して使用することができる。
Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, and the like, preferably intravenous injection. In addition, injections can be prepared as non-aqueous diluents (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, or emulsions. Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation. The injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.

7.癌の検出用試薬及びキット
本発明は、可溶型CD155タンパク質に対する抗体を含む癌の検出用試薬を提供する。可
溶型CD155タンパク質に対する抗体の説明については、上記の通りである。本発明の試薬
は、前記抗体を単独で含むものであってもよいし、前記抗体のほか、適宜担体又は希釈剤
等を含むものであってもよい。担体及び希釈剤等の説明は上記のとおりである。
7). The present invention provides a reagent for detecting cancer comprising an antibody against soluble CD155 protein. The description of the antibody against the soluble CD155 protein is as described above. The reagent of the present invention may contain the antibody alone, or may contain a carrier or a diluent as appropriate in addition to the antibody. The explanation of the carrier, diluent and the like is as described above.

本発明の癌の検出用キットは、本発明の抗体を含むものである。ここで用いる抗体は、
上記した固定化抗体や標識抗体でもよい。例えば、本発明の抗体を一次抗体として使用す
る場合、本発明のキットには、抗原抗体結合反応により形成された複合体を検出するため
の二次抗体を含めてもよい。本発明のキットには、該キットを効率的かつ簡便に利用でき
るようにするために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてもよい。補助剤としては、
例えば固体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄するために使用さ
れる洗浄剤、抗体の標識物質として酵素を使用した場合に酵素活性を測定するための基質
、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常使用されるものが挙げられ
る。
The cancer detection kit of the present invention comprises the antibody of the present invention. The antibody used here is
The above-described immobilized antibody or labeled antibody may be used. For example, when the antibody of the present invention is used as a primary antibody, the kit of the present invention may include a secondary antibody for detecting a complex formed by an antigen-antibody binding reaction. The kit of the present invention may contain various auxiliary agents in addition to these antibodies so that the kit can be used efficiently and conveniently. As an adjuvant,
For example, a solubilizer for dissolving a solid secondary antibody, a detergent used for washing an insolubilized carrier, a substrate for measuring enzyme activity when an enzyme is used as an antibody labeling substance, and its reaction Examples of the kit used for the immunological measurement reagent such as a terminator are those usually used.

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.

1.材料及び方法
(1)癌組織、血清
癌組織、癌患者血清は、筑波大学大学院人間総合科学研究科医の倫理委員会にて承認さ
れた方法に従い、いずれも初発の卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、乳癌、甲状腺癌の患者よ
り同意を得て採取した。組織は手術摘出標本の一部を、血清は手術前と手術後約2週間の
血液を解析に用いた。また健常人血清は、健常人ボランティアより同意を得て採取した。
1. Materials and Methods (1) Cancer Tissue, Serum Cancer tissue, serum of cancer patients is the first ovarian cancer, cervical cancer, according to the method approved by the Ethics Committee of the Graduate School of Comprehensive Human Sciences, University of Tsukuba. Collected with consent from patients with endometrial cancer, breast cancer, and thyroid cancer. The tissue was part of the surgically removed specimen, and the serum was used for analysis before and 2 weeks after surgery. Healthy human serum was collected with consent from healthy volunteers.

(2)細胞
HeLa細胞株(ヒト子宮頚癌由来)、HOS細胞株(ヒト骨肉腫由来)、RD細胞株(ヒト横
紋筋肉腫由来)、U87MG細胞株(ヒト神経膠腫由来)はDMEM培地(Sigma-Aldrich)、10%
ウシ胎児血清(Biological Industries)、20U/mlペニシリン/0.5mg/mlストレプトマイ
シン(Sigma-Aldrich)、37℃、10%CO2環境下にて培養を行った。Jurkat細胞株(ヒト急
性T細胞性白血病由来)、Colo205細胞株(ヒト大腸癌由来)はRPMI培地(Sigma-Aldrich
)を用い、37℃、5%CO2環境下にて培養を行った。
ヒト可溶型CD155 sandwitch ELISA にて解析を行ったHeLa細胞株の培養上清は、12well
プレートに1wellあたりHeLa細胞株1×106個を1mlの培養液で培養し、24時間後、48時間後
の培養上清を採取した。
(2) Cells
HeLa cell line (derived from human cervical cancer), HOS cell line (derived from human osteosarcoma), RD cell line (derived from human rhabdomyosarcoma), U87MG cell line (derived from human glioma) are DMEM medium (Sigma-Aldrich) ),Ten%
Fetal bovine serum (Biological Industries), 20 U / ml penicillin / 0.5 mg / ml streptomycin (Sigma-Aldrich), cultured at 37 ° C. in a 10% CO 2 environment. Jurkat cell line (derived from human acute T-cell leukemia) and Colo205 cell line (derived from human colon cancer) are RPMI medium (Sigma-Aldrich)
) And 37 ° C. in a 5% CO 2 environment.
The culture supernatant of the HeLa cell line analyzed by human soluble CD155 sandwitch ELISA was 12 well.
On the plate, 1 × 10 6 HeLa cell lines per well were cultured in 1 ml of the culture solution, and the culture supernatant after 24 hours and 48 hours was collected.

(3)マウス、ウサギ
BALB/cマウスは8〜12週齢の雄を用い、チャールスリバーより購入した。JWウサギは3.0
kg、13〜14週齢の雌を用い、北山ラベスより購入した。SPF(specific pathogen free)
の環境下にて飼育し、筑波大学生命科学動物資源センターの規約に従った。
(3) Mouse, rabbit
BALB / c mice were 8-12 week old males purchased from Charles River. JW Rabbit is 3.0
Using a kg, 13-14 week old female, it was purchased from Kitayama Labes. SPF (specific pathogen free)
In accordance with the rules of the University of Tsukuba Life Science Animal Resource Center.

