JP2006508697A - 勾配に暴露された細胞に関する方法および組成物 - Google Patents

勾配に暴露された細胞に関する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、方向性の細胞移動を刺激または抑制する方法および組成物に関する。

Description

関連出願の説明
本出願は、２００３年１２月６日に出願された米国特許出願第60/431424号、２００３年１月９日に出願された米国特許出願第60/438848号、および２００３年２月５日に出願された米国特許出願第60/445049号に優先権を主張する。
この明細書に引用される出願および特許、並びにそれぞれの出願および特許に引用される文書および参考文献（それぞれの公表された特許の出願中を含む；「出願に引用された文書」）、およびこれらの出願および特許に対応するおよび／または優先権を主張するそれぞれの国際特許出願および外国出願または特許、およびそれぞれの出願に引用されるまたは参照されるそれぞれの文書は、ここに言及することにより明白に引用される。より一般的には、文書または参考文献は、番号のついた段落の前の参考文献のリスト中であっても明細書自体の中であっても、明細書に引用される文書または参考文献；およびこれらの文書または参考文献（「ここに引用される参考文献」）、並びにここに引用される参考文献のそれぞれに引用されるそれぞれの文書または参考文献（製造者の仕様書、指示書等を含む）は、ここに言及することにより明白に引用される。
連邦政府による委託研究下でなされた発明に対する権利の声明
この研究は、国立保険研究所助成金R21 A145898-01により支援された。政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
技術分野
本発明は走化性およびfugetaxisの勾配中の細胞の遺伝子発現の調節に関する方法および組成物に関するものである。
原核生物および真核生物において特定の刺激に応じて細胞移動が起こる（Doetsch RN and Seymour WF.,1970; Bailey GB et al.,1985）。これらの生物による細胞移動は、3つの型に分類される；物質の濃度の増加方向の勾配に沿った細胞移動である走化性（例えば化学的な）、物質の濃度の減少方向に沿った細胞移動である負の走化性、および細胞の無作為の移動である化学運動性。
特定の走化性が正の化合物の作用により影響されたレセプターおよび情報伝達経路は、原核細胞において広く明らかにされている。大腸菌の走化性の研究により、ある濃度および条件で細菌を誘引する化学物質は別の細菌にとって忌避薬（すなわち、「負の走化性化学物質」または「化学忌避薬」）ともなりうるということがわかった（Tsang N et al.,1973; Repaske D and Adler J.,1981; Tisa LS and Adler J.,1995; Taylor BL and Johnson MS.,1998）。
走化性および化学運動性は、ケモカインと呼ばれる種類のタンパク質に反応して哺乳類細胞で生じることが観察されている（McCutcheon MW, Wartman W and HM Dixon,1934; Lotz M and H Harris,1956; Boyden SV,1962）（Ward SG and Westwick J,1998; Kim CH et al.,1998; Baggiolini M,1998; Farber JM,1997）。ケモカインは、Gタンパク質結合レセプターによる情報伝達により細胞移動を誘発する（Wells TN et al.,1998）。
Gタンパク質結合レセプターには、ホルモン、ウィルス、成長因子および神経レセプターのような生物学的に活性のある広範囲のレセプターが含まれる。Gタンパク質結合レセプターのファミリーには、精神異常および神経疾患の治療に使用される神経安定薬に結合するドーパミンレセプターが含まれる。このファミリーのメンバーの他の例には、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子1レセプター、ロドプシン、臭気剤、サイトメガロウィルスレセプター等が含まれる。
Gタンパク質結合レセプターは、膜貫通領域1-7（「TM1」、「TM2」、「TM3」、「TM4」、「TM5」、「TM6」、および「TM7」）として指定される７つの推定膜貫通領域を有するとして特徴付けられている。この領域は、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αへリックスを表すと考えられている。最初の２つの細胞外ループのそれぞれにおいて、ほとんどのGタンパク質結合レセプターは、機能的なタンパク質構造を安定させると考えられるジスルフィド結合を形成する一本の保護されたシステイン残基を有する。リン酸化反応（並びに脂質化反応、例えばパルミトイル化またはファルネシル化）は、情報伝達および第三の細胞質ループおよび／またはカルボキシル末端内に存在する潜在的なリン酸化部位に影響を与えうる。βアドレナリンレセプターのようないくつかのGタンパク質結合レセプターについては、プロテインキナーゼAおよび／または特定のレセプターキナーゼがレセプターの脱感作を媒介する。
Gタンパク質結合レセプターの細胞質残基のリン酸化は、Gタンパク質結合の調節に重要なメカニズムであると認識されている。Gタンパク質結合レセプターは、ヘテロ三量体Gタンパク質により細胞内で、様々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合される（非特許文献１参照）。異なるGタンパク質αサブユニットは、好ましくは特定のエフェクターを刺激し、細胞内で様々の生物学的機能を調節する。この情報伝達経路は、例えば百日咳毒素（PTX）によりブロックされ得る（Luster AD,1998; Baggiolini,1998）。
既述のように、ケモカインに誘導された細胞の走化性は、Gαi結合情報伝達経路により媒介される。ケモカインであるSDF-1αは、この情報伝達モデルにおいて１つの実施例を提供する。SDF-1αは、白血球の小集団を炎症部位に移動させる（Aiuti A et al.,1997; Bleul CC et al.,1996; Bleul CC et al.,1996; Oberlin E et al.,1996）。さらに、SDF-1αまたはそのレセプターであるCXCR-4を欠くように産生されたマウスは、胎児肝臓幹細胞が骨髄へ移動しないことにより造血組織およびB細胞が異常に発達した（Friendland JS,1995; Tan J and Thestrup-Pedersen K,1995; Corrigan CJ and Kay AB,1996; Qing M, et al.,1998; Ward SG et al.,1998）。この動きは濃度依存性であり、CXCR4レセプター、Gαiタンパク質およびPI-3キナーゼにより媒介される（非特許文献２）。T細胞における走化性の反応からfugetaxisの反応への転換は、サイクリックヌクレオチドのレベルおよびチロシンキナーゼ抑制因子への異なる感受性に関連する。
Johnson et al., Endoc Rev,1989,10:317-331 Nature Medicine 2000;6,543
勾配による細胞移動の調節に関連する遺伝子（例えば、適切なGαi結合情報伝達経路に関連する遺伝子）を同定する方法は行われていない。そのような方法は、異常な細胞移動により特徴付けられる疾患における新しい治療上の標的の同定に有用である。
本発明は一部、勾配への細胞の暴露によりそのような細胞の遺伝子発現特性に変化が生じるという発見を前提としている。さらに、勾配中の細胞の移動により遺伝子発現に変化が誘発されるということが意外にも発見された。ある場合において、勾配は細胞の直径を横切って存在し、細胞の最前縁は、細胞の後縁と異なる物質濃度にさらされる。
したがって、ある態様において、本発明は、濃度に依存した様式で発現する核酸を同定する方法であって、物質濃度勾配中の第一の位置における第一の細胞の第一の核酸発現特性を特定し、物質濃度勾配中の第二の位置における第二の細胞の第二の核酸発現特性を特定し、第一および第二の核酸発現特性の相違を特定する各工程を含む。物質濃度勾配中の第一の位置は物質の第一の濃度に対応し、物質濃度勾配中の第二の位置は物質の第二の濃度に対応する。好ましくは、第二の細胞は、物質濃度勾配中を移動する前は第一の細胞と遺伝学的に同一であった。
ある実施の形態において、少なくとも第二の細胞は、物質濃度勾配中を移動する。したがって、本発明は、濃度に依存した様式で発現する核酸を同定する方法であって、物質濃度勾配中の第一の位置における第一の細胞の第一の核酸発現特性を特定し、物質濃度勾配中を移動した第二の細胞の第二の核酸発現特性を特定し、第一および第二の核酸発現特性の相違を特定する各工程を含む。
他の実施の形態において、いずれの細胞も物質濃度勾配中を移動しないが、少なくとも第二の細胞は勾配中に存在し、細胞の一端における物質濃度が細胞の他端における物質濃度と相違する。
ある実施の形態において、核酸発現特性は、mRNA発現特性である。別の実施の形態において、mRNA発現特性は、PCR、RDA、ノザン分析、減算ハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイ分析を使用して特定される。
ある実施の形態において、物質濃度勾配はリガンド濃度勾配である。別の実施の形態において、物質濃度勾配はケモカイン濃度勾配である。
さらに別の実施の形態において、ケモカイン濃度勾配は、SDF-1α、SDF-1β、IP-10、MIG、GROα、GROβ、GROγ、IL-8、PF4、MCP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ（マウス）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、RANTES、フラクタルカイン、リンホタクチン、CXC、IL-8、GCP-2、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、HCC-1、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）およびITAC濃度勾配からなる群より選択される
物質濃度勾配はサイトカイン濃度勾配でもよい。サイトカイン濃度勾配は、PAF、N-ホルミルペプチド、C5a、LTB4およびLXA4、CXC、IL-8、GCP-2、GRO、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、HCC-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、MIP-1γ（マウス）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）、SDF-1α、SDF-1β、メチオニン-SDF-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、TGF-β、FLT-3リガンド、VEGF、DMDA、エンドセリンおよびCD40リガンド濃度勾配からなる群より選択されてもよい。
ある実施の形態において、物質の第一の濃度がゼロ濃度であり、物質の第二の濃度がゼロ濃度でない。別の実施の形態において、物質の第一の濃度が第二の濃度より高い。
ある実施の形態において、第一の細胞が物質濃度勾配中を移動する。物質濃度勾配中の移動は、fugetaxisの移動または走化性の移動でもよい。
ある実施の形態において、勾配は段階勾配である。別の実施の形態において、勾配は連続勾配である。さらに別の実施の形態において、本発明の方法はさらに、少なくとも一つの追加勾配が第一の勾配と共存する組合せ勾配を含む。
ある実施の形態において、第一および第二の細胞は成熟した細胞である。好ましい実施の形態において、第一および第二の細胞はヒト細胞である。ある実施の形態において、第一および第二の細胞は一次細胞である。別の好ましい実施の形態において、第一および第二の細胞は造血細胞であり、例えばTリンパ球が挙げられるがこれに限定されない。
別の実施の形態において、本発明は、一つ以上の物質濃度勾配中の細胞移動を調節する化合物を同定する方法であって、ある濃度勾配中の遊走細胞をテスト化合物と接触させ、細胞中の核酸発現特性を特定し、遺伝子発現産物中の発現の変化を同定する各工程を含む方法を提供する。細胞移動は、走化性またはfugetaxisでよく、したがって遺伝子発現産物は、走化性またはfugetaxis特有の遺伝子産物になり得る。
別の態様において、本発明は、細胞fugetaxisを抑制する方法であって、fugetaxisを受けているまたは受ける可能性のある細胞を、fugetaxis特有の遺伝子発現産物を抑制する有効な量の物質と接触させる工程を含む方法を提供する。
