JP2007106752A - Substance conveying body using hollow nanoparticle of hepatitis b viral protein and liposome and method for transferring substance to cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定の細胞および組織に物質を導入することが可能な運搬体である中空ナノ粒子へ導入物質を内包させるための方法及び導入物質を内包した複合粒子に関するものである。 The present invention relates to a method for encapsulating an introduced substance in hollow nanoparticles, which are carriers capable of introducing the substance into specific cells and tissues, and a composite particle encapsulating the introduced substance.
近年、薬剤の副作用を低減させるべく、ドラッグデリバリーシステム(DDS)と呼ばれる方法が注目されている。DDSは、薬剤などの有効成分を運搬体にて、患部等の目的細胞、あるいは目的組織へ特異的に運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法である。
本発明者らは、これまでに、B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質から構成される粒子(HBsAg粒子)に生体認識分子が導入されたものが、目的箇所へ導入物質を特異的、かつ安全に運搬し、導入するためのDDS運搬体として有効であることを見出している(WO01/64930, WO03/082330, WO03/082344)。該粒子に薬剤や遺伝子、タンパク質などの導入物質を内包させるには、従来はエレクトロポレーション法を用いて行っていた。エレクトロポレーション法を実施するにあたっては、エレクトロポレーション専用装置と同装置の操作に関する専門的知識を要することから、同法により導入物質を中空ナノ粒子へ内包させる方法を実施するには一定の制約があった。
WO97/17844に示されるように、脂質含量が70%程度の脂質を主成分とするセンダイウイルス粒子は同じ脂質であるリポソームと容易に複合粒子を形成してウイルス粒子に導入物質を内包させることは知られているが、HBsAgタンパク質粒子とリポソームとの相互作用については、知られていなかった。
In recent years, a method called a drug delivery system (DDS) has attracted attention in order to reduce the side effects of drugs. DDS is a method in which an active ingredient such as a drug can be specifically transported to a target cell or target tissue such as an affected part by a carrier, and the active ingredient can act on the target site.
In the past, the present inventors have introduced a biorecognition molecule into particles (HBsAg particles) composed of hepatitis B virus surface antigen protein, and transport the introduced substance specifically and safely to the target location. And found to be effective as a DDS carrier for introduction (WO01 / 64930, WO03 / 082330, WO03 / 082344). In the past, electroporation was used to encapsulate drugs, genes, proteins and other introduced substances in the particles. Since the electroporation method requires specialized knowledge about the electroporation dedicated device and the operation of the device, certain restrictions are imposed on the method of encapsulating the introduced substance in the hollow nanoparticles by this method. was there.
As shown in WO97 / 17844, Sendai virus particles containing lipids with a lipid content of about 70% as a main component can easily form complex particles with liposomes that are the same lipid, and encapsulate the introduced substance in the virus particles. Although known, the interaction between HBsAg protein particles and liposomes was not known.
本発明は、標的細胞や標的組織へ導入物質を特異的、効率的かつ安全に運搬、導入するための複合粒子及びその製造法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide composite particles for transporting and introducing a substance to be introduced into a target cell or target tissue specifically, efficiently and safely, and a method for producing the same.
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、HBsAg粒子のようにタンパク質が主成分である中空ナノ粒子であっても、リポソームと混合することで、両者が融合して複合粒子を形成し、該中空ナノ粒子に導入物質を内包させ得ることを見出した。 As a result of repeated studies in view of the above problems, the present inventor has formed a composite particle by mixing with liposomes even if it is a hollow nanoparticle mainly composed of protein such as HBsAg particles. The present inventors have found that the hollow nanoparticle can contain the introduced substance.
本発明は、以下の複合粒子及びその製造方法に関する。
1. B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体を含む中空ナノ粒子を、導入物質を封入したリポソームと融合させることを特徴とする、導入物質を内包するナノ粒子とリポソームの複合粒子の製造方法。
2. 前記中空ナノ粒子の粒径が、80〜130nmである、項1に記載の方法。
3. 前記複合粒子の粒径が130〜500nmである、項1に記載の方法。
4. 前記複合粒子の粒径が150〜400nmである、項1に記載の方法。
5. B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体を含む中空ナノ粒子が、70〜90重量部のB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、5〜15重量部の脂質、5〜15重量部の糖鎖から構成される、項1に記載の方法。
6. 前記中空ナノ粒子が予め凍結乾燥又は噴霧乾燥処理されている、項1〜5のいずれかに記載の方法
7. B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、リン脂質、脂質及び糖鎖から構成されるナノ粒子部と、該ナノ粒子部に内包された外因性の導入物質を含む複合粒子。
8. 前記複合粒子の粒径が150〜400nmである、項7に記載の複合粒子。
9. 前記ナノ粒子部が、70〜90重量部のB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、6〜75重量部の脂質、5〜15重量部の糖鎖から構成される、項6又は7に記載の複合粒子。
10. 項1〜6のいずれかの方法により得ることができる、導入物質を内包したナノ粒子とリポソームの複合粒子。
11. 項7〜9のいずれかに記載の複合粒子又は項10に記載の複合粒子を標的細胞に作用させることを包含する導入物質を標的細胞に導入する方法。
The present invention relates to the following composite particles and methods for producing the same.
1. A method for producing a composite particle of nanoparticles and liposomes encapsulating an introduced substance, comprising fusing hollow nanoparticles containing a hepatitis B virus protein or a variant thereof with a liposome encapsulating the introduced substance.
2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the hollow nanoparticles have a particle size of 80 to 130 nm.
3. Item 2. The method according to Item 1, wherein the composite particles have a particle size of 130 to 500 nm.
4). Item 2. The method according to Item 1, wherein the composite particles have a particle size of 150 to 400 nm.
5. Hollow nanoparticles containing hepatitis B virus protein or variant thereof are composed of 70 to 90 parts by weight of hepatitis B virus protein or variant thereof, 5 to 15 parts by weight lipid, and 5 to 15 parts by weight sugar chain Item 2. The method according to Item 1.
6). Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the hollow nanoparticles are previously freeze-dried or spray-dried. A composite particle comprising a nanoparticle part composed of hepatitis B virus protein or a variant thereof, phospholipid, lipid and sugar chain, and an exogenous introduction substance encapsulated in the nanoparticle part.
8). Item 8. The composite particle according to Item 7, wherein the composite particle has a particle size of 150 to 400 nm.
9. Item 8. The nanoparticle part is composed of 70 to 90 parts by weight of hepatitis B virus protein or a variant thereof, 6 to 75 parts by weight of lipid, and 5 to 15 parts by weight of a sugar chain. Composite particles.
10. Item 7. A composite particle of nanoparticles and liposomes encapsulating an introduced substance, which can be obtained by the method according to any one of Items 1 to 6.
11. Item 10. A method for introducing an introduction substance into target cells, which comprises causing the composite particles according to any one of Items 7 to 9 or the composite particles according to Item 10 to act on target cells.
本発明によれば、HBsAg粒子のようなタンパク質含量が高くて硬い(rigid)、中空ナノ粒子に容易に導入物質を内包させることができる。導入物質は、例えば100nm〜500nmのような導入物質の内包前の中空ナノ粒子に匹敵するあるいはそれよりはるかに大きい物質であってもよい。 According to the present invention, the introduced substance can be easily encapsulated in hollow nanoparticles having high protein content such as HBsAg particles and being rigid. The introduced substance may be a substance comparable to or much larger than the hollow nanoparticles before inclusion of the introduced substance, such as 100 nm to 500 nm.
また、リポソームを用いて導入物質を内包させた本発明の複合粒子は、中空ナノ粒子に対してエレクトロポレーション法により導入物質を内包させた粒子よりも導入物質の導入効率が向上する。 In addition, the composite particles of the present invention in which the introduction substance is encapsulated using liposomes have a higher introduction efficiency of the introduction substance than the particles in which the introduction substance is encapsulated in the hollow nanoparticles by the electroporation method.
さらに、プラスミドなどのDNA、RNAは、リポソームに封入後に中空ナノ粒子と融合することで、DNA、RNAよりも小さいサイズの複合粒子とすることができる。 Furthermore, DNA and RNA such as plasmids can be made into composite particles having a size smaller than that of DNA and RNA by fusing with hollow nanoparticles after encapsulating in liposomes.
本発明の複合粒子を用いることで、in vitroあるいはin vivoにおいて特定の細胞または組織に特異的に物質を導入することが可能となる。 By using the composite particles of the present invention, a substance can be specifically introduced into a specific cell or tissue in vitro or in vivo.
本明細書において、導入物質を内包する、B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体を含む中空ナノ粒子としては、HBsAgタンパク質粒子などが例示される。なお、HBsAgタンパク質は、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質と組み合わせて粒子を形成してもよい。 In this specification, HBsAg protein particle etc. are illustrated as a hollow nanoparticle containing the introduction | transduction substance and containing the hepatitis B virus protein or its modification. The HBsAg protein may be combined with a hepatitis B virus internal core antigen protein to form particles.
本明細書において、複合粒子、中空ナノ粒子、導入物質(核酸、タンパク質、薬物等)の大きさは、電子顕微鏡により測定してもよく、ゼーターサイザーナノ-ZS(Malvern Instruments)などにより光学的に測定してもよい。 In the present specification, the size of the composite particles, hollow nanoparticles, introduced substances (nucleic acid, protein, drug, etc.) may be measured by an electron microscope, and optically measured by a zeta sizer nano-ZS (Malvern Instruments) or the like. You may measure.