(4)PCR(polymerase chain reaction)
培養細胞、癌組織よりISOGEN(NIPPON GENE)を用いてプロトコールに従いmRNAを抽出
し、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用いて
プロトコールに従いcDNAを合成した。下記条件でPCRを行った。プライマーは
CD155 Forward: TCCTGTGGACAAACCAATCAACAC(配列番号11)
CD155 Reverse: GAGGCGCTGGCATGCTCTGT(配列番号12)
GAPDH Forward: CTTCACCACCATGGAGAAGGC(配列番号13)
GAPDH Reverse: GGCATGGACTGTGGTCATGAG(配列番号14)
(GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
を用い、PCRサイクル条件は、94℃にて5分変性後、94℃30秒、62℃30秒、72℃1分にて30
サイクル行った。
(4) PCR (polymerase chain reaction)
MRNA was extracted from cultured cells and cancer tissues using ISOGEN (NIPPON GENE) according to the protocol, and cDNA was synthesized using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) according to the protocol. PCR was performed under the following conditions. Primer is
CD155 Forward: TCCTGTGGACAAACCAATCAACAC (SEQ ID NO: 11)
CD155 Reverse: GAGGCGCTGGCATGCTCTGT (SEQ ID NO: 12)
GAPDH Forward: CTTCACCACCATGGAGAAGGC (SEQ ID NO: 13)
GAPDH Reverse: GGCATGGACTGTGGTCATGAG (SEQ ID NO: 14)
(GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
PCR cycle conditions were as follows: after denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 30 minutes at 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute
Cycled.

(5)ヒト可溶型CD155 sandwitch ELISA、抗体、タンパク質
96well黒色プレート(greiner bio-one)はマウス抗ヒトCD155抗体(TX24)2μg/ml、1
00 μl/wellを注入し4℃オーバーナイトでコートした。10%ウシ胎児血清200μl/wellを注
入し室温1時間でブロッキングした。0.05%Tween20で洗浄ののち、標準用ヒトCD155-ヒトI
gG Fc融合タンパク質、測定用細胞培養上清または血清を100μl/wellで3wellずつ注入し
、室温1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄ののち、ウサギ抗ヒトCD155血清5μg/ml
、100 μl/wellを注入し室温1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄ののち、HRP(horse
radish peroxidase)標識抗ウサギIgG抗体(GE Healthcare)2000倍希釈、100μl/wellを
注入し室温1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄ののち、QuantaBlu Working Solutio
n(PIERCE)100μl/wellを注入し遮光室温30分で反応させ、Stop Solution 100 μl/well
を注入し反応を停止させ、Spectra Max M2e(Molecular Devices)を用いて励起波長320n
m、測定波長430nmで蛍光強度を測定した。
(5) Human soluble CD155 sandwitch ELISA, antibody, protein
96 well black plate (greiner bio-one) is mouse anti-human CD155 antibody (TX24) 2μg / ml, 1
00 μl / well was injected and coated at 4 ° C. overnight. 10% fetal bovine serum (200 μl / well) was injected and blocked at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween20, standard human CD155-human I
A gG Fc fusion protein, a cell culture supernatant for measurement or serum was injected at a rate of 3 μl / well at 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween20, rabbit anti-human CD155 serum 5 μg / ml
100 μl / well was injected and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween 20, HRP (horse
radish peroxidase) -labeled anti-rabbit IgG antibody (GE Healthcare) 2000-fold diluted, 100 μl / well was injected and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween20, QuantaBlu Working Solutio
Inject 100 μl / well of n (PIERCE) and react at room temperature for 30 minutes in a dark place. Stop Solution 100 μl / well
To stop the reaction, excitation wavelength 320n using Spectra Max M2e (Molecular Devices)
m, fluorescence intensity was measured at a measurement wavelength of 430 nm.

マウス抗ヒトCD155抗体(TX24)は、本発明者らにより作製されたTX24ハイブリドーマ
クローンをヌードマウスの腹腔内に注射し、採取した腹水からカプリル酸を用いた塩析に
て精製することにより作製した。
上記TX24産生ハイブリドーマは、ヒトCD155を抗原として用いてBalb/cマウスに免疫し
た後、10〜30日後に当該マウスから脾臓またはリンパ節を採取し、脾臓細胞またはリンパ
節細胞とミエローマ細胞株とをペグチン等により融合し、さらに融合細胞から抗体産生ハ
イブリドーマをスクリーニングすることにより取得した。
ヒトCD155-ヒトIgG Fc融合タンパク質は、本発明者らにより作製されたヒトCD155-ヒト
IgG Fc発現ベクターを293T細胞にDEAE-Dextran法にて遺伝子導入し、培養上清中に産生さ
れたヒトCD155-ヒトIgG Fc融合タンパク質をProtein Aカラムを用いて精製した。
ウサギ抗ヒトCD155血清は、JWウサギ頸部にヒトCD155-ヒトIgG Fc融合タンパク質1mgを
complete freund’s adjuvantとまぜてエマルジョンにしたものを7日間おきに計3回皮下
注射し、オクタロニー法により抗体力価を確認したのち、全血採血を行い血清を得た。
The mouse anti-human CD155 antibody (TX24) was prepared by injecting the TX24 hybridoma clone prepared by the present inventors into the abdominal cavity of nude mice and purifying the collected ascites by salting out using caprylic acid. .
The TX24-producing hybridoma is obtained by immunizing Balb / c mice using human CD155 as an antigen, and collecting spleen or lymph nodes from the mice 10 to 30 days later, and spleen cells or lymph node cells and a myeloma cell line. Fused with pegtin or the like, and further obtained by screening antibody-producing hybridomas from the fused cells.
Human CD155-human IgG Fc fusion protein is a human CD155-human produced by the present inventors.
The IgG Fc expression vector was introduced into 293T cells by the DEAE-Dextran method, and the human CD155-human IgG Fc fusion protein produced in the culture supernatant was purified using a Protein A column.
Rabbit anti-human CD155 serum contains 1 mg of human CD155-human IgG Fc fusion protein on JW rabbit neck
An emulsion mixed with complete freund's adjuvant was injected subcutaneously every 7 days for a total of 3 times. After confirming the antibody titer by the octarony method, whole blood was collected to obtain serum.

