JP2006149378A - Pqq-dependent glucose dehydrogenase composition - Google Patents

Pqq-dependent glucose dehydrogenase composition Download PDF

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肇庸 松村
Kayoko Kajitani
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a glucose assaying system ensuring enzyme stability and excellent in practicability in assaying glucose by a sensor using a PQQ (pyrroloquinoline quinone)-dependent glucose dehydrogenase. <P>SOLUTION: A PQQ-dependent glucose dehydrogenase composition is provided, being characterized by containing no protein component other than host-derived protein components. An alternative PQQ-dependent glucose dehydrogenase composition is provided, containing only calcium or a calcium salt and a buffering agent in addition to host-derived protein components. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物に関するものである。(以下ピロロキノリンキノンをPQQ、グルコースデヒドロゲナーゼをGDH、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをPQQGDHともそれぞれ記載する。)   The present invention relates to a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition. (Hereinafter, pyrroloquinoline quinone is also referred to as PQQ, glucose dehydrogenase as GDH, and pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase as PQQGDH, respectively.)

血清、尿などの検体中のグルコース測定法として、PQQを補酵素として必要とするPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを使用する測定系が知られている(たとえば、非特許文献1)。この測定系は、溶液中の反応に適用することもできるが、一般に広く普及しているのはグルコースセンサーの形態である(たとえば、特許文献1)。このようなグルコースセンサーにおいて、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼなど反応に必要な成分は乾燥状態でセンサーに固定化されていることが多い。
Methods in Enzymology, Vol.89 (1982) p20(Academic Press,Inc) 特許公開2003−207475
As a method for measuring glucose in samples such as serum and urine, a measurement system using PQQ-dependent glucose dehydrogenase that requires PQQ as a coenzyme is known (for example, Non-Patent Document 1). Although this measurement system can be applied to a reaction in a solution, a glucose sensor is widely used in general (for example, Patent Document 1). In such a glucose sensor, components necessary for the reaction such as PQQ-dependent glucose dehydrogenase are often immobilized on the sensor in a dry state.
Methods in Enzymology, Vol. 89 (1982) p20 (Academic Press, Inc) Patent Publication 2003-207475

一般的に酵素製剤には、その安定性の向上や維持等を目的に何らかの安定化剤が添加されており、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ製剤の場合も同様である。しかしながら、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの場合、酵素をセンサーに適用しようとすると、安定化剤は測定値に影響を与え正確性を損ねるなど不測の問題をひきおこす可能性がある。また、測定時において、反応に必要な成分の溶解性を考慮すると、同一活性を有する酵素製剤としては少量である方が望ましい。これらのことから、添加される安定化剤としては極力少量であることが望ましく、かつ酵素製剤さらにはセンサーとしての安定性と正確性を確保していることが望ましい。
本願発明の課題は、酵素製剤の安定性、と、センサーに適用した場合の測定の正確性を損なう要因の低減、を両立させることにある。
In general, enzyme preparations are added with some kind of stabilizer for the purpose of improving or maintaining the stability thereof, and the same applies to PQQ-dependent glucose dehydrogenase preparations. However, in the case of PQQ-dependent glucose dehydrogenase, if the enzyme is applied to the sensor, the stabilizer may cause unexpected problems such as affecting the measured value and impairing accuracy. Further, in consideration of the solubility of components necessary for the reaction at the time of measurement, it is desirable that the amount of the enzyme preparation having the same activity is small. For these reasons, it is desirable that the added stabilizer is as small as possible, and it is desirable to ensure stability and accuracy as an enzyme preparation and further as a sensor.
The subject of this invention is to make compatible the stability of an enzyme formulation, and the reduction of the factor which impairs the accuracy of a measurement when it applies to a sensor.

本発明者はPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化剤について、種々鋭意検討したところ、生体由来物質を使用しなくとも安定性を担保できる組成を見いだし、本発明に達した。 As a result of diligent studies on the stabilizer for PQQ-dependent glucose dehydrogenase, the present inventor has found a composition that can ensure stability without using a biological substance, and has reached the present invention.