本発明で導入物質を内包するための中空ナノ粒子は、B型肝炎ウイルスタンパク質を主成分として包含し、該タンパク質は糖鎖を有していてもよい。また、該中空粒子には脂質成分が含まれていてもよい。 The hollow nanoparticle for encapsulating the introduced substance in the present invention includes a hepatitis B virus protein as a main component, and the protein may have a sugar chain. The hollow particles may contain a lipid component.
1つの好ましい実施形態において、中空ナノ粒子は、70〜90重量部のB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、5〜15重量部の脂質、5〜15重量部の糖鎖から構成される。本願の実施例で使用されている中空ナノ粒子は、B型肝炎ウイルスタンパク質80重量部、糖鎖10重量部、脂質10重量部からなる(J Biotechnol. 1992 Nov;26(2-3):155-62. Characterization of two differently glycosylated molecular species of yeast-derived hepatitis B vaccine carrying the pre-S2 region. Kobayashi M, Asano T, Ohfune K, Kato K.)。リポソームとの融合が公知のセンダイウイルスは、脂質が主成分であり、リポソームに少量のタンパク質が浮いている構造を有している(Methods Enzymol. 1993;221:18-41. Okada Y. Sendai virus-induced cell fusion.)。センダイウイルスは膜に刺さっているFタンパク質の膜融合作用により融合すると考えられている。本発明の中空ナノ粒子は、膜に刺さっているB型肝炎ウイルスタンパク質自身に膜融合活性があるとの報告は無く、本発明者が同活性を見出したことにより初めてリポソームとの融合が観察された。タンパク質含量の高いウイルス粒子に膜融合活性があることは本件出願前には誰も予測できなかった。 In one preferred embodiment, the hollow nanoparticles are composed of 70-90 parts by weight of hepatitis B virus protein or a variant thereof, 5-15 parts by weight lipid, 5-15 parts by weight sugar chain. The hollow nanoparticles used in the examples of the present application consist of 80 parts by weight of hepatitis B virus protein, 10 parts by weight of sugar chain, and 10 parts by weight of lipid (J Biotechnol. 1992 Nov; 26 (2-3): 155. -62. Characterization of two differently glycosylated molecular species of yeast-derived hepatitis B vaccine carrying the pre-S2 region. Kobayashi M, Asano T, Ohfune K, Kato K.). Sendai virus, which is known for fusion with liposomes, has a structure in which lipid is the main component and a small amount of protein floats in the liposome (Methods Enzymol. 1993; 221: 18-41. Okada Y. Sendai virus -induced cell fusion.). Sendai virus is thought to fuse by the membrane fusion action of the F protein stuck in the membrane. As for the hollow nanoparticles of the present invention, there is no report that the hepatitis B virus protein itself pierced in the membrane has a membrane fusion activity, and the fusion with liposomes is observed for the first time when the present inventors have found the same activity. It was. Prior to the filing of this application, no one could have predicted that virus particles with high protein content had membrane fusion activity.
本発明の好ましい実施形態において、リポソームと融合した後の、複合体を内包したナノ粒子部(複合体などの内包された物質以外の構造部分)は、70〜90重量部のB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、6〜75重量部の脂質(5〜15重量部の真核生物の膜の構成成分の脂質と、1〜60重量部のリポソームの構成成分の脂質を含む)、5〜20重量部の糖鎖から構成され得る。 In a preferred embodiment of the present invention, the nanoparticle part encapsulating the complex after fusing with the liposome (the structural part other than the encapsulated substance such as the complex) is 70 to 90 parts by weight of hepatitis B virus protein. Or a variant thereof, 6 to 75 parts by weight of lipid (including 5 to 15 parts by weight of eukaryotic membrane constituent lipids and 1 to 60 parts by weight of liposome constituent lipids), 5 to 20 It may be composed of parts by weight of sugar chains.
本発明の複合粒子は、少なくとも1つのリポソームと少なくとも1つの中空ナノ粒子の脂質部分が部分的または完全に融合し、この脂質膜にB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体が突き刺さった構造を有し得る(図1B)。 The composite particle of the present invention has a structure in which at least one liposome and a lipid part of at least one hollow nanoparticle are partially or completely fused, and this lipid membrane is stuck with a hepatitis B virus protein or a variant thereof. To obtain (FIG. 1B).
本発明の好ましい実施形態において、リポソームと融合した後の複合粒子の導入物質を内包したナノ粒子部(導入物質などの内包された物質以外の構造部分)は、70〜85重量部のB型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体、5〜15重量部の脂質(真核生物の膜の構成成分)、2〜30重量部の脂質(リポソームの構成成分)、5〜15重量部の糖鎖から構成され得る。 In a preferred embodiment of the present invention, the nanoparticle part (structure part other than the encapsulated substance such as the introduced substance) encapsulating the introduction substance of the composite particle after being fused with the liposome is 70 to 85 parts by weight of hepatitis B It is composed of 5-15 parts by weight of lipid (component of eukaryotic membrane), 2-30 parts by weight of lipid (component of liposome), 5-15 parts by weight of sugar chain. obtain.
リポソームは100%リン脂質のリポソームも使用可能であるが、このリポソームは柔軟性が低下する傾向にある。本発明で使用するリポソームは、リン脂質を主成分とし、コレステロールなどの少量の他の脂質成分を含むものが膜の流動性をあげて、柔軟性をもたせるために好ましい。リポソーム中のリン脂質成分はリポソーム総重量に対し80%程度またはそれ以上が好ましく、コレステロールなどの他の脂質成分はリポソーム総重量に対し20%程度またはそれ以下であるのが好ましい。中空ナノ粒子と融合したリポソームの脂質は、複合粒子の脂質膜を構成する。中空ナノ粒子とリポソームは、1:1で融合してもよく、中空ナノ粒子1個に複数のリポソームが融合することも可能であり、さらに、1個のリポソームと複数の中空ナノ粒子が融合することも可能であり、複数の中空ナノ粒子と複数のリポソームが融合することも可能である。 As the liposome, a 100% phospholipid liposome can also be used, but this liposome tends to be less flexible. As the liposome used in the present invention, those containing phospholipid as a main component and containing a small amount of other lipid components such as cholesterol are preferable because they increase the fluidity of the membrane and give flexibility. The phospholipid component in the liposome is preferably about 80% or more with respect to the total weight of the liposome, and other lipid components such as cholesterol are preferably about 20% or less with respect to the total weight of the liposome. Lipid lipids fused with hollow nanoparticles constitute a lipid membrane of composite particles. The hollow nanoparticles and the liposomes may be fused in a 1: 1 manner, and a plurality of liposomes may be fused to one hollow nanoparticle, and further, one liposome and a plurality of hollow nanoparticles are fused. It is also possible, and a plurality of hollow nanoparticles and a plurality of liposomes can be fused.
中空ナノ粒子に取り込まれる(したがって中空ナノ粒子の構成要素である)真核細胞の小胞体膜はリン脂質が主成分であり得る。リン脂質には、フォスファチヂルコリン(PC)、フォスファチジルセリン(PS)、フォスファチジルエタノールアミン(PE)などが含まれ、例えば酵母ではフォスファチジルコリン(PC)が主成分である。小胞体膜の組成は、真核細胞の種類によって変化する。中空ナノ粒子を製造するために用いられる真核細胞としては、哺乳類細胞(CHO細胞、HEK293細胞、COS細胞など)、昆虫細胞(Sf9、Sf21、HighFive株など)、酵母などが挙げられ、これらの真核細胞の小胞体膜が中空ナノ粒子の脂質の構成要素となる。 The endoplasmic reticulum membrane of eukaryotic cells that is taken up by hollow nanoparticles (and thus a component of hollow nanoparticles) can be composed mainly of phospholipids. Phospholipids include phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE), etc. For example, phosphatidylcholine (PC) is the main component in yeast. The composition of the endoplasmic reticulum membrane varies depending on the type of eukaryotic cell. Examples of eukaryotic cells used to produce hollow nanoparticles include mammalian cells (CHO cells, HEK293 cells, COS cells, etc.), insect cells (Sf9, Sf21, HighFive strains, etc.), yeast, etc. The endoplasmic reticulum membrane of eukaryotic cells is a component of the lipids of the hollow nanoparticles.
図3に示されるように、本発明の複合粒子は、エレクトロポレーションと比較して物質の導入効率が格段に優れている。 As shown in FIG. 3, the composite particles of the present invention are much more excellent in substance introduction efficiency than electroporation.
なお、本明細書において、「中空ナノ粒子」とは、導入物質を内包する前の粒子を意味し、「ナノ粒子」とは、導入物質を内包した後の粒子を意味する。「複合粒子」とは、中空ナノ粒子と、導入物質を内包したリポソームが融合し、ナノ粒子に導入物質が内包された粒子を指す。 In this specification, “hollow nanoparticle” means a particle before encapsulating the introduction substance, and “nanoparticle” means a particle after encapsulating the introduction substance. “Composite particle” refers to a particle in which hollow nanoparticles and liposomes encapsulating an introduction substance are fused, and the introduction substance is encapsulated in the nanoparticles.
HBsAgに包含され、S粒子の構成要素であるSタンパク質(226アミノ酸)は、粒子形成能を有している。S粒子に55アミノ酸からなるPre-S2を付加したのがMタンパク質(M粒子の構成蛋白)であり、M蛋白に108アミノ酸(サブタイプy)または119アミノ酸(サブタイプd)からなるPre-S1を付加したものがLタンパク質(L粒子の構成蛋白)である。 S protein (226 amino acids), which is included in HBsAg and is a component of S particles, has the ability to form particles. Pre-S2 consisting of 55 amino acids added to S particles is M protein (M particle constituent protein), and Pre-S1 consisting of 108 amino acids (subtype y) or 119 amino acids (subtype d) in M protein L protein (protein constituting L particle) is added.