ある実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、核酸またはペプチドである。別の実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物はシグナリング分子である。シグナリング分子は、細胞分裂周期42、アネキシンA3、Rap1グアニンヌクレオチド交換因子、アデニル酸シクラーゼ1、JAK結合タンパク質、およびRho GDP解離抑制剤アルファからなる群より選択されてもよいが、これらに限定されない。別の実施の形態において、シグナリング分子は、細胞分裂周期42（cdc42）、リボソームタンパク質S6キナーゼ、BAI1結合タンパク質2、FAKと結合したGTPアーゼ調節因子、タンパクキナーゼC-ベータ1、ホスホイノシチド特有のホスホリパーゼC-ベータ1、一酸化窒素シンターゼ1、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸5-キナーゼ、およびMAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ4からなる群より選択される。
別の実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、細胞外マトリクス関連分子である。関連する実施の形態において、細胞外マトリクス関連分子は、キチナーゼ3-様1（軟骨組織糖タンパク質-39）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子6、マトリクスメタロプロテイナーゼ8（好中球コラゲナーゼ）、インテグリン細胞領域結合タンパク質1、フィコリン（コラーゲンフィブリノーゲン領域含有）1、およびリソソーム結合膜タンパク質1、上皮V-様抗原1、血管内皮成長因子（VEGF）、フィブリン1、癌胎児性抗原結合細胞接着分子3、からなる群より選択されてもよいがこれらに限定されない。
さらに別の実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、細胞骨格関連分子である。細胞骨格関連分子は、アンキリン1（赤血球型）、S100カルシウム結合タンパク質A12（カルグラヌリンC）、プレクチン1（中間フィラメント結合タンパク質、500kD）、およびアンキリン2（神経型）、微小管結合タンパク質RPEB3、微小管結合タンパク質1A様タンパク質（MILP）、キャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、ゲルゾリン様）からなる群より選択されてもよいがこれらに限定されない。
さらに別の実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、細胞周期分子である。細胞周期分子は、v-キットハーディ-ズッカーマン（v-kit Hardy-Zuckerman）4ネコ肉腫ウィルス性癌遺伝子相同体2、リポカリン2（癌遺伝子24p3）、レクチン、（ガラクトシド結合ガレクチン3）RAB31（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー）、disabled（Drosophila）相同体2（マイトジェン応答リンタンパク質）、RAB9（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー、偽遺伝子1）、および成長分化因子8からなる群より選択されてもよいがこれらに限定されない。
さらなる実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、免疫応答関連分子である。免疫応答関連分子は、主要組織適合遺伝子複合体（クラスII、DRアルファ）、S100カルシウム結合タンパク質A8（カルグラヌリンA）、小誘導性サイトカインサブファミリーA（システイン-システイン）、真核生物翻訳開始因子5A、小誘導性サイトカインサブファミリーB（システイン-X-システイン）（メンバー6、顆粒球走化性タンパク質2）、IgG結合タンパク質のFcフラグメント、CD24抗原（小細胞肺癌クラスター4抗原）、シトクロムP450（サブファミリーIVF、ポリペプチド3、ロイコトリエンB4オメガヒドロキシラーゼ）、MHCクラスII転写促進因子、T細胞レセプター（アルファ鎖）、T細胞活性剤（後期発現の増加）、MKP-1様タンパク質チロシンホスファターゼ、T細胞レセプターガンマ定常部2、T細胞レセプターガンマ遺伝子座からなる群より選択されてもよい。
さらなる実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、ケモカイン（C-X3-C）レセプター1である。
別の態様において、本発明は、細胞の走化性を抑制する方法であって、走化性を受けているまたは受ける可能性のある細胞を、走化性特有の遺伝子発現産物を抑制する走化性の抑制に有効な量の物質と接触させる工程を含む。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、核酸またはペプチドである。別の実施の形態において、細胞は免疫細胞である。
ある実施の形態において、異常な免疫応答を有するまたは有する危険のある被験者の体内で接触が起こる。ある実施の形態において、異常な免疫応答は炎症性応答である。別の実施の形態において、異常な免疫応答は自己免疫応答である。自己免疫応答は、リウマチ様関節炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（SLE）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（MG）、ハシモト甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば尋常性天疱瘡）、グレイブ病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水泡性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病からなる群より選択されてもよいがこれらに限定されない。さらに別の実施の形態において、異常な免疫応答は移植片対宿主反応である。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、シグナリング分子である。関連する実施の形態において、シグナリング分子は、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ6、ワクシニア関連キナーゼ1、PTK2タンパク質チロシンキナーゼ2、SH3およびITAM領域2を含有するSTAM様タンパク質、シグナル誘導増殖関連遺伝子1、CD47抗原（Rh関連抗原、インテグリン関連シグナル変換因子）、およびタンパク質チロシンホスファターゼ（非レセプター型12）からなる群より選択される。別の関連する実施の形態において、シグナリング分子は、PTK2（局所接着キナーゼ）、MAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ2、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、PTホスファターゼ（レセプター）、cdc42-結合タンパク質キナーゼベータ、RalGEF（RalGPS1A）、MAPキナーゼ7、オートタキシン、イノシトール1,4,5-トリホスフェートレセプター、ホスホイノシチド-3-キナーゼガンマ、PTホスファターゼ（非レセプター）、RAS p21タンパク質アクチベーター（GAP）、RASグアニル放出タンパク質、およびArp23複合体20kDaサブユニットからなる群より選択される。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、細胞外マトリクス関連分子である。関連する実施の形態において、細胞外マトリクス関連分子は、スポンジン1（f-スポンジン、細胞外マトリクスタンパク質）、コラーゲン型XVIII（アルファ1）、CD31接着分子、テトラスパン3、糖タンパク質A33、および血管関連遊走細胞タンパク質からなる群より選択される。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、細胞骨格関連分子である。関連する実施の形態において、細胞骨格関連分子は、アクチン関連タンパク質23複合体（サブユニット4,20kD）、トロポミオシン2（ベータ）、クロマチンのSWISNF関連マトリクス関連アクチン依存調節因子（サブファミリーa、メンバー5）、スペクトリンベータ（非赤血球型1）、ミオシン軽鎖ポリペプチド5（調節型）、ケラチン1、プラコフィリン4、およびキャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、筋Z線、アルファ2）からなる群より選択される。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、細胞周期分子である。関連する実施の形態において、細胞周期分子は、FGFレセプター活性化タンパク質1、v-maf筋腱膜性繊維肉腫（ニワトリ）癌遺伝子相同体、サイクリン依存性キナーゼ（CDC2様）10、TGFB誘発性初期成長応答2、レチノイン酸レセプターアルファ、後期促進複合体サブユニット10、RAS p21タンパク質アクチベーター（GTPアーゼ活性化タンパク質、3-Ins-1,3,4,5-P4結合タンパク質）、細胞分裂周期27、プログラム細胞死2、c-myc結合タンパク質、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ1、TGFベータレセプターIII（ベータグリカン、300kDa）、およびG1期からS期までの遷移1からなる群より選択される。
ある実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、免疫応答関連分子である。関連する実施の形態において、免疫応答関連分子は、主要組織適合遺伝子複合体クラスIIDQベータ1、骨髄間質性細胞抗原2、バーキットリンパ腫レセプター1（GTP結合タンパク質、CXCR5）、CD7抗原（p41）、Stat2タイプa、T細胞免疫調節因子1、およびインターロイキン21レセプターからなる群より選択される。
別の態様において、本発明は、細胞fugetaxisを促進する方法であって、細胞を、fugetaxisを促進する有効な量の非ケモカイン物質と接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施の形態において、fugetaxisがないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で接触が起こる。ある実施の形態において、細胞はTリンパ球のような造血細胞である。別の実施の形態において、細胞は神経細胞である。
別の態様において、本発明は、細胞の走化性を促進する方法であって、細胞を、走化性を促進する有効な量の非ケモカイン物質と接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施の形態において、走化性がないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で接触が起こる。別の実施の形態において、細胞はTリンパ球のような造血細胞である。別の実施の形態において、細胞は神経細胞である。
本発明はまた、一部、様々の他の発見を前提とする。これらには、好中球はIL-8に反応して双方向に移動するという発見が含まれる。つまり、好中球は走化性を受けることにより低濃度のIL-8（例えば10ng/mlから500ng/ml）に反応する。好中球は、fugetaxisを受けることにより高濃度のIL-8（例えば1マイクログラム/mlから10マイクログラム/ml）に反応する。したがって、本発明は、IL-8の濃度を調節することにより好中球の移動を調節する方法を提供する。
ある実施の形態において、本発明は好中球の走化性を促進する方法であって、細胞を、好中球による走化性の促進に有効な量のIL-8と接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施の形態において、好中球の走化性がないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で接触が起こる。好中球がないことにより特徴付けられる疾患には、細菌感染および肉芽腫性疾患（例えば結核）が含まれるがこれらに限定されない。
ある実施の形態において、本発明は、好中球のfugetaxisを促進する方法であって、細胞を、好中球によるfugetaxisの促進に有効な量のIL-8と接触させる工程を含む方法を提供する。
好中球のfugetaxisがないことにより特徴付けられる疾患には、炎症性または免疫性の間接疾患、移植された器官または組織の拒絶、自己免疫疾患および喘息が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はさらに、IL-8に誘発されるfugetaxisまたは走化性に対応して調節される（すなわち、上方制御または下方制御される）遺伝子産物を同定する方法を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明はまた、IL-8により誘発されるfugetaxis特有の遺伝子産物またはIL-8により誘発される走化性特有の遺伝子産物の効果を抑制または増強することにより、好中球におけるIL-8の効果を調節する方法を提供する。
