JP2007116935A - Composition for improving substrate specificity of pqqgdh - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法、該マルトースに対する作用性を低減したグルコース測定用組成物、グルコースセンサー、ならびに、それらの製造方法に関する。 In the present invention, a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having a modified amino acid sequence (hereinafter, pyrroloquinoline quinone is referred to as PQQ, glucose dehydrogenase is referred to as GDH, and pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase is also referred to as PQQGDH). The present invention relates to a method for reducing the action on maltose in glucose measurement including a reaction step, a composition for measuring glucose with reduced action on maltose, a glucose sensor, and a method for producing them.
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（本願では、ＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）である。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定はバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、血中グルコース濃度の測定に使用される酵素としてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。このようなＰＱＱＧＤＨとして例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した事例（たとえば、特許文献１を参照。）などが開示されている。
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待される反面、２糖類、特に、マルトースに作用するなどの基質特異性に問題があった。 A pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase catalyzes a reaction that oxidizes D-glucose to produce D-glucono-1,5-lactone, and is not affected by dissolved oxygen in the reaction system. Because it has enzyme properties that do not require addition, it is expected to have a wide range of uses such as blood glucose biochemical diagnostic agents as well as blood glucose sensors, but it has problems with substrate specificity such as acting on disaccharides, especially maltose. .
本発明者らは上記課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、一般的に血糖センサーで電子のメディエーターとして使用されるフェリシアン化物イオンに対する反応性が低いことがわかった。
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で基質特異性の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの基質特異性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、測定反応条件の観点から基質特異性を向上する手段については、その可能性すら触れられていなかった。
We further investigated this point and clarified that the reason why the reactivity to ferricyanide ion is low is that the buffer condition is influenced by substrate specificity near neutrality.
To date, there is Patent Document 2 as a report on a strategy for improving the substrate specificity of PQQGDH, in which studies using PQQGDH modification means at the gene level have been reported. The possibility of improving the performance was not even mentioned.
本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な基質特異性の改良策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、グルコース測定反応液組成を改良することによりＰＱＱＧＤＨの基質特異性を向上できることを明らかにし、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
［項１］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該酵素を、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、及びセリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上の存在下で反応させる工程を含む、グルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項２］
コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上の物質の添加量の合計が０．０５％（溶液中の重量％として）以上である、項１に記載の、グルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項３］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、項１または２に記載の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項４］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、項１〜３のいずれかに記載の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項５］
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、項４に記載の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項６］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、項３または５に記載の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項７］
グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、項６に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法。
［項８］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性を低減したグルコース測定用組成物。
［項９］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性を低減したグルコースセンサー。
［項１０］
コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性を低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
［項１１］
コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性を低減したグルコースセンサーの製造方法。
である。
The present inventors searched for a simpler measure for improving the substrate specificity from a viewpoint different from the past measures, and as a result of further diligent research, as a result of improving the glucose measurement reaction solution composition, the substrate of PQQGDH It was clarified that the specificity can be improved, and finally the present invention has been completed. That is, the present invention
[Claim 1]
In a glucose measurement method comprising a step of reacting a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having an amino acid sequence modified, the enzyme is succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, Diammonium hydrogen acid, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, α-ketoglutarate sodium, fumaric acid, glycine , Glutamic acid, and serine in the presence of any one or more selected from the group consisting of serine, a method for reducing the action on maltose in glucose measurement.
[Section 2]
Succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, The total addition amount of one or more substances selected from the group consisting of amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid and serine is 0.05% (in the solution Item 2. The method for reducing the action on maltose in glucose measurement according to Item 1, which is equal to or greater than (by weight%).
[Section 3]
Item 3. The modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having a modified amino acid sequence is a pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having reduced maltose activity as compared with the corresponding wild-type enzyme. A method for reducing the action on maltose in glucose measurement, which comprises the step of reacting a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase.
[Claim 4]
Item 1-3, wherein the step of reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase is performed in a reagent composition for measuring glucose containing the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase subjected to amino acid sequence modification. The method of reducing the effect | action with respect to maltose in glucose measurement including the process of making the modified pyrroloquinoline quinone dependence glucose dehydrogenase react in any one of these.
[Section 5]
Item 5. The activity for maltose is reduced in glucose measurement including the step of reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase according to Item 4, wherein the glucose measurement composition takes the form included in a glucose assay kit. Method.