なお、本願明細書では特に断らない限り、Pre-S1領域のアミノ酸位置の番号付けは、108アミノ酸のサブタイプyに基づいて行う。 In the present specification, unless otherwise specified, the numbering of amino acid positions in the Pre-S1 region is performed based on subtype y of 108 amino acids.
Lタンパク質、Mタンパク質はSタンパク質と同様に粒子形成能を有している。従って、PreS1およびPreS2の2つの領域は任意に置換、付加、欠失、挿入を行ってもよい。例えばPre-S1領域の3-77位(サブタイプy)に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質を用いることで、肝細胞認識能を失った中空粒子を得ることができる。また、PreS2領域にはアルブミンを介して肝細胞を認識する部位が含まれているので、このアルブミン認識部位を欠失させることもできる。一方、S領域(226アミノ酸)は粒子形成能を担っているので、S領域の改変は、粒子形成能を損なわないように行う必要がある。例えば、S領域の107-148は削除しても粒子形成能を保持するので(J. Virol. 2002 76 (19), 10060-10063)、置換、付加、欠失、挿入等を行ってもよく、C末端部の疎水性の154-226残基も同様に置換、付加、欠失、挿入などを行っても粒子形成能を保持し得る。一方、S領域の8-26残基部(TM1)および80-98残基部(TM2)は膜貫通helix(transmembrane配列)であり、この領域は変異を行わないか、欠失、付加、置換等は、膜貫通特性を維持するように疎水性の残基を残して行うのが望ましい。 L protein and M protein have the ability to form particles, as does S protein. Therefore, the two regions of PreS1 and PreS2 may be arbitrarily substituted, added, deleted, or inserted. For example, by using a modified protein that lacks the hepatocyte recognition site contained in position 3-77 (subtype y) of the Pre-S1 region, hollow particles that have lost the ability to recognize hepatocytes can be obtained. In addition, since the PreS2 region includes a site that recognizes hepatocytes via albumin, this albumin recognition site can also be deleted. On the other hand, since the S region (226 amino acids) is responsible for particle forming ability, modification of the S region must be performed so as not to impair the particle forming ability. For example, even if the S region 107-148 is deleted, the particle forming ability is retained (J. Virol. 2002 76 (19), 10060-10063), so substitution, addition, deletion, insertion, etc. may be performed. Similarly, the hydrophobic 154-226 residues at the C-terminal part can retain the particle forming ability even when substitution, addition, deletion, insertion, and the like are performed. On the other hand, 8-26 residues (TM1) and 80-98 residues (TM2) of S region are transmembrane helix (transmembrane sequence), and this region is not mutated, deleted, added or replaced. Etc. are preferably performed leaving a hydrophobic residue so as to maintain transmembrane properties.
1つの好ましい実施形態において、B型肝炎ウイルスタンパク質の改変体としては中空ナノ粒子を形成する能力を有する限り種々の改変体が広く包含され、HBsAgを例に取ると、PreS1とPreS2領域に関しては任意の数の置換、欠失、付加、挿入が挙げられ、S領域に関しては、1又は数個もしくは複数個、例えば1〜120個、好ましくは1〜50個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に1〜5個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されていてもよい。置換、付加、欠失、挿入などの変異を導入する方法としては、該タンパク質をコードするDNAにおいて、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス(Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987);同 100, 468 (1983);Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984))などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段(例えばDNA合成機を使用する)(J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967);同 91, 3350 (1969);Science, 150, 178 (1968);Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981))などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。 In one preferred embodiment, various variants of hepatitis B virus protein are widely encompassed as long as they have the ability to form hollow nanoparticles. Taking HBsAg as an example, the PreS1 and PreS2 regions are optional. Of the number of substitutions, deletions, additions and insertions, and with respect to the S region, one or several or plural, for example, 1 to 120, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, Preferably 1 to 10, especially 1 to 5 amino acids may be substituted, added, deleted or inserted. As a method for introducing mutations such as substitution, addition, deletion, insertion and the like, in the DNA encoding the protein, for example, cytospecific mutagenesis (Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); , 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)), chemical synthesis means such as the phosphate triester method and phosphate amidite method (for example, using a DNA synthesizer) ( J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)). Codon selection can be determined by taking into account the codon usage of the host.
B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体としてLタンパク質、Mタンパク質などの肝細胞を認識可能なタンパク質から構成される中空バイオナノ粒子の場合には、細胞認識部位を導入する必要はない。一方、Pre-S1領域の3から77アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質、或いはPreS1とPreS2の両方の領域を欠失させたタンパク質から構成される中空バイオナノ粒子の場合、そのままでは細胞認識ができないので、細胞認識部位を導入して、肝細胞以外の任意の細胞を認識させ、核酸を種々の標的細胞に導入することができる。このような特定の細胞を認識する細胞認識部位としては、例えば成長因子、サイトカイン等のポリペプチドからなる細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するためのポリペプチド分子、ウィルスおよび微生物に由来するポリペプチド分子、抗体、糖鎖などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れるEGF受容体やIL−2受容体に対する抗体やEGF、またHBVの提示するレセプターも含まれる。或いは、抗体Fcドメインを結合可能なタンパク質(例えば、ZZタグ)、ストレプトアビジンを介してビオチン標識した生体認識分子を提示するためにビオチン様活性を示すストレプトタグなどを使用することもできる。 In the case of hollow bio-nanoparticles composed of proteins capable of recognizing hepatocytes such as L protein and M protein as hepatitis B virus protein or a variant thereof, it is not necessary to introduce a cell recognition site. On the other hand, a hollow bio-nanoparticle composed of a modified protein in which the hepatocyte recognition site contained in amino acids 3 to 77 of the Pre-S1 region has been deleted, or a protein in which both the PreS1 and PreS2 regions have been deleted. In this case, since cell recognition cannot be performed as it is, a cell recognition site can be introduced to recognize any cell other than hepatocytes, and nucleic acids can be introduced into various target cells. Such cell recognition sites for recognizing specific cells include, for example, cell function regulatory molecules consisting of polypeptides such as growth factors and cytokines, cell surface antigens, tissue-specific antigens, receptors and other cells and tissues. Polypeptide molecules derived from these, polypeptide molecules derived from viruses and microorganisms, antibodies, sugar chains and the like are preferably used. Specifically, antibodies against EGF receptor and IL-2 receptor that appear specifically in cancer cells, EGF, and receptors presented by HBV are also included. Alternatively, a protein capable of binding an antibody Fc domain (for example, a ZZ tag), a strept tag showing biotin-like activity to present a biorecognition molecule labeled with biotin via streptavidin, and the like can also be used.
上記ZZタグとは、イムノグロブリンGのFc領域と結合する能力を有するアミノ酸配列と規定され、次の2回繰り返し配列からなる(ZZ タグ の配列(配列番号1):
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK)。
The ZZ tag is defined as an amino acid sequence having the ability to bind to the Fc region of immunoglobulin G, and consists of the following twice-repeated sequence (ZZ tag sequence (SEQ ID NO: 1):
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK).
細胞認識部位がポリペプチドである場合には、B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体をコードするDNAと細胞認識部位をコードするDNAを必要に応じてスペーサーペプチドをコードするDNAを介してインフレームに連結し、これをベクター等に組み込み、真核細胞で発現させることにより、任意の標的細胞を認識する中空バイオナノ粒子を得ることができる。 When the cell recognition site is a polypeptide, the DNA encoding the hepatitis B virus protein or a variant thereof and the DNA encoding the cell recognition site are in-frame via the DNA encoding the spacer peptide as necessary. Hollow bio-nanoparticles that recognize any target cell can be obtained by ligation, incorporation into a vector or the like, and expression in eukaryotic cells.
細胞認識部位が抗体である場合、B型肝炎ウイルスタンパク質またはその改変体をコードするDNAとZZタグをコードするDNAを必要に応じてスペーサーペプチドをコードするDNAを介してインフレームに連結し、これをベクター等に組み込み、真核細胞で発現させ、得られた中空バイオナノ粒子と標的細胞を認識し得る抗体を混合することにより、目的とする、中空バイオナノ粒子を得ることができる。 When the cell recognition site is an antibody, a DNA encoding a hepatitis B virus protein or a variant thereof and a DNA encoding a ZZ tag are linked in-frame via a DNA encoding a spacer peptide, if necessary. Is incorporated into a vector or the like, expressed in a eukaryotic cell, and the resulting hollow bionanoparticle and an antibody capable of recognizing the target cell are mixed to obtain the desired hollow bionanoparticle.
細胞認識部位が糖鎖の場合、中空ナノ粒子に化学修飾によりビオチンを付加し、ストレプトアビジンなどを介してビオチン標識糖鎖などを提示する方法が挙げられる。 When the cell recognition site is a sugar chain, biotin is added to the hollow nanoparticle by chemical modification, and a biotin-labeled sugar chain or the like is presented via streptavidin or the like.
HBsAgタンパク質の改変体としては、抗原性(エピトープなどの抗原性に関与する部位を欠失/置換した改変体)、粒子構造の安定性、細胞選択性等を改変した改変体であってもよい。 The variant of HBsAg protein may be a variant with altered antigenicity (a variant in which a site involved in antigenicity such as an epitope is deleted / replaced), particle structure stability, cell selectivity, etc. .