別の実施の形態において、本発明は、好中球の走化性を抑制する方法であって、走化性を受けているまたは受ける可能性のある好中球を、走化性特有の遺伝子発現産物の発現の抑制または増強に有効な量のIL-8と接触させる工程を含む方法を提供する。
さらなる実施の形態において、走化性特有の遺伝子発現産物は、免疫応答関連分子である。免疫応答関連分子は、IL-8、GCP-2、Groα、Groβ、Groγ、CINC-1、CINC-2、ENA-78、NAP-2、LIX、SDF-1、IL-1αおよびIL-1β、C3a、C5aおよびロイコトリエンからなる群より選択されてもよい。
本発明はさらに、一部、IL-8により誘発される好中球の走化性がPIK3抑制剤ワートマニン（wortmannin）により選択的に抑制され、細胞があらゆる濃度のIL-8へのfugetaxisを受けるという発見を前提とする。したがって、ある実施の形態において、本発明は、有効な量のワートマニンを、これを必要とする被験者に投与することにより、IL-8により誘発される好中球の走化性を抑制する（逆にIL-8により誘発される好中球のfugetaxisを増強する）方法を提供する。ワートマニンの有効な量とは、IL-8により誘発される好中球の走化性を選択的に抑制し、必要に応じてIL-8の存在下で好中球のfugetaxisを増強するのに有効な量である。
別の実施の形態において、本発明は、好中球のfugetaxisを抑制する方法であって、fugetaxisを受けているまたは受ける可能性のある好中球を、fugetaxis特有の遺伝子発現産物の発現を抑制または増強するのに有効な量のIL-8と接触させる工程を含む方法を提供する。
さらなる実施の形態において、fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、免疫応答関連分子である。免疫応答関連分子は、IL-8、GCP-2、Groα、Groβ、Groγ、CINC-1、CINC-2、ENA-78、NAP-2、LIX、SDF-1、IL-1αおよびIL-1β、C3a、C5aおよびロイコトリエンからなる群より選択されてもよい。
本発明はさらに、一部、IL-8により誘発される好中球のfugetaxisが代替的なPI3K抑制剤LY294002により選択的に抑制され、細胞にあらゆる濃度のIL-8への走化性が生じるという発見を前提とする。したがって、ある実施の形態において、本発明は、有効な量のPI3K抑制剤LY294002を、これを必要とする被験者に投与することにより、IL-8により誘発される好中球のfugetaxisを抑制する（および逆にIL-8により誘発される好中球の走化性を増強する）方法を提供する。LY294002の有効な量とは、IL-8により誘発される好中球のfugetaxisを選択的に抑制し、必要に応じてIL-8の存在下で好中球の走化性を増強するのに有効な量である。本発明の方法はまた、この属の他の種類で行われてもよい。
本発明のこれらのおよび他の目的は、発明の詳細な説明と関連してさらに詳細に記載される。
以下の詳細な説明は、実施例として記載されるが、本発明を記載される特定の実施の形態に限定することを意図するものではなく、ここに言及することにより加えられる添付の図面と関連させて理解されるであろう。本発明の様々の好ましい特徴および実施の形態は、限定されない実施例としておよび添付の図面を参照することによりここに記載される。
発明の詳細な説明
本発明は一部、細胞が勾配にさらされて、勾配の存在および勾配中の移動と関連して遺伝子発現変化を受けるという発見を前提とする。ある物質勾配への細胞の暴露により、均一の物質濃度（すなわち非勾配）に暴露された細胞と比較して異なる遺伝子発現が生じるということが、意外にも発見された。その結果、勾配への暴露中または暴露後の遺伝子発現特性は、均一の物質濃度への暴露中または暴露後のものと著しく異なる。さらに、遺伝子発現特性は、勾配の構造に依存する。すなわち、細胞が物質供給源（吸引性勾配または化学吸引性勾配）に引き付けられるように勾配を構成した場合には、細胞が物質供給源（fugetaxisの勾配または物質）から拒絶されるように勾配を構成した場合とは遺伝子発現特性が異なるであろう。Fugetaxisの勾配にさらされた細胞についての遺伝子発現特性は、走化性勾配中で見られるものと明らかに異なる。例として、細胞をSDF-1（CXCL12）勾配にさらした場合、物質供給源に近づくように移動しようとそれから遠ざかるように移動しようと、ケモカイン情報伝達に関係する遺伝子を差別的に発現させ始める。
定義
ここに記載される用語に従って使用される場合、以下の定義が提供される。
「物質」とは、単独でまたは他の物質と組み合わせて、遊走細胞中の遺伝子発現を変化させることのできる拡散性の物質である。好ましくは、物質は遊走細胞の誘引薬または忌避薬である。
「物質濃度勾配」とは、徐々に増加する物質の濃度であり、最高物質濃度が物質供給源にある。
「連続勾配」とは、生理的に関連する、固定された間隔における連続的な物質濃度の値域である。
「段階勾配」とは、突然別の物質濃度に上がるまたは下がる物質濃度を意味する。
「物質供給源」とは、物質の濃度が最高になる地点である。細胞が供給源に向かって移動する場合、より高い物質濃度に向かって移動しており、細胞が供給源から遠ざかって移動する場合、より低い物質濃度に向かって移動している。
「リガンド」とは、タンパク質、脂質または陽イオンのような分子であり、レセプターのように親和性を持つ他の分子に結合できる。したがってリガンドは、結合の相互作用または関連性の一部である。
「走化性移動」または「走化性」とは、物質供給源に向かう（すなわちより高い物質濃度に向かう）遊走細胞の移動である。
「fugetaxisの移動」または「fugetaxis」とは、物質供給源から遠ざかる（すなわちより低い物質濃度に向かう）遊走細胞の移動である。
「化学運動性移動」または「化学運動性」とは、勾配に関係のない無作為の細胞の移動である。
「サイトカイン」とは、しばしば細胞の活性化状態を変化させる効果とともに細胞間の情報伝達を媒介するすべての細胞外タンパク質またはペプチドについての一般的用語である。
「ケモカイン」とは、保護されたシステインモチーフを有するサイトカインであり、誘引薬として作用できる。
「シグナリング分子」とは、細胞の一区画から別の区画へのシグナルカスケード（signal cascade）の変換に関連する分子である（例えば、細胞移動の場合には、シグナリング分子は、細胞膜からアクチン細胞骨格へのシグナルカスケードの変換）。
「細胞骨格関連分子」とは、細胞移動のための形および能力を与える真核細胞の細胞質中のタンパク質フィラメント（例えばアクチンフィラメント、インテグリン、微小管および中間径フィラメント）の系であり、細胞骨格の構成要素である。
「細胞周期分子」とは、細胞が内容物を複製し２つに分裂する周期である細胞の生殖周期の調節、開始または停止に関連する分子である。
「細胞外マトリクス関連分子」とは、細胞により分泌される多糖およびタンパク質のような構造上の要素の網状組織である細胞外マトリクスの構成要素である分子である。
「免疫応答関連分子」とは、抗原に対する免疫細胞による反応である免疫応答の発生、伝播または終了に関係する分子である。
「免疫細胞」とは、抗原の特異的認識に関係する造血起源の細胞である。免疫細胞には、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。
「一次細胞」とは、生きている正常なまたは病気の組織から直接得られる細胞である。
「炎症細胞」とは、免疫応答に寄与する細胞であり、好中球、好塩基球、好酸球およびマスト細胞を含むがこれらに限定されない。
さらなる定義および説明は、以下の明細書中に記載される。
本発明の他の態様は、以下の明細書中に開示されるかまたはそれから明らかであり、本発明の範囲内である。
本発明の方法
本発明の方法は、走化性を受ける細胞とfugetaxisを受ける細胞との間の相違、または走化性またはfugetaxisを受ける細胞と化学運動性（すなわち無作為の移動）を受ける細胞との間の相違の特定に使用できる。ある実施例において、化学運動性を受ける細胞の遺伝子発現特性は「バックグラウンド（background）」であると考えられ、したがって走化性およびfugetaxisの遺伝子発現特性の両方から控除される。
これらの発現の相違により、走化性およびfugetaxisのさらなる媒介物が同定され、方向性の細胞移動を調節するように作用できる新しい標的が提供される。ある実施例において、これらの新しく同定された標的は、細胞に直接投与することができる。あるいは、新しく同定された標的は、走化性またはfugetaxisの勾配へ実際にさらすことなく上方制御または下方制御することができる。これらには、細胞への核酸の導入（例えばアンチセンス療法または遺伝子治療）、および新しく同定された標的を調節する化合物（例えば作用薬または拮抗薬）への細胞の暴露が含まれる。
本発明のさらに別の予期せぬ発見は、細胞が、物質濃度中の相違だけでなく長さ方向の物質濃度中の相違を感じることができるという観察である。濃度勾配および細胞に関する以前の研究は、異なる濃度中の細胞を比較した。本発明は一部、細胞が、濃度の変化に反応するが、細胞の長さ方向の物質濃度の相違に基づく勾配中の位置を感じることもできるという発見に基づく。すなわち、細胞は勾配中の位置を感じることができ、それにより細胞の反対の端が異なる物質濃度にさらされていることを感じることによって発現特性を調節することができる。
ある態様において、本発明は、物質濃度依存的態様で発現される核酸を同定する方法を提供する。本発明の方法は、物質濃度勾配中の第一の位置における第一の細胞の第一の核酸発現特性を特定し、物質濃度勾配中の第二の位置における第二の細胞の第二の拡散発現特性を特定し、前記第一および第二の核酸発現特性の間の相違を特定する各工程を含み、物質濃度勾配中の第一の位置が第一の物質濃度に対応し、物質濃度勾配中の第二の位置が第二の物質濃度に対応することを特徴とする。
ある実施の形態において、少なくとも第二の細胞は、物質濃度勾配中を移動している。したがって、本発明は、濃度依存的態様で発現される核酸を同定する方法であって、物質濃度勾配中の第一の位置における第一の細胞の第一の核酸発現特性を特定し、物質濃度勾配中を移動した第二の細胞の第二の核酸発現特性を特定し、前記第一および第二の核酸発現特性の間の相違を特定する各工程を含む方法を提供する。
別の実施の形態において、第二の細胞は勾配中に位置し、勾配は細胞の長さ（または直径）方向に存在する。言い換えれば、細胞の一端（例えば細胞の前縁）における物質濃度は、細胞の反対端（例えば細胞の後縁）における物質濃度と異なる。したがって、細胞を予め形成された物質濃度中に置くことにより、または細胞を濃度勾配中を移動させることにより、所望の用途および情報に基づいて本発明の方法を実施してもよい。
走化性、fugetaxisまたは化学運動性の反応は、ここに記載されるように、または「リンパ球化学吸引薬に基づく分析および治療方法」と題され１９９６年５月７日に発行されたスプリンガー（Springer,TA）等の米国特許第6448054 B1、および米国特許第5514555により詳細に記載される移動分析にしたがって特定することができる。他の適切な方法は、当業者が知ることができ、通常の実験だけを使用して用いることができる。
物質濃度勾配は、物質供給源を使用して作成することができる。物質供給源は、物質の最高濃度を有する勾配中の位置であり、通常は勾配の作成のために物質が供給される位置である。物質は継続的に供給されてもよく、またはスクリーニングの過程中物質を補充する必要がないように供給源を物質で過飽和させてもよい。好ましい実施の形態において、勾配を形成してもよいし、スクリーニング過程の間中一定のままでもよい。すなわち、勾配の異なる位置の間の濃度が相違するままで、物質供給源と勾配の末端との間の濃度の相違は一定でもよい。
ある実施の形態において、物質の第一の濃度はゼロ濃度であり、物質の第二の濃度はゼロ濃度でなく、他の実施の形態において、物質の第一の濃度は物質の第二の濃度よりも高い。細胞は勾配中を移動してもよく、これらの実施の形態において、一方または両方の細胞は、物質濃度勾配中を移動してもよい。移動はfugetaxisの移動または走化性の移動でもよい。勾配は、段階勾配または連続勾配でもよいが、ある実施の形態においては連続勾配が好ましい。さらに別の実施の形態において、第二の勾配は第一の勾配に重なり合う。ある重要な実施の形態において、第一の細胞は走化性を受け、第二の細胞はfugetaxisを受け、これらの細胞の発現特性を比較する。
核酸発現特性は、RNA（好ましくはmRNA）特性かまたはタンパク質特性でもよい。どの発現産物が分析されるかに依存して、発現産物の分析および定量の方法は異なる。核酸発現産物は、RNA（例えばmRNA）のようにそれ自体が核酸である場合、ノザン分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、減算ハイブリダイゼーション、ディフェレンシャルディスプレイ（differential display）、発現差解析法（representational difference analysis）およびcDNAマイクロアレイ分析を含むがこれに限定されない多くの方法を使用して定量することができる。ある実施の形態において、核酸は細胞から採集され、生体外で増幅する必要なく分析される。
