JP2007084452A - Ｍｒｓａ関節炎治療薬及びモデル動物 - Google Patents

Abstract

【課題】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）関節炎治療薬の提供。
【解決手段】フェオフォーバイドａのナトリウム塩を含むメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）関節炎の治療用薬剤。
【選択図】なし

Description

本発明はフェオフォーバイドａ（Ｐｈｄｅ ａ）によるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）関節炎治療薬に関する。本発明はまたＭＲＳＡ関節炎モデル動物に関する。

フェオフォーバイドａは、植物色素クロロフィル由来の感光性物質として知られ、癌等の悪性腫瘍の光化学療法に用いることができる。フェオフォーバイドａは可視光、特に４００〜４２０ｎｍの波長の青色光及び６００〜７００ｎｍの波長を有する赤色光を効率よく吸収して、ＤＮＡの光切断等の光励起化学反応を引き起こすことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
高等植物にはクロロフィルａとｂの２種類のクロロフィルが存在するが、いずれも長い疎水性の側鎖（フィチル基、−Ｃ_２０Ｈ_３９）が存在するために水に対して不溶性である（非特許文献１）。そのため、強酸処理によって側鎖を脱離して得られるフェオフォーバイドａを光化学療法に用いることが検討されているが、その水に対する溶解度は極めて低く、そのままでは人体への適用は困難と考えられていた。
そこで本発明者の一人は先に、フェオフォーバイドａが溶媒と反応して分子変性を生じることなく水溶性のＮａ塩とするためには、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、この溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドａを溶解してフェオフォーバイドａ溶液を調製し、該溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合・溶解させることにより、安定な形でフェオフォーバイドａの水溶性塩を形成することに成功した（特許文献１）。
また、本発明者らは先に、人体に対して安全で副作用のないフェオフォーバイドａナトリウム塩の水溶液が、可視光を効率よく吸収して光励起化学反応を引き起こし、細菌の殺細胞効果を可能にする特異な特性を利用して、一定量の光の存在下でフェオフォーバイドａ水溶液を噴霧、散布又は清拭し、室内に光を照射することからなる室内の消毒方法を見出した（特許文献２）。

特許第２９６３１７８号公報 特願２００３−０３６９８５ 小林・小宮山、日本臨床、５３（６）、２０７−２１４（１９９５） 小林、井上、仲里ら、第１２回光線力学学会（１２ｔｈＪＣＩＰＡ）プログラム／抄録集、平成１４年（２００２年）５月２５日、５「Ｎａ−フェオフォーバイドａによるガンの光治療に関する基礎研究」

現在治療に使われているヘマトポルフィリン系光感受性腫瘍親和性物質については、その全身投与とエキシマーレーザー癌治療装置との組合せ等が知られている。しかし、副作用や光過敏症予防の必要性から長期の暗室内での生活を余儀なくされるため、症例数は伸びていないのが実情である。また、従来のような近赤外線のレーザーを使用した光線力学療法（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ，以下ＰＤＴとも言う）の応用では、組織に対する熱効果の影響も考えられ、従来のＰＤＴ効果の面で問題となっていた。
特に最近、従来の抗生物質が効かない、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性菌が出現してきており、院内感染の問題が大きく取り上げられてきている。このＭＲＳＡが急性化膿性関節炎の起炎菌となる臨床例も多く散見されるが、ＭＲＳＡ感染後、急性化膿性関節炎の症例を経時的に調査した報告は少ない。

そこで本発明者らは、ＭＲＳＡを関節腔内に注射して急性化膿性関節炎を発症させ、ＭＲＳＡ関節炎モデルマウスを作製し、その細菌の局在と、軟骨の変化について研究するとともに、光線力学療法（以下ＰＤＴ）に注目し、光感受性物質Ｎａ−フェオフォーバイトａ（以下Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａ）と半導体レーザーとの組み合わせによるインビボでのＭＲＳＡの殺菌効果について検討し、ＭＲＳＡ急性化膿性関節炎の治療効果を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。
（１）フェオフォーバイドａのナトリウム塩を含むメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）関節炎の治療用薬剤。
（２）光線力学治療薬である（１）記載の薬剤。
（３）前記光線力学治療に用いる光が可視光である（２）記載の薬剤。
（４）前記光は６００〜７００ｎｍの波長の光を含む（３）記載の薬剤。
（５）前記光はレーザー光である（４）記載の薬剤。
（６）ＭＲＳＡを起炎菌とする急性化膿性関節炎のモデル動物。
（７）前記動物が哺乳類である（６）記載のモデル動物。
（８）前記哺乳類がげっ歯類である（７）記載のモデル動物。
（９）前記げっ歯類がマウスである（８）記載のモデル動物。

