JP2006524633A - β−アドレナリン作動性経路における病理学的変化を打ち消すための方法 - Google Patents

Abstract

本発明はβ−アドレナリン作動性経路を調節する方法に関する。特に本発明は、ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することができる有効な量の化合物を投与することにより、例えばβ−アドレナリン作動性シグナル伝達経路のβアドレナリン作動性の感受性の低下のような病理学的変化を打ち消す方法に関する。

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、β−アドレナリン作動性経路の調節法に関する。特に本発明は例えばβ−アドレナリン作動性シグナル伝達経路におけるβ−アドレナリン作動性の感受性（β−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の低下のような病理学的変化を打ち消すための方法に関する。

関連分野の説明
トランスフォーミング増殖因子−ベータ
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）は、タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のファミリーを表し、これらは細胞増殖および分化、胚および骨の発育、細胞外マトリックス形成、造血、免疫および炎症応答の多面発現性モジュレーターである（非特許文献１；非特許文献２）。このスーパーファミリーの他のメンバーにはアクチビン、インヒビン、骨形成因子およびミュラー抑制物質を含む。ＴＧＦ−βは細胞内シグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）経路を開始し、最終的に細胞サイクルを調節し、増殖応答を制御するか、または細胞のシグナリングの外で細胞の接着、移動および細胞内コミュニケーションを媒介する細胞外マトリックスタンパク質に関する遺伝子発現を導く。

ＴＧＦ−β１、−β２および−β３を含むＴＧＦ−βは、その生物学的活性を、転写レギュレーターのＳｍａｄファミリーを介してシグナルを伝える細胞内セリン−トレオニンキナーゼドメインを持つＩ型およびＩＩ型の１回膜貫通ＴＧＦ−β受容体（受容体サブユニットとも呼ぶ）を含む受容体系を介して発揮する。ＴＧＦ−βのＩＩ型受容体の細胞外ドメインへの結合は、ＩＩ型受容体（ＴＧＦβ−ＲＩＩ）によるＩ型受容体（ＴＧＦβ−ＲＩ）のリン酸化および活性化を誘導する。活性化されたＴＧＦβ−ＲＩは受容体が会合した同時転写因子（ｃｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３をリン酸化し、これによりそれを細胞質に放出し、ここでＳｍａｄ４に結合する。このＳｍａｄ複合体は核に移入し（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ ｉｎｔｏ）、Ｆａｓｔ−１のようなＤＮＡ−会合コファクターと会合し、特異的遺伝子のエンハンサー領域に結合し、そして転写を活性化する。これらの遺伝子の発現は、増殖性応答を制御する細胞サイクルレギュレーターまたは細胞の外側のシグナリング、細胞接着、移動および細胞内コミュニケーションを媒介する細胞外マトリックスタンパク質の合成を導く。ＭＡＰキナーゼ−ＥＲＫカスケードのような他のシグナリング経路もＴＧＦ−βのシグナリングにより活性化される。総説については例えば非特許文献３；および非特許文献４（これらは引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。ＴＧＦ−βシグナリング経路に関するさらなる情報は、例えば以下の刊行物に見いだすことができる：非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７、総説；非特許文献８、総説）。

ＴＧＦ−βが誘導するベータ−アドレナリン受容体のダウンレギュレーションは、心臓の繊維芽細胞、および気管支平滑筋細胞、神経膠腫細胞および腎臓の上皮細胞で観察された。例えばＴＧＦ−β１は、アデニリルシクラーゼ活性の改変、およびβ２−アドレナリン受容体遺伝子の転写速度の低下を介するβ２−アドレナリン受容体ｍＲＮＡおよびタンパク質のダウンレギュレーションを介してβ２−アドレナリン受容体の脱感作を誘導することが示された。
ベータ−アドレナリン受容体
ベータ−アドレナリン受容体（βＡＲ）は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）に共役するグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ−タンパク質）を介して共役し、そしてシグナルを伝達する７回膜貫通ドメイン受容体の大きなファミリーに属する。βＡＲはβ１、β２およびβ３サブグループに分類され、これらははっきり異なる発現パターンを現す。β１ＡＲは心臓組織で主に発現され、β２ＡＲは気道の平滑筋組織で高度に、そしてまた心臓および他の組織で発現され；β３は主に脂肪組織で発現される。β１／β３−とβ２−受容体との間で約６５〜７０％の相同性がある。

肺におけるβ−アドレナリン受容体の役割が、例えば非特許文献９、総説で検討されている。β２−アドレノレセプターは広く分布し、そして気道平滑筋細胞だけでなく上皮および内皮細胞、ＩＩ型細胞およびマスト細胞のような肺の他の細胞にも存在する。気道の上皮細胞におけるβ２−アドレナリン受容体の導入遺伝子の過剰発現が気管支収縮を減少させることが報告された（非特許文献１０）。β２−アドレナリン受容体のＩＩ型細胞を標的とした導入遺伝子発現は、肺胞液の排除を増加することが示された（非特許文献１１）。

β−アドレナリン受容体の心臓における役割も、徹底的に研究された。β−アドレナリン受容体の心臓における役割に関する詳細は、例えば非特許文献１２；非特許文献１３、総説；非特許文献１４；および非特許文献１５を参照にされたい。β２−アドレナリン受容体の低−および高−レベルの導入遺伝子発現が、心臓肥大およびＧαｑ過剰発現マウスでの機能に示差的に影響を及ぼすことが報告された。

プロカテロール（ｐｒｏｃａｔｅｒｏｌ）、アルブテロール（ａｌｂｕｔｅｒｏｌ）、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ）およびホルモテロール（ｈｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）のようなβ−アドレナリンアゴニストは、気道の疾患の処置において気管支拡張薬として有用であることが示された。例えば喘息患者はエピソード性気管支痙攣の処置にアルブテロールのような吸入型のβ２−アドレナリン受容体アゴニストを投与されることが多い。アゴニストの結合はβＡＲの細胞内ドメインとヘテロ三量体Ｇ−タンパク質Ｇｓとの間の相互作用を促進する。この相互作用は次いでＧαサブユニット内のＧＤＰのＧＴＰへの交換を触媒し、これによりＧαを活性化する。活性化されたＧαはアデニリルシクラーゼを活性化して、ＡＴＰからｃＡＭＰの合成を触媒する。ｃＡＭＰはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化し、下流のリン酸化反応を生じる。特にｃＡＭＰは筋肉調節タンパク質のリン酸化および細胞性Ｃａ^＋＋濃度の低下を介して気道の弛緩を誘導する。βＡＲのシグナリング経路およびβ２−アドレナリンアゴニストの作用メカニズムに関するさらなる詳細は、例えば非特許文献１６；および非特許文献１７を参照にされたい。

ドブタミン（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ）のようなβ−アゴニスト変力薬は、現在、うっ血性心不全（ＣＨＦ）および類似の心疾患の管理に使用されている。

不幸なことに、気管支拡張薬としてβ−アドレナリン受容体アゴニストの長期使用が、しばしば患者に弱化した応答を生じる。アゴニストが誘導するβＡＲ感受性の低下（ｌｏｓｓ）には、（１）Ｇタンパク質シグナル伝達物質からの脱共役を介する受容体機能の低下（ｌｏｓｓ）、この効果は典型的には迅速な可逆性である；（２）長期のアゴニストへの暴露で、細胞内側の受容体の封鎖；および（３）βＡＲの分解を含む。さらに特定の疾患状態では、βＡＲの定常状態レベルがアゴニスト非依存的な手段によっても、βＡＲ合成またはβＡＲ分解速度のいずれかに影響することにより改変され得る。後者のメカニズムは、うっ血性心不全（ＣＨＦ）のような種々の心臓状態に役割を果たしていることが示され、そして恐らく嚢胞性線維症（ＣＦ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）にも役割を果たしていると思われる。

さらなる詳細に関しては、例えば非特許文献１８；非特許文献１７；非特許文献９を参照にされたい。

βＡＲ感受性の低下（ｄｅｃｌｉｎｅ）が受容体のアゴニストにより誘導されるならば、ある限界内で、βＡＲ応答性の低下はアゴニストの用量を増分的に増すことにより補償することが可能である。しかしこの取り組みは、アゴニストの治療指数により制限される。より高用量は毒性を示すか、あるいは他の副作用を有する。同様に、現時点でＣＨＦ、ＣＯＰＤまたはＣＦ患者におけるようなアゴニスト非依存性のメカニズムの結果として起こるβＡＲ感受性の低下を打ち消すために利用できる信頼性のある手段はない。したがって元にあるメカニズムには関係なく、βＡＲ感受性の低下のようなβＡＲ経路における病理学的変化を打ち消す新規取り組みが臨床的に大いに必要とされている。この目的が、アゴニストが誘導するβＡＲ感受性の低下を打ち消すことである場合、そのような取り組みはβ−アドレナリン受容体アゴニストの効力を低下することなくその長期使用を可能とし、かつ／または患者の全般的な状態を別なふうに改善することになるだろう。
［参考文献］
Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｐｏｒｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９０）９５：４１９−５８ Ｍａｓｓａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）６：５９７−６４６ Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２４４５−６２，１９９８ Ｍｉｙａｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１１１−５７，２０００ Ａｔｔｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，「ＴＧＦ−βスーパーファミリーによるシグナル伝達（Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＴＧＦ−β ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１６４６−７，２００２ Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｉｔｚｅｒ，「腎臓疾患におけるＴＧＦ−βシグナル伝達（ＴＧＦ−β Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｅ）」 Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２６００−２６１０，２００２ Ｔｏｐｐｅｒ，Ｊ．Ｎ．，「心血管系におけるＴＧＦ−β：コンテクスト特異的な増殖因子の分子メカニズム（ＴＧＦ−β ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）」 Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．１０：１３２−７，２０００ Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，「トランスフォーミング増殖因子−βファミリーのシグナル伝達（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β ｆａｍｉｌｙ）」 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６９５４−６７，２０００ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｉｒｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５８：Ｓ１４６−Ｓ１５３，１９９８ ＭｓＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｌ３７９−８９，２０００ ＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１：Ｌ８９５−９０３，２００１ Ｌｉｇｇｅｔ Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：９４７−８，２００１ Ｍｏｎｉｏｔｔｅ ａｎｄ Ｂａｌｌｉｇａｎｄ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｖ．２）：１９−２６，２００２ Ｘｉａｏ，Ｒ．Ｐ．，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ Ｏｃｔ １６：２００１（１０４）：ＲＥ１５ Ｐｏｒｔ ａｎｄ Ｂｒｉｓｔｏｗ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３３：８８７−９０５，２００１ Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８５：１０７７−１０８４，１９９９ Ｍｉｌｌｉｓ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．８０（Ｅ．Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｅ３０−Ｅ３５，２００２ Ｌｉｇｇｅｔ ａｎｄ Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，「アドレナリン受容体共役アデニリルシクラーゼ系：リン酸化、封鎖およびダウンレギュレーションによる受容体機能の調節（Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｃｏｕｐｌｅｄ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」、Ｄ．Ｒ．Ｓｉｂｌｅｙ ａｎｄ Ｍ．Ｄ．Ｈｏｕｓｌａｙ（ＳｕｄＦｊ）、脱感作および増幅による細胞シグナル伝達経路の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において、ｐｐ．７１−９６、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９４

１つの観点では、本発明はＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる化合物の有効量を投与することにより、哺乳動物個体のβ−アドレナリン作動性経路内の病理学的変化を打ち消すための方法に関する。

別の観点では、本発明はＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βシグナリングを阻害することができる化合物の有効量を投与することにより、哺乳動物個体のβ−アドレナリン受容体（βＡＲ）の感受性の低下を打ち消すための方法に関する。特定の態様では、βＡＲ感受性の低下はβＡＲアゴニストにより誘導される。別の態様ではＴＧＦ−β１を使用する。さらに別の態様ではβＡＲはβ２ＡＲである。

さらに別の観点では、本発明はβ２−ＡＲの細胞発現を、ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを可能にする化合物で処理することを含んでなる、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）発現およびβ−アドレナリン受容体アンタゴニストに対する応答の選択的阻害法に関する。
好適な態様の詳細な説明
Ａ．定義
用語「β−アドレナリン受容体」、「β−アドレノレセプター」および「βＡＲ」は互換的に使用し、そしてヒトおよびすべての哺乳動物種のβ１−、β２−およびβ−アドレナリン受容体を含むβ−アドレナリン受容体のすべての群、ならびにそれらの多型バリアントを包含する。

本明細書において用語「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βポリペプチドの任意の自然に存在するバリアントを含め、すべての哺乳動物種の天然配列のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含むために使用する。

本明細書において用語「β−アドレナリン作動性経路における病理学的変化」とは最も広義に使用し、そして疾患または病理学的状態を生じるか、またはそれらに引き起こされ、または付随する、限定するわけではないがβ１−、β２−およびβ−アドレナリン受容体、サイクリックアデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ５およびＡＣ６アイソフォームを含む）、α、βおよびγサブユニットを含む三量体Ｇｓタンパク質、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、グアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）等を含むβ−アドレナリン受容体シグナル伝達経路の任意のメンバーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベル、合成、密度、活性、機能、活性化の状態または感受性における変化を称する。例えばβ−アドレナリン受容体の過剰または不十分な発現、減少した感受性、低下した密度は種々の疾患または病理学的状態と関連し、そしてβ−アドレナリン作動性経路における病理学的変化と考えられる。

用語「病理学的変化を打ち消す」とは最も広義に使用し、そして元にあるメカニズムには関係なく病理学的変化を防ぐ、回避する、逆転する、補償する、遅らせる、遮断する、または限定する任意の作用を指す。

用語「β−アドレナリン作動性の感受性の低下」および「β−アドレナリン受容体の感受性の低下」ならびにそれらの文法的異形は互換可能に使用し、そしてそのような応答を誘引する刺激の持続的存在にもかかわらず、β−アドレナリン受容体を介してシグナルが伝達される生物学的応答の弱化を指す。

用語「β−アドレナリン作動性の感受性の低下を打ち消す」および「β−アドレナリン受容体の感受性の低下を打ち消す」ならびにそれらの文法的均等物は互換可能に、そして最も広義に使用し、そして元にある原因またはメカニズムに関係なく、そのような受容体を介してシグナルを伝達する分子、すなわち受容体のアゴニストに暴露されたβ−アドレナリン受容体の感受性の低下を防ぐ、回避する、逆転する、補償する、遅らせる、遮断する、または限定する任意の作用を含む。この用語は具体的には限定するわけではないが、β−アドレナリン受容体の脱感作、脱共役、封鎖およびダウンレギュレーションを網羅する。

用語「脱感作」は最も広義に使用し、そして事前にアゴニストに対して暴露した後に所定用量のアゴニストに対する低下した応答を意味する。

β−アドレナリン受容体に関連して用語「封鎖」は最も広義に使用し、そして元にあるメカニズムには関係なく、β−アドレナリン受容体アゴニストに暴露された後、細胞表面上のβ−アドレナリン受容体により提供されるリガンド結合部位に損失を生じるプロセスを説明する。

本明細書で使用する用語β−アドレナリン受容体の「アゴニスト」は、β−アドレナリン受容体を介するシグナリングに関与することができる任意の分子を指し、そしてそのような受容体の任意の天然リガンド、および受容体の天然リガンドの生物学活性を模する他の分子を含む。アゴニストには具体的に、β−アドレナリン受容体に対するアゴニスト抗体、β−アドレナリン受容体の天然リガンド（リガンド断片を含む）、およびペプチドおよび非ペプチド低分子を含む。

β−アドレナリン受容体により媒介される好適な「生物学的活性」は、哺乳動物個体の肺、心臓および／または腎臓機能に改善を生じる任意の活性である。

用語「肺（ｌｕｎｇ）機能の改善」および「肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）機能の改善」は互換的に使用し、そして肺の性能を測定するために適する任意のパラメーターにおける改善を指す。すなわち肺機能の改善は、例えば呼吸速度および一回呼吸量における改善をモニタリングするブレオマイシンラット肺損傷モデルのようなマウスのブレオマイシンが誘導する肺損傷モデルで測定することができる。肺機能の尺度としてヒト患者で典型的にモニタリングされるパラメーターには、限定するわけではないが吸気および呼気速度、肺容積（肺活量とも呼ぶ）、および一酸化炭素に関する拡散容量、強制的な呼気（ｆｏｒｃｉｂｌｅ ｅｘｈａｌｅ）、呼吸速度等を含む。患者の肺機能を定量的に測定する方法は当該技術分野では周知であり、そして具体的なパラメーターを測定するための吸気および呼気措置（ｉｎｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｍａｎｅｕｖｅｒ）の設定した時間での測定を含む。例えば努力肺活量（ＦＶＣ）は最初の深い吸気から患者により強制的に呼出される総容積をリットルで測定する。このパラメーターは、１秒に強制的に排出される容積（ＦＥＶ_１）と一緒に評価される時、気管支収縮が定量的に測定できるようになる。呼出された空気の容積を肺機能の指数として測定することに加えて、呼息サイクルの異なる部分にわたり測定される１分間あたりの流れ（リットルで）は、患者の肺機能の状態を測定するために有用となり得る。特に強制的な最大呼気中に１分あたりの最高流速としてリットルで取られるピーク呼気流は、呼吸疾患を有する患者の全体的な肺機能とよく相関する。これらのおよび類似するパラメーターを測定するための方法および道具は当該技術分野では周知であり、そして毎日の臨床的プラクティスで日常的に使用されている。