差別的に発現した分子は、多くの方法で同定できる。発現産物が核酸（すなわちmRNA）である場合、減算ハイブリダイゼーション（抑制減算ハイブリダイゼーションを含む）、ディフェレンシャルディスプレイ、発現差解析法、またはマイクロアレイ分析（例えばアフィメトリクスチップ分析）を使用して同定できる。これらの技術は、文献に報告され、したがって当業者はこれらに精通しているであろう（例えば、Methods Enzymol 303:349-380,1999; Ying and Lin in Biotechniques 26:966-8,1999; Zhao et al., J Biotechnol73:35-41,1999;およびBlumberg and Belmonte in Methods Mol Biol 97:555-574,1999参照）。このスクリーニング工程で単離された配列を決定し、ブラスト（BLAST）演算手順を使用してGenBankの重複しないデータベースおよびESTデータベースと比較してもよい。
差別的に発現した転写物を同定する別の重要な技術には、DNAチップ技術およびcDNAマイクロアレイハイブリダイゼーションが含まれる。この技術により、数千ではなくとも数百のコード配列を同時に分析できる。標準のおよび特注のDNAチップは現在、アフィメトリクス社（Affymetrix）およびインサイト社（InCyte）のような製造業者から購入できる。これらの方法を発展させ、異なる配列の高速スクリーニングが容易に達成できる（Von Stein, et al., Nuclei Acids Res 25:2598-602,1997; Carulli, et al., J Cell Biochem Suppl 30-31:286-96,1998）。DNAチップ技術の１つの大きな利点は、RNA増幅が必要ないということである。
核酸発現産物がタンパク質である場合、例えばゲル電気泳動分離およびその後のクマシーブルー染色を使用して同定することができる。この後者の方法において、実験細胞と対照との間の相違は、染色されたタンパク質のバンドの存在または不存在により明らかになる。これらの「相違バンド」のさらなる分離、配列決定およびクローニングがその後必要となるが、これらはすべて当業者の能力の範囲内である。他の方法を同様に使用して、タンパク質である核酸発現産物を同定および／または定量してもよく、これらには免疫組織化学、ウェスタン分析、および蛍光発色血球計算が含まれるがこれらに限定されない。
勾配の作成に使用される物質は、限定的であることを意図しない。遺伝子発現特性に変化を誘発するいずれの物質も適切である。物質はリガンドでもよく、この場合はリガンド濃度勾配となる。したがって、リガンドはレセプターでもよい。ある好ましい実施の形態において、物質は走化性またはfugetaxisを誘発する分子である。
物質は、サイトカインでもよい（ケモカインを含む）。サイトカインのさらなる説明については、ヒトサイトカイン：基礎および臨床研究のためのハンドブック参照（Aggrawal, et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass.1991）（これはすべての目的のためにここに完全に引用される）。サイトカインの例には、PAF、N-ホルミルペプチド、C5a、LTB4およびLXA4、CXC、IL-8、GCP-2、GRO、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、HCC-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、MIP-1γ（マウス）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）が含まれる。サイトカインは、ケモカイン（例えばCXCR-4レセプターに結合するケモカイン）のCys-X-Cysファミリーのメンバーでもよい。本発明の好ましいサイトカインには、SDF-1α、SDF-1β、メチオニン-SDF-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、TGF-β、FLT-3リガンド、VEGF、DMDA、エンドセリンおよびCD40リガンドが含まれる。このリストは完全なものを意図するものではなく、当業者は本発明の方法に使用できる他のサイトカインを発見できるであろう。ある実施の形態において、サイトカインは、化学誘引性および／または化学運動性特性を有するサイトカインである。
物質は、ケモカインでもよい。ケモカイン、または化学誘引性のサイトカインは、保護されたシステインモチーフ（motifs）を有する小さいタンパク質のファミリーである。これらの小さいタンパク質は、急性および慢性炎症性プロセス、脈管形成、白血球遊走、細胞増殖および成熟の調節、造血、ウィルス複製、および他の免疫調節作用のような広範囲の疾病状態に関連してきた。ケモカインは、多くの異なる細胞により発現され、識別できるが重複する細胞標的を有する。
ケモカインは、ポリペプチドのアミノ末端の近くに位置する２つの高度に保護されたシステインアミノ酸の間隔の性質に依存して、４つのサブグループに分類されている。第一のケモカインサブグループは、「CXC」と称される；第二のサブグループは、「CC」と称される；第三のケモカインサブグループは、「CX3C」と称される；第四のケモカインサブグループは「C」と称される。これらのサブグループ内で、ケモカインはさらに、アミノ酸配列相同性に基づく関連ファミリーに分類される。CXCケモカインファミリーには、IP-10およびMIGファミリー；GROα、GROβ、およびGROβファミリー；インターロイキン-8（IL-8）ファミリー；およびPF4ファミリーが含まれる。CCケモカインファミリーには、単球化学誘因性タンパク質（MCP）ファミリー；マクロファージタンパク質-1α（MIP-1α）、マクロファージ抑制タンパク質-1β（MIP-2β）、および活性化に基づき調節された発現した正常なT細胞（RANTES）が含まれる。間質細胞由来因子1α（MIP-1α）および間質細胞由来因子1β（SDF-1β）は、CXCおよびCCケモカインサブグループに相同性のアミノ酸配列にほぼ等しいケモカインファミリーを示す。
CX3Cケモカインファミリーには、フラクタルカインが含まれる；Cケモカインファミリーには、リンホタクチンが含まれる。
一般に、CXCケモカインは、レセプターのCXCRクラスのメンバーにより結合される；CCケモカインは、レセプターのCCRクラスレセプターにより結合される；CX3Cケモカインは、レセプターのCX3CRクラスにより結合される；およびCケモカインは、レセプターのCRクラスにより結合される。ケモカインレセプターの大部分は、Gタンパク質結合レセプターのファミリーに属する膜内外貫通分子である。これらのレセプターの多くは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質に結合し、細胞シグナルを伝達する。
ケモカインおよびレセプター発現は、炎症反応および細胞活性化の間上方制御される。ケモカインは、それぞれのレセプターへの結合中、多くの生理的状態に関連することが観察されている。例えば、血小板因子-4、成長関連癌遺伝子-β（GRO-β）およびインターフェロン-γ誘導タンパク質-10（IP-10）が内皮細胞の増殖および脈管形成を抑制する一方、インターロイキン-8のようなCXCグループのケモカインは脈管形成を刺激しうる。インターロイキン-8は、生体外で内皮細胞の増殖および走化性を刺激し、マクロファージ誘導脈管形成の最初の誘導因子であると考えられる。これらのケモカインの作用はNH2末端アミノ酸残基に依存するということが示された（Streiter et al., J. Biol. Chem., 270:27348-27357）。別のCXCケモカインであるSDF-1は、骨髄からの造血細胞の補充および流通、並びに単球およびリンパ球の誘引において活性である。
物質は、自然に発生するまたは合成的に産生されるいかなる分子でもよい。物質は生物学的液体のような生物学的サンプルから単離されてもよい。生物学的液体には、骨液、脳髄液、ファロピウス管液、精液、眼球液、心嚢液、胸膜液、炎症性滲出液、および腹水が含まれるがこれらに限定されない。物質はまた、腫瘍細胞の上清、腫瘍細胞溶出液、および／または腫瘍細胞溶解物中に存在してもよい。
好ましい実施の形態において、物質は、走化性またはfugetaxisを誘発する分子である。別の実施の形態において、物質は、ある濃度におけるfugetaxisの物質およびより低い濃度における走化性の物質である。
本発明の方法で使用される細胞は、遊走能力があれば、細胞の種類に制限されない。遊走能力を有する細胞の例は、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞等のような造血細胞である。ある実施の形態において、遊走能力を有する細胞は神経細胞である。別の実施の形態において、遊走能力を有する細胞は上皮細胞である。さらに別の実施の形態において、遊走能力を有する細胞は間葉細胞である。ある実施の形態において、遊走能力を有する細胞は胚幹細胞である。ある実施の形態において、遊走能力を有する細胞は生殖細胞である。重要な実施の形態において、細胞は一次ヒトT細胞である。他の実施の形態において、細胞は、例えば神経伝達物質に応答して走化性またはfugetaxisを受けることができるニューロンのような神経細胞である。
ケモカインレセプターを発現させる細胞には、免疫応答に関係すると考えられるまたは他の因子を放出して生体内で他の細胞プロセスを媒介し得るリンパ球、顆粒球、および抗原提示細胞（APC）のような遊走細胞が含まれる。ケモカイン勾配の存在は、ケモカインレセプターを発現させる遊走細胞の誘引に役立つ。例えば、遊走細胞は、ケモカイン勾配により特定の炎症の部位に誘引され、ここでさらなる免疫応答の修飾においてある役割を果たす。
ここで使用される「免疫細胞」とは、抗原の特異的認識に関係する造血起源の細胞である。免疫細胞には、樹状細胞またはマクロファージ、B細胞、T細胞等のような抗原提示細胞（APC）が含まれる。ここで用いられる「成熟T細胞」には、CD4loCD8hiCD69+TCR+、CD4hiCD8loCD69+TCR+、CD4+CD45+RA+、CD4+CD3+RO+、および／またはCD8+CD3+RO+表現型のT細胞が含まれる。
「造血起源」の細胞には、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および／または特定の造血系統に捧げられた前駆細胞が含まれるがこれらに限定されない。特定の造血系統に捧げられた前駆細胞は、T細胞系統、B細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統および／またはリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統のものでもよい。造血細胞は、骨髄、抹消血（集結された抹消血を含む）、臍帯血、胎盤血、胎児の肝臓、胚細胞（胚幹細胞を含む）、大動脈-生殖腺-中腎由来細胞、およびリンパ系軟組織のような組織に由来してもよい。リンパ系軟組織には、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃腺およびパイアー斑が含まれる。他の実施の形態において、「造血起源」細胞は、任意の既述の細胞の生体外培養、および特に前駆細胞の生体内培養に由来してもよい。
ニューロンおよびグリアを含む神経起源の細胞、および／または中枢および抹消神経組織の細胞はRR/Bを発現する（１９９９年１月２６日に出願されたアブラハム等(Avraham,et al.)の「神経細胞タンパク質マーカーRR/BおよびこれをコードするDNA（Neural cell protein marker RR/B and DNA encoding same）」と題される米国特許第5863744号参照）。ゼノプス（Xenopus）における研究により、ニューロンおよび成長円錐がネトリン（netrin）に反応することが示されている。ニューロンは、走化性またはfugetaxisにより神経伝達物質の存在に反応すると考えられる。上皮起源の細胞は、体の自由表面を覆うまたはその内側を覆う組織の細胞を含む。そのような上皮組織には、皮膚および感覚器官の細胞、並びに血管、消化管、気道、腎臓管および内分泌器官の内側を覆う分化した細胞が含まれる。間葉起源の細胞には、コラーゲン、ビメンチンおよびフィブロネクチンのような特定の繊維芽細胞マーカーを発現する細胞が含まれる。脈管形成に関連する細胞は、血管形成に関連する細胞であり、上皮起源の細胞および間葉起源の細胞を含む。胚幹細胞は、すべての系統の細胞を生じさせることができる細胞である；これはまた自己再生をする能力を有する。生殖細胞は、配偶子の産生に分化した細胞である。これは、より分化した生殖細胞系細胞をさらに生じさせることができる肝細胞よりもさらに分化した細胞である。細胞は、真核細胞でも原核細胞でもよい。
ある実施の形態において、スクリーニング分析で使用される細胞は、成熟細胞である。好ましくは、ヒト細胞である。これらは一次細胞（例えば直接採集された細胞）でもよく、また二次細胞（細胞株からの細胞を含む）でもよい。