[Claim 6]
The step of reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase is performed in a glucose sensor including the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having an amino acid sequence modified, and including an electrode having at least a working electrode and a counter electrode. Item 6. The method for reducing the action on maltose in glucose measurement, which comprises reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase according to Item 3 or 5.
[Claim 7]
The modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase according to Item 6, wherein the reaction in the glucose sensor is performed by applying a voltage to a reaction solution containing the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase and measuring the oxidation current of the mediator. A method for reducing the effect on maltose in glucose measurement including a step of reacting.
[Section 8]
Modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase with amino acid sequence modification, and succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, One selected from the group consisting of taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine A glucose measuring composition having reduced activity against maltose in a glucose measuring composition using one or more modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenases.
[Claim 9]
Modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase with amino acid sequence modification, and succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, One selected from the group consisting of taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine A glucose sensor having reduced activity against maltose in a glucose sensor using a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase, comprising one or more.
[Section 10]
Succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, A modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase comprising a step of containing at least one selected from the group consisting of amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine The manufacturing method of the composition for glucose measurement which reduced the effect | action with respect to maltose in the composition for glucose measurement using a potato.
[Section 11]
Succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, A modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase comprising a step of containing at least one selected from the group consisting of amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine A glucose sensor manufacturing method in which the action on maltose is reduced in a glucose sensor using the above.
It is.
本発明による基質特異性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサーでの測定精度の向上を可能にする。 The improvement in substrate specificity according to the present invention makes it possible to improve the measurement accuracy with glucose measurement reagents, glucose assay kits and glucose sensors.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の一実施形態は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該酵素を、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、及びセリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上の存在下で反応させる工程を含む、グルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減する方法である。 One embodiment of the present invention is a method for measuring glucose comprising a step of reacting a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having an amino acid sequence modified, wherein the enzyme comprises succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid , Potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, α- It is a method for reducing the action on maltose in glucose measurement, including a step of reacting in the presence of any one or more selected from the group consisting of sodium ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine.
本発明において、マルトースに対する作用性とは、ＰＱＱＧＤＨが当該糖基質を脱水素する作用を意味する。
さらに、マルトース以外にも、グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質に対する作用性が低下していてもよい。
グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質としては、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖類、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどの二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのオリゴ糖類、イコデキストリン（グルコースポリマー）などの多糖類（オリゴ糖類は２〜１０分子の単糖が、多糖類は１１分子以上の単糖がグリコシド結合などにより結合したものを意味し、それらの結合形態は問わない。）二糖類以上の場合はその構成はホモであってもヘテロであっても良い。）、さらには糖アルコール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコースなどそれらの誘導体が該当しうる。
上記の中でも特に、本発明のＰＱＱＧＤＨを糖尿病患者の臨床診断や血糖値コントロール等の目的で行われる血中グルコース濃度測定のために用いる際に問題となりうる、各種糖類が選択されることが好ましい。このような糖としては、マンノース、アロース、キシロース、ガラクトースまたはマルトースなどが挙げられ、さらに好ましくはガラクトース、ラクトースまたはマルトースが例示される。最も好ましくはマルトースが例示される。
ある糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、条件を変えて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
活性測定は、後述の試験例１に記載の活性測定法により行われる。
In the present invention, the action on maltose means the action of PQQGDH dehydrogenating the sugar substrate.
Furthermore, in addition to maltose, the activity on a selected sugar substrate other than at least one maltose other than glucose may be reduced.
At least one sugar substrate other than maltose other than glucose includes monosaccharides such as galactose, mannose, xylose, disaccharides such as sucrose, lactose, cellobiose, oligosaccharides such as maltotriose, maltotetraose, Polysaccharides such as icodextrin (glucose polymer) (oligosaccharide means 2 to 10 monosaccharides, polysaccharide means 11 or more monosaccharides linked by glycosidic bonds, etc. No.) In the case of disaccharides or more, the constitution may be homo or hetero. ), And derivatives thereof such as sugar alcohol, 2-deoxy-D-glucose, 3-o-methyl-D-glucose, and the like.