用語「一回呼吸量」は、それぞれ通常の呼吸で吸入または吐き出される空気の容積を指す。

用語「心機能の改善」および「心臓機能の改善」は互換的に使用し、そして心臓の性能を測定するために適する任意のパラメーターにおける改善を指す。適当なパラメーターには限定するわけではないが、不整脈、（末梢）血管収縮、循環しているカテコールアミンのレベル、イオノトロピーの程度等を含む。

用語「腎臓機能の改善」は、例えば種々の物質の血漿クリアランスの測定、三次元的コンピューター断層撮影法、腎臓機能の放射線評価等のような腎臓の性能を測定するために適する任意のパラメーターにおける改善を指す。

用語「ＴＧＦ−β受容体により媒介される生物学的活性」および類似の用語は、ＴＧＦ−β受容体の活性化、および下流の細胞内シグナリングの結果に伴う任意の活性を指すために使用する。

「ＴＧＦβ−Ｒ１キナーゼ受容体により媒介される生物学的活性」または「ＴＧＦβ−Ｒ１受容体により媒介される生物学的活性」は、ＴＧＦβ−Ｒ１の活性化、およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３のリン酸化のような下流の細胞内シグナリングの結果、または例えばｐ３８およびｒａｓを含むＴＧＦβシグナル伝達カスケードのＳｍａｄ非依存的なシグナリングアームで起こる任意のシグナリング効果に伴う任意の活性を指すことができる。

用語「処置」は治療的処置および予防的または防止的措置の両方を称し、ここで目的は標的とする病理学的状態または障害を防止し、または遅らせ（弱め）ることである。処置が必要であるものには、すでに障害を有するものならびに障害を有する傾向があるもの、あるいは障害が防止されるべきものを含む。すなわち肺機能、心機能または腎機能を改善する内容において、処置には肺機能、心機能または腎機能に負の影響を及ぼす疾患または状態の防止および処置、あるいは肺機能、心機能または腎機能の改善からそうではなく利益を得ること、そのような疾患の１以上の症状の軽減、あるいはそのような疾患から生じる合併症の防止および処置、および死亡率の低下を含む。肺機能の場合、処置は肺機能に欠陥がある患者の運動耐性の改善ももたらすことができる。

肺機能に負の影響を及ぼす疾患または状態の「病状」には、患者の健康を危うくするすべての現象を含む。

「肺機能の改善から利益を得る疾患または状態」には、肺の性能の測定に適する少なくとも１つのパラメーターに負の変化を含むすべての疾患、障害および状態を含む。そのような疾患および状態には限定するわけではないが、気管支収縮疾患、そして具体的には気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺水腫、嚢胞性線維症（ＣＦ）、閉塞性肺疾患、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、放射線が誘発する肺の損傷、および感染源、吸入した毒素、または循環している外因性毒素、老化および肺機能の減損に対する遺伝的素因のような他の因子から生じる肺の損傷を含む。

「心機能の改善から利益を得る疾患または状態」には、心臓の性能の測定に適する少なくとも１つのパラメーターに負の変化を含むすべての疾患、障害および状態を含む。そのような疾患および状態には限定するわけではないが、心臓肥大、うっ血性心不全、心筋障害等を含む。

「腎機能の改善から利益を得る疾患または状態」には、腎臓の性能の測定に適する少なくとも１つのパラメーターに負の変化を含むすべての疾患、障害および状態を含む。そのような疾患および状態には、限定するわけではないが、急性および慢性の腎臓疾患、腎不全および溶血性尿毒素症候群を含む。

本明細書で使用する用語「ＴＧＦ−βインヒビター」は、ＴＧＦ−β受容体キナーゼとの相互作用によりＴＧＦβ−Ｒ１またはＴＧＦβ−Ｒ２受容体のような、ＴＧＦ−β受容体キナーゼにより媒介される天然ＴＧＦ−β分子の生物学的機能を阻害する能力を有する分子を称する。したがって用語「インヒビター」は、ＴＧＦ−βおよびその受容体の生物学的役割の内容において定義される。本明細書のインヒビターはそれらがＴＧＦ−β受容体キナーゼと相互作用する能力、そしてこれによりＴＧＦ−βの生物学的機能を阻害することにより特徴つけられるが、それらはさらにＴＧＦ−βシグナル伝達経路の他のメンバーまたはＴＧＦ−βシグナル伝達経路および他の経路に共有されるメンバーと相互作用するかもしれない。すなわち用語「ＴＧＦ−βインヒビター」は、限定するわけではないがアクチビン受容体キナーゼ、例えばＡｌｋ４および／またはＭＡＰキナーゼを含む２以上の受容体キナーゼの生物学的機能と相互作用し、そして阻害できる分子を具体的に含む。

インヒビターおよび受容体に関して、用語「相互作用する」にはインヒビターの受容体への結合、ならびに結合が関与しない間接的相互作用を含む。受容体への結合は例えば特異的または優先的であることができる。

用語「特異的な結合性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」およびそれらの文法的異形は、ＴＧＦβ受容体のような標的分子内の独自なエピトープ、例えばＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦβ−Ｒ１）への結合を指すために使用する。結合は受容体、例えばＴＧＦβ−Ｒ１を介するＴＧＦ−βシグナル伝達を効果的に阻害するための親和性で起こらなければならない。

本明細書で使用する「優先的な結合性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「優先的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）」、「優先的結合（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）」およびそれらの文法的異形は、１つの標的に対する結合が任意の他の結合パートナーに対する結合よりも有意に大きいことを意味する。優先的に結合する標的への結合親和性は、任意の他の結合パートナーに対する結合親和性よりも一般に少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、さらに一層好ましくは少なくとも約１０倍大きい。

本明細書で使用する用語「優先的に阻害する」とは、「優先的に阻害される」標的に及ぼす阻害効果が、任意の他の標的よりも有意に大きいことを意味する。すなわち例えばｐ３８キナーゼと比較したＴＧＦ−β−Ｒ１キナーゼの優先的阻害の内容では、この用語はインヒビターがｐ３８キナーゼにより媒介される生物学的活性よりもＴＧＦ−β−Ｒ１キナーゼにより媒介される生物学的活性を有意に多く阻害することを意味する。優先的に阻害される受容体を選ぶ場合に阻害程度の差異は、一般に少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、さらに一層好ましくは約１０倍である。

処置の目的に関して用語「哺乳動物」はヒトを初めとして、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等のような家畜および飼育場の動物、および動物園、変種（ｓｐｏｒｔ）または愛玩動物を含む哺乳動物に分類される任意の動物を指す。好ましくは哺乳動物はヒトである。

１以上のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与には、任意の順序で同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））および順次の投与を含む。

本発明の内容において「治療に有効な量」とは、上記に定めるようにβ−アドレナリン作動性経路における病理学的変化を打ち消すことができる量を指す。疾患または状態の処置に関して、用語「治療に有効な量」とは以下の効果の１以上を引き起こすことができる量を指す：（１）疾患または状態の防止；（２）疾患または状態の発生または進行の抑制（すなわち低下、遅延または完全な停止）；（３）そのような疾患または状態から生じる結果または合併症の抑制（すなわち低下、遅延または完全な停止）；および（４）そのような疾患または状態に伴う１以上の症状、あるいはそのような疾患および／または状態から生じる結果または合併症の症状のある程度の軽減を含む。

本明細書で使用する「非妨害置換基」は、定性的に完全なＴＧＦ−β活性を阻害する式（１）の化合物の能力を残す置換基である。すなわち置換基は阻害の程度を改変することができる。しかし式（１）の化合物がＴＧＦ−β活性を阻害する能力を保持する限り、置換基は「非妨害置換基」に分類される。

本明細書で使用する「ヒドロカルビル残基」とは、炭素および水素のみを含む残基を指す。この残基は脂肪族または芳香族の直鎖、環状、分枝、飽和もしくは不飽和でよい。ヒドロカルビル残基は、示す時にはヘテロ原子を置換残基の炭素および水素の員の上（ｏｖｅｒ ａｎｄ ａｂｏｖｅ）に含むことができる。すなわちそのようなヘテロ原子を含有すると具体的に記す時、ヒドロカルビル残基はカルボニル基、アミノ基、ヒドロキシル基等を含み、またはヒドロカルビル残基の「骨格」内にヘテロ原子を含むことができる。

本明細書で使用する用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」には直鎖および分枝鎖および環式の一価の置換基を含む。例にはメチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニル等を含む。典型的にはアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、１−１０Ｃ（アルキル）または２−１０Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含む。好ましくはそれらは１−６Ｃ（アルキル）または２−６Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含む。ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニルは同様に定義されるが、１−２Ｏ、ＳまたはＮヘテロ原子またはそれらの組み合わせを骨格残基内に含むことができる。

本明細書で使用する「アシル」は、アルキル、アルケニル、アルキニルの定義、およびカルボニル基を介してさらなる残基に結合した関連するヘテロ形を包含する。

「芳香族」部分は、フェニルもしくはナフチルのような単環式または縮合二環式部分を指し；また「複素芳香族」はＯ、ＳおよびＮから選択される１以上のヘテロ原子を含有する単環式または縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子の包含は、５員環ならびに６員環の包含を可能とする。すなわち典型的な芳香族系にはピリジル、ピリミジル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、チエニル、フリル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル等を含む。環系全体の電子的分布という意味で、芳香族の特性を有する任意の単環式または縮合環二環式系がこの定義に含まれる。典型的には環系は５−１２環員の原子を含む。

同様に「アリールアルキル」および「ヘテロアルキル」とは、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の典型的には１−６Ｃの炭素鎖を含む炭素鎖を介して、別の残基に結合する芳香族および複素芳香族系を称する。これらの炭素鎖はカルボニル基を含んでもよく、これによりそれらがアシル部分としての置換基を提供できるようにする。
Ｂ．本発明の実施の形態
本発明は、ＴＧＦβ受容体を介するＴＧＦβのシグナリングを阻害することができる化合物はβ−アドレナリン作動性経路における病理学的変化を打ち消すことができるという驚くべき知見に基づく。したがって本発明は必要な哺乳動物、例えばヒト、個体にＴＧＦβ受容体を介するＴＧＦβのシグナリングを阻害することができる化合物を投与することに関する。

上で検討したように、β−アドレナリン作動性経路における特定の病理学的変化は、β−アドレナリン作動性の感受性の低下、すなわち刺激に対するβ−アドレナリン受容体の応答の損失である。β−アドレナリン作動性の感受性の低下は、限定するわけではないがβ−アドレナリン受容体アゴニストに対する長期または過剰な暴露を含む様々な理由から生じる。

β−アドレナリン受容体（βＡＲ）アゴニストは、それらの生物学的活性をβ−アドレノレセプターのリガンド結合部位との相互作用により発揮する。この相互作用は活性化されたアデニリルシクラーゼによるＡＴＰからｃＡＭＰの合成の触媒を含め、一連の下流の出来事を誘起する。ｃＡＭＰは筋肉調節タンパク質のリン酸化、および細胞性Ｃａ^＋＋濃度の低下（ａｔｅｎｎｕａｔｉｏｎ）を介して気道の弛緩を誘導することが知られている。βＡＲアゴニストはｃＡＭＰの生産を誘導するので、それらは有力な平滑筋弛緩剤である。

気管支拡張剤用の吸入型βＡＲアゴニストの使用は臨床的使用で広く行きわたっている。β−受容体アゴニストを用いた処置から利益を得る慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような多数の肺の状態が存在する。ＣＯＰＤは例えば慢性の閉塞性気管支、気腫、および慢性気道閉塞を含む個別に、または組み合わさって起こり得る状態、疾患および症状の範囲を説明するために通常使用される。時間の経過につれて、疾患が進行すると、次第により重篤な症状が発生し得る。ＣＯＰＤは進行性疾患であるが、その重篤度は時間とともに増し、例えば反復的な環境汚染物質への暴露、喫煙等により強度が変動する再発性の悪化を特徴とする。ＣＯＰＤは現在、米国で４番目の主な死亡原因である。またβＡＲアゴニストは限定するわけではないが気腫、慢性気管支炎、肺水腫、嚢胞性線維症（ＣＦ）、閉塞性肺疾患、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、放射線が誘発する肺の損傷、および感染源、吸入した毒素、または循環している外因性毒素、老化および肺機能の減損に対する遺伝的素因のような他の因子から生じる肺の損傷を含め、肺機能の改善を必要とするか、またはそれから利益を得る他の肺の状態（特に気管支拡張から利益を得る状態）の処置にも広く使用されている。すべての場合で、βＡＲアゴニストは単独で、または抗コリン作用性薬、テオフィリンのような他の薬理学的作用物質またはコルチコステロイド療法と組み合わせて投与することができる。

またβＡＲが媒介する心臓の変力性応答は、心臓の血流学的バランスに重要であることも周知である。心筋障害、心臓肥大およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）の様々な形態で、βＡＲ経路は低下したアドレナリン作動性の刺激をもたらす幾つかの改変を受ける。すなわち肥大および不全は、βＡＲ機能における著しい異常を特徴とする（Ｂｒｉｓｔｏｗ，Ｌａｎｃｅｔ ３５２（Ｓｕｐｐｌ．Ｉ）８−１４（１９９８））。機能しないヒトの心臓では、β１−ＡＲが脱感作され、そして選択的にダウンレギュレートされ、さらに弱いイオノトロピー応答をもたらす。β２−ＡＲは機能しない心臓で脱感作され得るが、受容体レベルは有意に変化せず、発生中の心筋層のβ１−ＡＲ／β２−ＡＲ比の記憶（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）を生じる（Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ． ５９：２９７−３０９（１９８６）；Ｂｒｏｄｄｅ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５１：６５１−６９０（１９９９）；Ｌｉｇｇｅｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：９４７−９４８（２００１））。心不全で観察される上昇したカテコールアミンは少なくとも一部が、β−ＡＲの脱感作およびダウンレギュレーションの両方の原因であると仮定された（Ｂｒｉｓｔｏｗ，１９９８，同上；Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：２０５−２１１（１９８２））。しかしアゴニストが誘導するダウンレギュレーションは、サブタイプに特異的なβ１−ＡＲの損失を説明せず；すなわち他のメカニズムが作動しているかもしれない。増加する証拠は、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）のような種々の増殖因子が、病理学的条件下の実験モデルの心臓でβ−ＡＲのシグナリングを調節することができることを示唆する（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：２３２−２３９（１９９５）：Ｌｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３：Ｈ１８８７−１８９５（２００２）；Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１２：７７９−７９１（１９９８））。ドブタミンのような外因性β−アゴニスト変力剤の投与は、これらのおよび類似の心臓状態の進行した形態の患者に利益をもたらす。

市販されているβ−アドレナリン受容体アゴニストにはアルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標））を含み、これはβ２受容体、フェノテロール、フォルモテロール、ピルブテロール、プロカテロールおよびドブタミンと選択的に相互作用するβ２−アゴニストの原型であると考えることができる。β−受容体アゴニストは、それらの生物学的活性を発揮するためにβ−アドレナリン受容体の活性部位と相互作用する必要がある。β２−アドレナリン受容体のようなβ−アドレナリン受容体のアゴニスト結合／相互作用部位も周知であり、そして受容体と受容体のアゴニストとの間の相互作用のメカニズムも十分に特性決定されている（例えばＳｔｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３５７２−１３５８０（１９８９）を参照にされたい）。

