JP2007049961A - リンゴ果実の収穫時期の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 リンゴの1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸合成酵素(ACS)遺伝子であるMdACS3aのプロモーター領域の機能発現タイミングを指標にして行うことを特徴とする。
【選択図】 図4
Description
また、請求項2記載の判定方法は、請求項1記載の判定方法において、プロモーター領域の塩基配列が配列番号1で表される塩基配列の少なくとも一部を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のDNAは、請求項3記載の通り、配列番号1で表される塩基配列の少なくとも一部を含み、プロモーター機能を有してなることを特徴とする。
(a)リンゴの幼葉(品種:ゴールデンデリシャス)3gを用いてVaradarajan et al.(1991)法によって全DNAを抽出した。得られたDNA 50μgをSau3AI 0.8unitで部分分解した後に0.5%アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画した。19〜23kbのDNA断片を含む領域を切り出し、GENECLEAN IIのプロトコールに従ってゲルからDNA断片を抽出した。これらのDNA断片をクレノー酵素存在下でλFIX IIのpartial fill-inベクターに組み込んだ。ベクターへのライゲーションは、TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2を用いて行った。反応は、16℃で1晩行った。パッケイジングは、Gigapack II Gold Packaging Extract(Stratagene社)のプロトコールに従って行った。
(実験方法)
(1)実験材料
リンゴ果実(品種:ゴールデンデリシャス)を国立大学法人弘前大学附属藤崎農場にて毎週(5月6日より11月4日まで)5果サンプリングした。これらのサンプルの発現解析には、6月3日までは花托全体、それ以降は果肉部分を用いた。
MdACS3aの他、リンゴの完熟果実で特異的に発現していることが知られている、MdACS1(Oraguzie NC, Iwanami H, Soejima J, Harada T, Hall A: Inheritance of Md-ACS1 gene and its relationship to fruit softening in apple (Malus X domestica Borkh.). Theor Appl Genet 108: 1526-1533 (2004))、MdACO1(Ross GS, Knighton ML, Lay-Yee M (1992) An ethylene-related cDNA from ripening apple. Plant Mol Biol 19: 231-238)、MdPG1(Atkinson RG (1994) A cDNA clone for endopolygalacturonase from apple. Plant Physiol 105: 1437-1438)、MdERF2(育種学研究, 第6巻, 別冊2号, 182頁, 2004年)を追跡対象遺伝子とした。
(3)RNA抽出
Dong et al.(1991)の方法を改良して、リンゴ果肉組織よりTotal RNAを抽出した。即ち、5gの果肉を液体窒素を用いてパウダー化し、サンプルの1/10量のpolyvinyl pyrrolidoneを加え混合した。20mlのLysis buffer(4.0M guanidine thiocyanate,10mM EDTA,300mM Tris-HCl,pH7.5,1% 2-mercaptoethanol,0.5% sodium lauroyl sarcosine)を加え、室温で30分間放置後、4℃の冷蔵庫内で2時間放置した。これを4℃,8000rpmで15分間遠心し、上澄みをミラクロスにて濾過して回収した。CsClによる平衡密度勾配遠心で得られたペレットを滅菌水に溶解し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿させたRNA分画を滅菌水に溶解した。
Total RNA 5μgをbuffer(1×MOPS,50% formamide,2.2M formaldehyde,10mM EDTA)に溶解し、65℃,15分間変性させた後、氷上で急冷した。これを1.2%アガロースゲル (1×MOPS,0.66M formaldehyde)で40V,3時間の電気泳動を行った。ゲルを10×SSCで20分間の洗浄を2回行った後、20×SSCによりナイロンメンブレン(Magna Nylon Transfer Membrane,MSI)上にトランスファーした。UVクロスリンカー(UV Stratalinker 2400,STRATAGENE)にて固定後、50% formamide,5×Denhardt's solution,0.5% SDS,5×SSPE,20μg/ml salmon sperm DNAを含むbuffer内でプレハイブリダイゼーションを行い、32PでラベルしたプローブDNAを加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。