本発明の概要は以下の通りである。すなわち、
[項1]
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
[項2]
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項1に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
[項3]
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項1に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
[項4]
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
[項5]
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項4に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
[項6]
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
[項7]
宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項6に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
[項8]
請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。
[項9]
請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。
The outline of the present invention is as follows. That is,
[Claim 1]
A pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition comprising no protein component other than a host-derived protein component.
[Section 2]
The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 1, comprising only calcium or a calcium salt and a buffer in addition to the protein component derived from the host.
[Section 3]
The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 1, comprising only calcium or calcium salt, pyrroloquinoline quinone, and a buffer in addition to the host-derived protein component.
[Claim 4]
A method for stabilizing pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in a pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition, which does not contain a protein component other than a host-derived protein component.
[Section 5]
The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in the pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 4, characterized by containing only calcium or a calcium salt and a buffer in addition to the protein component derived from the host. Stabilization method.
[Claim 6]
A method for producing a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition, which does not contain a protein component other than a host-derived protein component.
[Claim 7]
The method for producing a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 6, wherein only the calcium or calcium salt and the buffer are contained in addition to the protein component derived from the host.
[Section 8]
A glucose assay kit comprising the glucose dehydrogenase composition according to claim 1.
[Claim 9]
A glucose sensor comprising the glucose dehydrogenase composition according to claim 1.

本願発明によれば、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたセンサーによるグルコースの測定において、酵素の安定性を担保し、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。また、酵素の安定性と測定の正確性を両立させ、実用性に優れたグルコース測定系を提供することができる。   According to the present invention, it is possible to provide a glucose measurement system that ensures the stability of the enzyme and is highly practical in measuring glucose with a sensor using a PQQ-dependent glucose dehydrogenase. In addition, it is possible to provide a glucose measurement system having both practical stability and measurement accuracy and excellent practicality.

本発明において、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとは、補酵素としてPQQを配位する酵素であり、D−グルコースを酸化してD−グルコノ−1,5−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素(EC1.1.5.2(旧EC1.1.99.17))であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
例えば微生物では、Acinetobacter属細菌、Pseudomonas属細菌、Burkholderia属細菌、Gluconobactor属細菌、あるいはAcetobactor属細菌などから生産される。
例えば、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)(例えば、特許文献1を参照。)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)(例えば、非特許文献1および2を参照。)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonasaeruginosa)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)(例えば、非特許文献3を参照。)等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacteriumradiobacter)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)(例えば、非特許文献4を参照。)、クレブシーラ・エーロジーンズ(Klebsiella aerogenes)等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア(Burkhorderia cepacia)などを挙げることができる。
また、例えばAcinetobacter baumannii NCIMB11517株、Acinetobacter calcoaceticus IFO12552株、Acinetobacter calcoaceticus LMD79.41株などから生産される(特許文献2、3、4)。
A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,170,2121(1988) Mol.Gen.Genet.,217,430(1989) Mol.Gen.Genet.,229,206(1991) A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,172,6308(1990) 特開平11−243949 特開2004−173538 特表2004−512047
In the present invention, PQQ-dependent glucose dehydrogenase is an enzyme that coordinates PQQ as a coenzyme, and an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing D-glucose to produce D-glucono-1,5-lactone ( EC 1.1.5.2 (formerly EC 1.1.9.17)), and the origin and structure are not particularly limited.
For example, microorganisms are produced from Acinetobacter genus bacteria, Pseudomonas genus bacteria, Burkholderia genus bacteria, Gluconobacter genus bacteria, or Acetobacter genus bacteria.
For example, Acinetobacter baumannii (see, for example, Patent Document 1), Acinetobacter calcoaceticus (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2), Pseudomonas aeru in a eu ag au g. Oxidative bacteria such as Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans (see, for example, Non-Patent Document 3) and Agrobacterium radiobacterium (Agrobacterium radio acter), Escherichia coli (see, for example, Non-Patent Document 4), enterobacteria such as Klebsiella aerogenes, and Burkholderia cepacia. it can.
Moreover, it is produced from, for example, Acinetobacter baumannii NCIMB11517 strain, Acinetobacter calcaceticus IFO12552 strain, Acinetobacter calcaceticus LMD79.41 strain, etc. (Patent Documents 2, 3, 4).
A. M.M. Cleton-Jansen et al. Bacteriol. , 170, 2121 (1988) Mol. Gen. Genet. , 217, 430 (1989) Mol. Gen. Genet. , 229, 206 (1991) A. M.M. Cleton-Jansen et al. Bacteriol. , 172, 6308 (1990) JP-A-11-243949 JP 2004-173538 A Special table 2004-512047