(6)マウス可溶型CD155産生腫瘍細胞の作製
マウスCD155のcDNAからCD155の細胞外領域をPCRにより作製し、C末端3×FLAG融合タン
パク質の細胞外産生による安定発現用ベクターであるp3×FLAG-CMV-13 expression vecto
r(Sigma-Aldrich)に組み込み、CD155-3×FLAG発現ベクターを構築し、DMRIE-C(invitr
ogen)を用いてMethA細胞株に遺伝子導入した。Meth A細胞株はBALB/cマウスの腹腔内に
て継代したものを用いた。G418(Sigma-Aldrich)400μg/mlにより、導入遺伝子の安定発
現細胞を選択し、再びBALB/cマウスの腹腔内にて継代を行った。細胞の継代を行ったマウ
ス腹水中に、CD155-3×FLAG融合タンパク質が産生されていることをELISAにて確認した。
Mock細胞は、cDNAを組み込んでいないp3×FLAG-CMV-13 expression vectorを、同様にM
eth A細胞株に遺伝子導入して作製した。
(6) Production of mouse soluble CD155-producing tumor cells p3xFLAG, a vector for stable expression by producing the extracellular region of CD155 from cDNA of mouse CD155 by extracellular production of C-terminal 3xFLAG fusion protein -CMV-13 expression vecto
r (Sigma-Aldrich) and construct CD155-3 × FLAG expression vector, DMRIE-C (invitr
gene) into the MethA cell line. The Meth A cell line used was passaged intraperitoneally in BALB / c mice. Cells stably expressing the transgene were selected with G418 (Sigma-Aldrich) 400 μg / ml, and subcultured again in the peritoneal cavity of BALB / c mice. It was confirmed by ELISA that CD155-3 × FLAG fusion protein was produced in the ascites of mice that had undergone cell passage.
Mock cells can be expressed as p3 × FLAG-CMV-13 expression vector without cDNA.
The gene was introduced into the eth A cell line.

(7)マウス可溶型CD155 sandwitch ELISA、抗体
96well黒色プレート(greiner bio-one)はラット抗マウスCD155抗体(TX56)2μg/ml
、100 μl/wellを注入し4℃オーバーナイトでコートした。10%ウシ胎児血清200 μl/well
を注入し室温1時間でブロッキングした。0.05%Tween20で洗浄ののち、測定用マウス腹水
を100 μl/wellで3wellずつ注入し、室温1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄ののち
、マウス抗FLAG M2ビオチン化抗体(Sigma-Aldrich)1μg/ml、100μl/wellを注入し室温
1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄ののち、HRP標識ストレプトアビジン(GE Healt
hcare)2000倍希釈、100μl/wellを注入し室温1時間で反応させた。0.05%Tween20で洗浄
ののち、QuantaBlu Working Solution(PIERCE)100μl/wellを注入し遮光室温30分で反
応させ、Stop Solution 100μl/wellを注入し反応を停止させ、Spectra Max M2e(Molecu
lar Devices)を用いて励起波長320nm、測定波長430nmで蛍光強度を測定した。
ラット抗マウスCD155抗体(TX56)は本発明者らが作製した。具体的には、マウスCD155
を抗原として用いてWisterラットに免疫した後、10〜30日後に当該ラットから脾臓または
リンパ節を採取し、脾臓細胞またはリンパ節細胞とミエローマ細胞株とをペグチン等によ
り融合し、さらに融合細胞から抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることにより
TX56産生ハイブリドーマを取得した。TX56産生ハイブリドーマの培養上清をラット抗マウ
スCD155抗体(TX56)として用いた。
(7) Mouse soluble CD155 sandwitch ELISA, antibody
96 well black plate (greiner bio-one) is rat anti-mouse CD155 antibody (TX56) 2μg / ml
100 μl / well was injected and coated at 4 ° C. overnight. 10% fetal bovine serum 200 μl / well
Was blocked at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween 20, the measurement mouse ascites was injected in 3 wells at 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween 20, inject mouse anti-FLAG M2 biotinylated antibody (Sigma-Aldrich) 1μg / ml, 100μl / well at room temperature
The reaction was performed in 1 hour. After washing with 0.05% Tween20, HRP-labeled streptavidin (GE Healt
hcare) 2000-fold dilution, 100 μl / well was injected and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween20, inject 100 µl / well of QuantaBlu Working Solution (PIERCE) and react at room temperature for 30 minutes in the dark. Stop the reaction by injecting 100 µl / well of Stop Solution, and use Spectra Max M2e (Molecu
lar Devices) was used to measure fluorescence intensity at an excitation wavelength of 320 nm and a measurement wavelength of 430 nm.
The rat anti-mouse CD155 antibody (TX56) was prepared by the present inventors. Specifically, mouse CD155
10-30 days later, the spleen or lymph node is collected from the rat, and the spleen cell or lymph node cell and myeloma cell line are fused with pegtin or the like. By screening antibody-producing hybridomas
A TX56-producing hybridoma was obtained. The culture supernatant of TX56-producing hybridoma was used as a rat anti-mouse CD155 antibody (TX56).