中空ナノ粒子の大きさは、50〜500nm、好ましくは80〜130nm程度である。中空ナノ粒子は、特に封入される導入物質が大きい場合にはある程度以上の大きさであるのが望ましい。中空ナノ粒子を大きくするためには、例えばS領域のN末端に付加しているPre-S領域のサイズを大きくすると(Pre-S1+Pre-S2を足した163残基(サブタイプy)よりも大きくすると)粒子のサイズが大きくなることが本発明者により確認されている。 The size of the hollow nanoparticles is about 50 to 500 nm, preferably about 80 to 130 nm. The hollow nanoparticles are desirably larger than a certain size, particularly when the introduced substance to be encapsulated is large. To increase the size of the hollow nanoparticles, for example, increase the size of the Pre-S region added to the N-terminus of the S region (from 163 residues (subtype y) plus Pre-S1 + Pre-S2) It has been confirmed by the inventor that the size of the particles increases.
該粒子を構成するB型肝炎ウイルスタンパク質又はその改変体としてより長いものを使用すればよい。例えば肝細胞を標的化する場合にはL粒子或いは同等程度の大きさの中空バイオナノ粒子が好ましく使用され、S蛋白/M蛋白、或いはPre-S1領域の3から77アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させたタンパク質に細胞認識部位を導入して、肝細胞以外の細胞を標的化する中空粒子を得ることができる。 What is necessary is just to use a longer thing as the hepatitis B virus protein which comprises this particle | grain, or its modification. For example, when targeting hepatocytes, L particles or hollow bio-nanoparticles of the same size are preferably used, and hepatocytes contained in S protein / M protein or 3 to 77 amino acid residues in the Pre-S1 region By introducing a cell recognition site into a protein lacking the recognition site, hollow particles targeting cells other than hepatocytes can be obtained.
真核細胞でHBsAgタンパク質を発現させると、該タンパク質は、小胞体膜上に膜蛋白として発現、蓄積され、ナノ粒子として放出されるので好ましい。真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。このような粒子は、HBVゲノムを全く含まないので、人体への安全性が極めて高い。また、必要に応じて細胞認識分子を粒子を構成するタンパク質の少なくとも一部に導入することにより、肝細胞或いは他の細胞に対する本発明のナノ粒子の細胞選択性を高めることができる。 When the HBsAg protein is expressed in eukaryotic cells, the protein is preferably expressed and accumulated as a membrane protein on the endoplasmic reticulum membrane, and released as nanoparticles. As eukaryotic cells, animal cells such as mammals, yeast and the like can be applied. Since such particles do not contain any HBV genome, they are extremely safe for the human body. Moreover, the cell selectivity of the nanoparticles of the present invention for hepatocytes or other cells can be enhanced by introducing a cell recognition molecule into at least a part of the protein constituting the particles as necessary.
本発明の製造法では、HBsAgタンパク質を構成成分とする中空ナノ粒子を凍結乾燥し、その後、リポソームと融合、複合化するのが特に好ましい。凍結乾燥に代えて噴霧乾燥したものも使用できる。凍結乾燥もしくは噴霧乾燥した中空ナノ粒子を使用することで、融合効率が著しく向上する。 In the production method of the present invention, it is particularly preferable that the hollow nanoparticles containing HBsAg protein as a constituent component are freeze-dried and then fused and complexed with liposomes. Spray-dried ones can be used instead of freeze-drying. By using freeze-dried or spray-dried hollow nanoparticles, the fusion efficiency is significantly improved.
本発明の1つの実施形態において、HBsAgタンパク質を構成成分とするナノ粒子は、いったん凍結乾燥もしくは噴霧乾燥した後にリポソームと混合することにより複合粒子となり、中空ナノ粒子の内部にリポソームに封入された導入物質を取り込むことができる。従来法ではエレクトロポレーション法により導入物質を中空ナノ粒子に取り込ませていたが、本発明の方法により、導入物質の中空ナノ粒子への取り込みをより簡便に行うことができ、しかも細胞への導入効率も向上させることができる。 In one embodiment of the present invention, nanoparticles containing HBsAg protein as a constituent component are once freeze-dried or spray-dried and then mixed with liposomes to form composite particles, which are introduced into liposomes enclosed in hollow nanoparticles. Substances can be taken up. In the conventional method, the introduction substance is taken into the hollow nanoparticle by electroporation, but the introduction substance can be more easily taken into the hollow nanoparticle by the method of the present invention, and the introduction into the cell is possible. Efficiency can also be improved.
なお、凍結乾燥、噴霧乾燥に代えて凍結・急速融解、熱処理を行うことも可能である。 It is also possible to perform freezing / rapid thawing and heat treatment instead of freeze drying or spray drying.
必要に応じて凍結乾燥した中空ナノ粒子とリポソームの混合は、例えば中空ナノ粒子(凍結乾燥物)1mgあたり、リポソーム0.1〜10mg程度、好ましくは0.5〜2mg程度を使用し、37℃程度の温度下に10分程度混合することにより容易に行うことができる。中空ナノ粒子に対するリポソームの使用量が多すぎると、導入物質の細胞への導入効率が低下する。一方、リポソームの量が少なすぎると、中空ナノ粒子に導入物質を封入する効率が低下する。 Mixing of lyophilized hollow nanoparticles and liposomes as necessary is performed at a temperature of about 37 ° C., for example, using about 0.1 to 10 mg, preferably about 0.5 to 2 mg of liposomes per 1 mg of hollow nanoparticles (lyophilized product). For about 10 minutes. If the amount of liposome used for the hollow nanoparticles is too large, the efficiency of introducing the introduced substance into the cells will be reduced. On the other hand, if the amount of liposomes is too small, the efficiency of encapsulating the introduced substance in the hollow nanoparticles decreases.
本発明の好ましい実施形態において、リポソームと複合化する前の中空ナノ粒子の粒径は、80〜130nm程度であり、リポソームと複合化してナノ粒子の内部に導入物質を取り込ませた後の複合化ナノ粒子(複合粒子)の粒径は、130〜500nm程度、例えば、150〜400nm、より好ましくは200〜400nm程度である。 In a preferred embodiment of the present invention, the particle size of the hollow nanoparticles before complexing with the liposome is about 80 to 130 nm, and complexing after complexing with the liposome and incorporating the introduced substance into the interior of the nanoparticle The particle size of the nanoparticles (composite particles) is about 130 to 500 nm, for example, 150 to 400 nm, more preferably about 200 to 400 nm.
リポソームは、多重層リポソーム、一枚膜リポソームのいずれであってもよい。リポソームの大きさは50〜300nm程度(例えば100〜300nm)、好ましくは80〜250nm程度、より好ましくは100〜200nm程度、特に好ましくは100〜150nm程度である。リポソームの大きさは、中空ナノ粒子の0.5〜2倍程度の大きさであるのが好ましい。 The liposome may be either a multilamellar liposome or a monolayer liposome. The size of the liposome is about 50 to 300 nm (for example, 100 to 300 nm), preferably about 80 to 250 nm, more preferably about 100 to 200 nm, and particularly preferably about 100 to 150 nm. The size of the liposome is preferably about 0.5 to 2 times that of the hollow nanoparticle.
リポソームがナノ粒子に対して大きすぎても小さすぎても円滑な複合粒子の形成が妨げられる。 If the liposome is too large or too small relative to the nanoparticle, formation of a smooth composite particle is prevented.
リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法などにより製造することができる。 Liposomes can be produced by ultrasonic treatment, reverse phase evaporation, freeze-thaw, lipid dissolution, spray drying, and the like.
リポソームの構成成分としては、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸などが挙げられ、具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質が挙げられる。リン脂質は様々な飽和度を有する脂質を組み合わせて使用するのが望ましい。その他、コレステロール類としては、コレステロール、フィトステロールなどが挙げられ、脂肪酸としてはオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、或いはこれら不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物が挙げられる。側鎖の小さい不飽和脂肪酸を含むリポソームは曲率の関係から小さいリポソーム作製に有効である。 Examples of liposome components include phospholipids, cholesterols, fatty acids, and the like. Specifically, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean In addition to natural phospholipids such as lecithin and lysolecithin, or those hydrogenated by conventional methods, distearoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylserine, eleostearoyl phosphatidylcholine, eleostearoyl phosphatidylethanol Amine, eleostearoyl phosphatidylserine Like synthetic phospholipids of. It is desirable to use phospholipids in combination with lipids having various degrees of saturation. In addition, cholesterols include cholesterol, phytosterol, and the like, and examples of fatty acids include oleic acid, palmitooleic acid, linoleic acid, and fatty acid mixtures containing these unsaturated fatty acids. Liposomes containing unsaturated fatty acids with small side chains are effective in producing small liposomes because of curvature.
リポソームの製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに導入物質を含む水溶液、好ましくは緩衝液を加えて攪拌して、導入物質を内包したリポソームを得ることができる。該リポソームを直接、またはいったん凍結乾燥した後に、凍結乾燥処理された本発明のナノ粒子と混合することにより、リポソームとナノ粒子の複合粒子を得ることができる。 An example of a method for producing liposomes will be described in detail. For example, the above-described phospholipids, cholesterol and the like are dissolved in an appropriate organic solvent, put in an appropriate container, the solvent is distilled off under reduced pressure, and the inner surface of the container is removed. A phospholipid membrane is formed, and an aqueous solution containing an introduction substance, preferably a buffer solution, is added thereto and stirred to obtain a liposome encapsulating the introduction substance. The liposome is directly or once lyophilized, and then mixed with the freeze-dried nanoparticles of the present invention, whereby composite particles of liposomes and nanoparticles can be obtained.
本発明の複合粒子は、特定の細胞に対して特異的に導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、該複合粒子を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞或いは他の細胞に選択的/特異的な物質により標的細胞に導かれ、導入物質が標的細胞に導入される。 The composite particles of the present invention are useful as those for specifically introducing an introduced substance into specific cells. For example, if the composite particle is administered into the body by intravenous injection or the like, the particle circulates in the body and is guided to the target cell by a substance selective / specific to hepatocytes or other cells presented on the particle surface, An introduced substance is introduced into the target cell.