本発明に適用することができるPQQGDHは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Sambrookら著、Molecular Cloning; A Laboratory Manual 第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
PQQGDH that can be applied to the present invention may have some other amino acid residues deleted or substituted with those exemplified above as long as it has glucose dehydrogenase activity, and other amino acid residues may be removed. A group may be added.
Such modifications can be easily carried out by those skilled in the art using known techniques in the art. For example, various methods for substituting or inserting a base sequence of a gene encoding a protein in order to introduce a site-specific mutation into the protein are described in Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd edition (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

これらのPQQGDHは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
例えば、上記のPQQGDHを生産する天然の微生物、あるいは、天然のPQQGDHをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター(多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。)に挿入し、適当な宿主(多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。)に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてEDTAなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、PQQGDHを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したPQQGDHを直接培養液中に分泌させることが出来る。
上記のようにして得られたPQQGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたPQQGDHを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動(SDS−PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記工程と前後して、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合を向上させるために、好ましくは25〜50℃、より好ましくは30〜45℃の加熱処理を行っても良い。
These PQQGDHs can be easily produced by those skilled in the art using known techniques in the art.
For example, the above-mentioned natural microorganisms producing PQQGDH, or the gene encoding natural PQQGDH as it is or after being mutated, are expressed vectors (many are known in the art. For example, plasmids ), And cultivates the transformant transformed into an appropriate host (many are known in the art. For example, E. coli), and recovers the cell from the culture by centrifugation. After that, the bacterial cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, a chelating agent such as EDTA or a surfactant is solubilized, and a water-soluble fraction containing PQQGDH. You can get minutes. Alternatively, the expressed PQQGDH can be secreted directly into the culture medium by using an appropriate host vector system.
The PQQGDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to let them know. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Further, purified PQQGDH can be obtained by performing gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
Before and after the above step, in order to improve the ratio of holo-type PQQGDH to the total GDH enzyme protein, a heat treatment of preferably 25 to 50 ° C., more preferably 30 to 45 ° C. may be performed.

上記のようにして製造されたPQQGDHは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を実質的に含有しない。
あるいは、たとえば東洋紡績製GLD−321など市販の酵素を同様に精製することにより宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないPGGGDHを製造することができる。
PQQGDH produced as described above substantially does not contain protein components other than the host-derived protein components.
Alternatively, for example, a commercially available enzyme such as GLD-321 manufactured by Toyobo Co., Ltd. can be similarly purified to produce PGGGDH containing no protein component other than the host-derived protein component.

本発明の組成物は、上記のようにして製造された宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないPQQGDHに、さらに「宿主由来のタンパク質を加えること」以外の工程を経ることにより得ることができる。例えば、PQQGDHに何も加えなくても良いし、宿主由来のタンパク質成分以外の種々の成分を添加することによっても得ることができる。
組成物の形態は、液状などの水性組成物(水溶液、懸濁液等)、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができるが特に限定されない。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
The composition of the present invention can be obtained by passing through a process other than “adding a host-derived protein” to PQQGDH containing no protein component other than the host-derived protein component produced as described above. it can. For example, nothing may be added to PQQGDH, and it can be obtained by adding various components other than the host-derived protein component.
The form of the composition can take various forms such as an aqueous composition such as a liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powdered by vacuum drying or spray drying, freeze drying, etc., but is not particularly limited. The lyophilization method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the lyophilized product is redissolved.