(8)FACS(fluorescence activated cell sorter)、抗体
BALB/cマウスの腹腔内にて継代を行った可溶型CD155産生Meth A細胞(CD155-3×FLAG融
合タンパク質産生Meth A細胞)またはMock Meth A細胞を洗浄後、細胞浮遊液を1×106
/サンプルに調整し、一次抗体にて氷上で20分反応させ染色を行った。細胞を洗浄後、二
次抗体にて氷上で20分反応させ染色を行った。さらに細胞洗浄後、FACSにて解析を行った
。FACSはcalibur (Becton Dickinson) を用いた。サンプルの取り込み、解析は同社のプ
ロトコールに従って行った。一次抗体に使用した、ラット抗マウスCD155抗体(TX56)、
ラット抗マウスCD112抗体(TX78)は本発明者らが作製し、ビオチン化を行った。二次抗
体はストレプトアビジン-PE(phycoerythrin)(BD pharmingen)を使用した。
(8) FACS (fluorescence activated cell sorter), antibody
After washing the soluble CD155-producing Meth A cells (CD155-3 × FLAG fusion protein-producing Meth A cells) or Mock Meth A cells that were subcultured intraperitoneally in BALB / c mice, the cell suspension was washed 1 × 10 6 pieces / sample were prepared, and the reaction was carried out with the primary antibody on ice for 20 minutes for staining. The cells were washed and reacted with secondary antibody on ice for 20 minutes for staining. Further, the cells were washed and analyzed by FACS. FACS used calibur (Becton Dickinson). Sample uptake and analysis were performed according to the company's protocol. Rat anti-mouse CD155 antibody (TX56) used for the primary antibody,
The rat anti-mouse CD112 antibody (TX78) was prepared by the present inventors and biotinylated. As the secondary antibody, streptavidin-PE (phycoerythrin) (BD pharmingen) was used.

(9)細胞増殖ELISA
細胞増殖ELISAはCell Proliferation ELISA, BrdU(Roche)を用いて行った。BALB/cマ
ウスの腹腔内にて継代を行った可溶型CD155産生Meth A細胞(CD155-3×FLAG融合タンパク
質産生Meth A細胞)またはMock Meth A細胞を、96wellプレートに4×104〜3.1×102個を2
00μl/wellの培養液で、37℃、5%CO2環境下で培養した。BrdU標識溶液を20μl/well注入
し、20時間培養した。培養液を除いてプレートを乾燥させ、FixDenatを200μl/well注入
して室温30分で反応させ、細胞の固定とDNAの変性を行った。抗BrdU-POD反応液を100μl/
well注入して室温1時間で反応させた。洗浄液で洗浄ののち、基質液100 μl /wellを注入
して遮光室温5分で反応させ、0.5M H2SO4を注入して基質反応を停止させ、Spectra Max M
2e(Molecular Devices)を用いて波長450nmで吸光度を測定した。
(9) Cell proliferation ELISA
Cell proliferation ELISA was performed using Cell Proliferation ELISA, BrdU (Roche). Soluble CD155-producing Meth A cells (CD155-3 × FLAG fusion protein-producing Meth A cells) or Mock Meth A cells subcultured intraperitoneally in BALB / c mice, 4 × 10 4 to 96 well plate 3.1 × 10 2 pieces 2
The cells were cultured in a culture solution of 00 μl / well at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. BrdU labeling solution was injected at 20 μl / well and cultured for 20 hours. The culture solution was removed and the plate was dried. FixDenat was injected at 200 μl / well and reacted at room temperature for 30 minutes to fix cells and denature DNA. Anti-BrdU-POD reaction solution 100 μl /
Well injection was performed and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with the washing solution, inject 100 μl / well of the substrate solution and react at light-shielded room temperature for 5 minutes, inject 0.5MH 2 SO 4 to stop the substrate reaction, and use Spectra Max M
Absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using 2e (Molecular Devices).

(10)腫瘍移植実験
BALB/c雄マウスの背部に、腹腔内継代を行った可溶型CD155産生Meth A細胞(CD155-FLA
G融合タンパク質産生Meth A細胞)またはMock Meth A細胞を1匹あたり4×104個または8×
104個皮下注射し、腫瘍径とマウスの生存率を観察した。計測は1週間に2回行い、観察は
約60日間行った。
(10) Tumor transplantation experiment
Soluble CD155-producing Meth A cells (CD155-FLA) that were passaged intraperitoneally on the back of BALB / c male mice
G fusion protein producing Meth A cells) or Mock Meth A cells 4 × 10 4 or 8 ×
10 4 were injected subcutaneously, and the tumor diameter and the survival rate of the mice were observed. The measurement was performed twice a week and the observation was performed for about 60 days.

(11)統計
統計学的解析はunpaired t-testを用いて行った。P<0.05を有意差ありと判定した。
(11) Statistics Statistical analysis was performed using unpaired t-test. P <0.05 was determined to be significant.