ある態様において本発明は、化学運動（すなわち無作為の移動）中に上方制御または下方制御される、培地だけの中の細胞と比較して異なった発現産物を同定する。これらの産物の同定は、細胞移動の抑制または促進が所望な場合に利用できる。化学運動中に上方制御された産物は、シグナリング分子PTK2（局所接着キナーゼ）（6.88の数値により上方制御される）およびGタンパク質シグナリング10の調節因子（2.53の数値により上方制御される）を含む。化学運動中に下方制御される産物には、ホスホリパーゼCベータ3（2.54の数値により下方制御される）、RAS p21タンパク質活性因子（GAP）3（2.20の数値により下方制御される）、RASグアニル放出タンパク質2（カルシウム／DAG）（2.16の数値により下方制御される）、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ6（2.15の数値により下方制御される）、Rho特異的GEF（p114）（1.70の数値により下方制御される）およびタンパク質キナーゼC担体80K-H（1.70の数値により下方制御される）が含まれる。少なくともこれらの産物を知ることにより、走化性またはfugetaxisに反応して特異的に異なって調節される産物を同定することができる（すなわち、単に無作為に移動するのでなく意味のある方向性の移動により影響される産物を区別できる）。以下の表に提供されるデータは、概して、遺伝子産物が由来する細胞を培地中に単独で置くかまたは化学運動を受けさせる場合の遺伝子産物のレベルに相対的な特定の遺伝子産物の発現のレベルとして示されている。これらの産物を知ることにより、所望の効果に基づき、細胞の移動を抑制または刺激する方法が生じる。これらの産物の多くは走化性およびfugetaxisにおいて必要であり、したがってこれらの方向性移動を抑制または刺激するための別の標的を提供することができる。このように、これらの「化学運動性」特異的産物は、一般に細胞移動の「ハウスキーピング産物」であると考えてもよい（すなわち、移動が方向性であろうとなかろうと、移動に必要である）。これらの産物を刺激する物質には、作用薬および産物をコードする核酸が含まれるがこれらに限定されない。これらの産物を抑制する物質には、拮抗薬、抗体、およびアンチセンス核酸が含まれるがこれらに限定されない。
別の態様において、本発明は一つ以上の物質濃度勾配において細胞移動を調節できる化合物を同定する方法であって、ある物質濃度勾配中の遊走細胞をテスト化合物と接触させ、細胞中の核酸発現特性を特定し、遺伝子発現産物の発現における変化を同定する工程を含む方法を提供する。細胞移動は、走化性またはfugetaxisでもよく、したがって遺伝子発現産物は化学運動性またはfugetaxis特有の遺伝子産物でもよい。テスト化合物は、潜在的に走化性またはfugetaxisを調節すると考えられる任意の化合物である。
本発明はさらに、走化性およびfugetaxisを調節する方法を提供する。ここで用いられるように、調節とは影響または変化を意味し、刺激または抑制を含む。走化性またはfugetaxisを調節するために、本発明により同定される差別的な発現産物であるかまたは差別的な発現産物に影響を与える物質に細胞を接触または暴露する。したがって本発明により同定される差別的な発現産物はさらに、走化性またはfugetaxisを調節するように操作することのできる従来認識されていなかった標的である。
走化性およびfugetaxisを調節できることは、免疫応答、胸腺の遊出、および神経の副産物（例えば神経伝達物質に反応して）のような身体プロセスの操作に重要である。ある実施例において、被験者において起こっているまたは起こる可能性のある免疫応答を抑制することが所望である。実施例には、喘息、アレルギー、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、反応において形成される免疫応答のために有害である感染（例えば、特に幼児におけるRSV感染）、炎症状態、移植片対宿主反応（GVHD）等を有する被験者が含まれる。他の実施例において、被験者が恩恵を受けるように免疫反応を促進または刺激することが所望である。これらの被験者には、感染（例えば細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、寄生生物感染）を有するまたは発達させる可能性のある被験者、および癌細胞に対する免疫監視を高めるために癌を有するまたは発達させる可能性のある被験者が含まれる。特に免疫細胞が走化性因子に対応できないことに問題がある場合、他の被験者には、免疫応答が十分に機能を果たさないと診断された被験者が含まれる。
したがって、ある実施の形態において、fugetaxisを受けているまたは受ける可能性のある細胞を、fugetaxisの抑制に有効な量のfugetaxis特有の遺伝子発現産物を抑制する物質に接触させるまたは暴露する。Fugetaxis抑制物質は、核酸またはタンパク質レベルで作用できる。Fugetaxis特有の遺伝子発現産物は、細胞が無作為に移動する場合（すなわち化学運動性）または細胞が走化する場合のレベルと比較して、fugetaxisに反応して上方制御される。これらの産物はfugetaxisに反応して上方制御されるので、アンチセンス法および抗体法のような当該技術において知られる多くの方法を使用してこれらの産物の活性を阻害することによりfugetaxisを抑制してもよい。当業者が理解するように、産物はまた、走化性を調節するために標的としてもよい。
シグナリング分子は、細胞分裂周期42、アネキシンA3、Rap1グアニンヌクレオチド交換因子、アデニル酸シクラーゼ1、JAK結合タンパク質、およびRho GDP解離抑制剤アルファでもよいがこれらに限定されない。
別の実施の形態において、シグナリング分子は、細胞分裂周期42（cdc42）、リボソームタンパク質S6キナーゼ、BAI1結合タンパク質2、FAKと結合したGTPアーゼ調節因子、タンパクキナーゼC-ベータ1、ホスホイノシチド特有のホスホリパーゼC-ベータ1、一酸化窒素シンターゼ1、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸5-キナーゼ、およびMAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ4である。
細胞外マトリクス関連分子は、キチナーゼ3-様1（軟骨組織糖タンパク質-39）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子6、マトリクスメタロプロテイナーゼ8（好中球コラゲナーゼ）、インテグリン細胞領域結合タンパク質1、フィコリン（コラーゲンフィブリノーゲン領域含有）1、上皮V-様抗原1、血管内皮成長因子（VEGF）、フィブリン1、癌胎児性抗原結合細胞接着分子3、およびリソソーム結合膜タンパク質1でもよいがこれらに限定されない。
細胞骨格関連分子は、アンキリン1（赤血球型）、S100カルシウム結合タンパク質A12（カルグラヌリンC）、プレクチン1（中間フィラメント結合タンパク質、500kD）、微小管結合タンパク質RPEB3、微小管結合タンパク質1A様タンパク質（MILP）、キャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、ゲルゾリン様）、およびアンキリン2（神経型）が含まれるがこれらに限定されない。
細胞周期分子は、v-キットハーディ-ズッカーマン（v-kit Hardy-Zuckerman）4ネコ肉腫ウィルス性癌遺伝子相同体2、リポカリン2（癌遺伝子24p3）、レクチン、（ガラクトシド結合ガレクチン3）RAB31（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー）、disabled（Drosophila）相同体2（マイトジェン応答リンタンパク質）、RAB9（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー、偽遺伝子1）、および成長分化因子8でもよいがこれらに限定されない。
免疫応答関連分子は、主要組織適合遺伝子複合体（クラスII、DRアルファ）、S100カルシウム結合タンパク質A8（カルグラヌリンA）、小誘導性サイトカインサブファミリーA（システイン-システイン）、真核生物翻訳開始因子5A、小誘導性サイトカインサブファミリーB（システイン-X-システイン）（メンバー6、顆粒球走化性タンパク質2）、IgG結合タンパク質のFcフラグメント、CD24抗原（小細胞肺癌クラスター4抗原）、シトクロムP450（サブファミリーIVF、ポリペプチド3、ロイコトリエンB4オメガヒドロキシラーゼ）、MHCクラスII転写促進因子、T細胞レセプター（アルファ鎖）、T細胞活性剤（後期発現の増加）、MKP-1様タンパク質チロシンホスファターゼ、T細胞レセプターガンマ定常部2、T細胞レセプターガンマ遺伝子座でもよいがこれらに限定されない。
Fugetaxis特有の遺伝子発現産物はケモカイン（C-X3-C）レセプター1でもよい。
本発明はさらに、細胞の走化性を抑制する方法を提供する。本発明の方法は、走化性を受けているまたは受ける可能性のある細胞を、走化性特有の遺伝子発現産物を抑制する走化性の抑制に有効な量の物質と接触させる工程を含む。
シグナリング分子は、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ6、ワクシニア関連キナーゼ1、PTK2タンパク質チロシンキナーゼ2、SH3およびITAM領域2を含有するSTAM様タンパク質、シグナル誘導増殖関連遺伝子1、CD47抗原（Rh関連抗原、インテグリン関連シグナル変換因子）、およびタンパク質チロシンホスファターゼ（非レセプター型12）でもよいがこれらに限定されない。シグナリング分子はまた、PTK2（局所接着キナーゼ）、MAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ2、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、PTホスファターゼ（レセプター）、cdc42-結合タンパク質キナーゼベータ、RalGEF（RalGPS1A）、MAPキナーゼ7、オートタキシン、イノシトール1,4,5-トリホスフェートレセプター、ホスホイノシチド-3-キナーゼガンマ、PTホスファターゼ（非レセプター）、RAS p21タンパク質アクチベーター（GAP）、RASグアニル放出タンパク質、およびArp23複合体20kDaサブユニットからなる群より選択されてもよい。
細胞外マトリクス関連分子は、スポンジン1（f-スポンジン、細胞外マトリクスタンパク質）、コラーゲン型XVIII（アルファ1）、CD31接着分子、テトラスパン3、糖タンパク質A33、および血管関連遊走細胞タンパク質でもよいがこれらに限定されない。
細胞骨格関連分子は、アクチン関連タンパク質23複合体（サブユニット4,20kD）、トロポミオシン2（ベータ）、クロマチンのSWISNF関連マトリクス関連アクチン依存調節因子（サブファミリーa、メンバー5）、スペクトリンベータ（非赤血球型1）、ミオシン軽鎖ポリペプチド5（調節型）、ケラチン1、プラコフィリン4、およびキャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、筋Z線、アルファ2）でもよいがこれらに限定されない。
細胞周期分子は、FGFレセプター活性化タンパク質1、v-maf筋腱膜性繊維肉腫（ニワトリ）癌遺伝子相同体、サイクリン依存性キナーゼ（CDC2様）10、TGFB誘発性初期成長応答2、レチノイン酸レセプターアルファ、後期促進複合体サブユニット10、RAS p21タンパク質アクチベーター（GTPアーゼ活性化タンパク質、3-Ins-1,3,4,5-P4結合タンパク質）、細胞分裂周期27、プログラム細胞死2、c-myc結合タンパク質、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ1、TGFベータレセプターIII（ベータグリカン、300kDa）、およびG1期からS期までの遷移1でもよいがこれに限定されない。
免疫応答関連分子は、主要組織適合遺伝子複合体クラスIIDQベータ1、骨髄間質性細胞抗原2、バーキットリンパ腫レセプター1（GTP結合タンパク質、CXCR5）、CD7抗原（p41）、Stat2タイプa、T細胞免疫調節因子1、およびインターロイキン21レセプターでもよいがこれらに限定されない。
本発明の抑制または刺激物質との細胞の接触は、生体内で行ってもよい。既述のように、この物質を受け入れた被験者は、投与された物質の種類により変化し得る。したがって、本発明の方法が走化性の抑制を意図するある実施の形態において、被験者は異常な免疫応答を有するまたは有する危険がある。