あるいは、本発明の組成物は、上記酵素とカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、ピロロキノリンキノン、アミノ酸、糖類あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、本発明の酵素組成物は、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。中でも塩化カルシウムが好ましい。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量(W/W)は、0.05%〜5%であることが望ましく、さらに好ましくは0.1%〜0.5%である。
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のpHを5〜10とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのPQQ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、BES、Bicine、Bis−Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricineといったグッド緩衝剤が挙げられる。中でもpH6〜7に緩衝能をもつPIPESなどが好ましい。また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量(W/W)は、1.0%〜50%であることが望ましく、さらに好ましくは5%〜10%である。
アミノ酸としては特に限定されないが、グリシルグリシン、ジメチルグリシン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンなどまたはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸の含有量(W/W)は、10%〜80%であることが望ましく、さらに好ましくは20%〜70%、さらに好ましくは30%〜60%である。
有機酸としては特に限定されないが、αケトグルタル酸、ピルビン酸、L−リンゴ酸、グルクロン酸、αケトグルコン酸などあるいはそれらの塩が好ましいものとして挙げられる。有機酸の含有量(W/W)は、10%〜80%であることが望ましく、さらに好ましくは20%〜70%、さらに好ましくは30%〜60%である。
糖類としては特に限定されないが、αシクロデキストリンなどが好ましいものとして挙げられる。糖類の含有量(W/W)は、10%〜80%であることが望ましく、さらに好ましくは20%〜70%、さらに好ましくは30%〜60%である。
ピロロキノリンキノンの含有量(W/W)は、10%〜80%であることが望ましく、さらに好ましくは20%〜70%、さらに好ましくは30%〜60%である。
さらに、上記のうち2以上の組み合わせであっても良い。好ましい組合わせとしては、図1および図2に記載の組み合わせなどが挙げられる。組合わせた物質の含有量の合計(W/W)は、10%〜80%であることが望ましく、さらに好ましくは20%〜70%、さらに好ましくは30%〜60%である。
なお、上記の試薬類はいずれも市販品などを用いることができる。
Alternatively, the composition of the present invention basically consists of the enzyme and calcium or calcium salt and a buffer. Moreover, after containing these, pyrroloquinoline quinone, amino acid, saccharide or organic acid may be further added. The enzyme composition of the present invention may be an aqueous composition or a lyophilized product as long as it contains these.
Examples of the supply form of calcium include calcium salts of inorganic acids or organic acids such as calcium chloride, calcium acetate, and calcium citrate. Of these, calcium chloride is preferred. In the powder composition, the calcium content (W / W) is desirably 0.05% to 5%, and more preferably 0.1% to 0.5%.
Any buffering agent that is generally used may be used, and usually the buffering agent having a pH of 5 to 10 is preferable. However, those that form an insoluble salt with calcium such as a phosphate buffer are not preferred. Those having an amino group end such as trisaminomethane are not preferable because the PQQ bond of PQQ-dependent glucose dehydrogenase is unstable. For this reason, more preferably as a buffering agent, a buffering agent such as boric acid or acetic acid, BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, EPPS, HEPES, HEPPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES Good buffer such as Tricine. Among these, PIPES having a buffer capacity at pH 6 to 7 is preferable. Further, in the powder composition, the content (W / W) of the buffering agent is desirably 1.0% to 50%, and more preferably 5% to 10%.
The amino acid is not particularly limited, and preferred examples include glycylglycine, dimethylglycine, histidine, serine, asparagine, aspartic acid, glutamine, and salts thereof. The amino acid content (W / W) is desirably 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and further preferably 30% to 60%.
Although it does not specifically limit as an organic acid, (alpha) ketoglutaric acid, pyruvic acid, L-malic acid, glucuronic acid, alpha ketogluconic acid etc. or those salts are mentioned as a preferable thing. The organic acid content (W / W) is desirably 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and further preferably 30% to 60%.
Although it does not specifically limit as saccharides, alpha cyclodextrin etc. are mentioned as a preferable thing. The saccharide content (W / W) is desirably 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and further preferably 30% to 60%.
The content (W / W) of pyrroloquinoline quinone is desirably 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and further preferably 30% to 60%.
Further, a combination of two or more of the above may be used. Preferred combinations include those described in FIGS. 1 and 2. The total content (W / W) of the combined materials is desirably 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and further preferably 30% to 60%.
In addition, as for said reagents, all can use a commercial item.

さらに本発明は、該組成物を含むグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーである。これらにおいてPQQGDH組成物に係る部分は、液状(水溶液、懸濁液等)、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。   Furthermore, the present invention is a glucose measurement reagent, a glucose assay kit, and a glucose sensor containing the composition. In these, the part which concerns on a PQQGDH composition can take various forms, such as liquid (aqueous solution, suspension, etc.), what was pulverized by vacuum drying, spray drying, etc., freeze drying. The lyophilization method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the lyophilized product is redissolved.

グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、PQQGDH、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
Glucose Assay Kit The glucose assay kit of the present invention typically comprises reagents necessary for measurement such as PQQGDH, buffer solution, mediator, glucose standard solution for creating a calibration curve, and usage guidelines. The kit of the invention can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the PQQGDH of the present invention is provided in a holified form, but may be provided in the form of an apoenzyme and holified at the time of use.