Among the above, it is preferable to select various saccharides that may cause problems when the PQQGDH of the present invention is used for blood glucose concentration measurement performed for the purpose of clinical diagnosis, blood glucose level control, etc. of diabetic patients. Examples of such sugars include mannose, allose, xylose, galactose or maltose, and more preferably galactose, lactose or maltose. Most preferably, maltose is exemplified.
Judgment whether the action with respect to a certain saccharide | sugar is falling is performed as follows.
In the activity measurement method described in Test Example 1 described later, when PQQGDH is used, PQQGDH activity value (a) when D-glucose is used as the substrate solution, and when the saccharide is used as the substrate solution instead of D-glucose The PQQGDH activity value (b) is measured, and a relative value ((b) / (a) × 100) with respect to the measured value when glucose is used as a substrate is set to 100. Next, the same operation is performed under different conditions, and the values are compared and judged.
The activity measurement is performed by the activity measurement method described in Test Example 1 described later.
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
例えば微生物では、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
また、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＮＣＩＭＢ１１５１７株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＩＦＯ１２５５２株、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＬＭＤ７９．４１株などから生産される（特許文献１、３、４）。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株は、分類当初はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓとされていた。
For example, in microorganisms, Acinetobacter baumannii (see, for example, Patent Document 1), Acinetobacter calcoaceticus (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2), Pseudomonas aeruginosa (see, for example, Patent Document 1). Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans (see Non-patent literature, etc.) Radiobacter (Agrobacterium) Dibacter), Escherichia coli (see, for example, Non-Patent Document 4), enterobacteria such as Klebsiella aerogenes, and Burkholderia cepacia. it can.
Moreover, for example, it is produced from Acinetobacter baumannii NCIMB11517 strain, Acinetobacter calcaceticus IFO12552 strain, Acinetobacter calcaceticus LMD79.41 strain, etc. (Patent Documents 1, 3, 4). In addition, Acinetobacter baumannii NCIMB11517 strain was originally regarded as Acinetobacter calcaceticus.
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
本発明の方法に用いる酵素は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼであることが好ましい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
PQQGDH applicable to the method of the present invention may have some other amino acid residues deleted or substituted to those exemplified above as long as it has glucose dehydrogenase activity. An amino acid residue may be added.
The enzyme used in the method of the present invention is a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having a modified amino acid sequence, which has a reduced maltose activity compared to the corresponding wild-type enzyme. Dehydrogenase is preferred.
Such modifications can be easily carried out by those skilled in the art using known techniques in the art. For example, various methods for substituting or inserting a base sequence of a gene encoding a protein in order to introduce a site-specific mutation into the protein are described in Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd edition (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
これらのＰＱＱＧＤＨは、たとえば東洋紡績製ＧＬＤ−３２１など市販のものを用いることが出来る。あるいは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
As these PQQGDH, for example, commercially available products such as GLD-321 manufactured by Toyobo Co., Ltd. can be used. Alternatively, it can be easily manufactured by those skilled in the art using known techniques in the technical field.
For example, the above-mentioned natural microorganisms producing PQQGDH, or the gene encoding natural PQQGDH as it is or after being mutated, are expressed vectors (many are known in the art. For example, plasmids ), And cultivates the transformant transformed into an appropriate host (many are known in the art. For example, E. coli), and recovers the cell from the culture by centrifugation. After that, the bacterial cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, a chelating agent such as EDTA or a surfactant is solubilized, and a water-soluble fraction containing PQQGDH. You can get minutes. Alternatively, the expressed PQQGDH can be secreted directly into the culture medium by using an appropriate host vector system.
The PQQGDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to let them know. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Further, purified PQQGDH can be obtained by performing gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
Before and after the above step, in order to improve the ratio of holo-type PQQGDH to the total GDH enzyme protein, a heat treatment of preferably 25 to 50 ° C., more preferably 30 to 45 ° C. may be performed.
本発明におけるＰＱＱＧＤＨの濃度は特に制約がない。 The concentration of PQQGDH in the present invention is not particularly limited.
ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１．０Ｍ（１．８ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ2， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１． ０．９ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２５．５ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
２．３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３．０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
４．５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分 間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り 返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト − ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
The enzyme activity of PQQGDH can be measured by the following method.