不幸なことには、β−アゴニストに長期または過剰に暴露された患者は、典型的には受容体の脱感作、脱共役、封鎖および／またはダウンレギュレーションの結果としてそのような処置に対する耐性を発生するようである。このリスクは気管支拡張薬として使用されるアルブテロールのような急速に作用する吸入剤の場合に特に高い。したがってこれらのプロセスは気管支拡張薬から利益を得る種々の肺の状態の処置において、βＡＲアゴニストの効力を有意に制限する。同様に、機能しない心臓はβ−アゴニスト変力剤の投与に対して抑制された応答性を現すことが多い。すなわち心筋症およびＣＨＦの種々の形態には、β１ＡＲのダウンレギュレーションおよび／または脱共役およびβ２ＡＲの脱共役が関与することが示された。例えば心臓の繊維芽細胞において、ＴＧＦ−β１はβ−ＡＲ数およびイソプロテレノールに対する応答をダウンレギュレートすることが示された（Ｉｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｍｏｌ．Ｃｅｌ．，Ｃａｒｄｉｏｌ．２６：４３５−４４０（１９９４））。最近、Ｒｏｚａｎｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．がトランスジェニック（ＴＧ）マウスにおいて循環するＴＧＦ−β１の過剰発現が、心臓肥大および強化されたβ−アドレナリン作動性シグナリングを誘導することを報告した（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３：Ｈ１２５３−１２６２（２００２））。しかしこれらのマウスにおいて改変されたβ−ＡＲのシグナリングがＴＧＦ−β１の直接的効果を反映しているのか、またはＴＧ系での過剰ＴＧＦ−β１により引き起こされる心臓肥大の２次的効果によるものかどうかは明らかではない。

これまでの多くの検討はアゴニストが誘導するβＡＲ応答性の損失に集中してきたが、ＣＦおよびＣＯＰＤのような特定の状態では、βＡＲ感受性はアゴニス非依存的様式でも低下する可能性がある。例えばこれらのおよび他の疾患状態において、受容体の定常状態は疾患状態の結果としてβＡＲ合成の低下、またはβＡＲの分解速度の上昇の結果のいずれかにより改変し得る。

本発明はヒトのような哺乳動物個体において、減損されたβＡＲ応答を改善する新規かつ効率的方法を提供する。特定の観点では、本発明はＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−β１のシグナリングを阻害することができる化合物を投与することにより、β−アゴニスト治療に対する患者の応答性を上げる新規かつ効率的方法を提供する。
本発明の化合物
本発明の化合物は、ＴＧＦβ受容体を介するＴＧＦβのシグナリングを阻害することができ、そして結果として、βアドレナリン作動性シグナル伝達経路における病理学的変化を打ち消すことができる。すでに検討したように、本発明の目的について定義したＴＧＦ−βインヒビターは、ＴＧＦ−β受容体キナーゼとの相互作用を介してＴＧＦβ−Ｒ１またはＴＧＦβ−Ｒ２受容体のようなＴＧＦ−β受容体キナーゼにより媒介される天然ＴＧＦ−β分子の生物学的機能を阻害する能力を有する任意の化合物であることができる。インヒビターはそれらのＴＧＦ−β受容体キナーゼと相互作用する能力、そしてこれによりＴＧＦ−βの生物学的機能を阻害することにより特性づけられるが、それらはさらにＴＧＦ−βシグナル伝達経路の他のメンバーまたはＴＧＦ−βシグナル伝達経路および他の経路により共有されるメンバーと相互作用する可能性がある。すなわちＴＧＦ−βインヒビターは２以上の受容体キナーゼと相互作用するかもしれない。

すでに検討したように、１型および２型ＴＧＦ−β受容体は転写レギュレーターのＳｍａｄファミリーを介してシグナルを伝達するセリン−トレオニンキナーゼである。ＴＧＦ−βの結合はＴＧＦβ−Ｒ２によるＴＧＦβ−Ｒ１のリン酸化および活性化を誘導する。活性化されたＴＧＦβ−Ｒ１はＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３をリン酸化し；これはＳｍａｄ４に結合して核に移動し、そして転写調節複合体を形成する。ＭＡＰキナーゼ−ＥＲＫカスケードのような他のシグナリング経路もＴＧＦ−βのシグナリングにより活性化され、そしてＳｍａｄ活性化を調節する。Ｓｍａｄタンパク質は核の転写に対してＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体の両方の活性化と共役する。すなわち本発明のＴＧＦ−βインヒビターは、Ａｌｋ４および／またはＭＡＰキナーゼのようなアクチビン受容体キナーゼとさらに相互作用することができる。

本発明の化合物には限定するわけではないが、抗体および抗体様分子を含むポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、おとり物質（ｄｅｃｏｙ）、およびＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる非ペプチド小有機分子を含む。

特定の態様では、本発明の化合物は一般に約１，０００ダルトンよりも小さいサイズの小有機分子（非ペプチド低分子）である。好適な非ペプチド低分子は、約７５０ダルトン未満、より好ましくは約５００ダルトン未満、そしてさらに一層好ましくは約３００ダルトン未満の分子量を有する。

好適な態様では、本発明の化合物は、式

［式中、
Ｒ^３は非妨害置換基であり；
各ＺはＣＲ^２またはＮであり、環Ａ中の２より多くのＺ位がＮではなく、そして環Ａ中の２つの隣接するＺ位はＮであることはできず；
各Ｒ^２は独立して非妨害置換基であり；
Ｌはリンカーであり；
ｎは０または１であり；そして
Ａｒ’は、１〜３個の非妨害置換基で場合により置換された環式脂肪族、環式複素脂肪族、芳香族または複素芳香族部分の残基である］
の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩である。

好適な態様では、小有機分子は本明細書ではキナゾリンおよびキナゾリンの誘導体またはキナゾリンの２−および４−位に対応する位置に必須な（ｍａｎｄａｔｏｒｙ）置換基を含有する関連化合物である。一般にキナゾリン核が好適であるが、本発明の範囲内の選択肢も以下に具体的に説明する。Ｚ^３の好適な態様はＮおよびＣＨであり；Ｚ^５−Ｚ^８の好適な態様はＣＲ^２である。しかし各Ｚ^５−Ｚ^８は上記の条件下でＮであることもできる。このように基本的なキナゾリン型の環系に関して、好適な態様にはキナゾリン自体、およびすべてのＺ^５−Ｚ^８ならびにＺ^３がＮまたはＣＨのいずれかである態様を含む。また好適であるのは、Ｚ^３がＮであり、そしてＺ^５またはＺ^８のいずれか、またはＺ^５およびＺ^８の両方がＮであり、そしてＺ^６およびＺ^７がＣＨまたはＣＲ^２である態様である。Ｒ^２がＨ以外である場合、ＣＲ^２は６および／または７位に存在することが好適である。このように例として本発明の範囲内のキナゾリン誘導体には、さらに置換され得る非妨害置換基（Ｒ^３）として２位に結合した芳香族環を有するキナゾリン核を含んでなる化合物を含む。

キナゾリンの４−位に対応する位置の置換基、ＬＡｒ’に関して、Ｌは存在するか、または不存在であり、そして２−８Å、好ましくは２−６Å、より好ましくは２−４Åの距離で環Ｂから置換基Ａｒ’と距離を置くリンカーである。この距離はＬの一原子価が結合する環Ｂの環の炭素から、リンカーのもう１つの原子価が結合するＡｒ’の環式部分の原子に結合するまでを測定する。Ａｒ’部分は環Ｂに直接結合することができる（すなわちｎが０である時）。しかし典型的には、非限定的なＬの態様は式Ｓ（ＣＲ^２ _２）_ｍ、−ＮＲ^１ＳＯ_２（ＣＲ^２ _２）_ｌ、ＮＲ^１（ＣＲ^２ _２）_ｍ、−ＮＲ^１ＣＯ（ＣＲ^２ _２）_ｌ、Ｏ（ＣＲ^２ _２）_ｍ、ＯＣＯ（ＣＲ^２ _２）_ｌ、および

であり、式中、ＺはＮまたはＣＨであり、そしてｍは０−４であり、ｌは０−３であり、好ましくはそれぞれ１−３および１−２である。Ｌは好ましくは環Ｂに直接結合した−ＮＲ^１−を提供する。Ｒ^１の好適な態様はＨであるが、Ｒ^１はアシル、アルキル、アリールアシルまたはアリールアルキルでもよく、ここでアリール部分はアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｎ−アリール、ＮＨ−アルキルアリール、ＮＨ−アロイル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＮＲＳＯＲ、−ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、−ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２のような１−３個の基により置換されることができ、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）であり、好ましくは置換基はアルキル（１−６Ｃ）、ＯＲ、ＳＲまたはＮＲ_２であり、ここでＲはＨまたは低級アルキル（１−４Ｃ）である。より好ましくはＲ^１はＨまたはアルキル（１−６Ｃ）である。置換基に含まれる任意のアリール基はさらに、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、−ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３またはＮＯ_２により置換されることができ、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。

Ａｒ’はアリール、６−５縮合ヘテロアリールを含むヘテロアリール、シクロ脂肪族またはシクロ複素脂肪族を含む。好ましくはＡｒ’はフェニル、２−、３−もしくは４−ピリジル、インドリル、２−もしくは４−ピリミジル、ベンズイミダゾリル、インドリルであり、好ましくは各々は場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、Ｎ−アリール、Ｎ−アロイル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＯＯＣＲ、−ＮＲＯＣＲ、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２からなる群から選択される基で場合により置換され、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。

Ａｒ’はより好ましくはインドリル、６−ピリミジル、３−もしくは４−ピリジルまたは場合により置換されたフェニルである。

Ａｒ’が場合により置換されたフェニルである態様について、置換基には限定するわけではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｎ−アリール、ＮＨ−アルキルアリール、ＮＨ−アロイル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２を含み、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。好適な置換基にはハロ、ＯＲ、ＳＲおよびＮＲ_２を含み、ここでＲはＨまたはメチルもしくはエチルである。これらの置換基はフェニル環のすべての５つの位置、好ましくは１−２つの位置、好ましくは１つの位置を占めることができる。Ａｒ’の態様には置換または非置換フェニル、２−、３−もしくは４−ピリジル、２−、４−もしくは６−ピリミジル、インドリル、イソキノリル、キノリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピリジル、チエニル、フリル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリルおよびモルホリニルを含む。Ａｒ’の態様として特に好適であるのは、３−もしくは４−ピリジル、特に非置換形の４−ピリジルである。

任意のアリール部分、特にフェニル部分は２個の置換基も含むことができ、これらが一緒になる時、５−７員の炭素環式または複素環式脂肪族環を形成する。

このようにキナゾリンの４−位に対応する環Ｂ中の位置の好適な置換基の態様には、２−（４−ピリジル）エチルアミノ；４−ピリジルアミノ；３−ピリジルアミノ；２−ピリジルアミノ；４−インドリルアミノ；５−インドリルアミノ；３−メトキシアニリニル；２−（２，５−ジフルオロフェニル）エチルアミノ−等を含む。

Ｒ^３は一般に、Ｏ、ＳおよびＮから選択される０−５個のヘテロ原子を含有するヒドロカルビル残基（１−２０Ｃ）である。好ましくはＲ^３は、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであり、各々が非置換であるか、または１−３個の置換基で置換されている。置換基はハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２を含む群から独立して選択され、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）であり、そして任意のアリールまたはヘテロアリール部分に関して、該基はさらにアルキル（１−６Ｃ）またはアルケニルまたはアルキニルを含む。Ｒ^３の好適な態様（キナゾリンの２−位に対応する位置の置換基）は、１−２個の置換基、好ましくはハロ、アルキル（１−６Ｃ）、ＯＲ、ＮＲ_２およびＳＲで場合により置換されたフェニル部分を含んでなり、ここでＲは上記定義の通りである。このようにキナゾリンの２−位の好適な置換基には、フェニル、２−ハロフェニル、例えば２−ブロモフェニル、２−クロロフェニル、２−フルオロフェニル；２−アルキル−フェニル、例えば２−メチルフェニル、２−エチルフェニル；４−ハロフェニル、例えば４−ブロモフェニル、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル；５−ハロフェニル、例えば５−ブロモフェニル、５−クロロフェニル、５−フルオロフェニル；２，４−もしくは２，５−ハロフェニルを含み、ここで異なる位置のハロ置換基は同一もしくは異なってもよく、例えば２−フルオロ−４−クロロフェニル；２−ブロモ−４−クロロフェニル；２−フルオロ−５−クロロフェニル；２−クロロ−５−フロオロフェニル等でよい。Ｒ^３の他の好適な態様は、シクロペンチルまたはシクロヘキシル部分を含んでなる。

上記のように、Ｒ^２は非妨害置換基である。上で説明したように、「非妨害置換基」はその存在が式（１）の化合物のＴＧＦ−β阻害能を実質的に破壊しないものである。

各Ｒ^２も独立して、Ｏ、ＳおよびＮから選択される０−５個のヘテロ原子を含有するヒドロカルビル残基（１−２０Ｃ）である。好ましくはＲ^２は独立してＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシルまたはそれらのヘテロ形であるか、あるいはアリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであり、各々が非置換であるか、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｎ−アリール、ＮＨ−アルキルアリール、ＮＨ−アロイル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＮＲ_２、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２からなる群から独立して選択される１−３個の置換基で置換され、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。該置換基上のアリールまたはアロイル基はさらに、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２により置換されることができ、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。より好ましくはＲ^２上の置換基はＲ^４、ハロ、ＯＲ^４、ＮＲ^４ _２、ＳＲ^４、−ＯＯＣＲ^４、−ＮＲＯＣＲ^４−ＣＯＯＲ^４、Ｒ^４ＣＯ、−ＣＯＮＲ^４ _２、−ＳＯ_２ＮＲ^４ _２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２から選択され、ここで各Ｒ^４は独立してＨ、または場合により置換されたアルキル（１−６Ｃ）であるか、または場合により置換されたアリールアルキル（７−１２Ｃ）であり、そして２つのＲ^４または該アルキルまたはアリールアルキル上の２つの置換基は一緒に５−７員の縮合脂肪族環を形成することができる。

またＲ_２はそれ自体が、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＮＲ_２、ＲＣＯ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、ＮＲＳＯＲ、ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＣＮ、ＣＦ_３およびＮＯ_２からなる群から選択されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−４Ｃ）である。

Ｒ^２により表されるより好適な置換基は、上で説明したＡｒ’またはＲ^３に含まれるフェニル部分に関して説明したものである。２つの隣接するＣＲ^２は一緒に５−７原子の炭素環式または複素環式の縮合脂肪族環を形成することができる。好適なＲ^２置換基は、式Ｒ^４、−ＯＲ^４、ＳＲ^４またはＲ^４ＮＨ−、特にＲ^４ＮＨ−のものであり、ここでＲ^４は上記定義の通りである。特に好適であるのは、Ｒ^４が置換されたアリールアルキルである場合である。式（１）の化合物の具体的な代表例は以下の表１−３に示す。表１に列挙するすべての化合物は、キナゾリン環系（Ｚ^３はＮである）を有し、ここでＡ環は非置換である（Ｚ^５−Ｚ^８はＣＨを表す）。Ｂ環の置換基は表中に列挙する。

表２の化合物は、示すようなキナゾリン核の修飾を含む。表２中のすべての化合物は、Ｚ^３がＮであり、そしてＺ^６およびＺ^７がＣＨを表す式（１）の態様である。すべての場合でリンカーが存在し、そしてＮＨである。

環ＡがＺ^６またはＺ^７にＣＲ^２を含み、ここでＲ^２がＨではないさらなる化合物を調製した。ＬがＮＨであり、そしてＡｒ’が４−ピリジルである、すべてがキナゾリン誘導体のこれらの化合物を表３に示す。

本発明は特定のキナゾリン誘導体について具体的に説明するが、そのように限定されない。本発明のインヒビターには、キナゾリン誘導体について上で検討したもののような置換基を持つピリジン、ピリミジン核のような非キナゾリンを有する化合物を含む。

式（１）の化合物を含め本発明の化合物は、塩酸、硫酸、臭化水素酸またはリン酸のような無機酸の塩、あるいは酢酸、酒石酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸等のような有機酸の塩を含むそれらの製薬学的に許容され得る酸付加塩の状態で供給されることができる。カルボキシル部分が式（１）の化合物に存在する場合、化合物は製薬学的に許容され得るカチオンとの塩としても供給され得る。