フェオフォーバイドａは、組織透過性のよい長波長側の比較的弱い光で容易に励起されるので可視光領域での光励起が可能であり、光感受性物質として扱いやすく、それ自体は無害であり、体内の正常組織からの代謝が非常に早いため、接触、吸引されたとしても副作用が少ない。従って、安全かつ容易にＭＲＳＡ急性化膿性関節炎の治療薬として使用することができる。また本発明のＭＲＳＡ関節炎モデル動物は、関節液内の細菌数を調べることにより病態とその治療経過を調べるためのモデル動物として使用できる。

以下本発明を更に具体的に説明する。
フェオフォーバイドａ（以下Ｐｈｄｅ ａとも言う）及びそのナトリウム塩（以下Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａとも言う）は特許第２９６３１７８号公報（特許文献１）に記載された方法により製造することができる。
フェオフォーバイドａ（Ｃ_３２Ｈ_３２Ｎ_４Ｏ（ＣＯＯＨ）ＣＯＯＣＨ_３）をナトリウム塩にするには、フェオフォーバイドａを溶解する溶媒と水酸化ナトリウムを溶解する溶媒とが混合しあうことが好ましい。また生成したフェオフォーバイドａナトリウムがその混合された溶媒系では不溶であり、沈澱を生成して分離が可能であることが好ましい。この条件を満足するフェオフォーバイドａの製造のための好ましい溶媒としては、エーテル、アセトン、クロロホルム等が挙げられる。

一方、フェオフォーバイドａは水酸化ナトリウムのようなアルカリの存在下では、メタノールやエタノールに接触すると激しく分子変性を起こし酸化が促進されることが知られている。従ってフェオフォーバイドａをナトリウム塩とする場合は、酸化反応を促進しない溶媒を選択することが重要である。そこで、水酸化ナトリウムの溶媒として、通常、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール又はその混合液を用いる。これにより、フェオフォーバイドａの分子変性を起こすことなく、そのナトリウム塩を生成することができる。フェオフォーバイドａの水溶化に際しては、溶解補助剤を用いることなく、しかも特殊な溶解技法を用いることなく、極めて容易にフェオフォーバイドａのナトリウム塩の水溶液を調製することができる。

フェオフォーバイドａは６００〜７００ｎｍに大きなＱ吸収帯（ｍａｘ６６７ｎｍ）を有するので、可視光、特に細胞透過性の高い赤色光が利用できる。ヘマトポルフィリン誘導体のＱ帯の波長におけるレーザー光に対する吸光度係数と比較すると、フェオフォーバイドａはヘマトポルフィリン誘導体の約３３８倍も大きいことがわかっている。
本発明の薬剤は、光線力学療法に用いることができ、該光線力学療法において使用される光は、可視光、６００〜７００ｎｍの波長を含む光、赤色光のほか、ハロゲン光、レーザー光、特に６７０ｎｍの半導体レーザー、太陽光、蛍光灯の光（白色光）でもよいが、レーザー光、特に６７０ｎｍの半導体レーザーが好ましい。

フェオフォーバイドａのナトリウム塩を含む水溶液の濃度は１ｘ１０^−６〜１ｘ１０^−４Ｍであることが好ましい。ハロゲン光又はレーザー光を使用する場合、光照射時間が１５分〜３０分であることが好ましい。
本発明において、フェオフォーバイドａのナトリウム塩は、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、該溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドａを溶解してフェオフォーバイドａ溶液を調製し、該溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合・溶解させることにより製造されたものであることが好ましい。
以下、フェオフォーバイドａナトリウムの合成、フェオフォーバイドａナトリウムの水溶液の調製、及びフェオフォーバイドａナトリウムのＨＰＬＣ（高機能性液体クロマトグラフィー）分析及び紫外−可視吸収スペクトルによる同定の一例について説明する。