Method for measuring PQQGDH enzyme activity (1) Principle of measurement D-glucose + PMS + PQQGDH → D-glucono-1,5-lactone + PMS (red)
The presence of diformazan formed by the reduction of nitrotetrazolium blue (NTB) by 2PMS (red) + NTB → 2PMS + diformazan phenazine methosulfate (PMS) (red) was measured spectrophotometrically at 570 nm.
(2) Definition of Unit One unit refers to the amount of PQQGDH enzyme that forms 0.5 mmol of diformazan per minute under the conditions described below.
(3) Method Reagent A. D-glucose solution: 1.0 M (1.8 g D-glucose (molecular weight 180.16) / 10 ml H2O)
B. PIPES-NaOH buffer, pH 6.5: 50 mM (1.51 g of PIPES (molecular weight 302.36) suspended in 60 mL of water is dissolved in 5N NaOH and 2.2 ml of 10% Triton X-100 is added. The pH was adjusted to 6.5 ± 0.05 at 25 ° C. using 5N NaOH, and water was added to make 100 ml.)
C. PMS solution: 3.0 mM (9.19 mg phenazine methosulfate (molecular weight 817.65) / 10 ml H2O)
D. NTB solution: 6.6 mM (53.96 mg of nitrotetrazolium blue (molecular weight 817.65) / 10 ml H2O)
E. Enzyme dilution: 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 1 mM CaCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA
Procedure Prepare the following reaction mixture in a light-proof bottle and store on ice (prepared at the time of use)
1. 0.9 ml D-glucose solution (A)
25.5 ml PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) (B)
2.0ml PMS solution (C)
1.0ml NTB solution (D)
The concentrations in the assay mixture are as follows:
PIPES buffer 42 mM
D-glucose 30 mM
PMS 0.20 mM
NTB 0.22mM
2. 3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
3. Add 0.1 ml enzyme solution and mix by gentle inversion.
The increase in absorbance to water at 4.570 nm was recorded for 4-5 minutes with a spectrophotometer while maintaining at 37 ° C., and ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
At the same time, a blank (ΔOD blank) was measured by repeating the same method except that the enzyme diluent (E) was added instead of the enzyme solution.
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in an ice-cold enzyme diluent (E) and diluted to 0.1-0.8 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme) Is preferred).
Calculation Activity is calculated using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (20.1 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.1 ml)
Vs: Sample volume (0.1 ml)
20.1: 1/2 mmol molecular extinction coefficient of diformazan 1.0: optical path length (cm)
df: Dilution factor C: Enzyme concentration in solution (c mg / ml)
本発明の方法に用いる、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、及びセリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上の物質は、いずれも市販品の試薬などを用いることができる。
これらは、以上の群より選ばれるいずれか１つ以上の物質の添加量の合計が０．０５％（溶液中の重量％として）以上であることが好ましい。なお、ここでいう「溶液」には、グルコースセンサーを製造する際の、グルコースデヒドロゲナーゼを溶液中に溶解する工程における溶液も含まれる。
物質の供給形態としては、液体、固体を挙げることができる。中でも乾燥粉末が好ましい。また、粉末組成物において、緩衝液の含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．１％〜１０％であることが望ましく、さらに好ましくは０．２％〜５％、さらに好ましくは０．２％〜２％である。
Succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid used in the method of the present invention , Glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine, any one or more substances are commercially available These reagents can be used.
It is preferable that the total addition amount of any one or more substances selected from the above group is 0.05% (as% by weight in the solution). Here, the “solution” includes a solution in the step of dissolving glucose dehydrogenase in the solution when the glucose sensor is produced.
Examples of the substance supply form include liquid and solid. Of these, dry powder is preferred. In the powder composition, the content of the buffer solution (W / W) is desirably 0.1% to 10%, more preferably 0.2% to 5%, and still more preferably 0.2%. ~ 2%.
本発明の方法は、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含んでもよい。
さらに、当該グルコース測定用組成物が、グルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含んでもよい。
According to the method of the present invention, the step of reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase is performed in a reagent composition for measuring glucose containing the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase subjected to amino acid sequence modification. May be included.
Furthermore, the composition for measuring glucose may include taking the form included in the glucose assay kit.