また、本発明の複合粒子は、標的細胞とin vitroで混合することにより細胞導入試薬としても好ましく使用できる。 The composite particles of the present invention can also be preferably used as a cell introduction reagent by mixing with target cells in vitro.
細胞に導入される物質としては、特に限定されず、例えば細胞内に導入されて生理作用を生じる各種薬物、例えばホルモン、リンホカイン、酵素などの生理活性蛋白質;ワクチンとして作用する抗原性蛋白質;細胞内で発現する遺伝子、プラスミド等のポリヌクレオチド、又は発現を誘発もしくは誘導する特定の遺伝子発現に関与するポリヌクレオチド;さらに遺伝子治療のために導入される各種遺伝子及びアンチセンスDNA/RNA等を挙げることができる。なお、導入される「遺伝子」には、DNAだけでなくRNAも含まれる。また、導入される物質は蛋白質、遺伝子などの高分子の生理活性物質が好ましく例示できるが、低分子量の各種薬物に適用しても好ましい結果を得ることができる。また、遺伝子、タンパク質などは天然のものでも合成されたものでもよく、改変された遺伝子、タンパク質であってもよい。 The substance to be introduced into the cell is not particularly limited. For example, various drugs that are introduced into the cell to cause physiological action, for example, physiologically active proteins such as hormones, lymphokines, enzymes, etc .; antigenic proteins that act as vaccines; Genes expressed in, polynucleotides such as plasmids, or polynucleotides involved in specific gene expression that induces or induces expression; various genes introduced for gene therapy and antisense DNA / RNA, etc. it can. The “gene” to be introduced includes not only DNA but also RNA. The introduced substance is preferably a high molecular weight physiologically active substance such as a protein or a gene, but preferable results can be obtained even when applied to various low molecular weight drugs. In addition, genes and proteins may be natural or synthesized, and may be modified genes and proteins.
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものでなく、細部についてはさまざまな態様が可能であることは言うまでもない。 Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
以下の実施例において、HBsAgとは、B型肝炎ウイルス表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen)を示す。HBsAgは真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。その後、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら出芽様式でルーメン側にHBsAg粒子として放出される。 In the following examples, HBsAg refers to hepatitis B virus surface antigen. When expressed in eukaryotic cells, HBsAg is expressed and accumulated as a membrane protein on the endoplasmic reticulum membrane. After that, aggregation occurs between molecules, and it is released as HBsAg particles to the lumen side in a budding manner while taking up the endoplasmic reticulum membrane.
なお、HBsAg粒子は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などの真核細胞を利用して発現させ、これを精製した後に得たものである(特許文献1〜3)。 The HBsAg particles are obtained after expression using eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells and purification thereof (Patent Documents 1 to 3).
また、以下において「BNC」はバイオナノカプセルの略であり、HBsAg粒子、HBsAg粒子とリポソームが融合した複合粒子(遺伝子などの導入物質をHBs粒子内に含む粒子)の両方の意味に使用される。 In the following, “BNC” is an abbreviation for bio-nanocapsule, and is used to mean both HBsAg particles and composite particles in which HBsAg particles and liposomes are fused (particles that contain an introduced substance such as a gene in HBs particles).
実験方法
材料
BNCは既知の論文に記載の方法に従い酵母から調製し(Kuroda, S., Otaka, S., Miyazaki, T., Nkao, M. and Fujisawa, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267(3), 1953-1961)、AKTA (Amershambiosciences co., Japan)を用いて精製した。リポソーム(Coatsome EL-01-A, Coatsome EL-01-D)は、NOF corporation (Tokyo, Japan)から購入した。フルオロフォアカルボキシレート−修飾マイクロスフェア(100-nm ポリスチレンビーズ)は、Molecular probes Inc. (Eugene, OR)から購入した。プラスミドpEGFP-C1は、Clonetech laboratories Inc. (Takara bio Inc., Japan) から購入し、 プラスミドpcDNA6.2/C-EmGFPとpAD/CMV-GFPはInvitrogen co. (Carlsbad, CA) から購入した。
Experimental method <br/> Materials
BNC was prepared from yeast according to a method described in a known paper (Kuroda, S., Otaka, S., Miyazaki, T., Nkao, M. and Fujisawa, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267 ( 3), 1953-1961) and AKTA (Amershambiosciences co., Japan). Liposomes (Coatsome EL-01-A, Coatsome EL-01-D) were purchased from NOF corporation (Tokyo, Japan). Fluorophore carboxylate-modified microspheres (100-nm polystyrene beads) were purchased from Molecular probes Inc. (Eugene, OR). Plasmid pEGFP-C1 was purchased from Clonetech laboratories Inc. (Takara bio Inc., Japan), and plasmids pcDNA6.2 / C-EmGFP and pAD / CMV-GFP were purchased from Invitrogen co. (Carlsbad, CA).
BNCとリポソームの融合
100-nm ポリスチレンビーズをリポソームに封入するために、凍結乾燥リポソーム(Coatsome-El-01-A)を100-nm ポリスチレンビーズの水溶液(0.2% w/v)に溶解し、次いで室温で穏やかに振盪した。DNAのリポソームへの封入のために、凍結乾燥リポソーム(Coatsome-EL-01-A)を 室温で15分間DNAの水溶液 (250μg/mL)に溶解した。導入物(100-nm ポリスチレンビーズまたは遺伝子)を含むリポソームを凍結乾燥BNCに加え、室温で15分間処理した。
Fusion of BNC and liposome
To encapsulate 100-nm polystyrene beads in liposomes, lyophilized liposomes (Coatsome-El-01-A) were dissolved in an aqueous solution of 100-nm polystyrene beads (0.2% w / v) and then gently shaken at room temperature. did. For encapsulation of DNA in liposomes, lyophilized liposomes (Coatsome-EL-01-A) were dissolved in an aqueous DNA solution (250 μg / mL) at room temperature for 15 minutes. Liposomes containing the transduct (100-nm polystyrene beads or genes) were added to lyophilized BNC and treated for 15 minutes at room temperature.
透過電子顕微鏡(TEM)
リポソーム融合BNCを視覚的に調べるために、文献(Kuroda, S., Otaka, S., Miyazaki, T., Nkao, M. and Fujisawa, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267(3), 1953-1961)に記載の方法に従い、TEM (JEOL, Japan)により観察した。
Transmission electron microscope (TEM)
To visually examine liposome-fused BNC, the literature (Kuroda, S., Otaka, S., Miyazaki, T., Nkao, M. and Fujisawa, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267 (3) , 1953-1961), and observed with TEM (JEOL, Japan).
粒子サイズ
粒子サイズは、Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., U.K.)を用いて25℃で測定した。この測定は、動的光散乱法に基づき; Z-平均粒子サイズはEinstein-Stokes式に基づき評価された。
Particle size The particle size was measured at 25 ° C. using a Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., UK). This measurement was based on dynamic light scattering; the Z-average particle size was estimated based on the Einstein-Stokes equation.
細胞
HepG2 (human hepatocellular carcinoma) 細胞とA431 (human epidermoid carcinoma)細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を添加したダルベッコの改良MEM培地で維持した。WiDr (human colon adenocarcinoma) とNuE (human hepatocellular carcinoma, 防衛医科大学校のT. Tadakumaから得た)細胞は、10% FBSを添加したRPMI 1640培地で維持された。これらの細胞は、5% CO2中37℃でインキュベートされた。
cell
HepG2 (human hepatocellular carcinoma) cells and A431 (human epidermoid carcinoma) cells were maintained in Dulbecco's modified MEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). WiDr (human colon adenocarcinoma) and NuE (human hepatocellular carcinoma, obtained from T. Tadakuma, National Defense Medical College) cells were maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS. These cells were incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 .
マウス異種移植モデル
5週齢の雄性BALB/c ヌード(nu/nu)マウスをCLEA Japan, Inc. (Osaka, Japan)から購入した。動物は、文部科学省のガイドラインに沿って処理した。約5x106のカルチノーマ細胞(NuEとA431)をマウスの背中に皮下注射した。2週間後、マウスに100-nmポリスチレンビーズ 含有BNCまたはGFPプラスミドを静脈内注射した。
Mouse xenograft model
5-week old male BALB / c nude (nu / nu) mice were purchased from CLEA Japan, Inc. (Osaka, Japan). Animals were treated according to the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology guidelines. Approximately 5 × 10 6 carcinoma cells (NuE and A431) were injected subcutaneously into the back of the mice. Two weeks later, mice were injected intravenously with BNC or GFP plasmid containing 100-nm polystyrene beads.
組織学的分析
マウスをペントバルビタール(Dainippon sumitomo pharma Co., Japan)で麻酔し、腫瘍、肝臓及び腎臓を摘出した。これらの組織を4% (wt/vol) パラホルムアルデヒドで固定し、Technovit 8100 (Kluzer, Germany)で合成樹脂に包埋した。ブロックを5μmの幅で切片とし、次いでLSM5 PASCALレーザースキャンニング共焦点顕微鏡(Carl ziess, Germany)で観察した。
Histological analysis The mice were anesthetized with pentobarbital (Dainippon sumitomo pharma Co., Japan), and the tumor, liver and kidney were removed. These tissues were fixed with 4% (wt / vol) paraformaldehyde and embedded in synthetic resin with Technovit 8100 (Kluzer, Germany). Blocks were sectioned at a width of 5 μm and then viewed with an LSM5 PASCAL laser scanning confocal microscope (Carl ziess, Germany).