異常な免疫応答は、炎症反応または自己免疫反応でもよいがこれらに限定されない。自己免疫疾患は、被験者自身の抗体が宿主組織に反応するかあるいは免疫エフェクターT細胞が内生の自己ペプチドに自己反応性であり組織を破壊する種類の病気である。自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（SLE）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（MG）、ハシモト甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば尋常性天疱瘡）、グレイブ病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水泡性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、インスリン依存性糖尿病、ブドウ膜炎、リウマチ熱、ギャン-バレー症候群、および自己免疫性肝炎が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の方法はfugetaxisを促進する方法を提供する。本発明の方法は、fugetaxisを促進する有効な量の非ケモカイン物質と細胞を接触させる工程を含む。ある実施の形態において、接触は、異常なfugetaxisを特徴とする疾患を有する被験者において生体内で起こる。ここで用いられるように、非ケモカイン物質は、既述のようなケモカインではない物質である。非ケモカイン物質は好ましくは、本発明により同定されるfugetaxisの下方制御標的の１つまたはその作用薬である。
本発明はさらに、走化性を促進する方法を提供する。本発明の方法は、走化性を促進させる有効な量の非ケモカイン物質と細胞を接触させる工程を含む。ある実施の形態において、接触は、走化性のないことを特徴とする疾患を有する被験者において生体内で起こる。非ケモカイン物質は好ましくは、本発明により同定されるfugetaxisの下方制御標的の１つまたはその作用薬である。
既述のように、ある実施例において、核酸（例えばアンチセンス療法）、またはタンパク質またはペプチド（例えば抗体療法）の投与により調節が生じる。ある実施の形態において、核酸またはタンパク質／ペプチドは単離されている。さらに別の実施の形態において、核酸またはタンパク質／ペプチドは実質的に純粋である。
核酸に関してここに用いたように、「単離された」という用語は、以下のことを意味する：(i)たとえばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生体外で増幅される(ii)クローニングにより組み換えて産生される(iii)分解またはゲル分離により精製される(iv)例えば化学的合成により合成される。単離された核酸は、当該技術においてよく知られる組み換えDNA技術により容易に操作される。したがって、5’および3’制限配列が既知であるかまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマー配列が開示されている、ベクターに組み込まれたヌクレオチド配列が単離されると考えられるが、自然宿主中のもとの部位に存在する核酸配列は単離されていない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、精製する必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離された核酸は、細胞内に存在するほんのわずかな割合の物質を含有し純粋ではない。しかしながら、そのような核酸は、ここに用語が用いられるように、当業者に知られる標準的な技術により容易に操作できる。
タンパク質／ペプチドに関してここで用いられるように、「単離された」という用語は、天然の環境から分離され十分に純粋な状態であることを意味し、したがって本発明の任意の目的のために利用または使用することができる。したがって、単離されたとは、 (i)抗体を惹起しおよび／または単離するために、(ii)分析における試薬として、または(iii)配列決定のために等、使用できるように、十分に純粋なことを意味する。
「実質的に純粋」とは、意図される用途に役に立つまたは適切な程度まで、天然または生体外システムにおいて見られる他の物質が核酸またはタンパク質／ペプチドに存在しないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野においてよく知られる技術により産生できる。例として、単離されたタンパク質は医薬品中で薬学的に許容できるキャリアと混合されるので、タンパク質は、製剤の重量で小さい割合のみ構成する。それにもかかわらず、タンパク質は、生物系において関連する多くの物質から分離される、すなわち特定の他のタンパク質から単離されるという点で単離されている。
別の態様により、本発明は、物質表面にまたは物質表面からの免疫細胞の誘引または拒絶に関する組成物および方法を提供する。本発明のこれらの態様は、ここに提供される走化性の抑制物質、走化性の刺激物質、fugetaxisの抑制物質、またはfugetaxisの刺激物質による二者択一的な物質表面の被覆または物質表面への装填を含む。ここで用いたように、「物質表面」は、歯科および整形外科人工インプラント、人工弁、およびステント、同種および／または異種組織、器官および／または脈管構造のような有機移植可能組織を含むがこれに限定されない。
移植可能な人工器官は、何年間も外科的修復または内部組織の交換において使用されてきた。整形外科インプラントはそれぞれ特定の医療的必要性を満たすのに適切な様々の装置を含む。そのような装置の例は、股関節交換装置、膝関節交換装置、肩関節交換装置、および骨折した骨を固定するためのピン、ギプスおよびプレートである。最新の整形外科および歯科インプラントは、高強度を達成するためにコバルト-クロムおよびチタン合金のような高性能金属を使用する。これらの金属は、鋳造および機械加工を含む成熟した金属加工技術を使用して、これらの装置の典型的な複雑な形に容易に加工できる。
物質表面は、所望の治療効果に依存して、細胞（例えば免疫細胞）を拒絶または誘引するのに有効な量の物質で被覆される。重要な実施の形態において、物質表面はインプラントの一部である。重要な実施の形態において、fugetaxisの物質に加えて、細胞成長増強物質、抗感染物質、および／または抗炎症物質で物質表面を被覆してもよい。
ここで用いたように細胞成長増殖物質とは、細胞の成長を刺激する物質であり、PDGF、EGF、FGF、TGF、NGF、CNTF、およびGDNFのような成長因子を含む。
ここで用いたように抗感染物質とは、微生物の活性を減少させるまたは微生物を殺す物質であり、以下のものを含む：アズトレオナム；グルコン酸クロルヘキシジン；イミヅレア（Imidurea）；リセタミン（Lycetamine）；ニブロキサン（Nibroxane）；ピラズモナンナトリウム（Pirazmonam Sodium）；プロピオン酸；ピリチオンナトリウム（Pyrithione Sodium）；塩化サンギナリウム（Sanguinarium Chloride）；チゲモナムジコリン（Tigemonam Dicholine）；アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン（Alamecin）；アレキシジン（Alexidine）；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミシクリン（Amicycline）；アミフロキサシン（Amifloxacin）；アミフロキサシンメシレート（Amifloxacin Mesylate）；アミカシン；硫酸アミカシン；アミノサリチル酸；アミノサリチレートナトリウム（Aminosalicylate sodium）；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピリシン；アンピリシンナトリウム；アパルシリンナトリウム（Apalcillin sodium）；アプラマイシン（Apramycin）；アスパルトシン（Aspartocin）；硫酸アストロミシン（Astromicin Sulfate）；アビラマイシン（Avilamycin）；アボパルシン（Avoparcin）；アジスロマイシン（Azithromycin）；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；バシトラシンメチレンヂサリシレート（Bacitracin Methylene Disalicylate）；亜鉛バシトラシン；バンベルマイシン（Bambermycins）；ベンゾイルパスカルシウム（Benzoylpas Calcium）；ベリスロマイシン（Berythromycin）；硫酸ベータミシン（Betamicin Sulfate）；ビアペネム（Biapenem）；ビニラミシン（Biniramycin）；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグサルフェクス（Bispyrithione Magsulfex）；ブチカシン（Butikacin）；硫酸ブチロシン（Butirosin Sulfate）；硫酸カプレオマイシン；カルバドックス（Carbadox）；カルベニシリン２ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム（Carumonam Sodium）；セファクロール；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール（Cefaparole）；セファトリジン；セファザフラーナトリウム（Cefazaflur Sodium）；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セファブペラゾン（Cefbuperazone）；セフジニル（Cefdinir）；セフェパイム（Cefepime）；塩酸セフェパイム（Cefepime Hydrochloride）；セフェテコル（Cefetecol）；セフィキシム（Cefixime）；塩酸セフメノキシム（Cefmenoxime Hydrochloride）；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド１ナトリウム；セフォテタン；セフォテタン２ナトリウム；塩酸セフォチアム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール（Cefpimizole）；セフピミゾールナトリウム（Cefpimizole Sodium）；セフピラミド（Cefpiramide）；セフピラミドナトリウム（Cefpiramide Sodium）;硫酸セフピロム（Cefpirome Sulfate）；セフポドキシムプロキセチル（Cefpodoxime Proxetil）；セフプロジル（Cefprozil）；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアセチル；セフロキシムピボキセチル（Pivoxetil）；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セファラジン；塩酸セトシクリン（Cetocycline Hydrochloride）； セトフェニコール（Cetophenicol）；クロラムフェニコール；パルミチン酸クロラムフェニコール；パントテン酸クロラムフェニコール複合体；コハク酸クロラムフェニコールナトリウム；クロルヘキシジンホスファニレート（Phosphanilat
e）；クロロキシレノール（Chloroxylenol）；重硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン（Cirolemycin）；クラリスロマイシン；塩酸クリナフロキサシン（Clinafloxacin Hydrochloraide）；リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン（Cloxacillin Benzathine）；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン（Cloxyquin）；コリスチメテートナトリウム（Colistimethate Sodium）；硫酸コリスチン；コウメルミシン（Coumermycin）；コウメルミシンナトリウム；シクラシリン（Cyclacillin）；サイクロセリン；ダルホプリスチン（Dalfopristin）；ダプソーン；ダプトマイシン（Daptomycin）；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメシクリン（Demecycline）；デノファンジン（Denofungin）；ディアベリジン（Diaveridine）；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン（Dipyrithione）；ジリスロマイシン（Dirithromycin）；ドキシサイクリンハイレート（Hyelate）；ドロキサシンナトリウム（Droxacin Sodium）；エノキサシン；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリン（Epitetracycline Hydrochloride）；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート（Acistrate）；エリスロマイシンエストレート；エチルコハク酸エリスロマイシン；グルコヘプタン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイシン；プロピオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；塩酸エタンブトール；エチオナミド；フレロキサシン（Fleroxacin）；フロキサシリン；フルダラニン（Fludalanine）；フルメキン（Flumequine）；ホスホマイシンン；ホスホマイシントロメタミン（Tromethamine）；フモキシシリン（Fumoxicillin）；塩化フラゾリウム（Furazolium Chloride）；酒石酸フラゾリウム；フシジン酸ナトリウ