グルコースセンサー
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にPQQGLDを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、PQQを別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のPQQGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose sensor In the glucose sensor of the present invention, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used as an electrode, and PQQGLD is immobilized on this electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, or the like, or ferrocene or It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with an electron mediator typified by a derivative thereof, or may be used in combination. Preferably, the PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holo form, but it is also possible to immobilize it in the form of an apoenzyme and supply PQQ as a separate layer or in solution. Typically, PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.

本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法である。   The present invention provides the stability of pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in a pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition characterized by not containing a protein component other than a host-derived protein component by, for example, the means described above. It is a conversion method.

また、本発明は、例えば上記に記載した手段により、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法である。   Further, the present invention is a method for producing a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition characterized in that no protein component other than a host-derived protein component is contained, for example, by the means described above. .

なお、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は、次の方法に従った。50mM PIPES緩衝液、pH6.5 25.5ml、3.0mM PMS 2.0ml、6.6mM NTB 1.0mlおよび1M グルコースを含む6.3% TritonX−100 0.9mlを混合する。この混合液を37℃で5分間インキュベートした後、酵素液を0.1ml添加し、混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で570nmの吸光度変化を4〜5分間記録し、その初期直線部分から1分間当たりの吸光度変化を求める。1分間に1マイクロモルのグルコースを酸化する酵素量を1単位(U)とする。   The PQQ-dependent glucose dehydrogenase activity was measured according to the following method. Mix 0.9 ml of 50 mM PIPES buffer, pH 6.5 25.5 ml, 3.0 mM PMS 2.0 ml, 6.6 mM NTB 1.0 ml and 1% glucose 6.3% Triton X-100. After incubating this mixed solution at 37 ° C. for 5 minutes, 0.1 ml of enzyme solution was added, and after mixing, the absorbance change at 570 nm was recorded for 4 to 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control. The change in absorbance per minute is determined from the initial linear portion. The amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of glucose per minute is defined as 1 unit (U).

さらに詳しくは、PQQGDHの酵素活性は以下の方法により測定できる。
PQQGDH酵素活性の測定方法
(1)測定原理
D−グルコース+PMS+PQQGDH → D−グルコノ−1,5−ラクトン + PMS(red)
2PMS(red) + NTB → 2PMS + ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート(PMS)(red)によるニトロテトラゾリウムブルー(NTB)の還元により形成されたジホルマザンの存在は、570nmで分光光度法により測定した。
(2)単位の定義
1単位は、以下に記載の条件下で1分当たりジホルマザンを0.5ミリモル形成させるPQQGDHの酵素量をいう。
(3)方法
試薬
A.D−グルコース溶液:1.0M(1.8g D−グルコース(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES−NaOH緩衝液, pH6.5:50mM(60mLの水中に懸濁した1.51gのPIPES(分子量302.36)を、5N NaOHに溶解し、2.2mlの10% Triton X−100を加える。5N NaOHを用いて25℃でpHを6.5±0.05に調整し、水を加えて100mlとした。)
C.PMS溶液:3.0mM(9.19mgのフェナジンメトサルフェート(分子量817.65)/10mlH2O)
D.NTB溶液:6.6mM(53.96mgのニトロテトラゾリウムブルー(分子量817.65)/10mlH2O)
E.酵素希釈液:1mM CaCl2, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSAを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)
1. 0.9ml D−グルコース溶液 (A)
25.5ml PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5) (B)
2.0ml PMS溶液 (C)
1.0ml NTB溶液 (D)

上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
PIPES緩衝液 42mM
D−グルコース 30mM
PMS 0.20mM
NTB 0.22mM