本発明の方法は、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含んでもよい。
さらに、当該グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、請求項６に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含んでもよい。
In the method of the present invention, the step of reacting the modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase comprises an altered pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having an amino acid sequence modified, and comprises at least a working electrode and a counter electrode May be included in a glucose sensor including
Furthermore, the reaction in the said glucose sensor applies a voltage to the reaction solution containing modified pyrroloquinoline quinone dependence glucose dehydrogenase, and measures the oxidation current of a mediator, The modified pyrroloquinoline quinone dependence of Claim 6 A step of reacting sex glucose dehydrogenase.
さらに本発明は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性を低減したグルコース測定用組成物、あるいは、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性を低減したグルコースセンサーである。
組成物の形態は、液状などの水性組成物（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができるが特に限定されない。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明の酵素を含む組成物がグルコースセンサーの一部を構成する場合においても、同様に、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
Furthermore, the present invention relates to a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase having a modified amino acid sequence, and succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid , L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, serine A glucose measurement composition having reduced activity against maltose in a glucose measurement composition using a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase, comprising one or more selected from the above, or a modified pyrroloquinoline quinone It is a glucose sensor in which the action on maltose is reduced in a glucose sensor using a dependent glucose dehydrogenase.
The form of the composition can take various forms such as an aqueous composition such as a liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powdered by vacuum drying or spray drying, freeze drying, etc., but is not particularly limited. The lyophilization method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the lyophilized product is redissolved.
Similarly, when the composition containing the enzyme of the present invention constitutes a part of a glucose sensor, it is similarly liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powdered by vacuum drying, spray drying, etc. It can take the form of The lyophilization method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the lyophilized product is redissolved.
さらに本発明は、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、セリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性を低減したグルコース測定用組成物の製造方法、あるいは、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性を低減したグルコースセンサーの製造方法である。 Furthermore, the present invention provides succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid, glutar Modified pyrroloquinoline comprising a step of containing at least one selected from the group consisting of acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, sodium α-ketoglutarate, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine A method for producing a glucose measurement composition having reduced activity against maltose in a glucose measurement composition using a quinone-dependent glucose dehydrogenase, or a glucose sensor using a modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase. This is a method for producing a glucose sensor with reduced action on lactose.
本発明の方法において測定時に、種々のバッファーを用いることが出来る。緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。例えばトリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、グルタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩などやＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液などがあげられる。
但し、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。
このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。中でもｐＨ６〜７に緩衝能をもつＰＩＰＥＳなどが好ましい。また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましく、さらに好ましくは５％〜１０％である。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
これらのバッファーは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。
In the method of the present invention, various buffers can be used at the time of measurement. Any buffering agent that is generally used may be used, and usually the buffering agent having a pH of 5 to 10 is preferable. For example, tris hydrochloric acid, boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phthalic acid, glutaric acid, maleic acid, glycine and their salts, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, Good buffer solutions such as MOPS, TES, and HEPES.
However, a buffer solution that does not form an insoluble salt with calcium is preferred. Those which form an insoluble salt with calcium such as a phosphate buffer are not preferred. Those having an amino group end such as trisaminomethane are not preferable because the PQQ bond of PQQ-dependent glucose dehydrogenase is unstable.
For this reason, more preferably as a buffering agent, a buffering agent such as boric acid or acetic acid, BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, EPPS, HEPES, HEPPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES Good buffer such as Tricine. Among these, PIPES having a buffer capacity at pH 6 to 7 is preferable. Further, in the powder composition, the content (W / W) of the buffering agent is desirably 1.0% to 50%, and more preferably 5% to 10%.
Of these, only one type may be applied, or two or more types may be used. Furthermore, one or more composite compositions including those other than the above may be used.
In addition, the concentration of these additives is not particularly limited as long as it has a buffer capacity, but the preferable upper limit is 100 mM or less, more preferably 50 mM or less. A preferred lower limit is 5 mM or more.
The content of the buffering agent in the lyophilized product is not particularly limited, but is preferably 0.1% (weight ratio) or more, particularly preferably 0.1 to 30% (weight ratio). used.
These can use various commercially available reagents.
These buffers may be added at the time of measurement, or may be contained in advance when a glucose measuring reagent, a glucose assay kit, or a glucose sensor described later is prepared. In this case, the liquid state, the dry state, etc. are not limited, and it is sufficient to function at the time of measurement.