ム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナム（Gloximonam）；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン（Hexedine）；イバフロキサシン（Ibafloxacin）；イミペネム（Imipenem）；イソコナゾール；イセパミシン（Isepamicin）；イソニアジド；ジョサマイシン（Josamycin）；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン（Levofuraltadone）；レボプロピルシリンカリウム（Levopropylcillin Potassium）；レキシスロマイシン（Lexythromycin）；リンコマイシン；塩酸リンコマイシン；ロメフロキサシン（Lomefloxacin）；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシレート（Mesylate）；ロラカルベフ（Loracarbef）；メフェニド（Mefenide）；メクロシクリン（Meclocycline）；メクロシクリンスルホサリシレート（Sulfosalicylate）；リン酸メガロミシンカリウム（Megalomicin Potassium Phosphate）；メキドックス（Mequidox）；メロペネム（Meropenem）；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；馬尿酸メテナミン；マンデル酸メテナミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム（Metioprim）；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン；塩酸ミリンカマイシン（Mirincamycin Hydrochloride）；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリヂキセートナトリウム（Nalidixate Sodium）；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；パルミトイル酸ネモマイシン；硫酸ネオマイシン；ウンデシレン酸ネオマイシン；硫酸ネチルマイシン；ニュートラマイシン（Neutramycin）；ニフラデン（Nifuradene）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン（Nifuratrone）ニフルダジル（Nifurdazil）；ニフリミド（Nifurimide）；ニフルピリノール（Nifurpirinol）；ニフルキナゾール（Nifurquinazol）；ニフルチアゾール
（Nifurthiazole）；ニトロサイクリン（Nitrocycline）；ニトロフラントイン；ニトロミド（Nitromide）；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム（Ormetoprim）；オキサシリンナトリウム；オキシモナム（Oximonam）；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン（Paldimycin）；パラクロロフェノール；パウロマイシン（Paulomycin）；ペフロキサシン（Pefloxacin）；ペフロキサシンメシレート（Mesylate）；ペナメシリン（Penamecillin）；ペニシリンGベンザチン（Benzathine）；ペニシリンGカリウム；ペニシリンGプロカイン；ペニシリンGナトリウム；ペニシリンV；ペニシリンVベンザチン；ペニシリンVヒドラバミン（Hydrabamine）；ペニシリンVカリウム；ペンチジドンナトリウム（Pentizidone Sodium）；フェニルアミノサリチレート；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム（Pirbenicillin Sodium）；ピリジシリンナトリウム（Piridicillin Sodium）；塩酸ピルリマイシン（Pirlimycin Hydrochloride）；塩酸ピバンピシリン；ピバンピシリンナトリウム；ピバンピシリンパモエート（Pamoate）；ピバンピシリンプロベネート（Probenate）；硫酸ポリミキシンB；ポルフィロマイシン（Porfiromycin）；プロピカシン（Propikacin）；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛（Pyrithione Zinc）；キンデカミンアセテート（Quindecamine Acetate）；キヌプリスチン（Quinupristin）；ラセフェニコール（Racephenicol）；ラモプラニン（Ramoplanin）；ラニマイシン（Ranimycin）；レロマイシン（Relomycin）；レプロミシン（Repromicin）；リファブチン（Rifabutin）；リファメタン（Rifametane）；リファメキシル（Rifamexil）；リマミド（Rifamide）；リファンピン（Rifampin）；リファペンチン（Rifapentine）；リファキシミン（Rifaximin）；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロザラミシン（Rosaramicin）；酪酸ロザラミシン；プロピオン酸ロザラミシン；ロザラミシンリン酸ナトリウム；ステアリン酸ロザラミシン；ロソキサシン（Rosoxacin）；ロクサルソン（Roxarsone）；ロキシスロマイシン（Roxithromycin）；サンサイクリン（Sancycline）；サンフェトリネムナトイルム（Sanfetrinem Sdium）；サルモキシシリン（Sarmoxicillin）；サルピシリン（Sarpicillin）；スコパフンジン（Scopafungin）；シソマイシン；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン（Sparfloxacin）；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン（Stallimycin Hydrochloride）；ステフィマイシン（Steffimycin）；硫酸ストレプトマイシン；ストレプトニコジド（Streptonicozid）；スルファベンズ（Sulfabenz）；スルファベンザミド（Sulfabenzamide）；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン（Sulfacytine）；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン（Sulfadoxine）；スルファレン（Sulfalene）；スルファメラジン；スルファメータ；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニレート亜鉛（sulfanilate Zinc）；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール（Sulfasomizole）；スルファチアゾール；スルファザメト（Sulfazamet）；スルフィソキサゾール；スルフィソキサゾールアセチル；スルフィソキサゾールジオラミン（Diolamine）；スルフォミキシン（Sulfomyxin）；スロペネム（Sulopenem）；スルタミシリン（Sultamicillin）；サンシリンナトリウム（Suncillin Sodium）；塩酸タランピシリン；テイコプラニン（Teicoplanin）；塩酸テマフロキサシン（Temafloxacin Hydrochloride）；テモシリン（Temocillin）；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン複合体；テトロキソプリム（Tetroxoprim）；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム（Thiphencillin Potassium）；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン２ナトリウム；チカルシリン１ナトリウム；チクラトン（Ticlatone）；塩化チオドニウム（Tiodonium Chloride）；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン（Tosufloxacin）；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン（Trisulfapyrimidines）；トロレアンドマイシン（Troleandomycin）；硫酸トロスペクトマイシン（Trospectomycin Sulfate）；チロトリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；ゾルバマイシン（Zorbamycin）；塩酸ジフロキサシン（Difloxacin Hydrochloride）；ラウリルイソキノリニウムブロミド（Lauryl Isoquinolinium Bromide）；モキサラクタム２ナトリウム；オルニダゾール（Ornidazole）；ペンチソミシン（Pentisomicin）；および塩酸サラフロキサシン（Sarafloxacin Hydrochloride）。
抗炎症性物質は、生体内で炎症反応を減少または完全に抑制する物質であり、以下のものを含む；アルクロフェナック；アルクロメタゾン；ジプロピオネート（Dipropionate）；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファル（Amcinafal）；アムシナフィド（Amcinafide）；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリローズ（Amiprilose Hydrochloride）；アナキンラ（Anakinra）；アニロラック（Anirolac）；アニトラザフェン（Anitrazafen）；アパゾン；バルサラジド２ナトリウム（Balsalazide Disodium）；ベンダザック；ベノキサプロフェン（Benoxaprofen）；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモル（Broperamole）；ブデソニド（Budesonide）；カルプロフェン（Carprofen）；シクロプロフェン（Cicloprofen）；シンタゾン（Cintazone）；クリプロフェン（Cliprofen）；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタソン（Clobetasone Butyrate）；クロピラク（Clopirac）；プロピオン酸クロチカソン（Cloticasone Propionate）；酢酸クロチカソン（Cloticasone Propionate）；酢酸コルメタソン（Cormethasone Acetate）；コルトドキソン（Cortodoxone）；デフラザコート（Deflazacort）；デソニド（Desonide）；デソキシメタソン（Desoximetasone）；デキサメタゾン；デキサメタゾンジプロピオネート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム（Diflumidone Sodium）；ジフルニサル；ジフルプレドネート（Difluprednate）；ジフタロン（Diftalone）；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド（Drocinonide）；エンドリソン（Endrysone） ;エンリモマブ（Enlimomab）；エノリカムナトリウム（Enolicam Sodium）；エピリゾール；エトドラク（Etodolac）；エトフェナメート（Etofenamate）；フェルビナク（Felbinac）；フェナモル（Fenamole）；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク（Fenclorac）；フェンドサル（Fendosal）；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザク；フラザロン（Flazalone）；フルアザコート（Fluazacort）；フルフェナム酸；フルミゾール（Flumizole）；フルミソリドアセテート（Flunisolid Acetate）；フルニキシン（Flunixin）；フルニキシンメグルミン（Flunixin