2.結果
(1)ヒト癌細胞株の可溶型CD155の発現
ヒト癌細胞株の可溶型CD155のmRNAの発現を解析するため、CD155 Exon5にForwardプラ
イマー(配列番号11)、Exon7にReverseプライマー(配列番号12)を設計しPCRを行
った(図4A)。CD155はExon6に膜貫通領域を含み、可溶型CD155はこの膜貫通領域を欠
失している。可溶型CD155であるβは一部の細胞外領域を残してExon6を部分的に欠失、γ
はExon6を全部欠失するため、この条件下でPCRを行うと膜型CD155であるαは273bp、可溶
型CD155であるβは138bp、γは114bpのバンドを検出することができる。
検出の結果、Jurkat細胞株(ヒト急性T細胞性白血病由来)、Colo205細胞株(ヒト大腸
癌由来)、HeLa細胞株(ヒト子宮頚癌由来)、HOS細胞株(ヒト骨肉腫由来)、RD細胞株
(ヒト横紋筋肉腫由来)、U87MG細胞株(ヒト神経膠腫由来)ともCD155α、β、γのバン
ドを検出し、膜型と可溶型のCD155 mRNAの発現を認めた(図4B)。
この結果から、種々の癌(ヒトの急性T細胞性白血病、大腸癌、子宮頚癌、骨肉腫、横
紋筋肉腫、神経膠腫など)が可溶型CD155のmRNAを発現することが示された。また、生体
試料中の可溶型CD155タンパク質をコードする遺伝子のmRNA量を測定することにより、癌
の検出が可能であることが示された。
さらに、可溶型CD155タンパク質の発現を解析するため、本発明の抗体を用いてヒト可
溶型CD155 sandwitch ELISAを行い(図5A)、癌細胞株の可溶型CD155タンパク質の産生
をHeLa細胞株の培養上清を用いて解析したところ、可溶型CD155タンパク質の産生を検出
した(図5B)。
この結果から、癌細胞が含まれる生体試料には可溶型CD155タンパク質が産生されてい
ることが示された。また、生体試料中の可溶型CD155タンパク質の発現量を測定すること
により、癌の検出が可能であることが示された。
2. Results (1) Expression of soluble CD155 in human cancer cell line To analyze the expression of soluble CD155 mRNA in human cancer cell line, forward primer (SEQ ID NO: 11) for CD155 Exon5 and reverse primer (sequence) for Exon7 No. 12) was designed and PCR was performed (FIG. 4A). CD155 contains a transmembrane region in Exon6, and soluble CD155 lacks this transmembrane region. Β, a soluble CD155, partially lacks Exon6, leaving some extracellular region, γ
Since all of Exon6 are deleted, PCR under these conditions allows detection of a band of 273 bp for membrane CD155, 138 bp for soluble CD155, and 114 bp for γ.
As a result of detection, Jurkat cell line (derived from human acute T cell leukemia), Colo205 cell line (derived from human colon cancer), HeLa cell line (derived from human cervical cancer), HOS cell line (derived from human osteosarcoma), RD cell CD155α, β, and γ bands were detected in both the strain (derived from human rhabdomyosarcoma) and the U87MG cell line (derived from human glioma), and expression of membrane-type and soluble-type CD155 mRNA was observed (FIG. 4B). .
This result shows that various cancers (human acute T-cell leukemia, colon cancer, cervical cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, glioma, etc.) express soluble CD155 mRNA. It was. In addition, it was shown that cancer can be detected by measuring the amount of mRNA of a gene encoding soluble CD155 protein in a biological sample.
Furthermore, in order to analyze the expression of soluble CD155 protein, human soluble CD155 sandwitch ELISA was performed using the antibody of the present invention (FIG. 5A), and the production of soluble CD155 protein in the cancer cell line was determined using the HeLa cell line. As a result, the production of soluble CD155 protein was detected (FIG. 5B).
From this result, it was shown that soluble CD155 protein was produced in the biological sample containing cancer cells. Moreover, it was shown that cancer can be detected by measuring the expression level of soluble CD155 protein in a biological sample.

(2)癌組織、癌患者血清の可溶型CD155の発現
次に、癌組織の可溶型CD155のmRNAの発現と癌患者血清の可溶型CD155タンパク質の発現
を、前述と同様にPCRとsandwitch ELISAにて解析した。症例はいずれも初発癌である。
解析の結果、癌組織では、卵巣癌5例、子宮頚癌4例、子宮体癌7例の全ての症例におい
て膜型と可溶型のCD155 mRNAの発現を認めた(図6)。
この結果から、ヒトの癌患者から採取した癌組織において、可溶型CD155のmRNAが発現
することが示された。また、ヒトの癌患者から採取した生体試料中の可溶型CD155タンパ
ク質をコードする遺伝子のmRNA量を測定することにより、癌の検出が可能であることが示
された。
(2) Expression of Soluble CD155 in Cancer Tissue and Cancer Patient Serum Next, the expression of soluble CD155 mRNA in cancer tissue and the expression of soluble CD155 protein in cancer patient serum were determined by PCR as described above. Analyzed by sandwitch ELISA. All cases are primary cancers.
As a result of the analysis, in the cancer tissue, expression of membrane-type and soluble CD155 mRNA was observed in all cases of ovarian cancer, 4 cases of cervical cancer, and 7 cases of endometrial cancer (FIG. 6).
From these results, it was shown that soluble CD155 mRNA is expressed in cancer tissues collected from human cancer patients. In addition, it was shown that cancer can be detected by measuring the mRNA level of a gene encoding soluble CD155 protein in a biological sample collected from a human cancer patient.