本発明でいう基質特異性の向上とは、ＰＱＱＧＤＨ酵素のグルコースに対する反応性がグルコース以外の糖類に対する反応性よりも向上することを意味する。グルコース以外の糖類としては、特に二糖類のマルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことも、基質特異性の向上と表現する。
二糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、ＰＱＱＧＤＨ酵素を用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。
The improvement of substrate specificity as used in the present invention means that the reactivity of the PQQGDH enzyme to glucose is improved compared to the reactivity to saccharides other than glucose. Examples of saccharides other than glucose include disaccharides such as maltose, sucrose, lactose and cellobiose, and particularly maltose. In the present invention, a decrease in the activity on disaccharides is also expressed as an improvement in substrate specificity.
Judgment whether the action with respect to a disaccharide has fallen is performed as follows.
In the activity measurement method described in Test Example 1 described later, using the PQQGDH enzyme, the PQQGDH activity value (a) when D-glucose is used as the substrate solution, and the disaccharide instead of D-glucose is used as the substrate solution. The PQQGDH activity value (b) is measured, and a relative value ((b) / (a) × 100) with respect to the measured value when glucose is used as a substrate is set to 100 is obtained.
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
The effect of the present invention becomes more remarkable in a system including a mediator. The mediator applicable to the method of the present invention is not particularly limited, but a combination of phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP), a combination of PMS and nitroblue tetrazolium (NBT), or DCPIP alone And ferricyanide ions (such as potassium ferricyanide as a compound) alone, ferrocene alone and the like. Of these, ferricyanide ions (such as potassium ferricyanide) are preferable.
Since there are various differences in sensitivity among these mediators, it is not necessary to uniformly define the concentration of addition, but in general, addition of 1 mM or more is desirable.
These mediators may be added at the time of measurement, or may be contained in advance when a glucose measuring reagent, a glucose assay kit, or a glucose sensor described later is prepared. In this case, the liquid state, the dry state, and the like are not limited, and it is only necessary to dissociate at the time of the reaction during the measurement so as to be in an ion state.
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。 In the present invention, various components can coexist if necessary. For example, you may add surfactant, a stabilizer, an excipient | filler, etc.
例えば、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＰＱＱＧＤＨをより安定化することができる。
例えば、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。ここにさらに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有させてもよい。
あるいは、（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化することができる。
For example, PQQGDH can be further stabilized by adding calcium ions or salts thereof, amino acids such as glutamic acid, glutamine, and lysine, and serum albumin.
For example, PQQGDH can be stabilized by containing calcium ions or calcium salts. Examples of calcium salts include calcium chloride, calcium salts of inorganic acids such as calcium acetate and calcium citrate, and organic acids. In the aqueous composition, the calcium ion content is preferably 1 × 10 −4 to 1 × 10 −2 M.
The stabilizing effect by containing calcium ions or calcium salts is further improved by containing an amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine. One or more amino acids selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine may be used. This may further contain bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA).
Or (1) one or more compounds selected from the group consisting of aspartic acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, malic acid, α-ketogluconic acid, α-cyclodextrin, and salts thereof; and (2) By coexisting albumin, PQQGDH can be stabilized.
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
In the present invention, glucose can be measured by the following various methods.
The glucose measurement reagent, glucose assay kit, and glucose sensor of the present invention can take various forms such as liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powdered by vacuum drying or spray drying, freeze drying, and the like. The lyophilization method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the lyophilized product is redissolved.
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
Glucose Measuring Reagent The glucose measuring reagent of the present invention typically includes a reagent necessary for measurement such as PQQGDH, a buffer solution and a mediator, a glucose standard solution for preparing a calibration curve, and usage guidelines. The kit of the invention can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the PQQGDH of the present invention is provided in a holified form, but may be provided in the form of an apoenzyme and holified at the time of use.
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
Glucose Assay Kit The glucose assay kit of the present invention typically comprises reagents necessary for measurement such as PQQGDH, buffer solution, mediator, glucose standard solution for creating a calibration curve, and usage guidelines. The kit of the invention can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the PQQGDH of the present invention is provided in a holified form, but may be provided in the form of an apoenzyme and holified at the time of use.
グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＰＱＱＧＬＤを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose sensor In the glucose sensor of the present invention, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used as an electrode, and PQQGLD is immobilized on this electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, or the like, or ferrocene or It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with an electron mediator typified by a derivative thereof, or may be used in combination. Preferably, the PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holo form, but it is also possible to immobilize it in the form of an apoenzyme and supply PQQ as a separate layer or in solution. Typically, PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。 The glucose concentration can be measured as follows. A buffer solution is put in a thermostatic cell, and CaCl 2 and a mediator are added to maintain a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used. An electrode on which the PQQGDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited by an Example.