本発明の方法に使用するための別の化合物群は、以下の式（２）

［式中、
Ｙ_１は、ハロ、アルコキシ（１−６Ｃ）、アルキルチオ（１−６Ｃ）、アルキル（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｐｈ、シアノ、フェニルおよびＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）であり、そしてｍは０−３である）から選択される１以上の置換基で場合により置換されたフェニルまたはナフチルであるか；あるいは５−もしくは７−員の芳香族または非芳香族環（ここで該環はＮ、ＯおよびＳから独立して選択される最高３個のヘテロ原子を含む）に縮合したフェニルであり、
Ｙ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５は独立して、水素、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）を表すか；あるいは隣接するＹ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５の対が、場合により最高２個の窒素原子を含む縮合した６−員の芳香族環を形成し、該環は、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（ａ−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）から独立して選択される１以上の置換基により場合により置換され、そして残りのＹ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５は、水素、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）を表し；そして
Ｘ_１およびＸ_２の１つがＮであり、そしてもう１つがＮＲ_６であり、ここでＲ_６は水素またはアルキル（１−６Ｃ）である］
により表される。

式（２）で使用するように、点線で表す二重結合は化合物の可能な互変異性体環を表す。式（２）の化合物およびそれらの調製に関するさらなる情報は、２００２年５月２３日に公開された国際公開第０２／４０４６８号パンフレットに開示され、その全開示は引用により明白に本明細書に編入する。

本発明の方法に使用するための別の化合物群は、以下の式（３）

［式中、
Ｙ_１は、ハロ、アルコキシ（１−６Ｃ）、アルキルチオ（１−６Ｃ）、アルキル（１−６Ｃ）、−Ｏ−（ＣＨ_２）−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ、シアノ、フェニルおよびＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）であり、そしてｎは０、１、２または３である）からなる群から選択される１以上の置換基で場合により置換されたナフチル、アントラセニルまたはフェニルであるか；あるいはＹ_１は５−７員の芳香族または非芳香族の環式環（ここで該環式環はＮ、ＯおよびＳから独立して選択される最高２個のヘテロ原子を場合により含む）に縮合したフェニルを表し；
Ｙ_２は、Ｈ、ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−ＰｈまたはＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）（ここでｎは０、１、２または３である）であり；
Ｙ_３は、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮＨ_２、ＣＮ、ＮＯ_２、アルキルチオ（１−６Ｃ）、−ＳＯ_２−アルキル（Ｃ１−６）、アルコキシ（１−６Ｃ）、ＳＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨＯ、ＣＨ_２ＮＨ_２またはＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）である）であり；
Ｘ_１およびＸ_２の１つがＮまたはＣＲ’であり、そしてもう１つがＮＲ’またはＣＨＲ’（ここでＲ’は水素、ＯＨ、アルキル（Ｃ−１６）またはシクロアルキル（Ｃ３−７）である）であるか；あるいはＸ_１およびＸ_２の１つがＮまたはＣＲ’である時、他はＳまたはＯであることができる］
により表される。

式（３）の化合物およびそれらの調製様式に関するさらなる詳細は、２０００年１０月１９日に公開された国際公開第００／６１５７６号パンフレットに開示され、その全開示は引用により明白に本明細書に編入する。

さらなる態様では、本発明のＴＧＦ−βインヒビターは以下の式（４）

［式中、
Ａｒは５−１２の環の員を含む場合により置換された芳香族または場合により置換された複素芳香族部分を表し、ここで該複素芳香族部分は、場合により置換されたＡｒが

｛式中、Ｒ^５はＨ、アルキル（１−６Ｃ）、アルケニル（２−６Ｃ）、アルキニル（２−６Ｃ）、５−１１の環の員を含む芳香族または複素芳香族部分である｝
でないならば、１以上のＯ、Ｓおよび／またはＮを含み；
ＸはＮＲ^１、ＯまたはＳであり；
Ｒ^１は、Ｈ、アルキル（１−８Ｃ）、アルケニル（２−８Ｃ）またはアルキニル（２−８Ｃ）であり；
Ｚは、ＮまたはＣＲ^４を表し；
各Ｒ^３およびＲ^４は独立して、Ｈまたは非妨害置換基であり；
各Ｒ^２は独立して、非妨害置換基であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］
およびそれらの製薬学的に許容され得る塩およびプロドラッグ形により表される。１つの態様では、ｎ＞２、そしてＲ^２’が隣接する場合、それらは一緒に連結して、各ヘテロ原子が独立してＯ、ＮまたはＳであることができる１〜３個のヘテロ原子を含有する５〜７員の非芳香族、複素芳香族または芳香族環を形成することができる。

好適な態様では、Ａｒは５−９環の員を含有する場合により置換された芳香族または場合により置換された複素芳香族部分を表し、ここで該複素芳香族部分は１以上のＮを含むか；あるいは
Ｒ^１は、Ｈ、アルキル（１−８Ｃ）、アルケニル（２−８Ｃ）またはアルキニル（２−８Ｃ）であり；あるいは
Ｚは、ＮまたはＣＲ^４を表し；ここで
Ｒ^４はＨ、アルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（２−１０Ｃ）またはアルキニル（２−１０Ｃ）、アシル（１−１０Ｃ）、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アロイル、ＮＲ−アリール、ＮＲ−アルキルアリール、ＮＲ−アロイルまたは前記のヘテロ形、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＮＲＳＯＲ、−ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、−ＳＯ_２ＮＲ_２、−ＣＮ、−ＣＦ_３または−ＮＯ_２であり、ここで各Ｒは独立してＨまたはアルキル（１−１０Ｃ）または該アルキルのハロまたはヘテロ原子の含有形であり、その各々は場合により置換されてもよい。好ましくはＲ^４はＨ、アルキル（１−１０Ｃ）、ＯＲ、ＳＲまたはＮＲ_２であり、ここでＲはＨまたはアルキル（１−１０Ｃ）であるか、またはＯ−アリールであるか；あるいは
Ｒ^３はＲ^４と同じ様式で定義され、そして好適な形態は類似するが、Ｒ^３は独立して具体化され；あるいは
各Ｒ^２は独立してアルキル（１−８Ｃ）、アルケニル（２−８Ｃ）、アルキニル（２−８Ｃ）、アシル（１−８Ｃ）、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アロイル、ＮＲ−アリール、ＮＲ−アルキルアリール、ＮＲ−アロイルまたは前記のヘテロ形、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＮＲＳＯＲ、−ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＮＲＳＯ_２Ｒ_２、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＯＳＯ_３Ｒ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、−ＳＯ_２ＮＲ_２、−ＣＮ、−ＣＦ_３または−ＮＯ_２であり、ここで各Ｒは独立してＨまたは低級アルキル（１−４Ｃ）である。好ましくはＲ^２は、ハロ、アルキル（１−６Ｃ）、ＯＲ、ＳＲまたはＮＲ_２であり、ここでＲはＨまたは低級アルキル（１−４Ｃ）であり、より好ましくはハロであり；またはｎは０−３である。

Ａｒにより表される芳香族または複素芳香族部分上の任意の置換基には、アルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（２−１０Ｃ）、アルキニル（２−１０Ｃ）、アシル（１−１０Ｃ）、アリール、アルキルアリール、アロイル、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アロイル、ＮＲ−アリール、ＮＲ−アルキルアリール、ＮＲ−アロイルまたは前記のヘテロ形、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＮＲＳＯＲ、−ＮＲＳＯ_２Ｒ、−ＳＯ_２Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲ_２、−ＮＲＣＯＯＲ、−ＯＣＯＮＲ_２、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＣＯＮＲ_２、−ＳＯ_２ＮＲ_２、−ＣＮ、−ＣＦ_３および／または−ＮＯ_２を含み、ここで各Ｒは独立してＨまたは低級アルキル（１−４Ｃ）である。好適な置換基にはアルキル、ＯＲ、ＮＲ_２、Ｏ−アルキルアリールおよびＮＨ−アルキルアリールを含む。

一般に置換基に含まれる任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、アシルまたはアリール基は、それら自体がさらなる置換基により場合により置換されてもよい。これら置換基の性質は、主たる置換基自体に関して述べた性質に類似する。

式（４）の代表的化合物を以下の表４に列挙する。

さらに本発明の方法に使用するためのＴＧＦ−βインヒビターは、式（５）

［式中、
各Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７およびＺ^８はＮまたはＣＨであり、そしてＺ^５、Ｚ^６、Ｚ^７およびＺ^８の１または２個がＮであり、そして２つの隣接するＺ位はＮであることはできず；
ｍおよびｎはそれぞれ独立して０−３であり；
２つの隣接するＲ^１基は連結して、５〜６員の脂肪族の複素環式環を形成することができ；
Ｒ^２は非妨害置換基であり；そして
Ｒ^３はＨまたはＣＨ_３である］
またはそれらの製薬学的に許容され得る塩により表される。

式（５）の代表的化合物は、以下の表５に列挙する。

本明細書でＴＧＦ−βインヒビターは、個体に投与された時に化合物を放出するように設計された「プロドラッグ」の形態で供給することもできる。プロドラッグ形の設計は当該技術分野では周知であり、そして化合物に含まれる置換基に依存する。例えばスルフヒドリルを含有する置換基は、内因性酵素により、または例えば特定の受容体または個体の場所を標的とする酵素により除去されるまで、化合物を生物学的に不活性にする担体に結合させることができる。

前述の化合物の任意の置換基がキラル中心を含む場合（実際に幾つかは含むのであるが）、化合物はそれらのすべての立体異性体を、単離された立体異性体として、およびこれらの立体異性体の混合物としての両方で含む。
本発明の化合物の合成
本発明の式（１）の低分子化合物は、対応する４−ハロ−２−フェニルキナゾリンから、反応スキーム１に記載するように合成することができる；これは対応する４−ヒドロキシキナゾリンから反応スキーム２に示すように得ることができる。あるいは化合物は出発材料としてアントラニルアミドを使用し、そしてアミノ基をベンゾイル化して調製し、続いて環化して反応スキーム３に示す中間体２−フェニル−４−ヒドロキシキナゾリンを得ることができる。反応スキーム４−６は、反応スキーム３に準じるが、カルボキサミド残基および隣接するアミノ残基で置換された適切なピリジンまたは１，４−ピリミジン核にアントラニルイミドを代える。Ｒ^１がＨである本発明の化合物はさらに誘導化して、反応スキーム７に示すようなＲ^１が他の態様を含んでなることができる。

反応スキーム１はハロゲン化キナゾリンの本発明の化合物への単純な転換の具体的説明である。もちろんこの具体的説明の２位のフェニルはＲ^３として一般化することができ、そして２位の４−ピリジルアミノはＡｒ’−ＬまたはＡｒ’−に一般化することができる。

反応スキーム２はもちろん、反応スキーム１に関して説明したものと同じ様式で一般化することができる。

ここでも反応スキーム３は、パラフルオロベンゾイルクロライドを対応するアシルハライド、Ｒ^３ＣＯＣｌに代えることにより一般化することができる。さらに最終工程で４−アミノピリジンをＡｒ’またはＡｒ’−Ｌに代えることができる。

反応スキーム１は反応スキーム２−６の最終工程を表し、そして反応スキーム２は反応スキーム３−６の最後の２工程を表すことが分かる。

反応スキーム７は、Ｒ^１がＨ以外である式（１）の化合物が得られる条件を提供する。

反応スキーム８は反応スキーム３の修飾であり、これは環Ａ上の置換基が合成工程を通して保たれることを単に示す。この置換基の挙動の原理は、反応スキーム４−６にも適用される。

反応スキーム８は式（１）のキナゾリン環に置換基Ｒ^２を含む反応スキーム３の修飾形を示す。置換基は反応スキームを通じて保たれる。工程ａでは、出発材料をメタノールの存在下で塩化チオニルで処理し、そして１２時間還流する。工程ｂでは適切に置換された塩化ベンゾイルを、適当に置換された塩化ベンゾイルを用いてピリジン中で２４時間処理することにより、工程ａの生成物と反応させる。Ｘ（具体的説明のためにオルト位で示す）がフルオロである態様では、試薬として２−フルオロベンゾイルクロライドを使用し；ここでＸは（オルト−クロロの具体的説明に関して）２−クロロベンゾイルクロライドを使用する。

工程ｃでは、エステルをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような非プロトン性溶媒中の水酸化アンモニウム中で２４時間処理することによりアミドに転換する。次いでこの生成物は工程ｄにて１０Ｎ ＮａＯＨ（エタノール中）を用いて処理し、そして３時間還流することにより環化される。

次いで生成した環化形は、工程ｅにて触媒量のＤＭＦが存在するクロロホルム中の塩化チオニルを用いて還流下、４時間処理することによりクロライドに転換する。最後に具体的に説明する４−ピリジルアミノ化合物は、工程ｆにて炭酸カリウムおよびＤＭＦの存在下で４−アミノピリジンを用いて処理し、そして２時間還流することにより得る。

反応スキーム８の具体的説明の態様では、出発材料が２−アミノ−４，５−ジメトキシ安息香酸であり、そして生成物は例えば２−（２−クロロフェニル）−４−（ピリジルアミノ）−６，７−ジメトキシキナゾリンであるので、Ｒ^２は例えば２つのメトキシ置換基を提供することができる。

別の具体的説明の態様では、Ｒ^２は１つのニトロを提供し；出発材料はすなわち、例えば２−アミノ−５−ニトロ安息香酸であり、そして生成する化合物は例えば２（２−フルオロフェニル）−４−（ピリジルアミノ）−５−ニトロキナゾリンである。

反応スキーム４−６は反応スキーム８に説明する様式に準じて行うことができ、すなわち方法の工程を通じてＲ^２置換基を保持する。

Ｒ^２がニトロである本発明の化合物では、ニトロ基はアミノに還元され、そして反応スキーム９に示すようにさらに誘導化することができる。

反応スキーム９では、反応スキーム８の具体的説明の生成物は、最初に工程ｇにて酢酸およびメタノールの存在下、水素および炭素担持パラジウム（１０％）を用いて大気圧で１２時間処理することにより還元してアミノ化合物を得る。生成したアミノ化合物は、クロロホルムおよびピリジンの存在下で適切な酸クロライドを４時間使用してアシル形（Ｒ＝アシル）に転換するか、またはアミン中間体をエタノール、酢酸およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で適当なアルデヒドを用いて４時間処理することにより対応するアルキル化アミン（Ｒ＝アルキル）に転換する。

前述の例示的反応スキームは、本発明の合成法を具体的に説明するために示すが、生成物のキナゾリン環上に示す置換基は本明細書に記載する包括的な式（１）であり、そして反応物はそれに応じて代えることができると理解される。これらの具体的説明例で示す部分以外のＲ^３の態様、またはこれらの具体的説明例でＡｒ’として示す種々の置換基を有する変形も使用することができる。同様に４位の置換基がアリールアルキルを含む態様も、これらのスキームで使用することができる。本発明の化合物を合成するための方法は、一般に当該技術分野で知られている。

キナゾリン誘導体以外の小有機分子は、標準的な教科書に記載されているように有機化学の周知方法により合成することができる。

式（４）または（５）の化合物は、当業者には直ちに明白な当該技術分野で周知の方法により合成することができる。
処置法
本発明に有用な化合物およびそれらの関連化合物の投与および製剤の様式は、状態の性質および重篤度、処置する特定の個体、および専門家の判断に依存するだろう。また詳細な製剤は投与様式に依存する。

すなわち本発明の低分子化合物は、錠剤、カプセル、シロップ等を提供するように化合物を適当な製薬学的補形剤と配合することにより、経口投与により都合よく投与される。また経口投与に適する製剤には、バッファー、風味料等のような微量成分を含んでもよい。典型的には製剤中の有効成分の量は全製剤の約５％−９５％の範囲内であるが、担体に依存して広い変動が可能である。適当な担体にはシュクロース、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、ピーナッツ油、オリーブ油、水等を含む。

本発明に有用な化合物は、座薬または他の経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）賦形剤を介して投与することができる。典型的にはそのような製剤には、製薬学的に許容され得る界面活性剤のような化合物の粘膜の通過を促進する補形剤を含む。

化合物はさらに、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内または腹腔内注射を含む注射により投与することができる。そのような使用に典型的な製剤は、ハンクス溶液またはリンゲル溶液のような等張性賦形剤中の液体製剤である。