実施例1 リポソームを介したHBsAg粒子への物質の内包
FITC標識ポリスチレンビーズ(FluospheresR(直径100 nm)、Molecular Probe社製)を滅菌水にて10 mg/mlに調製したFITC標識ポリスチレンビーズ溶液1 mlを、8.5%ショ糖とともに凍結乾燥した空リポソーム(COATSOME EL-01-A、日本油脂社製)へ加えて均一になるよう混合し、FITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソーム溶液を調製した。調製したFITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソーム溶液を、ベックマン社超遠心スイングローターSW41相当品において、6%ショ糖溶液3.5 ml、10%ショ糖溶液3.5 ml、30%ショ糖溶液3.5 mlを用いて密度勾配を作成した分離溶液の上層に載せ、24,000 rpm、4℃の条件にて1時間、超遠心分離を行うことにより、リポソームに包含されなかったFITC標識ポリスチレンビーズを除去し、FITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソームを回収した。PBS(リン酸バッファー生理食塩水)中にショ糖溶液を終濃度5%となるようにHBsAg粒子と混合した溶液を一晩凍結乾燥することで得た凍結乾燥HBsAg粒子(Vaccine. 2001 Apr 30;19(23-24):3154-63. Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1 + pre-S2 + S) protein. Yamada T, Iwabuki H, Kanno T, Tanaka H, Kawai T, Fukuda H, Kondo A, Seno M, Tanizawa K, Kuroda S.)とFITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソームを均一になるように混合し、HBsAg粒子とFITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソームの融合を行い、その結果、FITC標識ポリスチレンビーズ包含HBsAg融合粒子を得た。この融合反応は、混合後、37℃で1時間加温することでリポソームとHBsAg粒子の融合をより促進した。また、この試料を先ほどと同様に10%ショ糖溶液3.5 ml、30%ショ糖溶液3.5 ml、50%ショ糖溶液3.5 mlを用いて密度勾配を作成した分離溶液の上層に載せ、24,000 rpm、4℃の条件にて2時間、超遠心分離を行うことにより、HBsAg融合粒子のみを回収することができた。図1は超遠心分離した後、遠心管上部から回収した画分の分離状況を示したグラフであり、Fraction 8にあるピークがHBsAg融合粒子に相当し、当該ピーク分画を回収することによりHbsAg複合粒子(BNC)を得た。BNCの大部分はリポソームと融合し、遊離のBNCはほとんど存在しなかった。リポソーム融合BNCはTEMで観察された(Fig. 1B)。リポソーム融合BNCの電子顕微鏡写真は、BNCがFITC-ビーズを封入するリポソームに囲まれていることを示した。BNCの平均サイズは約200 nmであった(表1)。
Example 1 Encapsulation of substance in HBsAg particles via liposome
FITC-labeled polystyrene beads (Fluospheres R (diameter 100 nm), manufactured by Molecular Probe) prepared in sterile water at 10 mg / ml, 1 ml of FITC-labeled polystyrene beads solution freeze-dried with 8.5% sucrose ( COATSOME EL-01-A (manufactured by NOF Corporation) and mixed uniformly to prepare a FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposome solution. The prepared FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposome solution in a Beckman ultracentrifugal swing rotor SW41 equivalent product was used with a 6% sucrose solution, 3.5 ml, a 10% sucrose solution, 3.5 ml, and a 30% sucrose solution, 3.5 ml. The FITC-labeled polystyrene beads that were not included in the liposomes were removed by ultracentrifugation for 1 hour at 24,000 rpm and 4 ° C, and placed on the upper layer of the separation solution. Was recovered. Freeze-dried HBsAg particles (Vaccine. 2001 Apr 30; obtained by lyophilizing overnight a solution prepared by mixing sucrose solution with HBsAg particles to a final concentration of 5% in PBS (phosphate buffer saline); 19 (23-24): 3154-63. Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1 + pre-S2 + S) protein.Yamada T, Iwabuki H, Kanno T, Tanaka H, Kawai T, Fukuda H, Kondo A, Seno M, Tanizawa K, Kuroda S.) and FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposomes are mixed uniformly to fuse HBsAg particles with FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposomes. As a result, HBsAg fused particles including FITC-labeled polystyrene beads were obtained. This fusion reaction further promoted the fusion of liposomes and HBsAg particles by heating at 37 ° C. for 1 hour after mixing. In addition, this sample was placed on the upper layer of the separation solution prepared with a density gradient using 3.5 ml of 10% sucrose solution, 3.5 ml of 30% sucrose solution, and 3.5 ml of 50% sucrose solution as before, 24,000 rpm, Only HBsAg fused particles could be recovered by ultracentrifugation at 4 ° C for 2 hours. FIG. 1 is a graph showing the state of separation of the fraction collected from the upper part of the centrifuge tube after ultracentrifugation. The peak in Fraction 8 corresponds to HBsAg fused particles. By collecting the peak fraction, HbsAg Composite particles (BNC) were obtained. Most of the BNC was fused with liposomes, and there was almost no free BNC. Liposome-fused BNC was observed by TEM (Fig. 1B). Electron micrographs of liposome-fused BNC showed that BNC was surrounded by liposomes encapsulating FITC-beads. The average size of BNC was about 200 nm (Table 1).
表1に示されるように、本発明の複合粒子は、GFPプラスミドのような核酸(DNA/RNA)をコンパクト化(サイズを縮小)することができ、ドラッグデリバリーシステム(DDS)に適している。 As shown in Table 1, the composite particle of the present invention can compact a nucleic acid (DNA / RNA) such as a GFP plasmid (reducing the size), and is suitable for a drug delivery system (DDS).
実施例2 リポソームを介して物質を内包させたHBsAg粒子によるヒト肝癌細胞HepG2への物質導入
指数増殖期にあるヒト肝癌細胞HepG2を1×104細胞/ウェルになるように96穴プラスティック底皿プレートに播種し、37℃、5%CO2存在下にて10%ウシ胎児血清を含むMEM(修飾Eagle培地)を用いて一晩培養した。翌日、実施例1の通り、FITC標識ポリスチレンビーズ(直径100nm)、凍結乾燥リポソーム、凍結乾燥HBsAg粒子を用いてFITC標識ポリスチレンビーズ包含HBsAg粒子を調製した後、これをHepG2培養液へ添加し、37℃、5%CO2存在下にて一晩培養した。
Example 2 Introduction of substance into human hepatoma cell HepG2 by HBsAg particles encapsulating substance via liposome
Human hepatoma cell HepG2 in the exponential growth phase is seeded on a 96-well plastic bottom plate at 1 × 10 4 cells / well, and MEM containing 10% fetal bovine serum in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. (Modified Eagle's medium) was used for overnight culture. The next day, as in Example 1, FITC-labeled polystyrene beads (diameter 100 nm), freeze-dried liposomes, freeze-dried HBsAg particles were used to prepare FITC-labeled polystyrene bead-containing HBsAg particles, which were then added to the HepG2 culture solution. ° C., and cultured overnight at the presence of 5% CO 2.
HepG2内へ導入されたFITC標識ポリスチレンビーズ量を定量するためにプレートリーダーにて測定した。また、HepG2内へのFITC標識ポリスチレンビーズの導入の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。 In order to quantify the amount of FITC-labeled polystyrene beads introduced into HepG2, it was measured with a plate reader. The state of introduction of FITC-labeled polystyrene beads into HepG2 was observed with a confocal laser fluorescence microscope.
FITC標識ポリスチレンビーズの定量結果を図2のグラフに示した。また、HepG2の蛍光写真を図3に示した。図2、図3には、HepG2の対照として用いたヒト大腸癌細胞WiDrにおける結果を併せて示した。図2のグラフから、HepG2、WiDrともにFITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソーム単独の場合に比べて、HBsAg粒子と融合した融合粒子を用いたHepG2への導入では約10倍の蛍光強度を示した。一方、融合粒子を用いた場合でもWiDrではほとんど差が見られなかったことから、リポソームと融合した後もHBsAg粒子の肝細胞への特異性は維持されたままであることが分かった。図3では、FITC標識ポリスチレンビーズに代わってRITC標識ポリスチレンビーズを用いた際の写真を示した。図3の結果より、リポソームと融合したHBsAg粒子による導入は、HepG2のみに観察された。 The quantitative results of the FITC-labeled polystyrene beads are shown in the graph of FIG. A fluorescence photograph of HepG2 is shown in FIG. FIGS. 2 and 3 also show the results of the human colon cancer cell WiDr used as a control for HepG2. From the graph of FIG. 2, both HepG2 and WiDr showed about 10 times the fluorescence intensity when introduced into HepG2 using fused particles fused with HBsAg particles, compared to the case where only FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposomes were used. On the other hand, even when fused particles were used, there was almost no difference with WiDr, indicating that the specificity of HBsAg particles to hepatocytes remained maintained after fusion with liposomes. In FIG. 3, the photograph at the time of using RITC labeled polystyrene beads instead of FITC labeled polystyrene beads is shown. From the results shown in FIG. 3, introduction by HBsAg particles fused with liposomes was observed only in HepG2.
以上より、この発明のリポソームによって物質を封入したHBsAg粒子を用いて、培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で物質を導入することが可能であることが示された。 From the above, it was shown that it is possible to introduce a substance with extremely high specificity and efficiency to human hepatocytes at the level of cultured cells using HBsAg particles encapsulated with the liposome of the present invention. .