2.3.0mlの反応混合液を試験管(プラスチック製)に入れ、37℃で5分間予備加 温した。
3.0.1mlの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
4.570nmでの水に対する吸光度の増加を37℃に維持しながら分光光度計で4〜5 分間記録し、曲線の初期直線部分からの1分当たりのΔODを計算した(ODテスト) 。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(E)加えることを除いては同一の方法を繰り 返し、ブランク(ΔODブランク)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液(E)で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で0.1−0.8U/mlに希釈した(該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい)。
計算
活性を以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODテスト − ΔODブランク)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.1ml)
Vs:サンプル体積(0.1ml)
20.1:ジホルマザンの1/2ミリモル分子吸光係数
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶液中の酵素濃度(c mg/ml)
More specifically, the enzyme activity of PQQGDH can be measured by the following method.
Method for measuring PQQGDH enzyme activity (1) Principle of measurement D-glucose + PMS + PQQGDH → D-glucono-1,5-lactone + PMS (red)
The presence of diformazan formed by the reduction of nitrotetrazolium blue (NTB) by 2PMS (red) + NTB → 2PMS + diformazan phenazine methosulfate (PMS) (red) was measured spectrophotometrically at 570 nm.
(2) Definition of Unit One unit refers to the amount of PQQGDH enzyme that forms 0.5 mmol of diformazan per minute under the conditions described below.
(3) Method Reagent A. D-glucose solution: 1.0 M (1.8 g D-glucose (molecular weight 180.16) / 10 ml H2O)
B. PIPES-NaOH buffer, pH 6.5: 50 mM (1.51 g of PIPES (molecular weight 302.36) suspended in 60 mL of water is dissolved in 5N NaOH and 2.2 ml of 10% Triton X-100 is added. The pH was adjusted to 6.5 ± 0.05 at 25 ° C. using 5N NaOH, and water was added to make 100 ml.)
C. PMS solution: 3.0 mM (9.19 mg phenazine methosulfate (molecular weight 817.65) / 10 ml H2O)
D. NTB solution: 6.6 mM (53.96 mg of nitrotetrazolium blue (molecular weight 817.65) / 10 ml H2O)
E. Enzyme dilution: 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 1 mM CaCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA
Procedure Prepare the following reaction mixture in a light-proof bottle and store on ice (prepared at the time of use)
1. 0.9 ml D-glucose solution (A)
25.5 ml PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) (B)
2.0ml PMS solution (C)
1.0ml NTB solution (D)

The concentrations in the assay mixture are as follows:
PIPES buffer 42 mM
D-glucose 30 mM
PMS 0.20 mM
NTB 0.22mM

2. 3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
3. Add 0.1 ml enzyme solution and mix by gentle inversion.
The increase in absorbance for water at 4.570 nm was recorded on a spectrophotometer while maintaining at 37 ° C. for 4-5 minutes and the ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
At the same time, a blank (ΔOD blank) was measured by repeating the same method except that the enzyme diluent (E) was added instead of the enzyme solution.
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in an ice-cold enzyme diluent (E) and diluted to 0.1-0.8 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme) Is preferred).
Calculation Activity is calculated using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (20.1 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.1 ml)
Vs: Sample volume (0.1 ml)
20.1: 1/2 mmol molecular extinction coefficient of diformazan 1.0: optical path length (cm)
df: Dilution factor C: Enzyme concentration in solution (c mg / ml)

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例1
下記成分を水道水6Lに溶解し、pHを7.0に調整した後、オートクレーブで121℃、20分間滅菌して、培地を得た。
グルコース 60gポリペプトン 180g酵母エキス 30gNaCl 60g上記培地の入った10Lジャーファーメンターに、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB11517(National Collection of Industrial Bacteria, Abadeen Scotland) を接種し、30℃で20時間通気攪拌培養後、遠心分離して菌体を取得した。得られた菌体をダイノミルにより破砕し、PEI処理、硫安分画、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびDEAE−セファロースクロマトグラフィーによる精製、及び蒸留水への緩衝液置換を実施し、600UのPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを得た。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is shown concretely, this invention is not limited by an Example.
Example 1
The following components were dissolved in 6 L of tap water and the pH was adjusted to 7.0, and then sterilized with an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes to obtain a medium.
Glucose 60 g Polypeptone 180 g Yeast extract 30 g NaCl 60 g The 10 L jar fermenter containing the above medium was inoculated with Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 11517 (National Collection of Industrial Bacterium 30 ° C.) After stirring culture, the cells were obtained by centrifugation. The obtained cells were crushed with dynomill, subjected to PEI treatment, ammonium sulfate fractionation, purification by phenyl sepharose chromatography and DEAE-sepharose chromatography, and buffer replacement with distilled water, and 600 U of PQQ-dependent glucose dehydrogenase Got.