実施例１
グルコース測定系を用いた基質特異性の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ フェロシアン化物イオン
Ｄ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定する。フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．各種緩衝液， フタル酸緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍＭ
グルタル酸緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍＭ
Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ フェリシアン化カリウム（分 子量３２９．２５）を １０ｍｌ 蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：３１０００Ｕ／ｍｌ（約１２８ｍｇ ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製 ：ＧＬＤ−３３１）を蒸留水５ｍｌに溶解した）
Ｄ．基質溶液， Ｄ−グルコース溶液 あるいは マルトース溶液：１００，４００ｍＭ
手順
１． 遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４８．２ｍｌ 各種緩衝液（ｐＨ６．５） （Ａ）
４．０ｍｌ フェリシアン化カリウム溶液 （Ｂ）
０．１９ｍｌ （Ｃ）
２． 試験管（プラスチック製）に、反応混合液２．６５ｍｌと添加剤０．３ｍｌを入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３． ０．１５ｍｌの基質溶液（Ｄ）を加え、穏やかに混合した。
４． ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）。同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、添加剤としてコハク酸、アジピン酸、スベリン酸、ピメリン酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸、L-リジン、タウリン、３，３−ジメチルグルタル酸、リンゴ酸、グルタル酸、グリセリン酸カルシウム、アミノーｎー酪酸、グリコール酸ナトリウム、α―ケトグルタル酸ナトリウム、フマル酸、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを用いて、それぞれ表１〜３記載の所定濃度にて実施した。なお、添加剤無添加のものも各種添加剤の効果を見る対象として行った。
Example 1
Confirmation of substrate specificity using glucose measurement system <br/> Principle of measurement
PQQGDH
D-glucose + ferricyanide ion →
The part of D-glucono-1,5-lactone + ferrocyanide ion D-glucose is changed to another saccharide, and the specificity for each substrate is measured. The presence of ferrocyanide ions generated by reduction of ferricyanide ions was confirmed by measuring a decrease in absorbance at a wavelength of 420 nm by spectrophotometry.
(2) Method Reagent A. Various buffers, Phthalate buffer pH 7.0: 50 mM
Potassium phosphate buffer pH 7.0: 50 mM
Glutaric acid buffer pH 7.0: 50 mM
B. Potassium ferricyanide solution: 50 mM (0.165 g potassium ferricyanide (molecular weight 329.25) was dissolved in 10 ml distilled water)
C. PQQGDH solution: 31000 U / ml (about 128 mg PQQGDH (manufactured by Toyobo Co., Ltd .: GLD-331) was dissolved in 5 ml of distilled water)
D. Substrate solution, D-glucose solution or maltose solution: 100, 400 mM
Procedure 1. Prepare the following reaction mixture in a light-proof bottle and store on ice (prepared at the time of use)
48.2 ml Various buffers (pH 6.5) (A)
4.0 ml potassium ferricyanide solution (B)
0.19ml (C)
2. A test tube (made of plastic) was charged with 2.65 ml of the reaction mixture and 0.3 ml of additive, and pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes.
3. 0.15 ml of substrate solution (D) was added and mixed gently.
4). The decrease in absorbance for water at 420 nm was recorded with a spectrophotometer for 1-3 minutes while maintaining at 37 ° C., and ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (ΔOD test). At the same time, the same method was performed except that distilled water was added instead of the glucose solution, and a blank (ΔOD blank) was measured.
The above operations were performed using succinic acid, adipic acid, suberic acid, pimelic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, malonic acid, L-lysine, taurine, 3,3-dimethylglutaric acid, malic acid as additives. , Glutaric acid, calcium glycerate, amino-n-butyric acid, sodium glycolate, α-ketoglutarate sodium, fumaric acid, glycine, glutamic acid, and serine were used at the predetermined concentrations shown in Tables 1 to 3, respectively. In addition, the thing without an additive was also made into the object which sees the effect of various additives.