また、癌患者血清の可溶型CD155タンパク質の濃度(発現量)は、卵巣癌15例、子宮頚
癌11例、子宮体癌12例、乳癌20例、甲状腺癌5例(計63例)を健常人血清(計22例)と比
較すると、卵巣癌と子宮体癌の患者血清については健常人血清より高い傾向がみられた(
図7)。また可溶型CD155タンパク質濃度と癌の病期との相関について検討すると、卵巣
癌や子宮体癌で認める可溶型CD155タンパク質濃度が非常に高値の症例は、進行癌の患者
血清であることが分かった(図7)。さらに、癌患者血清のうち23例について手術前と手
術後の可溶型CD155タンパク質濃度を解析すると、手術前と比較し手術後に有意に低下す
るという結果を得た(図8)。
これらの結果から、ヒトにおける種々の癌患者から採取した血清には可溶型CD155タン
パク質が産生されていることが示された。また、進行癌患者の血清において可溶型CD155
タンパク質濃度が非常に高い値を示したこと、並びに癌の手術後の血清において可溶型CD
155タンパク質濃度が有意に低下したことから、血清中の可溶型CD155タンパク質濃度と癌
の病期との間にはある程度の相関関係があることが示された。そして、この結果により、
血清等の生体試料中の可溶型CD155タンパク質量を測定し、その測定結果と癌とを関連づ
けることにより、癌の検出が可能であることが示された。また、可溶型CD155に対する抗
体は、癌の検出用試薬又はキットに用いることができることが示された。
In addition, the concentration (expression level) of soluble CD155 protein in the serum of cancer patients was 15 cases of ovarian cancer, 11 cases of cervical cancer, 12 cases of endometrial cancer, 20 cases of breast cancer, 5 cases of thyroid cancer (63 cases in total). Compared with healthy human serum (22 cases in total), ovarian cancer and endometrial cancer patient sera tended to be higher than normal human serum (
FIG. 7). In addition, when the correlation between soluble CD155 protein concentration and cancer stage was examined, cases with very high soluble CD155 protein concentration observed in ovarian cancer and endometrial cancer were patients with advanced cancer. Okay (Figure 7). Furthermore, analysis of soluble CD155 protein concentration before and after surgery for 23 cases of cancer patient sera yielded a result that it significantly decreased after surgery compared to before surgery (FIG. 8).
From these results, it was shown that soluble CD155 protein was produced in sera collected from various cancer patients in humans. In addition, soluble CD155 in the serum of patients with advanced cancer
The protein concentration was very high, and soluble CD in serum after cancer surgery
The significant decrease in 155 protein concentration indicated that there was some correlation between the soluble CD155 protein concentration in serum and the stage of cancer. And this result
It was shown that cancer can be detected by measuring the amount of soluble CD155 protein in a biological sample such as serum and correlating the measurement result with cancer. It was also shown that antibodies against soluble CD155 can be used in cancer detection reagents or kits.

(3)マウス可溶型CD155産生腫瘍細胞の作製
マウスCD155 cDNAの細胞外領域を、C末端3×FLAG融合タンパク質の細胞外産生による安
定発現用ベクター:p3×FLAG-CMV-13 expression vectorに組み込み、CD155-FLAG融合タ
ンパク質発現ベクターを構築し、Meth A細胞株に遺伝子導入して可溶型CD155産生Meth A
細胞(CD155-FLAG融合タンパク質産生Meth A細胞)を作製した。Mock Meth A細胞は、cDN
Aを組み込んでいないp3×FLAG-CMV-13 expression vectorを、同様にMeth A細胞株に遺伝
子導入して作製した。
可溶型CD155産生Meth A細胞及びMock Meth A細胞の双方をマウス腹腔内にて継代し、腹
水中のCD155-FLAG融合タンパク質をsandwitch ELISAにより測定した結果、可溶型CD155産
生Meth A細胞は腹水中にCD155-FLAG融合タンパク質を産生し、Mock Meth A細胞はCD155-F
LAG融合タンパク質を産生しないことを確認した(図9A)。
また可溶型CD155タンパク質産生の有無のほかに、可溶型CD155産生Meth A細胞とMock M
eth A細胞の性質に相違がないことを確認するため、細胞表面のCD155(膜型CD155)、CD1
12の発現をFACSにて解析した。
その結果、可溶型CD155産生Meth A細胞とMock Meth A細胞のいずれもCD155は高発現す
るがCD112は低発現であることを確認した(図9B)。つまり、可溶型CD155と膜型CD155
の両方を発現するMeth A細胞と、膜型CD155のみ発現するMeth A細胞を作製することがで
きた。
さらにin vitroにおける細胞増殖を細胞増殖ELISAにて解析し、可溶型CD155産生Meth A
細胞とMock Meth A細胞に差がないことを確認した(図9C)。
(3) Preparation of mouse soluble CD155 producing tumor cells The extracellular region of mouse CD155 cDNA is incorporated into a vector for stable expression by extracellular production of C-terminal 3 × FLAG fusion protein: p3 × FLAG-CMV-13 expression vector Constructed a CD155-FLAG fusion protein expression vector and introduced the gene into the Meth A cell line to produce soluble CD155-producing Meth A
Cells (CD155-FLAG fusion protein-producing Meth A cells) were prepared. Mock Meth A cells are cDN
Similarly, p3 × FLAG-CMV-13 expression vector without A was introduced into the Meth A cell line.
Both soluble CD155-producing Meth A cells and Mock Meth A cells were passaged intraperitoneally in mice, and as a result of measuring CD155-FLAG fusion protein in ascites by sandwitch ELISA, soluble CD155-producing Meth A cells were Produces CD155-FLAG fusion protein in ascites, Mock Meth A cells are CD155-F
It was confirmed that no LAG fusion protein was produced (FIG. 9A).
In addition to the presence or absence of soluble CD155 protein production, soluble CD155-producing Meth A cells and Mock M
Cell surface CD155 (membrane-type CD155), CD1 to confirm that there is no difference in the properties of eth A cells
The expression of 12 was analyzed by FACS.
As a result, it was confirmed that both soluble CD155-producing Meth A cells and Mock Meth A cells expressed CD155 at a high level but CD112 at a low level (FIG. 9B). In other words, soluble CD155 and membrane CD155
Both Meth A cells expressing both and Meth A cells expressing only membrane-type CD155 could be produced.
Furthermore, cell proliferation in vitro was analyzed by cell proliferation ELISA, and soluble CD155 producing Meth A
It was confirmed that there was no difference between the cells and Mock Meth A cells (FIG. 9C).