別の製剤には、当該技術分野で知られているようなエーロゾル吸入物、鼻スプレー、リポソーム製剤、緩効型製剤等を含む。

任意の適切な製剤を使用することができる。

本発明の化合物が、β２−アドレナリンアゴニストのような別の治療薬の長期使用または過剰使用から生じるβ−アドレナリン作動性の感受性の低下を打ち消すために使用される場合、化合物の投与経路は他の治療薬が投与される経路にも依存するかもしれない。例えば肺機能の改善から利益を得る喘息、ＣＯＰＤおよび他の疾患（特に気管支拡張）の処置に使用するβ２−アゴニストは、吸入使用のためのエーロゾル製剤として投与されることが多い。したがって本発明の化合物の同時投与は、同じかまたは異なる製剤を使用して吸入経路を使用して都合よく行うことができる。また本発明の化合物は、天然または合成コルチコステロイド、特にプレドニゾンおよびその誘導体、および限定するわけではないが脳由来ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＢＰ）を含むうっ血性心不全のよう心疾患の処置に使用する薬剤のような他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。

技術的に知られている製剤の概論は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、最新版、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルバニア州に見いだされる。このマニュアルの引用は、当該技術的分野では日常的である。

本発明の化合物の投薬用量は、患者毎に変動する多数の因子に依存するだろう。しかし一般に毎日の経口投薬用量には０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ（全体重）、好ましくは０．０１−５０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇを利用すると考えられる。しかし投薬処方は、処置する状態および専門家の判断に依存して変動する。

上に示したように、本発明の化合物はヒトに使用することができるが、それらはまた非ヒト哺乳動物個体を処置するために獣医学的用途にも利用することができる。

本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかになるだろう。

ＴＧＦβ−Ｒ１インヒビターは、ヒト気管支平滑筋細胞（ｈＢＳＭＣ）および心筋細胞のβ−アドレナリン作動性シグナル伝達経路における病理学的変化を打ち消す
材料および方法
材料：
ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦβ１）およびＡｖｔｉｖｉｎ Ａは、Ｒ＆Ｄシステム（ミネアポリス、ミネソタ州）から得た；ポルカテロール、プロパノルオール、ＩＣＩ １１８，５５１は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から得た；イソプロテレノール、フォルスコリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）はカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。［５，７−^３Ｈ］−ＣＧＰ１２１７７（比活性３３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、パーキンエルマーライフサイエンス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ボストン、マサチューセッツ州）から購入した。ダイレクトサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）ＥＩＡキットはアッセイデザイン（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ）（アン アーバー、ミシガン州）から購入した。抗−Ｓｍａｄ２／３マウスモノクローナル抗体はＢＤトランスダクションラボラトリー（Ｔｒｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入し、抗−ホスホ−Ｓｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）ウサギ抗血清は、セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から購入た。ＴＧＦβ受容体Ｉ特異的インヒビターである化合物番号７９（表２）は、サイオス社（Ｓｃｉｏｓ，Ｉｎｃ．）の医化学部門により合成され、そしてストックとしてＤＭＳＯに溶解した。
細胞培養および薬剤処理：
ヒト気管支平滑筋細胞（ｈＢＳＭＣ）はクロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）（バイオフィッタカー社（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ウォーカーズヴィル、メリーランド州）から購入し、そして５％ウシ胎児血清（クロンテック）を含有するＳｍＧＭ−２で３７℃／５％ＣＯ_２にて維持した。すべての実験は６−８継代の細胞について行った。前処理については、細胞を１％血清含有培地または無血清培地で、ＴＧＦβ１、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａおよび他の薬剤の存在または不存在下でインキュベーションした。対照細胞は適切な賦形剤で処理した。

心室の心筋細胞は新生児ラットの心臓から前に記載したように単離し、そしてフィブロネクチンで覆ったプレート（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ２１およびＣｏｏｎ’ｓＦ１２中）に播種した。特に１つの心筋細胞を、１−２日齢のラットの子の心室から酵素的に単離し、そしてヒトのフィブロネクチンを覆ったプレート（ベクトンデッキンソンラボウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｅｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）、ブレッドフォード、マサチューセッツ州）（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ２１およびＣｏｏｎ’ｓＦ１２中）ですでに記載したように維持した（Ｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：７５７−７６３（２０００））。筋細胞は単離から２４−７２時間内に使用した。

実験に関しては、ｃＡＭＰアッセイ用に細胞を２４−ウェルプレートで、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析、ウエスタンブロッティング分析および放射性リガンド結合実験用には６−ウェルプレートで培養した。前処理に関しては、細胞は０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した無血清培地（ＳＦＭ）で１回洗浄し、そして同培地中でインヒビターの存在または不存在下でＴＧＦ−β１とインキュベーションした。対照細胞は適切な賦形剤で処理した。
サイクリックＡＭＰ蓄積のアッセイ：
ＨＢＳＭＣまたはラット新生児の心筋細胞を、９６−ウェルまたは２４−ウェルプレートで２４時間から４８時間、継代培養し、次いで１％血清含有または無血清培地中のＴＧＦβ１（１−２ｎｇ／ｍｌ）、 Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１０−５０ｎｇ／ｍｌ）および他の薬剤で処理した。２４時間後、ホスフォジエステラーゼインヒビター、ＩＢＭＸ（２００μＭ）を１０−１５分間、新たな培地に加えた後、１０μＭプロカテロール、１μＭイソプロテレノールまたは１０−５０μＭのフォルスコリンに１０分間暴露して、ｃＡＭＰ生産の刺激した。刺激培地を除去し、そして細胞を０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。ｃＡＭＰレベルはアッセイデザイン社からのダイレクトｃＡＭＰ ＥＩＡキットを製造元の指示に従い使用して測定した。
放射性リガンド結合アッセイ：
細胞表面上のβ２−アドレナリン受容体数は、親水性の膜非透過性β−アドレナリンアンタゴニスト［^３Ｈ］ＣＧＰ−１２１７７を使用して放射性リガンド結合により測定した。１０ｃｍ皿中の完全なｈＢＳＭＣを、５ｎＭの［^３Ｈ］−ＣＧＰ １２１７７と２０μＭのプロプラノルオール（非特異的結合の量を定めるために）の存在または不存在下で、ＳｍＢＭ中にて１時間、３７℃で大変穏やかに振盪しながらプレインキュベーションした。細胞を０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する氷冷１Ｘ ＰＢＳ（結合バッファー）で３回洗浄し、そして氷冷１Ｘ ＰＢＳでさらに３回洗浄した。プロテアーゼインヒビターを含有する４００μｌのＲＩＰＡバッファーをプレートに加え、そして細胞をプレートから掻き取った。細胞溶解物を集め、そしてタンパク質濃度をＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ）により測定した。全細胞に結合した放射性リガンドは、液体シンチレーションカウンターにより定量し、そしてタンパク質濃度に対して標準化した。
定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：
全ＲＮＡはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（バレンシア、カリフォルニア州）のＲＮＡｅａｓｙキットを使用して細胞から抽出し、そして定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ［Ｇｉｂｓｏｎ ＵＥＭ，Ｈｅｉｄ ＣＡ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＭ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６，９９５−１００１，１９９６］によりＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）７７００配列検出システム（ＰＥアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター市、カリフォルニア州）を使用して分析した。このシステムはＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がＰＣＲの延長期間中に非延長性の二重標識蛍光ハイブリダイゼーションプローブを分解する能力に基づく。プローブはレポーターの蛍光色素で５’末端を標識し、そしてクエンチャーの蛍光色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で３’末端を標識する。プローブが完全である時、レポーターの発光はレポーターとクエンチャーの蛍光色素との物理的近位により消される。しかしＰＣＲの延長期間中に、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオリティック（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性がハイブリダイゼーションプローブを分解し、そしてレポーター色素をプローブから放出され、同時にレポーターの蛍光が増加する。

配列特異的プライマーおよびプローブは、プライマーエスクプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ソフトウェア（ＰＥアプライドバイオシステム、フォスター市、カリフォルニア州）を使用して設計した。１８Ｓ ｒＲＮＡ用のプライマーおよびプローブは、
フォワード ５´−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ−３´（配列番号：１），リバース ５´−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３´（配列番号：２），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＣＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：３）であり；ヒトおよびラットβ１−ＡＲ用はフォワード ５´−ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧ−３´（配列番号：４），リバース ５´−ＡＧＧＴＡＣＡＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧ−３´（配列番号：５）およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＣＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴＡＧＴＣＴＣＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：６）であり；ヒトβ２−ＡＲ用はフォワード ５´−ＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴ−３´（配列番号：７），リバース ５´−ＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧ−３´（配列番号：８），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＡＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：９）であり； ラットβ２−ＡＲ用はフォワード ５´−ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＴＣＴＴＡＴＣ−３´（配列番号：１０），リバース ５´−ＴＧＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＣＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧ−３´（配列番号：１１），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＡＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：１２）であった。プライマーは２００ｎＭ濃度で、そしてプローブは１００ｎＭ濃度で各反応に使用した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素およびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（ＰＥアプライドバイオシステム、フォスター市、カリフォルニア州）をすべてのＲＴ−ＰＣＲ反応およびＰＣＲ反応に使用した。ＲＴ−ＰＣＲのパラメーターは以下の通りであった：４８℃で３０分間（逆転写）、９５℃で１０分間（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ活性化）および４０サイクルの９５℃で１５秒、６０℃で１分。β１−ＡＲ、β２−ＡＲおよび１８Ｓ ｍＲＮＡの相対的定量は、５点標準曲線に対して合わせた各サンプルについて、相対的閾値サイクル数（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ）を使用して算出した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ユーザーニュースレター＃２、ＰＥアプライドバイオシステム、フォスター市、カリフォルニア州）。発現レベルは１８Ｓ ｒＲＮＡに対して標準化した。内因性対照としての１８Ｓの選択は、数種のハウスキーピング遺伝子のΔＣ_Ｔレベルの評価に基づいた：シクロフィリンＡ、１８Ｓ、ＧＡＰＤＨおよびβ−グルクロニダーゼ（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ，１８Ｓ，ＧＡＰＤＨ，ａｎｄ β−Ｇｕｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ）。１８ＳのΔＣ_Ｔレベルは処理条件間で有意に異ならなかった；すなわちそれらはサンプル間で一定レベルで発現された（データは示さず）。
ウエスタンブロット分析：
ＴＧＦβ１および他の薬剤とのインキュベーション後、細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄し、そして０．２ｍｌ／プレートの冷ＲＩＰＡバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ β−グリセロホスフェート、１μＭ オカダ酸、１０ｎｇ／ｍｌ アプロチニン、１０ｎｇ／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ フェニメチルスルホニルフルオリド）に溶解した。サンプルは遠心（４℃、１０分間、１５，０００×ｇ）により清澄化し、そしてタンパク質濃度をＢＣＡ法（ＰＩＲＣＥ）により測定した。等量の全細胞タンパク質を含む溶解物（１５−２０μｇ）は、１０％ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ（インビトロジェン）で分離し、次いでニトロセルロース膜に移した。膜は３％無脂肪ドライミルク／ＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間ブロックし、そして抗−Ｓｍａｄ２／３マウスモノクローナル抗体［トラスンスダクションラボラトリー（Ｓ６６２２０）；３％ミルク／ＴＢＳＴ中で１：５００希釈］、または抗−ホスホ−Ｓｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）ウサギ抗血清［セルシグナリング：（３１０１Ｓ）；３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で１：５００希釈］で、４℃にて一晩、プローブ処理した。ウマ抗−マウスＨＲＰ［サンタクルス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）（ＳＣ−２３１４）；１：２０００希釈］またはウマ抗−ウサギＨＲＰ［サンタクルス（ＳＣ−２３１３０）；１：２０００希釈］を２次抗体として使用した。免疫反応性は化学発光試薬（サンタクルス）で検出し、そしてｘ−線フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））に露出することにより視覚化した。
結果
ヒト気管支平滑筋細胞（ｈＢＳＭＣ）をＴＧＦβ１で処理し、そしてβ２ＡＲ ｍＲＮＡをリアルタイムの定量的ＰＣＲにより上記のように分析した。図１に示す結果は、ＴＧＦβ１への暴露がβ２ＡＲを有意に減少させることを示す。

ｈＢＳＭＣをＴＧＦβ１で処理し、そして細胞表面上のβ２−アドレナリン受容体の数は、親水性の膜非透過性β−アドレナリンアンタゴニスト［３Ｈ］−ＣＧＰ１２１７７を使用して放射性リガンド結合により測定した。図２に示すように、ＴＧＦβ１への暴露はｈＢＳＭＣ上のβＡＲ結合部位を減少させる。

サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の蓄積は、上記のように測定した。図３はｈＢＳＭＣ中のプロカテロールが誘導する、およびフォルスコリンが誘導するｃＡＭＰの蓄積に及ぼすＴＧＦβ１の効果のタイムコースを示す。プロカテロールはβ２ＡＲの特異的アゴニストであり、そしてフォルスコリンはアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を活性化し、そしてプロカテロールおよびフォルスコリンの両方は細胞中にｃＡＭＰ生産を誘導することができる。図３に示すように、ＴＧＦβ−１が誘導するβ２ＡＲ応答の損失は１２時間後に起こり、そして２４時間以降でより顕著であるが、ＴＧＦβ−１が影響を及ぼすＡＣ活性およびシグナル伝達は、２４時間以降により少ない程度で観察されただけである。

これらの結果はＴＧＦβ１がｈＢＳＭＣ中でＳｍａｄ２のリン酸化を誘導し、そしてβ２ＡＲ／ＡＣシグナル伝達を調節することを証明する。

ｈＢＳＭＣは上記のようにプロカテロールおよびイソプロテレノールを用いて、ＴＧＦβ−Ｒ１の代表的な非ペプチド小有機分子インヒビターの存在下で処理した。図４に示すように、インヒビターはＴＧＦβが誘導するｈＢＳＭＣ中のアドレナリン作動性の応答の損失を防止した。さらにインヒビターは、ｈＢＳＭＣ中のＴＧＦβが誘導するＳｍａｄ２リン酸化およびアドレナリン作動性の応答の損失を防止した。

図５はｈＢＳＭＣにおけるＴＧＦβ１処置が誘導するｐ３８のリン酸化、およびＴＧＦβ１が誘導するβ２ＡＲの損失を示し、これはｐ３８インヒビターにより部分的に逆転させることができた。

図６は、より高濃度のアクチビンＡもｈＢＳＭＣ中でβＡＲ応答の損失およびＡＣ活性の低下を引き起こすことを示す。これらの効果はＴＧＦ−β−Ｒ１インヒビターにより逆転することができる。

ラット新生児の心筋細胞をＴＧＦβ１で処理し、そしてβ１ＡＲ発現を上記のようにモニタリングした。図７に示す結果は、ＴＧＦβ１がラット新生児の心筋細胞でβ２ＡＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることを示す。

ＴＧＦβ１で処理したラット新生児の心筋細胞では、ｃＡＭＰの蓄積を上記のように測定した。図８に示す結果は、ＴＧＦβ１がＳｍａｄ２のリン酸化を誘導し、そしてβ２ＡＲ応答の損失を引き起こすことを示す。

図９に示すように、式（１）の代表的な低分子化合物はラット新生児の心筋細胞において、ＴＧＦβ１が誘導するβ２ＡＲ応答およびＡＣ活性の損失を防止する。

図１０に示すように、Ａｃｔｉｖｉｎはラット新生児の心筋細胞でβ２ＡＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートし、そしてこのダウンレギュレーションは代表的な低分子ＴＧＦβ１インヒビターにより防止することができる。

ラット心筋細胞を培養し、そして上記のようにプロカテロールおよびフォルスコリンで処理した。図１１に示すように、続いてアクチビンＡおよびＩＬ−１βを用いた処理がそれぞれβ２ＡＲ応答／ＡＣ活性の損失を誘導する。

次いでＴＧＦβが誘導するＳｍａｄのシグナル伝達をｈＢＳＭＣ細胞培養で調査した。ウエスタンブロット分析を行い、そしてホスホル−Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３レベルを上記のように測定した。図１２に示す結果は、ＴＧＦβ１がｈＢＳＭＣでＳｍａｄ２のリン酸化、およびダウンレギュレートされたＳｍａｄ３発現を誘導することを示す。

図１３は、代表的な式（１）の化合物が、ｈＢＳＭＣにおいてＴＧＦβ１が誘導するＳｍａｄ２のリン酸化、およびＳｍａｄ３のダウンレギュレーションを遮断することを示す。

図１４は、ｈＢＳＭＣにおいてＴＧＦβ１の暴露がＳｍａｄ２／３の核への一過性の転位を誘導することを示す。

結論すると、この実施例で記載する実験は、ＴＧＦβ１がｈＢＳＭＣおよびラット心筋細胞の両方で、β２ＡＲ応答の損失を誘導し、そしてＡＣ活性を減少させることを証明した。ＴＧＦβ１はその機能をＳｍａｄ２／３転写因子の活性化を介して発揮する。この上で検討した結果は、さらに代表的なＴＧＦβ−ＲＩインヒビターがＳｍａｄ２／３の活性化を遮断することによりＴＧＦβ１効果を遮断できることを示す。さらにアクチビンも同様の効果を有することが分かり、これは代表的なＴＧＦβ−ＲＩインヒビターにより逆転することができた。