実施例3 リポソームを介して物質を内包させたHBsAg粒子によるヒト肝癌を移植したヌードマウスに対する物質導入
担癌マウスは、ヌードマウス(系統:BALB/c, nu/nu, 微生物学的品質:SPF、性別:オス5週齢)の両側背部皮下に、ヒト肝癌由来細胞NuEをそれぞれ2×105個の細胞を注射し、移植腫瘍が直径2 cm程度の固形癌になるまで2〜3週間生育させて得た。
Example 3 Substance introduction into nude mice transplanted with human liver cancer by HBsAg particles encapsulating substance via liposomes
Tumor-bearing mice were nude mice (strain: BALB / c, nu / nu, microbiological quality: SPF, sex: male 5 weeks of age) subcutaneously on the dorsal dorsal area, 2 × 10 5 human hepatocarcinoma-derived cells each The cells were injected and grown for 2-3 weeks until the transplanted tumor became a solid tumor of about 2 cm in diameter.
実施例1で記載した方法により得たFITC標識ポリスチレンビーズ包含HBsAg融合粒子100μg(100μlのPBSに溶解)を、マウス尾静脈内へ26G注射針を使用して投与した。投与16時間後、麻酔下にて開腹し、常法に従って灌流固定を行った後、腫瘍部、肝臓、腎臓を摘出し、樹脂包埋キット(Technovit 8100)を用いて組織を固定・包埋した。 100 μg of FIB-labeled polystyrene bead-containing HBsAg fusion particles obtained by the method described in Example 1 (dissolved in 100 μl of PBS) was administered into the mouse tail vein using a 26G injection needle. 16 hours after administration, the abdomen was opened under anesthesia, and after perfusion fixation was performed according to a conventional method, the tumor, liver, and kidney were removed, and the tissue was fixed and embedded using a resin embedding kit (Technovit 8100). .
具体的には、開腹後、21G翼付き注射針を左心室に刺し、右心耳を開切、PBSを流して脱血させた。その後、予め氷冷しておいた4%中和ホルムアルデヒドを流し、組織内をホルムアルデヒド溶液にて満たした。組織摘出後、さらに4%中和ホルムアルデヒドに4℃にて2時間浸漬して固定し、6.8%ショ糖-PBS液に4℃にて一晩浸漬した。翌日、100%アセトンにて脱水を行い、その後、Technovit 8100にて4℃24時間以内の浸漬を行い、取り出した後、4℃にて静置して重合反応を行った。 Specifically, after laparotomy, a 21G winged injection needle was inserted into the left ventricle, the right atrial appendage was opened, and blood was removed by flowing PBS. Thereafter, 4% neutralized formaldehyde that had been ice-cooled in advance was poured, and the tissue was filled with the formaldehyde solution. After tissue removal, the tissue was further fixed by immersion in 4% neutralized formaldehyde at 4 ° C for 2 hours, and then immersed in 6.8% sucrose-PBS solution at 4 ° C overnight. The next day, dehydration was carried out with 100% acetone, and then immersion was carried out with Technonov 8100 within 4 ° C. for 24 hours. After removal, the polymer was allowed to stand at 4 ° C. for polymerization reaction.
常法に従って、切片を作製し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡によりHBsAg粒子投与群と非投与群のFITC標識ポリスチレンビーズによる蛍光を比較した(図4)。 According to a conventional method, sections were prepared, and the fluorescence of FITC-labeled polystyrene beads in the HBsAg particle-administered group and the non-administered group was compared with a confocal laser fluorescence microscope (FIG. 4).
図4より、ヒト肝癌由来NuE細胞による担癌マウスの腫瘍部にFITC標識ポリスチレンビーズに由来する蛍光が認められた。しかし、同マウスより同時に摘出した肝臓、腎臓には蛍光を認めなかった。また、FITC標識ポリスチレンビーズ単独、あるいはFITC標識ポリスチレンビーズ封入リポソーム単独では、腫瘍部を含めた担癌マウスの組織には蛍光は認められなかった。 From FIG. 4, fluorescence derived from FITC-labeled polystyrene beads was observed in the tumor part of the tumor-bearing mouse by human liver cancer-derived NuE cells. However, no fluorescence was observed in the liver and kidney simultaneously removed from the mouse. In addition, with the FITC-labeled polystyrene beads alone or the FITC-labeled polystyrene bead-encapsulated liposomes alone, no fluorescence was observed in the tissues of tumor-bearing mice including the tumor site.
以上より、リポソームにより物質を封入されたHBsAg粒子は、実験動物レベルでも、ヒト肝癌細胞に対して極めて高い特異性と効率で物質導入を可能にすることが判明した。 From the above, it was found that HBsAg particles encapsulated with liposomes enable the introduction of substances with extremely high specificity and efficiency even at the experimental animal level for human hepatoma cells.
実施例4 リポソームを介して物質を内包させたZZタグ表面提示HBsAg粒子(ZZ-HBsAg粒子)によるヒト扁平上皮癌細胞A431への物質導入
指数増殖期にあるヒト扁平上皮癌細胞A431を1×104細胞/ウェルになるように96穴プラスティック底皿プレートに播種し、37℃、5%CO2存在下にて10%ウシ胎児血清を含むMEMを用いて一晩培養した。翌日、実施例1の通り、FITC標識ポリスチレンビーズ、凍結乾燥リポソーム、凍結乾燥したZZ-HBsAg粒子(PCT/JP03/03694)を用いて、FITC標識ポリスチレンビーズ包含ZZ-HBsAg融合粒子を調製した。その後、ヒト上皮成長因子受容体(human Epidermal Growth Factor Receptor; hEGFR)に対するモノクローナル抗体(anti-hEGFR抗体)8μgと調製したZZ-HBsAg粒子100μgを均一になるように混合し、4℃下で1時間結合反応を行った。この結合反応により得られたanti-hEGFR抗体提示ZZ-HBsAg融合粒子をA431培養液へ添加し、37℃、5%CO2存在下にて一晩培養した。
Example 4 Substance Introduction into Human Squamous Cell Carcinoma Cell A431 Using ZZ Tag Surface Displayed HBsAg Particles (ZZ-HBsAg Particles) Encapsulating Substances via Liposomes
Exponentially growing human squamous cell carcinoma cell A431 is seeded in a 96-well plastic bottom dish plate at 1 × 10 4 cells / well, and 10% fetal bovine serum in the presence of 37 ° C and 5% CO 2 Incubated overnight with MEM containing. The next day, as in Example 1, FITC-labeled polystyrene beads, freeze-dried liposomes, and freeze-dried ZZ-HBsAg particles (PCT / JP03 / 03694) were used to prepare ZZ-HBsAg-fused particles containing FITC-labeled polystyrene beads. Then, 8μg of monoclonal antibody against human epidermal growth factor receptor (hEGFR) (anti-hEGFR antibody) and 100μg of the prepared ZZ-HBsAg particles were mixed uniformly and then at 4 ℃ for 1 hour. A binding reaction was performed. Anti-hEGFR antibody-presenting ZZ-HBsAg fused particles obtained by this binding reaction were added to the A431 culture solution and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
A431内へ導入されたFITC標識ポリスチレンビーズ量を定量するためにプレートリーダーにて測定した。また、A431内へのFITC標識ポリスチレンビーズの導入の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。 In order to quantify the amount of FITC-labeled polystyrene beads introduced into A431, the amount was measured with a plate reader. The state of introduction of FITC-labeled polystyrene beads into A431 was observed with a confocal laser fluorescence microscope.
FITC標識ポリスチレンビーズの定量結果を図5のグラフに示した。また、A431の蛍光写真を図6に示した。図5、図6には、対照としてanti-hEGFR抗体との結合反応を行わなかったZZ-HBsAg融合粒子の結果を併せて示した。図5のグラフ、図6の写真から、ZZ-HBsAg融合粒子はanti-hEGFR抗体を介してA431内へ内包したFITC標識ポリスチレンビーズを導入できることが判明した。この結果から、ZZ-HBsAg粒子はリポソームと融合した後もZZタグの抗体結合能を維持し、かつ、ZZタグに結合させた抗体を介した物質導入を行うことが可能であることが示された。 The quantitative results of the FITC-labeled polystyrene beads are shown in the graph of FIG. A fluorescent photograph of A431 is shown in FIG. FIGS. 5 and 6 also show the results of ZZ-HBsAg fused particles that did not undergo a binding reaction with an anti-hEGFR antibody as a control. From the graph of FIG. 5 and the photograph of FIG. 6, it was found that the ZZ-HBsAg fused particles can introduce FITC-labeled polystyrene beads encapsulated in A431 via an anti-hEGFR antibody. This result shows that the ZZ-HBsAg particles maintain the antibody binding ability of the ZZ tag even after fusing with the liposome, and can introduce substances through the antibody bound to the ZZ tag. It was.
また、図7では、FITC標識ポリスチレンビーズに代わってRITC標識ポリスチレンビーズを用い、A431と同様にEGF受容体を細胞表面に発現している乳がん由来細胞MCF-7へも上述の方法の通り、物質導入を行った際の写真を示した。図7の結果より、表面に外来機能性タンパク質を提示したHBsAg粒子でも、実施例1の手法を用いることにより、その粒子の機能を維持させたまま、内部に物質を封入することが可能であることが示された。 In addition, in FIG. 7, as described above, the substance is also applied to breast cancer-derived cell MCF-7 expressing RIGF labeled polystyrene beads instead of FITC labeled polystyrene beads and expressing the EGF receptor on the cell surface in the same manner as A431. The photograph at the time of introduction was shown. From the results shown in FIG. 7, even with the HBsAg particles presenting the foreign functional protein on the surface, it is possible to encapsulate substances inside the particles while maintaining the function of the particles by using the method of Example 1. It was shown that.