(4)生体内における可溶型CD155による腫瘍免疫逃避
作製した可溶型CD155産生Meth A細胞とMock Meth A細胞を、BALB/cマウスの背部に1匹
あたり4×104個または8×104個皮下注射し、腫瘍の大きさとマウス生存率を観察した。
その結果、可溶型CD155産生Meth A細胞の腫瘍は、全てのマウスにおいて増大を認めた
のに対し、Mock Meth A細胞は全てのマウスにおいて拒絶された。その結果、可溶型CD155
産生Meth A細胞4×104個を移植したマウスにおいては、移植後約50日で生存率0%、8×104
個を移植したマウスにおいては移植後約35日で生存率0%となったのに対し、Mock Meth A
細胞を移植したマウスの生存率は100%であった(図10)。
上記結果から、可溶型CD155は癌細胞が腫瘍免疫から逃避するために機能していること
が示された(図11)。このことは、可溶型CD155を本発明の抗体等で中和し、そのレセ
プターであるDNAM-1との結合を阻害することにより、癌細胞を腫瘍免疫により殺傷するこ
とが可能であり、その結果として癌を治療することができることを示す。より詳細なメカ
ニズムについての検討は、下記の「3.考察」に記載する。
(4) Tumor immune escape by soluble CD155 in vivo The prepared soluble CD155-producing Meth A cells and Mock Meth A cells were placed on the back of BALB / c mice at 4 × 10 4 cells or 8 × 10 6 cells per mouse Four mice were injected subcutaneously, and tumor size and mouse survival rate were observed.
As a result, tumors of soluble CD155-producing Meth A cells increased in all mice, whereas Mock Meth A cells were rejected in all mice. As a result, soluble CD155
In mice transplanted with 4 × 10 4 producing Meth A cells, the survival rate was 0%, 8 × 10 4 at about 50 days after transplantation.
In mice transplanted individually, the survival rate was 0% approximately 35 days after transplantation, whereas Mock Meth A
The survival rate of mice transplanted with cells was 100% (FIG. 10).
From the above results, it was shown that soluble CD155 functions to escape cancer cells from tumor immunity (FIG. 11). This is because it is possible to kill cancer cells by tumor immunity by neutralizing soluble CD155 with the antibody of the present invention and inhibiting the binding with its receptor, DNAM-1, As a result, it shows that cancer can be treated. A more detailed study of the mechanism is described in “3. Discussion” below.

3.考察
ヒトCD155は膜型と可溶型のアイソフォームがあるが、癌細胞の可溶型CD155の発現につ
いては、大腸癌において膜型と可溶型のCD155 mRNAの発現が認められるという報告が1編
あるのみであり、種々の癌における可溶型CD155の発現については未だ明らかではなかっ
た。
本実施例では、種々のヒト癌細胞株、卵巣癌組織、子宮頚癌組織、子宮体癌組織におい
て膜型と可溶型のCD155 mRNAの発現を認め、種々の癌において膜型と可溶型のCD155が発
現することを明らかにした。
次に、本実施例では、癌患者血清中の可溶型CD155濃度を健常人血清のものと比較する
と、卵巣癌と子宮体癌の患者血清については健常人血清より高い傾向がみられ、また可溶
型CD155タンパク質濃度が高値を示す症例は進行癌の患者血清であった。このことから可
溶型CD155タンパク質濃度は進行癌で高値を示す傾向が示された。
さらに手術前と比較し手術後に可溶型CD155タンパク質濃度が低下したという結果から
は、可溶型CD155タンパク質を産生していた癌を摘出したことにより、血清中の可溶型CD1
55タンパク質濃度が下がったことが考えられる。
以上より、癌患者、特に進行癌患者においては癌が可溶性CD155タンパク質の主要産生
源となることが示された。
3. Discussion Although human CD155 has both membrane and soluble isoforms, there is a report that the expression of soluble CD155 mRNA in cancer cells is found in membrane cancer and soluble CD155 mRNA in colorectal cancer. It was only edited, and the expression of soluble CD155 in various cancers was not yet clear.
In this example, expression of membrane-type and soluble CD155 mRNA was observed in various human cancer cell lines, ovarian cancer tissue, cervical cancer tissue, endometrial cancer tissue, and membrane-type and soluble-type in various cancers. Of CD155 was revealed.
Next, in this example, when the soluble CD155 concentration in the serum of cancer patients is compared with that of healthy human serum, the patient serum of ovarian cancer and endometrial cancer tends to be higher than that of healthy human serum, and Cases with high levels of soluble CD155 protein were patients with advanced cancer. This indicates that the soluble CD155 protein concentration tends to be high in advanced cancer.
Furthermore, from the results that the soluble CD155 protein concentration decreased after surgery compared to before surgery, it was found that the soluble CD1 in serum was removed by removing the cancer that produced soluble CD155 protein.
55 The protein concentration may have decreased.
These results indicate that cancer is a major source of soluble CD155 protein in cancer patients, particularly advanced cancer patients.

