JP2007024871A - 腎症関連疾患の診断方法及び診断キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド(HODE)類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも1種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。
【選択図】図1
Description
1. 哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド(HODE)類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも1種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。
2. 前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも1種である項1に記載の診断方法。
3. 前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも1種である項2に記載の診断方法。
4. HODE)類とα−トコフェロールの比に基づいて腎症関連疾患を診断することを特徴とする、項1〜3のいずれかに記載の診断方法。
5. 腎症関連疾患が糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選ばれる少なくとも1種である、項1〜4のいずれかに記載の診断方法。
6. 哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類を測定することを特徴とする、項1〜5のいずれかに記載の診断方法。
7. 還元剤がNaBH4である項6に記載の診断方法。
8. アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う項6に記載の診断方法。
9. 還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類を測定して腎症関連疾患を診断するための診断キット。
腎症関連疾患は、サンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド(HODE)類及び/又はα−トコフェロールを測定ないし定量することにより評価、検出もしくは診断することができる。
サンプルとしては、血液(血漿、血清、血球(赤血球、白血球)を含む)、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部(生検等により得られる)などが挙げられ、好ましくは血液(血漿、血清、血球を含む)、尿、特に血漿または血清が例示される。
R={(Z, E)体と(E, Z)体の合計量}/(E, E)体の量
により計算できる。HODE類の上記比(R)が高い方が腎症関連疾患に罹患している可能性が高く、該比(R)が高いほど腎症関連疾患が重篤である可能性が高い。
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような通常の分析手段を用いて、HODE類、α−トコフェロールなどの物質を定量し、腎症関連疾患を診断ないし評価することができる。
実施例1
腎症患者の内で非糖尿病患者21名(平均年齢65.9歳SD13.8歳)、腎症患者の内で糖尿病患者23名(平均年齢70.1歳SD7.8歳)さらに腎症を伴わない糖尿病患者16名(平均年齢52.3歳SD13.7歳)から採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した(3500rpm×10分)。血漿2mlを正確に測りとり、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-d4および9-ヒドロキシオクタデカジエノイック酸-d4をそれぞれ50ng添加した。メタノールを1ml添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01g添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1mol/lに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ml添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Gで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってpHを3に調整した。さらに4℃にて3000Gで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびpH3の水(各2ml)によって前調整したSep−Pak C18(Waters社製、体積1ml)へ充填し、各々10mlのpH3水およびアセトニトリル/水(15/85、体積)混合液によって洗浄した。続いて4mlのヘキサン/酢酸エチル/イソプロピルアルコール(30/65/5、体積)混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5mlのヘキサンによって前調整したSep−Pak NH2(Waters社製、体積1ml)へ充填し、各々5mlのヘキサン/酢酸エチル(3/7、体積)およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5mlの酢酸エチル/メタノール/酢酸(10/85/5、体積)混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にN、O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(和光純薬社製)を30μl加え、60℃にて1時間反応した。得られたTMS化サンプルの3μlをマス検出装置(アジェレント社製5973)を備えたガスクロマトグラフィー(アジェレント社製6890N)によって分析し、血漿中の濃度として、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸および8-アイソ-プロスタグランジンF2aを得た。一方、疾病歴がない健常者21名(平均年齢64.2歳SD11.4歳)の血漿をまったく同様に測定した。図1に示すように、ANOVA-Tukeyによる統計解析の結果、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸は健常者に比べて非糖尿病性腎症および糖尿病性腎症患者さらに非腎症である糖尿病で有意に高いことがわかった。また、図2に示すようにトータル8-アイソ-プロスタグランジンF2aの値は健常者群に比べていずれの疾患も統計学上有意な変化は認められなかった。また、同様に遠心処理によって得られた血漿を2倍体積量のクロロホルム/メタノール(2/1体積)によって抽出し、下層のクロロホルム層の10μlを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法によってα-トコフェロールの分析を行った。HPLC法は、資生堂社製電気化学検出器(NANOSPACE SI-1)によって800 mV、オクタデシルシリカカラムにより50mMの過塩素酸ナトリウムを含むメタノール/t-ブチルアルコール(95/5体積)を1ml/分の流速で通液することによって分析した。図3に示すようにこのように、健常者に比べて非糖尿病性腎症および糖尿病性腎症患者さらに非腎症である糖尿病で有意に低いことがわかった。図4にはHODE/α-トコフェロールの値を図示する。ここに示すように、HODEおよびα-トコフェロールを組み合わせることによってより明確に疾患を診断することが可能であった。さらに、図5には糖尿病患者22人に対してヘモグロビンA1c(HbA1c)とHODEとの相関を図示する。ここに示すように、HbA1cとHODEとが統計学上有意に正の相関を示すことが判明し、糖尿病発症の推定に有用であることが示唆される。
Claims (9)
- 哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド(HODE)類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも1種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。
- 前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載の診断方法。
- 前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項2に記載の診断方法。
- HODE)類とα−トコフェロールの比に基づいて腎症関連疾患を診断することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の診断方法。
- 腎症関連疾患が糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1〜4のいずれかに記載の診断方法。
- 哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類を測定することを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の診断方法。
- 還元剤がNaBH4である請求項6に記載の診断方法。
- アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う請求項6に記載の診断方法。
- 還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類を測定して腎症関連疾患を診断するための診断キット。
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