実施例2
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を37℃、1週間保存した後、GLD活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図1に記載する。
従来から知られているBSA(ウシ血清アルブミン)等の生体由来物質を使用せずとも、有機酸やアミノ酸で同等以上の安定性を示すことが確認された。
Example 2
The following compound was added to the obtained enzyme solution, followed by lyophilization to obtain enzyme powder. After each enzyme powder was stored at 37 ° C. for 1 week, the GLD activity was measured to determine the residual activity compared with that before storage. The results are listed in FIG.
It has been confirmed that organic acids and amino acids exhibit the same or higher stability without using a conventionally derived biological material such as BSA (bovine serum albumin).

実施例3
得られた酵素溶液に下記化合物を添加後、凍結乾燥を実施し、酵素粉末を取得した。各酵素粉末を37℃、1週間保存した後、GLD活性を測定し、保存前と比較した残存活性を求めた。結果を図2に記載する。
緩衝剤のみでは安定化効果は少ないが、少なくともカルシウム塩を添加することで、一定の安定性を担保可能であることが確認された。また、従来から知られているBSA等のタンパク成分を添加しなくても安定性を担保可能であることも確認された。なお、カルシウム塩と緩衝剤からなる組成にさらにPQQを添加しても問題はなく、むしろ更なる安定化効果が確認された。
Example 3
The following compound was added to the obtained enzyme solution, followed by lyophilization to obtain enzyme powder. After each enzyme powder was stored at 37 ° C. for 1 week, the GLD activity was measured to determine the residual activity compared with that before storage. The results are shown in FIG.
Although the stabilizing effect is small with only the buffer, it was confirmed that a certain level of stability can be ensured by adding at least a calcium salt. It has also been confirmed that stability can be ensured without adding a conventionally known protein component such as BSA. It should be noted that there was no problem even if PQQ was added to the composition composed of the calcium salt and the buffering agent, but a further stabilizing effect was confirmed.

実施例4
グルタルアルデヒドを用いて本発明のPQQGDH(ホロ型)をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることによりグルコースセンサーを作製する。作製時には、ウシ血清アルブミン添加(A)、無添加(B)の両方で行う。次いで、得られたセンサーを用いて、100mg/dl(濃度)のグルコース水溶液を20回測定する。同時再現性および正確性(理論値との差)は(B)の方が優れている。
Example 4
The PQQGDH (holo type) of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde to produce a glucose sensor. At the time of preparation, both bovine serum albumin addition (A) and no addition (B) are performed. Next, a 100 mg / dl (concentration) aqueous glucose solution is measured 20 times using the obtained sensor. Simultaneous reproducibility and accuracy (difference from theoretical values) are superior to (B).

本発明により、グルコースセンサーへの適用上優れたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供することが可能になる。   According to the present invention, it is possible to provide a PQQ-dependent glucose dehydrogenase excellent in application to a glucose sensor.

実施例2の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較Comparison of glucose dehydrogenase residual activity after storage in each composition of Example 2 実施例3の各組成における保存後のグルコースデヒドロゲナーゼ残存活性の比較Comparison of glucose dehydrogenase residual activity after storage in each composition of Example 3

Claims (9)

宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。   A pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition comprising no protein component other than a host-derived protein component. 宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有する、請求項1に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。   The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 1, comprising only calcium or a calcium salt and a buffer in addition to the protein component derived from the host. 宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、ピロロキノリンキノン、及び緩衝剤のみを含有する、請求項1に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。   The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 1, comprising only calcium or calcium salt, pyrroloquinoline quinone, and a buffer in addition to the host-derived protein component. 宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。   A method for stabilizing pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in a pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition, which does not contain a protein component other than a host-derived protein component. 宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項4に記載のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物中におけるピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。   The pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in the pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 4, which contains only calcium or a calcium salt and a buffer in addition to the protein component derived from the host. Stabilization method. 宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有させないことを特徴とする、安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。   A method for producing a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition, which does not contain a protein component other than a host-derived protein component. 宿主由来のタンパク質成分以外に、カルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤のみを含有させることを特徴とする、請求項6に記載の安定化されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。   The method for producing a stabilized pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase composition according to claim 6, wherein only the calcium or calcium salt and the buffer are contained in addition to the protein component derived from the host. 請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースアッセイキット。   A glucose assay kit comprising the glucose dehydrogenase composition according to claim 1. 請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を含むグルコースセンサー。   A glucose sensor comprising the glucose dehydrogenase composition according to claim 1.
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