可溶性CD155の機能をさらに解析するため、マウス可溶型CD155産生腫瘍細胞を作製し、
マウスモデルを用いて研究を行った。本実施例では種々のヒトの癌は膜型と可溶型のCD15
5を発現することを明らかにしたが、作製したマウス可溶型CD155産生腫瘍細胞も、膜型CD
155と可溶型CD155の両方を発現する。従って、作製したマウス可溶型CD155産生腫瘍細胞
は、これらのヒトの癌細胞の性質を表しているといえる。
またこのマウスモデルの特徴として、(1)生体内における機能解析であること、(2
)可溶型CD155タンパク質をマウスに投与するなどではなく、マウスに移植した癌細胞が
可溶型CD155タンパク質を直接産生するため、癌の局所つまり微小環境における可溶型CD1
55の機能を解析できること、が挙げられる。これらのことより、本実施例で得られた結果
は腫瘍免疫における可溶型CD155の機能を表しているといえる。
可溶型と膜型のCD155を発現する可溶型CD155産生Meth A細胞は、全てのマウスにおいて
増大を認めたのに対し、膜型CD155のみ発現するMock Meth A細胞は全てのマウスにおいて
拒絶された。この結果から、次のように考察した。生体内において、膜型CD155のみを発
現する癌細胞はCTLやNK細胞に発現するDNAM-1の腫瘍免疫監視を受け、標的となって排除
される。一方で膜型CD155と可溶型CD155の両方を発現する腫瘍細胞は、産生した可溶型CD
155がCTLやNK細胞のDNAM-1に接着し、DNAM-1と膜型CD155の接着を阻害することにより、
腫瘍細胞がDNAM-1の腫瘍免疫監視から逃避し、排除されない。結果、膜型CD155のみ発現
する腫瘍細胞は拒絶され、可溶型と膜型のCD155を発現する腫瘍細胞は増殖すると考えら
れる(図11)。
In order to further analyze the function of soluble CD155, mouse soluble CD155 producing tumor cells were prepared,
A mouse model was used for the study. In this example, various human cancers are membrane type and soluble type CD15.
The mouse soluble CD155-producing tumor cells produced were also expressed as membrane-type CD.
It expresses both 155 and soluble CD155. Therefore, it can be said that the produced mouse soluble CD155-producing tumor cells represent the properties of these human cancer cells.
In addition, the mouse model is characterized by (1) functional analysis in vivo, (2
) Soluble CD1 in the local or microenvironment of cancer because soluble cells are directly produced by cancer cells transplanted into mice, rather than administering soluble CD155 protein to mice.
The ability to analyze 55 functions. From these results, it can be said that the results obtained in this example represent the function of soluble CD155 in tumor immunity.
Soluble CD155-producing Meth A cells expressing soluble and membrane-type CD155 showed an increase in all mice, whereas Mock Meth A cells expressing only membrane-type CD155 were rejected in all mice. It was. From this result, it considered as follows. In vivo, cancer cells that express only membrane-type CD155 undergo tumor immunity monitoring of DNAM-1 expressed in CTL and NK cells, and are eliminated as targets. On the other hand, tumor cells that express both membrane CD155 and soluble CD155
155 adheres to CTL and NK cell DNAM-1 and inhibits adhesion between DNAM-1 and membrane CD155,
Tumor cells escape from DNAM-1 tumor immune surveillance and are not excluded. As a result, tumor cells expressing only membrane-type CD155 are rejected, and tumor cells expressing soluble and membrane-type CD155 are considered to proliferate (FIG. 11).

本実施例では、可溶型CD155が免疫逃避に機能することを示した。また本実施例ではヒ
トの種々の癌に可溶型CD155が発現することを明らかにした。これらの癌が発癌する過程
において、癌細胞が産生した可溶型CD155は、免疫逃避に関与し、癌の発症につながって
いると考えられる。
In this example, it was shown that soluble CD155 functions for immune escape. In this example, it was clarified that soluble CD155 is expressed in various human cancers. In the process of carcinogenesis of these cancers, soluble CD155 produced by cancer cells is thought to be involved in immune escape and lead to the onset of cancer.

本発明の方法により、採取された生体試料中の可溶型CD155タンパク質を測定し、当該
測定結果を癌と関連づけることにより、癌を検出することができる。
According to the method of the present invention, cancer can be detected by measuring soluble CD155 protein in a collected biological sample and correlating the measurement result with cancer.

配列番号11:合成DNA
配列番号12:合成DNA
配列番号13:合成DNA
配列番号14:合成DNA
SEQ ID NO: 11: synthetic DNA
SEQ ID NO: 12: synthetic DNA
SEQ ID NO: 13: synthetic DNA
SEQ ID NO: 14: synthetic DNA

Claims (5)

膜型CD155タンパク質に結合せず、ヒト可溶型CD155タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、癌の治療用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising an antibody that does not bind to membrane-type CD155 protein but specifically binds to human soluble CD155 protein. 抗体が、ヒト可溶型CD155タンパク質を中和する抗体である、請求項1に記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the antibody is an antibody that neutralizes human soluble CD155 protein. 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項3に記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a humanized antibody. 癌が、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、乳癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、肝癌、胆道癌、膵癌、腎癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、副腎癌、精巣癌、前立腺癌、悪性軟部腫瘍、悪性骨腫瘍、脳腫瘍、皮膚悪性腫瘍、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される少なくとも1種の癌である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。   Cancer is ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, renal cancer, renal pelvis -It is at least one cancer selected from the group consisting of ureteral cancer, bladder cancer, adrenal cancer, testicular cancer, prostate cancer, malignant soft tissue tumor, malignant bone tumor, brain tumor, skin malignant tumor, leukemia and malignant lymphoma. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 4.
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