なお、各プローブの調製は、各cDNAクローンをテンプレートとしたPCR産物をPCR purification Kit(QIAGEN)により精製することで行った。各遺伝子のプローブ領域および使用したプライマーは次の通りである。MdACS3a(Accession No. U73816(MdACS3),1086-1573bp,5’-GACAAATAGAAAGGACTGAGACG-3’(配列番号3)と5’-CCATCGATTATACAAACTGATTGTG-3’(配列番号4))、MdACS1(Accession No. U89156,4056-4153bp,5’-GATGAAGGTACCTGTCTGA-3’(配列番号5)と5’-TACACTAATCACATTGTAG-3’(配列番号6))、MdACO1(Accession No. AF030859,3558-3780bp,5’-TGAAATCCAAGCCAAGGAG-3’(配列番号7)と5’-TTCAACTACCAAACAGAGTGG-3’(配列番号8))、MdPG1(Accession No. L27743,433-1650bp,5’-AGGTCATGGAATTGATCAGGCC-3’(配列番号9)と5’-ATGCCATGCCCATAATTATGACCC-3’(配列番号10))。MdERF2に関しては、Tournier et al.(2003)のdegenerate primer(5’-CCRTGGGGRAAATKKGCGGCK-3’(配列番号11)と5’-CATAAGCVAVAKBGCRGCTTCYTC-3’(配列番号12))を用い、適期収穫されたゴールデンデリシャス果実を24℃,6日間完熟を進行させた果肉より抽出した全RNAをテンプレートとして、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer)を用いてRT-PCRを行い、得られたcDNAをシーケンシングしてMdERF2であることを確認し、さらに3’RACE法により3’非翻訳領域のクローニングを行い、この領域をプライマー(5’-TATGCTGGCAATTGGCGAGC-3’(配列番号13)と5’-ATGACCAATCCCGCACTCAC-3’(配列番号14))により増幅し、プローブとして用いた。
図3に果実の横径の変動(5果の平均値)と遺伝子の発現変動の関係を示す。図3から明らかなように、MdACS3aは、他の遺伝子に先行して完熟直前の10月7日あたりから発現することがわかった。
(実験方法)
リンゴ果実(品種:ゴールデンデリシャス)を国立大学法人弘前大学附属藤崎農場にて10月1日より11月4日まで隔日で5果ずつサンプリングし、収穫後1時間以内にエチレン生成量を測定した。エチレン生成量の測定は、サンプリングした果実を1.3m3の容器に密封し、24℃の部屋に1時間静置した後、この容器内気体1mlを注射器で回収し、直径3mm,長さ2mのアルミナカラムのFID-ガスクロマトグラフィー(GC-8A,Shimadzu,Japan)を用いて行った。エチレン生成量を測定した後、直ちに果肉をスライスして液体窒素で凍結した。果実個体間のバラツキを少なくする目的で、3日分のサンプル15果をまとめ、これを中間日で表す一つのサンプルとした。即ち、10月3日の結果は10月1日、3日、5日のエチレン測定量の平均値でもって表した。また、これらの凍結保存サンプルを均等に混合した材料から抽出したRNAでゲルブロットを実施例1と同様にして行い、遺伝子の発現変動を解析した。
図4にエチレン生成量の変動と遺伝子の発現変動の関係を示す。図4から明らかなように、MdACS3aは、果実の完熟に伴うエチレン合成が本格的に始まる直前(10月3日)から他の遺伝子に先行して発現することがわかった。
Claims (3)
- リンゴの1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸合成酵素(ACS)遺伝子であるMdACS3aのプロモーター領域の機能発現タイミングを指標にして行うことを特徴とするリンゴ果実の収穫時期の判定方法。
- プロモーター領域の塩基配列が配列番号1で表される塩基配列の少なくとも一部を含んでなることを特徴とする請求項1記載の判定方法。
- 配列番号1で表される塩基配列の少なくとも一部を含み、プロモーター機能を有してなることを特徴とするDNA。
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WO1998045445A1 (en) * | 1997-04-09 | 1998-10-15 | The Minister Of Agriculture Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Nothern Ireland | Inducible plant promoters |
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