（１）フェオフォーバイドａナトリウムの合成
既知の製法（クロロフィルａをエーテル中、濃塩酸により脱マグネシウム、及び加水分解による脱フィトール化する方法）により得られたフェオフォーバイドａ ５００ｍｇを３００ｍｌのエーテルに溶解する。一方、水酸化ナトリウム１００ｍｇを３０ｍｌのｎ−プロピルアルコール又はイソプロピルアルコールに溶解する。次いでフェオフォーバイドａのエーテル溶液中に水酸化ナトリウムのｎ−又はイソプロピルアルコール溶液を攪拌しながら滴下する。この際、反応の進行状態は、濾紙上に溶液を一滴落とすことにより沈澱の生成を観察するという方法で確認し、その終点は沈澱の周囲に広がる溶液の色が無色となった時とする。
次に上記沈澱（フェオフォーバイドａナトリウム）を含有する溶液を遠心管に入れ遠心分離（２５００ｒｐｍ、２分間）することにより沈澱部分を分離することができる。上澄みを捨て、遠心管底部に残る固形分を真空乾燥機にて乾燥することにより粉末状フェオフォーバイドａナトリウムを得ることができる。
（２）フェオフォーバイドａナトリウムの水溶液の調製
フェオフォーバイドａナトリウム約１０ｍｇに２ｍｌの蒸留水を入れ軽く振るとフェオフォーバイドａナトリウムは溶解し、透明な溶液が形成される。その溶液のｐＨは約９．２〜９．５を示すため、燐酸緩衝液（ｐＨ７．４又は７．８）を用い、適宜適当な濃度に希釈し使用される。
（３）フェオフォーバイドａナトリウムのＨＰＬＣ（高機能性液体クロマトグラフィー）分析及び紫外−可視吸収スペクトルによる同定
フェオフォーバイドａナトリウムを希塩酸により脱ナトリウム化し、そのエーテル溶液を得る。次いでこの溶液と既知のフェオフォーバイドａとの両サンプルのＨＰＬＣ分析及び吸収スペクトルの測定を行い、比較検討する。ＨＰＬＣ分析に関しては、既知のフェオフォーバイドａのチャートと上記エーテル溶液のチャートから保持時間を比較したところ、両フェオフォーバイドａが一致することが判り、これをもってフェオフォーバイドａの存在を確認することができる。ただし、上記ＨＰＬＣ分析の分離条件は次の通りである。
カラム・・・ＯＤＳ ＳＳＣｐａｃｋ ４×２５０ｍｍ
溶離液・・・アセトニトリル：０．１％リン酸溶液：テトラヒドロフラン＝８８：１０：２
流量・・・１．０ｍｌ／分、波長・・・４１０ｎｍ、チャート速度・・・０．５ｃｍ／分、温度・・・１２℃
吸収スペクトルの吸収波長についても、上記エーテル溶液と既知のフェオフォーバイドａ溶液とがほぼ完全に一致し、これによってもフェオフォーバイドａの存在を確認できる。

実施例１
ＭＲＳＡ急性化膿性関節炎モデル動物の作製
ＭＲＳＡを関節腔内に注射して動物に急性化膿性関節炎を発症させ、その細菌の局在と、軟骨の変化について調べた。
（材料及び方法）
ＭＲＳＡ菌株として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）の、約１０^８ ＣＦＵ／ｍｌ生理食塩水浮遊液を用いた。ＤＢＡ−１Ｊマウス（雌、４週齢、チャールズリバー社）の後肢両膝関節に、上記ＭＲＳＡ浮遊液各０．０５ｍｌを関節内注射した。対照群には生理食塩水を同量注射した。投与後１日群、３日群、１週群、３週群を各５匹作製した。検討項目として体重、関節周囲径の推移、屠殺時の関節液細菌培養、及び病理組織学的評価の４項目とした。
（結果）
体重は感染後２４時間で一度減少する傾向を示したが、明らかな有意差はなかった。関節周囲径は１週間以内で最大となり、２週目以降は自然消退した。関節液からのＭＲＳＡ回収は、１日群１０例／１０例、３日群１０例／１０例、１週群５例／１０例、３週群０例／１０例であった。関節内病理組織学検査では、１日群は全例に好中球の遊出と、炎症性細胞を認めたが、明らかな軟骨性変化はなかった。３日群は好中球浸潤が強く、滑膜表層細胞の増殖がみられ、全例に軟骨の壊死、破壊像が認められた。１週群はフィブリンの析出、好中球浸潤も見られたが、肉芽組織の増殖も一部に認められた。３週群はリンパ球浸潤と軟骨辺縁のパンヌスの形成がみられ、慢性炎症の傾向を示した。
（考察）
関節内のＭＲＳＡは１日目でピークとなり、３日目まで一定量の菌数を維持し、１週目では半数に菌の自然消退を認めた。病理組織学的にはＴｏｒｉｓｕら（Torisu et al.Orthop.Assoc.63:1479,1989）は感染後４時間以降、軟骨の変性、壊死が始まっていると報告している。我々の実験では２日目以降より軟骨の変化が起こり、約１週目から修復機転が働き始め、３週目には慢性炎症に移行すると考えている。
ＭＲＳＡ急性化膿性関節炎モデルマウスとしては、作製後２４時間から３日以内のものが理想的であると考えられ、薬剤の治療効果を観察するためには、この期間中に薬剤を投与することが理想的であると考えられた。