ＴＧＦβ−ＲＩインヒビターが心筋細胞のＴＧＦ−βのシグナリングに及ぼす効果
材料および方法
試薬：
試薬は実施例１に記載した同じ供給元から得た。（Ｌ）−形、細胞透過性ＪＮＫインヒビターＩはカルビオケム（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。ＴＧＦ−β Ｉ型受容体（ＴＧＦβ−ＲＩ）インヒビター化合物番号７９（表２を参照）およびｐ３８αＭＡＰキナーゼインヒビターは、サイオス社の医化学部門により合成され、そしてストックとしてＤＭＳＯに溶解した。化合物番号７９はインビトロのＴＧＦβ−ＲＩキナーゼ活性に対して〜３７ｎＭのＩＣ５０を、ＴＧＦβ−ＲＩＩ受容体に対して＞１００倍、そして関連するタンパク質キナーゼパネルのメンバーよりも少なくとも２０倍高い特異性で有した（データは含まず）。
心筋細胞の培養および処理
心筋細胞は実施例１に記載したように培養し、そして処理した。
サイクリックＡＭＰ蓄積のアッセイ
ＴＧＦ−β１（１−２ｎｇ／ｍｌ）での処理に続いて、心筋細胞（２４ウェルプレート中で〜１×１０^５細胞／ウェル）を、ＳＦＭ中のホスフォジエステラーゼインヒビター、ＩＢＭＸ（２００μＭ）と３０分間インキュベーションした。次いで細胞をプロカテロール（１０μＭ）、フォルスコリン（１０−５０μＭ）またはイソプロテレノール（Ｉｓｏ、１μＭ）に１０分間暴露してｃＡＭＰを蓄積させた。幾つかの実験では、選択的なβ１−ＡＲアンタゴニスト、ＣＧＰ−２０７１２Ａ（２００ｎＭ）または選択的なβ２−ＡＲアンタゴニスト、ＩＣＩ １１８，５５１（２００ｎＭ）を筋細胞とプレインキュベーションした後、Ｉｓｏ処理を行ってそれぞれ特異的なβ２−ＡＲまたはβ１−ＡＲ媒介型のｃＡＭＰ蓄積を刺激した。インキュベーションは培地を除去することにより止めた。各ウェル中の細胞を１５０μｌの０．１Ｍ ＨＣｌで室温（ＲＴ）にて３０分間溶解した。細胞内ｃＡＭＰ含量は、ダイレクトｃＡＭＰ ＥＩＡキットを使用して製造元の指示に従い測定し、そしてｃＡＭＰレベルをｐｍｏｌ／ｍｌで算出した。
放射性リガンドアッセイ
放射性リガンド結合アッセイは実施例１に記載したように行った。β２−ＡＲに対する非特異的結合を測定するために、５０ｎＭのＣＧＰ−２０７１２Ａを使用した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは実施例１に記載したように行い、そして以下のさらなる配列特異的プライマーおよびプローブの使用を含んだ：
ラットＳｍａｄ３用は、フォワード ５´−ＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＴＡＣＡＧ−３´（配列番号：１３），リバース ５´−ＡＡＣＴＣＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＧＴＡ−３´（配列番号：１４），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＡＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：１５）であり；ラットβＡＲＫ−１／ＧＲＫ２用はフォワード ５´−ＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡ−３´（配列番号：１６），リバース ５´−ＧＣＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＣ−３´（配列番号：１７），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：１８），であり；ラットＡＣ５用はフォワード ５´−ＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＡＧＡＣＴＴ−３´（配列番号：１９），リバース ５´−ＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴ−３´（配列番号：２０），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：２１）であり； ラットＡＣ６用はフォワード ５´−ＧＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＣＧＴ−３´（配列番号：２２），リバース ５´−ＧＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡ−３´（配列番号：２３），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＣＡＣＧＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣＴ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：２４）であり；ラットＧｉα−１用はフォワード ５´−ＣＧＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡ−３´（配列番号：２５），およびリバース ５´−ＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴ−３´（配列番号：２６），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＣＧＧＣＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＣＡＧＡＡＴ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：２７）であり；そしてラットＧｉα−２用はフォワード ５´−ＴＧＣＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＧＡＡＧ−３´（配列番号：２８），およびリバース ５´−ＣＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡ−３´（配列番号：２９）およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＡＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＡＡＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：３０）であり； ラットＧｉα−３用はフォワード ５´−ＧＣＴＴＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴＡＡＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＡＧＡ−３´（配列番号：３１），およびリバース ５´−ＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴ−３´（配列番号：３２），およびプローブ ５´−６ＦＡＭ−ＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号：３３）であった。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は実施例１に記載したように行い、そして以下のさらなる１次抗体の使用を含んだ：Ｓｍａｄ２／３モノクローナル抗体（ＢＤトランスダクションラボラトリー、サンディエゴ、カリフォルニア州）；抗−ホスホ−Ｓｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）ウサギ抗血清（セルシグナリングテクノロジー社、ベヴァリー、マサチューセッツ州）：Ａｃｔｉｎ（ｓｃ−１６１６）およびＧＲＫ−２（ｓｃ−１３１４３）用の抗体（サンタクルスバイオテクノロジー、サンタクルス、カリフォルニア州）；抗−Ｇｓα、抗−Ｇｉα−１、抗−Ｇｉα３抗体（カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア州）。１次抗体の結合に続いて、２次の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗−マウスまたはヤギ抗−ウサギ抗体とＲＴで１時間、インキュベーションした（サンタクルスバイオテクノロジー）。免疫反応性は化学発光試薬で検出し、そしてｘ−線フィルム（コダック）に露出することにより視覚化した。
免疫蛍光染色
ＴＧＦ−β１に応答したＳｍａｄタンパク質の核への転位は、モノクローナル抗−Ｓａｍｄ２／３抗体（ＢＤトランスダクションラボラトリー）および抗−Ｓｍａｄ４抗体（ｓｃ−７９６６）（サンタクルスバイオテクノロジー）を用いて免疫蛍光染色により測定した。簡単に説明すると、フィブロネクチンおよびゼラチンで覆ったＬａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド（ナルジェ ヌンク インターナショナル（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ナパーヴィル、イリノイ州）上で培養した筋細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で５分間固定し、次いで０．１％サポニン／１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（ＰＢＳ中）を１５分間染み込ませた。非特異的結合を５％ＮＧＳ／０．０５％サポニン（ＰＢＳ中）で１５分間ブロッキングした後、スライドを１次抗体と１％ＮＧＳ（ＰＢＳ中）中で４℃にて一晩インキュベーションした。さらに洗浄およびブロッキングした後、スライドをビオチン化抗−マウス抗体と３０分間インキュベーションし、続いてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合−アビジン（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、バーリンガム、カリフォルニア州）と３０分間インキュベーションした。スライドを乾燥させ、そしてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクター）に乗せた。サンプルは蛍光顕微鏡により分析した。
統計分析
調査したデータは、平均＋Ｓ．Ｅとして表した。スチューデントｔ検定は群の対を比較するために使用した。０．０５未満のＰ値は統計的に有意と考えた。
結果
ＴＧＦ−β１はラット心筋細胞のβ２−ＡＲ応答の損失を誘導する
最初の実験はラット心筋細胞中の最大ｃＡＭＰ蓄積を測定するために、非選択的β−ＡＲアゴニストであるイソプロテレノール（１μＭ）を使用した。以前の知見と一致して（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｉｒ Ｒｅｓ．８５：１１０１−１１１１（１９９９）；Ｓａｂｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒ Ｒｅｓ．８６：１０４７−１０５３（２０００））、応答は２００ｎＭのＣＧＰ−２０７１２Ａ（β１−ＡＲアンタゴニスト）で〜７５％まで弱められ、２００ｎＭのＩＣＩ １１８，５５１（β２−ＡＲアンタゴニスト）で〜２５％まで弱められ、そして両方の存在下で９０％以上まで遮断された（図１８）。これらの結果は、ｃＡＭＰ蓄積の刺激がβ１−およびβ２−ＡＲ作用の組合わせを介して媒介されたことを示す。β２−ＡＲ特異的アゴニストであるプロカテロール（１０μＭ）もラット心筋細胞中のｃＡＭＰ蓄積を実質的に増加した。

心筋細胞のＴＧＦ−β１を用いた２４時間の前処理は、β２−ＡＲアゴニストであるプロカテロール（１０μＭ）による後のｃＡＭＰ蓄積に濃度依存的な減少を引き起こした。最大効果は１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で達成され、５９±５．２％の低下を生じた（ｎ＝５回の独立した実験）（図１９Ａ）。ＴＧＦ−β１の効果は時間依存的であり；ｃＡＭＰ蓄積の最大減少は、２４時間までに観察された（図１９Ｂ）。またＴＧＦ−β１は、β２−ＡＲがＣＧＰ−２０７１２Ａの存在下でイソプロテレノールにより選択的に刺激された時、ｃＡＭＰ蓄積を有意に減少させた（〜６５％）。興味深いことには、筋細胞の２４時間のＴＧＦ−β１前処理は、ＩＣＩ １１８，５５１の存在下でイソプロテレノールを用いた刺激により測定されるβ１−ＡＲ媒介型のｃＡＭＰ蓄積に、わずかな低下を引き起こしただけであった（１６．５±３．１％）（ｎ＝３回の独立した実験）（図１９Ｃ）。加えて、ＴＧＦ−β１への暴露は直接的なアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）アクチベーターであるフォルスコリン（２５μＭ）により刺激されるｃＡＭＰ蓄積を減少させ（図１９Ｄ）、ＴＧＦ−β１がＡＣ活性の改変が関与するβ−アドレナリン作動性の感受性の低下を誘導したことを示唆する。合わせるとこれらの結果は、心筋細胞のＴＧＦ−β１処置が主に低下したβ２−ＡＲ応答によるアゴニスト刺激に応答してβ−ＡＲ応答の減損を引き起こし；さらに減少したＡＣ活性が少なくとも一部は貢献することを示す。
ＴＧＦ−β１はβ２−ＡＲの定常状態ｍＲＮＡレベルおよび受容体数をダウンレギュレートする
ＴＧＦ−β１は、β２−ＡＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質のダウンレギュレーションを介して種々の細胞型のβ−ＡＲ受容体および機能を調節することが示された（Ｉｉｚｕｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２６：４３５−４４０（１９９４）：Ｎｏｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：Ｌ１８７−１９１（１９９４）；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｕｎｙｎ，Ｓｃｈｍｉｅｄｂｅｒｇｓ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６２：５２０−５２５（２０００））。β−ＡＲ ｍＲＮＡの変化を検出できるかどうかを調査するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。２４時間のＴＧＦ−β１前処理はβ２−ＡＲ ｍＲＮＡレベルを劇的に減少させた（図２０Ａ）。機能的アッセイと合致して、ＴＧＦ−β１の暴露は心筋細胞のβ１−ＡＲ ｍＲＮＡレベルを有意に改変しなかった。さらにタイムコース実験では、ＴＧＦ−β１によるβ２−ＡＲ ｍＲＮＡの抑制が処置からわずか１時間で起こることが明らかとなり、β２−ＡＲ遺伝子転写の調節がラット新生児の心筋細胞では迅速な出来事であることを示す（図２０Ｂ）。これらの結果は、ＴＧＦ−β１がβ２−ＡＲメッセージレベルをダウンレギュレートし、心筋細胞において可能な受容体発現の減少に関するメカニズムを示唆している。
β−アドレナリン作動性のシグナリング分子の発現に及ぼすＴＧＦ−β１の効果
ＴＧＦ−β１で処置した心筋細胞で、β−アゴニストに対する改変されたｃＡＭＰ応答に貢献することができる他のβ−ＡＲシグナル伝達分子の発現に変化があるのかどうかを調査するために、我々はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析をそれぞれ使用してｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを調査した。心筋細胞でβ−ＡＲのシグナル伝達を媒介する幾つかの候補が試験され、それらにはβ−ＡＲキナーゼ１（βＡＲＫ１、ＧＲＫ２としても知られている）、Ｇｓ、Ｇｉ、ＡＣ５およびＡＣ６を含む。代表的なデータを図５に示す。ＴＧＦ−β１への暴露は、心筋細胞でメッセージおよびタンパク質レベルのいずれでもβＡＲＫ１、Ｇｓα、Ｇｉα−１またはＧｉα−３の発現を改変しなかったことを示す（図２１Ａ−Ｃ、データは示さず）。対照的に、ＡＣ５およびＡＣ６のｍＲＮＡレベルは、時間依存的な様式でＴＧＦ−β１による有意な低下を示し、ＴＧＦ−β１で処理した心筋細胞においてフォルスコリンが誘導するＡＣ活性の低下は、低下したＡＣ５およびＡＣ６発現に由来し得ることを示唆する。
ＴβＲＩキナーゼインヒビターは心筋細胞においてＴＧＦ−β１活性化Ｓｍａｄのシグナリングを遮断する
ＴＧＦ−β１が誘導するβ２−ＡＲ応答の損失の原因となるシグナル伝達経路（１つまたは複数）を読み解くために、最初に培養した心筋細胞でＴＧＦ−β１により開始される潜在的なシグナル伝達反応を調査した。筋細胞とＴＧＦ−β１とのインキュベーションは、Ｓｍａｄシグナル伝達の迅速な活性化を誘導した。Ｓｍａｄ２タンパク質のセリンリン酸化は１時間で頂点となり、そして２４時間維持され、全Ｓｍａｄタンパク質レベルの変化は最少であった（図２２Ａ）。同様なリン酸化プロファイルがＴＧＦ−β１で処理した心筋細胞のＳｍａｄ３タンパク質について観察された（データは示さず）。ＴＧＦ−β１が活性化したＳｍａｄシグナル伝達がＴβＲＩキナーゼ活性に依存するのかどうかを測定するために、選択的な低分子インヒビターである化合物番号７９を使用した。４００ｎＭの化合物番号７９とのプレインキュベーションは、１時間および２４時間の両方でＴＧＦ−β１により誘導されるＳｍａｄ２のリン酸化／活性化を有意に遮断した（図６Ｂ）。対照的に、特異的なｐ３８キナーゼインヒビターとのプレインキュベーションでは、化合物番号７９は、ＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２のリン酸化に影響を及ぼさなかった（図２２Ｂ）。Ｓｍａｄ２／３またはＳｍａｄ４に対して特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色は、休止している心筋細胞中のＳｍａｄ２／３およびＳｍａｄ４の優勢な細胞質での局在化を明らかとした（図２２Ｃ）。ＴＧＦ−β１による１時間の刺激で蛍光染色は核で劇的に増加し、Ｓｍａｄ２／３およびＳｍａｄ４の核への転位を示した。ここでも化合物番号７９は４００ｎＭで、これらの細胞におけるＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２／３およびＳｍａｄ４の核への転位を完全に廃止した。加えて我々はＴＧＦ−β１処理が２４時間内に心筋細胞においてＳｍａｄ３をダウンレギュレートするが、Ｓｍａｄ２ ｍＲＮＡはしないことが分かった。これはまた化合物番号７９により用量依存的様式で遮断された（図２３Ａ、データは示さず）。対照的に、阻害Ｓｍａｄ７ ｍＲＮＡは心筋細胞でＴＧＦ−β１処理によりアップレギュレートされ（データは示さず）、負のフィードバックループを表した。Ｓｍａｄ３のダウンレギュレーションは、幾つかの系で報告されるようなＴＧＦ−βシグナル伝達の別の負のフィードバックループを表す可能性があり（Ｐｏｎｃｅｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５６：１３５４−１３６５（１９９９）；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｇｅｖｅｒｅｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９４：３１９−３２３（２００２））、そして心筋細胞における遺伝子発現を調節するためのＴＧＦ−βシグナル伝達に、Ｓｍａｄ２とは異なるＳｍａｄ３の役割の可能性を示唆する。