計算
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グルコース以外の糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりにその他の糖類を基質溶液とした場合のΔＯＤ／ｍｉｎ（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、行った。
Calculation The change in absorbance per unit time was determined by calculating ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank).
Judgment whether the activity with respect to saccharides other than glucose is reduced is based on ΔOD / min (a) when D-glucose is used as a substrate solution, and when other saccharides are used as a substrate solution instead of D-glucose. ΔOD / min (b) was measured, and a relative value ((b) / (a) × 100) with respect to a measurement value when glucose was used as a substrate was determined to be 100.
フタル酸バッファーをベースとして各種添加剤を検討したときの結果を表１に、リン酸カリウムバッファーをベースとして各種添加剤を検討したときの結果を表２に、グルタル酸バッファーをベースとして各種添加剤を検討したときの結果を表３に示す。
緩衝液の組成に関わらず、表１〜３記載の各種添加剤を共存させることにより、マルトースに対する作用性が低減することが確認できた。
表１は、改変型ＰＱＱＧＤＨのフタル酸バッファー（ｐＨ７．０）におけるマルトース作用性の低減効果の関係を示す。表２は、改変型ＰＱＱＧＤＨのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）におけるマルトース作用性の低減効果の関係を示す。表３は、改変型ＰＱＱＧＤＨのグルタル酸バッファー（ｐＨ７．０）におけるマルトース作用性の低減効果の関係を示す。
表１〜表３のいずれにおいても、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ：無添加）に対してマルトース／グルコースの測定値比（Ｍａｌｔｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｓｅ）の数値が小さい場合、グルコース測定においてマルトースに対する作用性が低減している。
基質濃度４．８ｍＭは、８６ｍｇ／ｄｌの濃度であり、健常者の血糖値に相当する。１９．２ｍＭは、３５０ｍｇ／ｄｌの濃度であり、糖尿病患者の血糖値でも最も高値なところを考慮しており、４．８〜１９．２ｍＭの基質濃度範囲で基質特異性の有効性が示せれば、実用域での利用意義も大きい。
基質濃度が４．８ｍＭの場合、一部の事例（コハク酸、ピメリン酸、クエン酸水素二アンモニウム、マロン酸）でマルトースに対する作用性が低減していないが、それ以外についてはいずれもコントロールを下回っている。
Table 1 shows the results when various additives were examined based on phthalate buffer, Table 2 shows the results when various additives were examined based on potassium phosphate buffer, and various additives based on glutaric acid buffer. Table 3 shows the results of the study.
Regardless of the composition of the buffer solution, it was confirmed that the activity against maltose was reduced by the coexistence of various additives shown in Tables 1 to 3.
Table 1 shows the relationship of the effect of reducing maltose activity in the modified PQQGDH phthalate buffer (pH 7.0). Table 2 shows the relationship of the maltose-reducing effect of the modified PQQGDH in potassium phosphate buffer (pH 7.0). Table 3 shows the relationship of the effect of reducing maltose activity in the glutamic acid buffer (pH 7.0) of the modified PQQGDH.
In any of Tables 1 to 3, when the numerical value of maltose / glucose measurement value (maltose / glucose) is small with respect to control (Control: no addition), the action on maltose is reduced in glucose measurement. .
The substrate concentration of 4.8 mM is a concentration of 86 mg / dl and corresponds to the blood glucose level of a healthy person. 19.2 mM is a concentration of 350 mg / dl, considering the highest blood glucose level of diabetic patients. If the substrate concentration range of 4.8 to 19.2 mM can demonstrate the effectiveness of substrate specificity Also, it has great significance in practical use.
When the substrate concentration is 4.8 mM, maltose activity is not reduced in some cases (succinic acid, pimelic acid, diammonium hydrogen citrate, malonic acid). ing.
このように、グルコースに対する基質特異性が向上した改変体では、中性付近のバッファーでもその反応液組成を改良することにより、約１．１〜２．５倍基質特異性を更に向上できることが明らかとなった。 Thus, it is clear that the modified substance with improved substrate specificity for glucose can further improve the substrate specificity by about 1.1 to 2.5 times by improving the reaction solution composition even with a buffer near neutrality. It became.
本発明による基質特異性の改良は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサでの測定精度を向上することができる。 The improvement in substrate specificity according to the present invention can improve the measurement accuracy with a glucose measurement reagent, a glucose assay kit, and a glucose sensor.
Claims (11)
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