実施例２
光線力学療法（ＰＤＴ）によるＮａ−Ｐｈｄｅ ａの急性化膿性関節炎に対する治療効果
光線力学療法に注目し、光感受性物質Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａと半導体レーザーの組み合わせによるｉｎ ｖｉｖｏでのＭＲＳＡの殺菌効果及び急性化膿性関節炎に対する治療効果について検討した。
（材料及び方法）
実施例１で作製した化膿性関節炎モデルマウスを本検討に使用した。
光感受性物質としてＮａ−Ｐｈｄｅ ａ（クロロフィル研究所）を用い、レーザーとして波長６７０ｎｍの可視光ＧａＡｌＰ半導体レーザー（ジュンテック（株））を使用した。
関節炎惹起後２４時間後に、上記マウスにＮａ−Ｐｈｄｅ ａの生理食塩水溶液（濃度６８μｍｏｌ／ｌ）の０．０５ｍｌを関節内投与した。関節内にＮａ−Ｐｈｄｅ ａを注入後３０分経過してから、レーザー出力３００ｍＷ、照射距離１０ｃｍで、経皮的にレーザーの持続照射を１５分行った（ＰＤＴ群）。
対照群として、Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａを投与せずレーザー照射を行わないもの（非処理群）、Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａを投与せず上記と同様のレーザー照射のみを行ったもの（レーザー群）、及びＮａ−Ｐｈｄｅ ａを投与しレーザー照射を行わないもの（Ｎａ−Ｐｈｅｄｅ ａ群）を各３匹６関節に作製した。
Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａ投与後２４時間でＰＤＴ群及び対照群のマウスを屠殺し、関節液を３７℃、４８時間培養後に菌の発育を観察した。
（結果）
関節液中のＭＲＳＡ回収は、ＰＤＴ群について１関節／６関節（図１）、非処理群について６関節／６関節（図２）、レーザー群について６関節／６関節（図３）、Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａ群について６関節／６関節（図４）で見られた。結果を図１〜４に示す。
（考察）
一般的に化膿性関節炎は急性炎症に伴う関節腔内の圧上昇と化膿菌による蛋白分解酵素の産生、血液供給の途絶によって起こると言われている。Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａを用いたＰＤＴ療法は、関節内の細菌の数を有意に減少させることが可能であり、化膿性関節炎の治療に有用であることがわかる。

ＰＤＴ群についての関節液中のＭＲＳＡの回収結果を示す写真。菌発育（−）。 非処理群についての関節液中のＭＲＳＡの回収結果を示す写真。菌発育（＋＋＋）。 レーザー群についての関節液中のＭＲＳＡの回収結果を示す写真。菌発育（＋＋＋）。 Ｎａ−Ｐｈｄｅ ａ群についての関節液中のＭＲＳＡの回収結果を示す写真。菌発育（＋＋＋）。

Claims (9)

1. フェオフォーバイドａのナトリウム塩を含むメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）関節炎の治療用薬剤。
2. 光線力学治療薬である請求項１記載の薬剤。
3. 前記光線力学治療に用いる光が可視光である請求項２記載の薬剤。
4. 前記光は６００〜７００ｎｍの波長の光を含む請求項３記載の薬剤。
5. 前記光はレーザー光である請求項４記載の薬剤。
6. ＭＲＳＡを起炎菌とする急性化膿性関節炎のモデル動物。
7. 前記動物が哺乳類である請求項６記載のモデル動物。
8. 前記哺乳類がげっ歯類である請求項７記載のモデル動物。
9. 前記げっ歯類がマウスである請求項８記載のモデル動物。