ＴＧＦ−β１がＭＡＰキナーゼ経路に及ぼす効果も調査した。ＭＥＫ１／２（Ｕ０１２６）、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）（細胞透過性ペプチドインヒビター）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼの特異的インヒビターを機能的アッセイに使用して、それらのβ２−ＡＲ応答のＴＧＦ−β１調節における役割を調査した。これらの化合物に有意な効果は観察されなかった（図２４Ａ）。これらのデータは、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼ依存的なＳｍａｄシグナル伝達がラットの心筋細胞でＴＧＦ−β１による刺激で活性化され、そして恐らくこれらの細胞でＴＧＦ−β１の細胞作用を媒介する可能性がある主要なシグナル伝達経路の１つであることを示す。
化合物番号７９はＴＧＦ−β１が誘導するβ２−ＡＲ発現および機能のダウンレギュレーションを遮断する
次に我々はＴＧＦ−β１と同時処理した化合物番号７９が、β２−ＡＲ遺伝子およびタンパク質発現レベルに及ぼす効果を調査した。培養した心筋細胞を、化合物番号７９の不存在または存在下で５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と２４時間インキュベーションした。ＴＧＦ−β１が誘導するβ２−ＡＲ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、用量依存的様式で化合物番号７９により逆転された（図２３Ｂ）。最高用量（４００−１０００ｎＭ）の化合物番号７９で、ＴＧＦ−β１処理細胞中のβ２−ＡＲのｍＲＮＡレベルは対照細胞のレベルよりも高く、休止心筋細胞中の基本的なＴＧＦ−βシグナル伝達がＴＧＦβＲＩキナーゼインヒビターである化合物番号７９により阻害されることが示唆される。対照的に、ｐ３８インヒビターはβ２−ＡＲ ｍＲＮＡレベルに効果が無かった。加えてＴＧＦ−β１処理心筋細胞における減少したＡＣ５およびＡＣ６のｍＲＮＡレベルも、用量依存的様式で化合物番号７９により阻害された（図２３Ｃ、Ｄ）。

ＴＧＦ−β１への暴露から２４時間後のプロカテロール刺激に対するβ２−ＡＲ応答の機能的分析は、賦形剤対照に比べて２００ｎＭの化合物番号７９または中和抗−ＴＧＦβｐａｎ−特異的モノクローナル抗体の存在下で、心筋細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の上昇を示した（図２４Ａ）。対照的に化合物番号７９、Ｕ０１２６またはＪＮＫインヒビターＩは、ＴＧＦ−β１処理心筋細胞におけるβ２−ＡＲが媒介するｃＡＭＰ蓄積に影響を及ぼさず、主要なＭＡＰキナーゼ経路はβ２−ＡＲ機能のＴＧＦ−β１調節の原因ではないことを示す。さらにＴＧＦ−β１処理心筋細胞におけるイソプロテレノールまたはフォルスコリンが誘導するｃＡＭＰ蓄積は、２００ｎＭの化合物番号７９またはＴＧＦ−β中和抗体とのプレインキュベーションにより保護された（図２４Ｂ）。まとめると、これらのデータはＴβＲＩキナーゼインヒビターである化合物番号７９が心筋細胞中でＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナル伝達を遮断し、そしてＴＧＦ−β１が誘導するβ２−ＡＲ遺伝子発現および機能の抑制を排除することを示す。
考察
本実験はラットの心筋細胞において、ＴＧＦ−β１処理がβ−アドレナリン作動性機能の脱感作を誘導し、β−アゴニスト（β２−特異的プロカテロールおよび非特異的βアゴニストのイソプロテレロール）に応答して減少したｃＡＭＰ蓄積を生じることを示す。この効果はβ２−ＡＲ応答でさらに劇的であり、２４時間でプロカテロールが刺激するｃＡＭＰ生産に最大〜６０％の減少をもたらした。ＴＧＦ−β１効果は濃度および時間依存的であり、そしてＴＧＦ−β１の効果的濃度は、生理学的範囲であった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８：ＩＩ−１４４−ＩＩ−１６０（１９９８））。ＴＧＦ−β１によるβ２−ＡＲ ｍＲＮＡレベルの明白なダウンレギュレーションが観察された。放射性リガンド結合実験は、ＴＧＦ−β１処理心筋細胞中でβ２−ＡＲ受容体の結合部位を減少させる傾向を示し、そしてこの低下はそのダウンレギュレーションにより説明することができる。興味深いことに、ＴＧＦ−β１はβ１−ＡＲ ｍＲＮＡレベルも受容体レベルも改変せず、ＴＧＦ−β１処理心筋細胞中のβ１−ＡＲが媒介するｃＡＭＰ蓄積には恐らくＡＣ活性の低下のような他のメカニズム（１つまたは複数）が関与することを示唆している。

実際に心筋細胞のＴＧＦ−β１処理は、フォルスコリン（直接的なＡＣアクチベータ）が完全な細胞中のｃＡＭＰ蓄積を増す能力を下げた。さらに２つの主要な心臓ＡＣアイソフォームであるＡＣ５およびＡＣ６（Ｈａｎｏｕｎｅ ａｎｄ Ｄｅｆｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１４５−１７４（２００１））の発現も、時間依存的様式でＴＧＦ−β１により抑制されることが示され、これはＴＧＦ−β１処理細胞に由来する膜中で低下したＡＣ活性に貢献することができた（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：２３２−２３９（１９９５））。対照的にβ−ＡＲの下流の他のシグナル伝達分子（Ｇｓα、Ｇｉα−１、−２、−３およびβＡＲＫ１）の発現は、改変されなかった。したがって心筋細胞においてＴＧＦ−α１が誘導するβ２−ＡＲ応答性の損失は、減少したβ２−ＡＲタンパク質レベルおよび改変されたＡＣ活性の組合わさった作用による可能性がある。

化合物番号７９は本出願で一般に、または具体的に開示するちょうど他の化合物のように、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼの有力な選択的低分子インヒビターの新規クラスに属する。このインヒビターを使用して、本明細書に与えるデータはＳｍａｄシグナル伝達経路がラット心筋細胞におけるβ２−ＡＲ発現および機能のＴＧＦ−β１調節を媒介することを証明する。ＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２／３の活性化および核への転位ならびにＳｍａｄ２の基本的リン酸化は、化合物番号７９とのインキュベーションにより遮断され（図２２Ｂ）、オートクラインメカニズムにより基本的ＴＧＦ−βシグナル伝達が培養した休止心筋細胞に存在することを示唆する。この現象はβ２−ＡＲ遺伝子発現に反映され、ここで化合物番号７９を用いた処置はＴＧＦ−β１により低下したβ２−ＡＲ ｍＲＮＡレベルを回復するだけでなく、高濃度で未処置カルチャー中よりも高くβ２−ＡＲレベルを上昇させる（図２３）。これは化合物番号７９が、より高濃度で使用した時に心筋細胞中の基準ｃＡＭＰレベルを上昇させることが観察されたこととも一致する。

多くの証拠が、β−ＡＲ刺激に対する心臓の応答は、ヒトおよび動物モデルにおける慢性的心不全で減少することを証明した。また実験は、上昇した血漿カテコールアミンレベルとβ−ＡＲ応答の弱化の程度との間に正の相関があることも示唆する（Ｂｒｉｓｔｏ，Ｌａｎｃｅｔ １９９８、同上）。多くの類似性にもかかわらずβ１−ＡＲおよびβ２−ＡＲは、β２−ＡＲのＧｓおよびＧｉタンパク質への二重共役に起因する心臓肥大および生存に著しく異なる慢性的効果を有する（Ｚｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８５：１０９２−１１００（１９９９））。一般にβ２−ＡＲは保護的となるが、β１−ＡＲの過剰刺激は有害である。心臓β１−ＡＲの導入遺伝子過剰発現は、低レベルで心臓肥大および心不全をもたらす（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１６７０１−１６７０８（１９９９））。対照的にβ２−ＡＲの過剰発現は中程度のレベルで生化学的およびインビボの心臓機能を強化する（Ｍｉｎａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：５８２−５８６（１９９４）およびＬｉｇｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：１７０７−１７１４（２０００））。さらに培養したラット心筋細胞の実験は、β２−ＡＲがアゴニスト刺激で生存シグナルを発揮する一方、β１−ＡＲ刺激はアポトーシス経路を活性化するだけであることを示唆している（Ｃｏｍｍｕｎａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：２２１０−２２１２（１９９９）およびＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１６０７−１６１２（２００１））。これらの知見を仮定すると、心臓β２−ＡＲの選択的な再活性化は、心臓毒性との因果関係無しにカテコールアミン依存的な変力的支持（ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｓｕｐｐｏｒｔ）を提供できる。実際に幾つかの実験モデルにおいて、アデノウイルス伝達によるβ２−ＡＲの心臓特異的な発現は心筋β−ＡＲのシグナリングおよび心室機能こ有意な改善をもたらした（Ａｋｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２１００−１２１０５（１９９７）；Ｍａｕｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：２１−２９（１９９９）およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：４０８−４１４（２０００））。

本実験では、ＴβＲＩキナーゼインヒビターである化合物番号７９がＴＧＦ−β１処理心筋細胞でβ２−ＡＲ発現およびβ−アゴニストに対する応答を選択的に上昇させることが証明された。ＴＧＦ−β１は肥大および線維症のようなＨＦの他の観点で重要な役割を果たすことが示された。化合物番号７９を使用した他の実験も、幾つかのインビトロおよびインビボモデルで化合物がＴＧＦ−β媒介型の線維症を遮断できることを示す。化合物番号７９のようなＴβＲＩキナーゼインヒビターの組み合わされた特性は、慢性心不全に新たな治療的パラダイムを与える。

心筋細胞におけるＴＧＦ−β１および化合物番号７９によるβ−ＡＲ結合部位の改変 心筋細胞は、ＴＧＦβ１の存在または不存在下で５００ｎＭの化合物番号７９の手段により処理した。次いで膜を調製し、１００ｐｍ［^１２５］−ＣＹＰの結合は８μｇの膜タンパク質を使用して２３℃で２時間測定し、そしてｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質として表した。１００ｎＭのＣＧＰ−２０７１２Ａの存在下での結合はβ２−ＡＲへの結合と定め、一方、１００μＭのプロプラノルオールの存在下での結合は非特異的結合を定めた。全結合からβ２−ＡＲ結合を引いたものをβ１−ＡＲ結合と定めた。結果を図２５に示す（ｐ＜０．０５対賦形剤）。

ＴＧＦβ１への暴露がヒト気管支平滑筋細胞においてβ２ＡＲ ｍＲＮＡを減少させることを具体的に説明する。 ＴＧＦβ１への暴露がｈＢＳＭＣ上のβＡＲ結合部位を減少させることを示す。 ｈＢＳＭＣにおいてプロカテロールが誘導する、およびフォルスコリンが誘導するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＴＧβ１効果のタイムコースを示す。 代表的な小分子ＴＧＦβ−ＲＩキナーゼインヒビター（化合物番号７９）は、ｈＢＳＭＣにおいてＴＧＦβ−１が誘導するアドレナリン作動性応答の損失を防止することを表す。 ｐ３８キナーゼもｈＢＳＭＣにおいてＴＧＦβ１が調節するβ２ＡＲのシグナリングに関与していることを示す。 アクチビンＡは、より高濃度でβ２ＡＲ応答の損失ならびに低下したＡＣ活性を引き起こす。これらの効果は本発明の代表的な小分子であるＴＧＦβ１インヒビターにより可逆的であった。 ＴＧＦβ１はラット新生児の心筋細胞のβ２ＡＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートする。 ＴＧＦβ１はラットの心筋細胞において、Ｓｍａｄ２のリン酸化を誘導し、そしてβ２ＡＲ応答の損失を引き起こすことを示す。 式（１）の代表的な小分子化合物（化合物番号７９）は、ラット新生児の心筋細胞においてＴＧＦβが誘導するβ２ＡＲ応答およびＡＣ活性の損失を防止することを示す。 アクチビンはラット新生児の心筋細胞においてβ２ＡＲをダウンレギュレートし、そしてこのダウンレギュレーションを代表的な小分子のＴＧＦβ１インヒビター（化合物Ｎｏ，７９）により防止することができる。 アクチビンＡおよびＩＬ−１βがラット新生児の心筋細胞においてβ２ＡＲ応答／ＡＣ活性の損失を誘導することを示す。 ＴＧＦβ１が、ｈＢＳＭＣにおいてＳｍａｄ２のリン酸化を誘導し、そしてＳｍａｄ３発現をダウンレギュレートすることを示す。 式（１）の代表的な小分子化合物（化合物番号７９）は、ＴＧＦβ１が誘導するＳｍａｄ２のリン酸化およびＳｍａｄ３のダウンレギュレーションを遮断することを示す。 ＴＧＦβ１への暴露は、ｈＢＳＭＣにおいてＳｍａｄ２／３の核への一過性の転位を誘導することを示す。 ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を具体的に説明する。 β−アドレナリン受容体シグナル伝達経路を具体的に説明する。 β−アドレナリン受容体分解の種々のメカニズムを具体的に説明する。 ラット新生児の心筋細胞におけるβ１−およびβ２−ＡＲが媒介するｃＡＭＰの蓄積。心筋細胞は賦形剤（アンタゴニスト無し）、ＩＣＩ １１８，５５１（β２−ＡＲアンタゴニスト）、ＣＧＰ−２０７１２Ａ（β１−ＡＲアンタゴニスト）、または両アンタゴニストと、ホスフォジエステラーゼインヒビターＩＢＭＸ（２００μＭ）を含有する無血清培地中で３０分間プレインキュベーションした後、１μＭのイソプロテレノール（Ｉｓｏ）で１０分間処理した。細胞内ｃＡＭＰ蓄積はＥＩＡで測定し、ｐｍｏ／ｍｌ（細胞溶解物）として材料および方法に記載したように表した。 ＴＧＦ−β１はβ２−ＡＲ応答の低下を誘導する。Ａ、ｃＡＭＰ蓄積のプロカテロール刺激に及ぼすＴＧＦ−β１の濃度依存的効果。心筋細胞は示すような種々の濃度のＴＧＦ−β１の不存在下（対照）または存在下で２４時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、次いで１０μＭのプロカテロールにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積をＥＩＡにより測定した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。Ｂ、プロカテロールが刺激するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＴＧＦ−β１の時間依存的効果。心筋細胞は２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１の不存在または存在下で示した時間インキュベーションした。１０μＭのプロカテロールにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積は、ＥＩＡにより測定した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。Ｃ、β１−ＡＲおよびβ２−ＡＲが媒介するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＴＧＦ−β１の効果。心筋細胞は１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で２４時間前処理し、続いて１μＭのＩｓｏと１０分間、ＩＣＩ １１８，５５１またはＣＧＰ−２０７１２Ａの存在下でインキュベーションした。次いでｃＡＭＰ蓄積を測定した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。Ｄ、Ｉｓｏおよびフォルスコリンが刺激するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＴＧＦ−β１の効果。ＴＧＦ−β１と２４時間インキュベーションした後、心筋細胞は２００μＭのＩＢＭＸの存在下で対照培地（基準）、１μＭのＩｓｏまたは２５μＭのフォルスコリンを用いて１０分間刺激した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。 ＴＧＦ−β１への暴露はβ２−ＡＲ ｍＲＮＡの定常状態のレベルを低下させる。心筋細胞は種々の濃度のＴＧＦ−β１と２４時間（Ａ）、または５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と示した時間（Ｂ）処理した後、回収した。次いで各処理から全ＲＮＡを抽出し、そしてβ１−ＡＲおよびβ２−ＡＲメッセージレベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。１８Ｓ ｒＲＮＡは内部対照として使用した。 ＴＧＦ−β１によるβ−アドレナリンの作動性シグナリング分子の調節。示した異なる時点のＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した心筋細胞における、ＧＲＫ２（Ａ）、アデニリルシクラーゼＡＣ５、（Ｄ）およびＡＣ６（Ｅ）のｍＲＮＡレベルに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。１８Ｓ ｒＲＮＡは内部対照として使用した。ＡＣ５およびＡＣ６のｍＲＮＡレベルは有意に低下した。ＧＲＫ２ ｍＲＮＡレベルの変化は観察されなかった。ＧＲＫ２（Ｂ）およびＧ−タンパク質（刺激Ｇタンパク質、Ｇｓα；阻害Ｇタンパク質Ｇｉα−１およびＧｉα−３）（Ｃ）に対する特異抗体（Ｃ）を用いた、未処理（対照）における、またはＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ）で処理した心筋細胞の２４時間の、または示した種々の時点のウエスタンブロット分析。ＧＲＫ２またはＧ−タンパク質レベルに変化は観察されなかった。 化合物番号７９（表２を参照）は、ＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２の活性化およびＳｍａｄ２／３／４の核への転位を遮断する。Ａ、ＴＧＦ−β１により誘導されるＳｍａｄ２リン酸化／活性化のキネティック。心筋細胞は２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と示した種々な時間処理した。細胞溶解物は、それぞれホスホ−特異的Ｓｍａｄ２または全Ｓｍａｄ２のいずれかに対する抗体でイムノブロットした。Ｂ。化合物番号７９によるＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２活性化の排除。細胞溶解物は、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１無しで、またはそれと一緒に、４００ｎＭの化合物番号７９またはｐ３８インヒビターの不存在（−）または存在下（＋）でインキュベーションした１および２４時間後に、ホスフォ−特異的Ｓｍａｄ２、アクチンおよび全Ｓｍａｄ２に対してそれぞれ特異的な抗体でイムノブロットした。化合物はＴＧＦ−βを加える前に３０分間プレインキュベーションした。Ｃ、化合物番号７９によるＴＧＦ−β１が誘導するＳｍａｄ２／３およびＳｍａｄ４の核への転位の阻害。心筋細胞は２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と一緒に、またはそれ無しで６０分間処理した後、それぞれＳｍａｄ４およびＳｍａｄ２／３に対する抗体を使用した免疫蛍光染色用に固定した。化合物で処理した場合、細胞は４００ｎＭの化合物番号７９で３０分間プレインキュベーションした後、ＴＧＦ−β１を加えた。ＤＭＳＯは賦形剤対照として使用した。 化合物番号７９はＴＧＦ−β１が誘導する遺伝子発現のダウンレギュレーションを阻害する。細胞は種々の濃度の化合物番号７９またはｐ３８インヒビターとプレインキュベーションした後、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で２４時間処理した。各処理から全ＲＮＡを抽出し、そしてＳｍａｄ３（Ａ）、β２−ＡＲ（Ｂ）、ＡＣ５（Ｃ）およびＡＣ６（Ｄ）の相対的ｍＲＮＡレベルについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。１８Ｓ ｒＲＮＡは内部対照として使用した。 ＴβＲＩインヒビター化合物番号７９（しかしＭＡＰキナーゼインヒビターではない）は、β２−アドレナリン作動性応答ならびにＡＣ活性のＴＧＦ−β１が誘導する減少を逆転させる。Ａ、プロカテロールが刺激するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすインヒビターの効果。心筋細胞はＤＭＳＯ（賦形剤）、ＴＧＦ−βモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、化合物番号７９（２００ｎＭ）、ｐ３８インヒビター（０．５μＭ）、Ｕ−０１２６（５μＭ）またはＪＮＫインヒビターＩ（５μＭ）で、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下で２４時間処理した。１０μＭのプロカテロールにより刺激された細胞内のｃＡＭＰ蓄積を測定した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。＊＊Ｐ＜０．０５ 対 ＤＭＳＯ。Ｂ、フォルスコリンが刺激するｃＡＭＰ蓄積に及ぼすインヒビター効果。細胞はＡと同様に処理し、そして２５μＭのフォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積を測定した。＊Ｐ＜０．０５ 対 対照。＊＊Ｐ＜０．０５ 対 ＤＭＳＯ。 心筋細胞におけるＴＧＦ−βおよび化合物番号７９によるβ−ＡＲ結合部位の改変を具体的に説明する。