実施例5 リポソームを介して遺伝子を封入したHBsAg粒子によるヒト肝癌細胞HepG2への遺伝子導入
指数増殖期にあるヒト肝癌細胞HepG2を1×104細胞/ウェルになるように96穴プラスティック底皿プレートに播種し、37℃、5%CO2存在下にて10%ウシ胎児血清を含むMEMを用いて一晩培養した。翌日、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescence Protein; GFP)発現プラスミド(pEGFP-C1; Clontech社)を滅菌水にて50 μg/mlとした調製溶液1.5 mlを、8.5%ショ糖とともに凍結乾燥した空リポソーム(COATSOME EL-A-01、日本油脂社製)へ加えて均一になるよう混合し、室温にて5分間静置させることによりGFP発現プラスミド封入リポソーム溶液を調製した。調製したGFP発現プラスミド封入リポソーム溶液150μlを、ショ糖溶液を終濃度5%となるようにHBsAg粒子と混合した溶液を一晩凍結乾燥することで得た凍結乾燥HBsAg粒子200 μgと均一になるように混合し、室温にて5分間静置させることによりHBsAg粒子とGFP発現プラスミド封入リポソームの融合を行い、その結果、GFP発現プラスミド包含HBsAg融合粒子を得た。その後、これをHepG2培養液へ添加し、37℃、5%CO2存在下にて48時間培養した。48時間後、導入されたGFP発現プラスミドにより細胞内で発現したGFPの様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。
Example 5 Gene transfer into human hepatoma cell HepG2 using HBsAg particles encapsulating genes via liposomes
Exponentially growing human hepatoma cell HepG2 is seeded in a 96-well plastic bottom dish plate at 1 × 10 4 cells / well, and MEM containing 10% fetal bovine serum in the presence of 37% at 5% CO 2 Was used for overnight culture. On the next day, empty liposomes prepared by freeze-drying 1.5 ml of a solution prepared by making Green Fluorescence Protein (GFP) expression plasmid (pEGFP-C1; Clontech) 50 μg / ml in sterile water with 8.5% sucrose ( COATSOME EL-A-01 (manufactured by NOF Corporation) and mixed uniformly, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to prepare a GFP expression plasmid-encapsulated liposome solution. 150 μl of the prepared GFP-expressing plasmid-encapsulated liposome solution mixed with HBsAg particles so that the final concentration of sucrose solution becomes 5% is freeze-dried overnight, so that it becomes homogeneous with 200 μg of freeze-dried HBsAg particles. The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes to fuse the HBsAg particles with the GFP expression plasmid-encapsulated liposomes. As a result, GFP expression plasmid-containing HBsAg fusion particles were obtained. Thereafter, this was added to a HepG2 culture solution and cultured for 48 hours at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . After 48 hours, the state of GFP expressed in the cells by the introduced GFP expression plasmid was observed with a confocal laser fluorescence microscope.
HepG2の蛍光写真を図8に示した。図8には、HepG2の対照として用いたヒト大腸癌細胞WiDrにおける結果を併せて示した。図8の結果より、リポソームと融合したHBsAg粒子による導入は、HepG2のみに観察され、WiDrには蛍光は認められなかった。 A fluorescence photograph of HepG2 is shown in FIG. In FIG. 8, the result in the human colon cancer cell WiDr used as a control of HepG2 is also shown. From the results shown in FIG. 8, the introduction of HBsAg particles fused with liposomes was observed only in HepG2, and no fluorescence was observed in WiDr.
以上より、この発明により、リポソームによって遺伝子を封入したHBsAg粒子を用いて、培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入することが可能であることが示された。 From the above, the present invention shows that it is possible to introduce genes with extremely high specificity and efficiency to human hepatocytes at the level of cultured cells using HBsAg particles encapsulated with liposomes. It was.
実施例6
リポソーム融合BNCを用いた100-nm ポリスチレンビーズのEx vivo及びin vivo 送達
BNC はリポソームとほぼ完全に融合できるので、ローダミン標識された100-nm ポリスチレンビーズ (Rho-beads)を封入するリポソーム融合BNC を超遠心による分離することなく使用した。1μg の Rho-beadsを封入する 10 μgのリポソーム融合BNCを使用して約5×104細胞のHepG2 細胞, WiDr 細胞およびA431 細胞をトランスフェクトした。6時間後、蛍光がHepG2細胞特異的に観察されたが、WiDr細胞及びA431細胞では観察されなかった(Fig. 9)。さらに、これらのBNCは、肝NuE 細胞 及びA431 細胞を担持する異種移植モデルに注射された。マウスあたり25μgのRho-beadsを封入する100μgのリポソーム融合BNCを使用した。16時間後、NuE-由来腫瘍では蛍光が観察されたが、A431-由来腫瘍では蛍光は観察されなかった。Rho-beadsの存在部位を確認するために、FITC-標識トマトレクチンを犠牲にする前に注射した。血管周辺に存在するRho-beadsは緑色を示した(図10)。
Example 6
Ex vivo and in vivo delivery of 100-nm polystyrene beads using liposome-fused BNC
Since BNC can be almost completely fused with liposomes, liposome-fused BNC encapsulating rhodamine-labeled 100-nm polystyrene beads (Rho-beads) was used without separation by ultracentrifugation. Approximately 5 × 10 4 HepG2 cells, WiDr cells and A431 cells were transfected using 10 μg of liposome-fused BNC encapsulating 1 μg of Rho-beads. After 6 hours, fluorescence was observed specifically in HepG2 cells, but not in WiDr cells and A431 cells (Fig. 9). In addition, these BNCs were injected into a xenograft model carrying liver NuE cells and A431 cells. 100 μg of liposome-fused BNC encapsulating 25 μg of Rho-beads per mouse was used. After 16 hours, fluorescence was observed in NuE-derived tumors, but no fluorescence was observed in A431-derived tumors. To confirm the location of Rho-beads, FITC-labeled tomato lectin was injected before sacrificing. Rho-beads present around the blood vessels showed a green color (FIG. 10).
実施例7
リポソーム融合BNCを用いるEx vivo及びin vivo遺伝子送達
DNA をBNC内に導入するために、DNAを最初にカチオン性リポソームに封入し、次いでビーズの導入と同様にしてBNCと融合した。GFP プラスミド (pEGFP-C1)を封入するリポソーム融合BNC をHepG2細胞及びWiDr 細胞 (2x105細胞/ウェル)に添加した. 2μgのGFPプラスミドを10μgのBNCに封入した。トランスフェクション後の2日目に有意なGFP発現をBNC処理されたHepG2 細胞で観察した(図11)。異種移植モデルにおいて、50μgのBNCを注入した。5日後、マウス肝臓、マウス腎臓、NuE-由来腫瘍及びA431-由来腫瘍を集めた。マウスあたりのビーズ含有BNC量と比較するとこの量は減少していたが、GFP発現はNuE-由来腫瘍では観察されたが、A431-由来腫瘍では観察されなかった(図12)。GFP発現はマウスの肝臓と腎臓では全く観察されなかった(データは示さない)。
Example 7
Ex vivo and in vivo gene delivery using liposome-fused BNC
In order to introduce DNA into BNC, the DNA was first encapsulated in cationic liposomes and then fused with BNC in the same manner as the introduction of beads. Liposome-fused BNC encapsulating GFP plasmid (pEGFP-C1) was added to HepG2 cells and WiDr cells (2 × 10 5 cells / well). 2 μg of GFP plasmid was encapsulated in 10 μg of BNC. Significant GFP expression was observed in BNC-treated HepG2 cells on the second day after transfection (FIG. 11). In the xenograft model, 50 μg of BNC was injected. After 5 days, mouse liver, mouse kidney, NuE-derived tumor and A431-derived tumor were collected. This amount was reduced compared to the amount of bead-containing BNC per mouse, but GFP expression was observed in NuE-derived tumors but not in A431-derived tumors (FIG. 12). No GFP expression was observed in mouse liver and kidney (data not shown).
実施例8
リポソーム融合BNCを用いた35-kbp GFP プラスミドの有効なex vivo送達
4.7-kbpのpEGFP-C1を効率よくBNCに導入し、ex vivoまたはin vivoでHepG2細胞またはNuE 細胞に送達した。さらに、6.4-kbpのpcDNA6.2/C-EmGFPを肝細胞に送達した(データは示さない)。DNAのサイズ限界を測定するために、本発明者はBNC内への封入のためにpAD/CMV-GFP (約35kbp)を使用した。HepG2細胞とA431細胞(5x104 細胞/ウェル)を播種し、2μgのDNAを含むリポソーム融合BNCを翌日HepG2細胞とA431 細胞に移した。48時間後、HepG2 細胞において予想通りGFP発現を観察したが、A431細胞では観察されなかった (図13)。リポソーム融合BNC(Fusion)による有効なトランスフェクションは約10% (n = 400)であったが、エレクトロポレーション(EP) では1%未満であった(図14)。
Example 8
Efficient ex vivo delivery of 35-kbp GFP plasmid using liposome-fused BNC
4.7-kbp of pEGFP-C1 was efficiently introduced into BNC and delivered to HepG2 cells or NuE cells ex vivo or in vivo. In addition, 6.4-kbp pcDNA6.2 / C-EmGFP was delivered to hepatocytes (data not shown). In order to determine the size limit of DNA, we used pAD / CMV-GFP (about 35 kbp) for encapsulation in BNC. HepG2 cells and A431 cells (5 × 10 4 cells / well) were seeded, and liposome-fused BNC containing 2 μg of DNA was transferred to HepG2 cells and A431 cells the next day. After 48 hours, GFP expression was observed in HepG2 cells as expected, but not in A431 cells (FIG. 13). Effective transfection with liposome-fused BNC (Fusion) was approximately 10% (n = 400), but less than 1% with electroporation (EP) (FIG. 14).
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