【配列表】

Claims (65)

1. ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナルシリングを阻害することができる化合物の有効量を必要な哺乳動物個体に投与することを含んでなる、β−アドレナリン作動性シグナル伝達経路における病理学的変化を打ち消すための方法。
2. ＴＧＦ−β受容体がＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼである、請求項１に記載の方法。
3. 上記化合物がＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼに特異的に結合することができる、請求項２に記載の方法。
4. 上記化合物がＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼにより媒介される生物学的活性を優先的に阻害する、請求項２に記載の方法。
5. 病理学的変化が、（ａ）β−アドレナリン受容体のｍＲＮＡレベルにおける低下、（ｂ）β−アドレナリン受容体の結合部位数の低下、（ｃ）ＴＧＦ−βが誘導するＳｍａｄ３発現のダウンレギュレーション、および（ｄ）β−アドレナリン作動性の感受性の低下からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. β−アドレナリン作動性の感受性の低下がβ−アドレナリンアゴニストの投与に付随する、請求項５に記載の方法。
7. β−アドレナリン作動性の感受性の低下がβ−アドレナリンアゴニストの長期または過剰投与から生じる、請求項６に記載の方法。
8. β−アドレナリンアゴニストが、プロカテロール、アルブテロール、サルメテロール、ホルモテロールおよびドプタミンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 病理学的変化が肺組織で観察される請求項１に記載の方法。
10. 病理学的変化が肺機能の改善から利益を得る疾患または状態を生じる、請求項９に記載の方法。
11. 疾患または状態が気管支収縮疾患である請求項１０に記載の方法。
12. 疾患または状態が、気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺水腫、嚢胞性線維症（ＣＦ）、閉塞性肺疾患、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、放射線が誘発する肺の損傷、および感染源、吸入した毒素、または循環している外因性毒素、老化および肺機能の減損に対する遺伝的素因のような他の因子から生じる肺の損傷からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
13. 哺乳動物個体がヒトである請求項１２に記載の方法。
14. ヒト個体が気管支拡張を必要とする、請求項１３に記載の方法。
15. 病理学的変化が心臓組織で観察される、請求項１に記載の方法。
16. 哺乳動物個体がヒトである請求項１５に記載の方法。
17. ヒト個体がすでに心臓疾患と診断されている、請求項１６に記載の方法。
18. 心臓疾患が慢性またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）である、請求項１７に記載の方法。
19. 化合物がさらなる受容体キナーゼに結合することができる、請求項３に記載の方法。
20. さらなる受容体キナーゼがアクチビン受容体（Ａｌｋ４）である、請求項１９に記載の方法。
21. 化合物が小有機分子である請求項２に記載の方法。
22. 小有機分子が、式（１）
    ［式中、
    Ｒ^３は非妨害置換基であり；
    各ＺはＣＲ^２またはＮであり、環Ａ中の２より多くのＺ位がＮではなく、そして環Ａ中の２つの隣接するＺ位はＮであることはできず；
    各Ｒ^２は独立して非妨害置換基であり；
    Ｌはリンカーであり；
    ｎは０または１であり；そして
    Ａｒ’は、１〜３個の非妨害置換基で場合により置換された環式脂肪族、環式複素脂肪族、芳香族または複素芳香族部分の残基である］
    の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩である、請求項２１に記載の方法。
23. 化合物がキナゾリン誘導体である請求項２２に記載の方法。
24. Ｚ^３がＮであり；そしてＺ^５−Ｚ^８がＣＲ^２である請求項２３に記載の方法。
25. Ｚ^３がＮであり；そしてＺ^５−Ｚ^８の少なくとも１つが窒素である請求項２３に記載の方法。
26. Ｒ^３が場合により置換されたフェニル部分である、請求項２３に記載の方法。
27. Ｒ^３が２−、４−、５−、２，４−および２，５−置換フェニル部分からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. フェニル部分の少なくとも１つの置換基がアルキル（１−６Ｃ）またはハロである、請求項２７に記載の方法。
29. 小有機分子が、式（２）
    ［式中、
    Ｙ_１が、ハロ、アルコキシ（１−６Ｃ）、アルキルチオ（１−６Ｃ）、アルキル（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｐｈ、シアノ、フェニルおよびＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）であり、そしてｍは０−３である）から選択される１以上の置換基で場合により置換されたフェニルまたはナフチルであるか；あるいは５−もしくは７−員の芳香族または非芳香族環（ここで該環はＮ、Ｏおよびから独立して選択される最高３個のヘテロ原子を含む）に縮合したフェニルであり、
    Ｙ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５が独立して、水素、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）を表すか；あるいは隣接するＹ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５の対が、場合により最高２個の窒素原子を含む縮合した６−員の芳香族環を形成し、該環は、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（ａ−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）から独立して選択される１以上の置換基により場合により置換され、そして残りのＹ_２、Ｙ_３、Ｙ_４およびＹ_５が、水素、アルキル（１−６Ｃ）、アルコキシ（１−６Ｃ）、ハロアルキル（１−６Ｃ）、ハロ、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）またはＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ（ここでｎは０−３である）を表し；そして
    Ｘ_１およびＸ_２の１つがＮであり、そしてもう１つがＮＲ_６（ここでＲ_６は水素またはアルキル（１−６Ｃ）である）である］
    の化合物である、請求項２１に記載の方法。
30. 上記小有機分子が、式（３）
    ［式中、
    Ｙ_１が、ハロ、アルコキシ（１−６Ｃ）、アルキルチオ（１−６Ｃ）、アルキル（１−６Ｃ）、−Ｏ−（ＣＨ_２）−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐｈ、シアノ、フェニルおよびＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）であり、そしてｎは０、１、２または３である）からなる群から選択される１以上の置換基で場合により置換されたナフチル、アントラセニルまたはフェニルであるか；あるいはＹ_１が５−７員の芳香族または非芳香族の環式環（ここで該環式環はＮ、ＯおよびＳから独立して選択される最高２個のヘテロ原子を場合により含む）に縮合したフェニルを表し；
    Ｙ_２が、Ｈ、ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−ＰｈまたはＮＨ−アルキル（１−６Ｃ）（ここでｎは０、１、２または３である）であり；
    Ｙ_３が、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮＨ_２、ＣＮ、ＮＯ_２、アルキルチオ（１−６Ｃ）、−ＳＯ_２−アルキル（Ｃ１−６）、アルコキシ（Ｃ１−６）、ＳＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨＯ、ＣＨ_２ＮＨ_２またはＣＯ_２Ｒ（ここでＲは水素またはアルキル（１−６Ｃ）である）であり；
    Ｘ_１およびＸ_２の１つがＮまたはＣＲ’であり、そしてもう１つがＮＲ’またはＣＨＲ’（ここでＲ’は水素、ＯＨ、アルキル（Ｃ−１６）またはシクロアルキル（Ｃ３−７）である）であるか；あるいはＸ_１およびＸ_２の１つがＮまたはＣＲ’である時、もう１つはＳまたはＯであることができる］
    の化合物である、請求項２１に記載の方法。
31. 上記小有機分子が、式（４）
    ［式中、
    Ａｒが５−１２の環の員を含む場合により置換された芳香族または場合により置換された複素芳香族部分を表し、ここで場合により置換されたＡｒが
    ｛式中、Ｒ^５がＨ、アルキル（１−６Ｃ）、アルケニル（２−６Ｃ）、アルキニル（２−６Ｃ）、５−１１の環の員を含む芳香族または複素芳香族部分である｝
    でないならば、該複素芳香族部分は１以上のＯ、Ｓおよび／またはＮを含み；
    ＸがＮＲ^１、ＯまたはＳであり；
    Ｒ^１が、Ｈ、アルキル（１−８Ｃ）、アルケニル（２−８Ｃ）またはアルキニル（２−８Ｃ）であり；
    Ｚが、ＮまたはＣＲ^４を表し；
    各Ｒ^３およびＲ^４が独立して、Ｈまたは非妨害置換基であり；
    各Ｒ^２が独立して、非妨害置換基であり；そして
    ｎが０、１、２、３、４または５である］
    の化合物およびそれらの製薬学的に許容され得る塩およびプロドラッグ形である請求項２１に記載の方法。１つの態様では、ｎ＞２、そしてＲ^２’が隣接する場合、それらは一緒に連結して、各ヘテロ原子が独立してＯ、ＮまたはＳであることができる１〜３個のヘテロ原子を含有する５〜７員の非芳香族、複素芳香族または芳香族環を形成することができる。
32. 上記小有機分子が、式（５）
    ［式中、
    各Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７およびＺ^８がＮまたはＣＨであり、そしてＺ^５、Ｚ^６、Ｚ^７およびＺ^８の１または２個がＮであり、そして２つの隣接するＺ位はＮであることはできず；
    ｍおよびｎがそれぞれ独立して０−３であり；
    ２つの隣接するＲ^１基は連結して、５〜６員の脂肪族複素環式環を形成することができ；
    Ｒ^２が非妨害置換基であり；そして
    Ｒ^３がＨまたはＣＨ_３である］
    の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩である請求項２１に記載の方法。
33. ＴＧＦ−β受容体を介してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することができる有効な量の化合物を必要な哺乳動物個体に投与することを含んでなる、β−アドレナリン受容体の感受性における低下を打ち消すための方法。
34. β−アドレナリン受容体の感受性における低下がアゴニストにより誘導される請求項３３に記載の方法。
35. β−アドレナリン受容体の感受性における低下が、アゴニストにより誘導されるβ−アドレナリン受容体の脱共役、封鎖、分解および脱感作からなる群から選択される１以上の原因から生じる、請求項３４に記載の方法。
36. β−アドレナリン受容体の感受性における損失がアゴニスト非依存的メカニズムによる請求項３３に記載の方法。
37. 哺乳動物個体がヒトである請求項３６に記載の方法。
38. ヒト個体に気管支拡張の必要がある、請求項３７に記載の方法。
39. ヒト個体が肺機能の改善から利益を得る疾患または状態を有するとすでに診断されている、請求項３８に記載の方法。
40. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が、気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺水腫、嚢胞性線維症、閉塞性肺疾患、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、放射線が誘発する肺の損傷、および感染源、吸入した毒素、または循環している外因性毒素、老化および肺機能の減損に対する遺伝的素因のような他の因子から生じる肺の損傷からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
41. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が急性肺損傷を含む請求項３９に記載の方法。
42. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が肺線維症を伴わない、請求項３９に記載の方法。
43. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が、肺線維症が主な症状ではない時の段階である、請求項３９に記載の方法。
44. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が肺の炎症を伴う請求項３９に記載の方法。
45. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が、有害な粒子またはガスに対する肺の異常な炎症応答を伴う請求項３９に記載の方法。
46. 肺機能の改善から利益を得る疾患または状態が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である請求項３９に記載の方法。
47. ヒト個体がβ−アドレナリンアゴニストで処置される、請求項３９に記載の方法。
48. β−アドレナリン受容体がβ２−アドレナリン受容体である、請求項４７に記載の方法。
49. β２−アドレナリンアゴニストが気管支拡張薬である請求項４８に記載の方法。
50. β２−アドレナリンアゴニストが、プロカテロール、アルブテロール、サルメテロールおよびホルモテロールからなる群から選択されている、請求項４８に記載の方法。
51. 哺乳動物個体がすでに心臓疾患と診断された、請求項３７に記載の方法。
52. 心臓疾患がうっ血性心不全である、請求項５２に記載の方法。
53. ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる化合物の投与がイオノトロピーの上昇を生じる、請求項５２に記載の方法。
54. ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦβのシグナリングを阻害することができる化合物の投与が循環するカテコールアミンの減少を生じる、請求項５２に記載の方法。
55. ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる化合物の投与が不整脈および末梢血管収縮の減少を生じる、請求項５２に記載の方法。
56. ヒト個体が脳由来ナトリウム排出増加性ペプチド（ＢＮＰ）で処置される、請求項５２に記載の方法。
57. 上記受容体がＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼである、請求項３３に記載の方法。
58. 上記ＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼを介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる化合物が、β−アドレナリン受容体の感受性の低下を生じる化合物を用いた処置と同時に投与される、請求項５７に記載の方法。
59. 上記ＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼを介するＴＧＦ−βのシグナリングを阻害することができる化合物が、β−アドレナリン受容体の感受性の低下を生じる化合物を用いた処置により断続的に投与される、請求項５７に記載の方法。
60. 上記ＴＧＦβ−Ｒ１受容体キナーゼを介するＴＧＦβのシグナリングを阻害することができる化合物が、β−アドレナリン受容体の脱感作を生じる化合物を用いた処置後に投与される、請求項５７に記載の方法。
61. 上記β２−ＡＲを発現する細胞を、ＴＧＦ−β受容体を介するＴＧＦ−βのシグナリングを可能にする化合物で処理することを含んでなる、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）発現およびβ−アドレナリン受容体アンタゴニストに対する応答の選択的阻害法。
62. ＴＧＦ−β受容体がＴＧＦβ−Ｒ１キナーゼである、請求項６１に記載の方法。
63. 細胞が心臓細胞である、請求項６２に記載の方法。
64. 心臓細胞が疾患している、請求項６３に記載の方法。
65. 心臓細胞がうっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する個体の細胞である、請求項６４に記載の方法。