Meglumine）；フルコルチンブチル（Fluocortin Butyl）；酢酸フルオロメトロン；フルクアゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン；フルレトフェン（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカソン（Fluticasone Propionate）；フラプロフェン（Furaprofen）；フロブフェン（Furobufen）；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタソル（Hlobetasol Propionate）；酢酸ハロプレドン（Halopredone Acetate）；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノル（Piconol）；イロニダップ（Ilonidap）；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソル（Indoxole）；イントラゾル（Intrazole）；酢酸イソフルプレドン（Isoflupredone Acetate）；イソゼパク（Isoxepac）；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール（Lofemizole Hydrochloride）；ロルノキシカム（Lornoxicam）；ロテプレドノルエタボネート（Loteprednol Etabonate）；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリゾンジブチレート（Meclorisone Dibutyrate）；メフェナム酸；メサラミン（Mesalamine）；メセクラゾン（Meseclazone）；メチルプレドニゾロンスレプタネート（Methylprednisolone suleptanate）；モルニフルメート（Morniflumate）；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソル（Naproxol）；ニマゾン（Nimazone）；オルサラジンナトリウム（Olsalazine Sodium）；オルパノキシン（Orpanoxin）；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン（Paranyline Hydrochloride）；ペントサンポリスルフェートナトリウム（Pentosan Polysulfate Sodium）；フェンブタゾンナトリウムグリセレート（Phenbutazone Sodium Glycerate）；ピエルフェニドン（Pirfenidone）；ピロキシカム；ピロキシカムシナメート（Piroxicam Cinnamate）；ピロキシカムオラミン（Olamine）;ピプロフェン（Piprofen）；プレドナゼート（Prednazate）；プリフェロン（Prifelone）；プロドリック酸（Prodolic Acid ）；プロクアゾン（Proquazone）；プロキサゾール（Proxazole）；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン（Rimexolone）；ロマザリト（Romazarit）；サルコレックス（Salcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート；塩化サンギナリウム（Sanguinarium Chloride）；セクラゾン（Seclazone）；セルメタシン（Sermetacin）；スドキシカム（Sudoxicam）；スリンダク；スプロフェン（Suprofen）；タルメタシン（Talmetacin）；タルニフルメート（Talniflumate）；タロサレート（Talosalate）；テブフェロン（Tebufelone）；テニダップ（Tenidap）テニダップナトリウム；テノキシカム（Tenoxicam）；テシカム（Tesicam）；テシミド（Tesimide）；テトリダミン（Tetrydamine）；チオピナク（Tiopinac）；チキソコートルピバレート（Tixocortol Pivalate）；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド（Triclonide）；トリフルミデート（Triflumidate）；ジドメタシン（Zidometacin）；ゾメピラックナトリウム。
本発明のある態様によれば、被験者中の特異的部位への免疫細胞の移動を抑制する方法が提供される。本発明の方法は、そのような治療を必要とする被験者中の特異的部位に、被験者中の特異的部位への免疫細胞の移動を抑制するのに有効な量のfugetaxisを促進する物質を局所的に投与する工程を含む。
ある重要な実施の形態において、本発明は、被験者中の炎症の部位への免疫細胞の移動を抑制する方法を提供する。ここで用いたように「炎症」とは、異種（非自己）抗原により、および／または組織の損傷または破壊により導き出される局所的な防御反応であり、これは異種抗原、有害物質、および／または損傷した組織を破壊、希釈または隔離する作用をする。組織がウィルス、細菌、外傷、化学物質、熱、低温、または任意の他の有害な刺激により傷つけられることにより炎症が生じる。そのような実施例において、免疫系統のよく知られる武器（T細胞、B細胞、マクロファージ）が細胞と連動し、可溶性の産物が炎症反応を媒介する。
一般的な炎症反応は、以下により特徴付けられる。(i)抗原（損傷）の局在部位における白血球の移動；(ii)BおよびT白血球、マクロファージおよび代替の補足的経路により媒介される「異種」および他の（壊死／損傷組織）の特異的および非特異的認識；(iii)補足的化合物、リンホカインおよびモノカイン、キニン、アラキドン酸代謝産物、およびマスト細胞／好塩基球産物による、特異的および非特異的エフェクター細胞との炎症反応の増幅；および(iv)食作用により抗原（損傷した組織）粒子を最終的に除去する抗原破壊へのマクロファージ、好中球およびリンパ球の参加。
本発明のさらに別の態様によれば、特異的部位を含む状態を有する被験者において免疫応答を増強する方法が提供される。本発明の方法は、そのような治療を必要とする被験者中の特異的部位へ、被験者中の特異的部位において免疫細胞特異的なfugetaxisの活性の抑制に有効な量のfugetaxisを抑制し走化性を刺激する物質を局所的に投与する工程を含む。ある実施の形態において、特異的部位は、病原菌感染の部位である。したがって、感染の除去を助けるために免疫細胞の効果的な補充が有効である。
ある実施の形態において、特異的部位は生殖細胞含有部位である。この場合、これらの特異的部位への免疫細胞の補充は、所望でない生殖細胞、および／または移植されたおよび移植されていない胚の除去に役立つ。さらなる実施の形態において、抗fugetaxisの物質ではない避妊薬の同時投与もまた提供される。
さらなる実施の形態において、特異的部位は、すぐに腫瘍を取り囲む領域である。既知の腫瘍の多くは免疫認識を避けるので、腫瘍部位への免疫細胞の移動を増強することが有益である。さらなる実施の形態において、抗fugetaxisの物質ではない抗癌剤の同時投与もまた提供される。抗fugetaxisではない抗癌剤には以下のものが含まれる：。アシビシン（Acivicin）；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（Acodazole Hydrochlorid）；アクロニン；アドゼレシン（Adozelesin）；アルデスレウキン（Aldesleukin）；アルトレタミン（Altretamine）；アンボマイシン（Ambomycin）；アメタントロンアセテート（Ametantrone Acetate）；アミノグルテチミド；アムサクリン（Amsacrine）；アナストロゾル（Anastrozole）；アントラマイシン（Anthramycin）；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Asperlin）；アザシチジン（Azaciticine）；アゼテパ（Azetepa）；アゾトマイシン（Azotomycin）；バチマスタット（Batimastat）；ベンゾデパ（Benzodepa）；ビカルタミド（Bicalutamide）；塩酸ビサントレン（Bisantrene Hydrochloride）；ビスナフィドジメシレート（Bisnafide Dimesylate）；ビゼレシン（Bizelesin）；ブレオマイシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナーナトリウム（Brequinar Sodium）；ブロピリミン（Bropirimine）；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（Caracemide）；カルベチマー（Carbetimer）；クロラムブシル；シロレマイシン（Cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン（Cladribine）；クリスナトールメシレート（Crisnatol Mesylate）；シクロホスファミド；シタラビン；デカルバジン（Decarbazine）；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン（Decitabine）；デクソルマプラチン（Dexormaplatin）；デザグアニン（Dezaguanine）；デザグアニンメシレート；ジアジクオン（Diaziquone）；ドセタクセル（Docetaxel）；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン（Droloxifene）；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ヅアゾマイシン（Duazomycin）；エダトレキセート（Edatrexate）；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Elsamitrucin）；エンロプラチン（Enloplatin）；エンプロメート（Enpromate）；エピプロピジン（Epipropidine）；塩酸エピルビシン（Epirubicin Hydrochloride）；エルブロゾール（Ervulozole）；塩酸エソルビシン（Esorubicin Hydrochloride）；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール（Etanidazole）；エトポシド（Etoposide）；リン酸エトポシド；エトプリン（Etoprine）；塩酸ファドロゾル（Fadrozole Hydrochloride）；ファザラビン（Fazarabine）；フェンレチニド（Fenretinide）；フロクスリジン（Floxuridine）；リン酸フルダラビン（Fludarabine Phosphate）；フルオロウラシル；フルロシタビン（Flurocitabine）；フォスキドン（Fosquidone）；フォストリエシンナトリウム（Fostriecin Sodium）；塩酸ゲンシタビン（Gemcitabine Hydrochloride）；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン（Idarubicin Hydrochloride）；イフォスファミド（Ifosfamide）；イルモフォシン（Ilmofosine）；インターフェロンアルファ-2a；インターフェロンアルファ-2b；インターフェロンアルファ-n1；インターフェロンアルファ-n3；インターフェロンベータ-1a；インターフェロンガンマ-1b；イプロプラチン（Iproplatin）；塩酸イリノテカン（Irinotecan Hydrochloride）；酢酸ランレオチド（Lanreotide Acetate）；レトロゾール（Letrozole）；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾル（Liarozole Hydrochloride）；ロメトレキソルナトリウム（Lometrexol Sodium）；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（Losoxantrone Hydrochloride）；マソプロコル（Masoprocol）；マイタンシン（Maytansine）；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル（Menogaril）；メルカトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ（Meturedepa）；ミチンドミド（Mitindomide）；ミトカルシン（Mitocarcin）；ミトクロミン（Mitocromin）；ミトギリン（Mitogillin）；ミトマルシン（Mitomalcin）；ミトマイシン；ミトスパー（Mitosper）;ミトタン（Mitotane）；塩酸ミトザントロン；ミコフェノール酸（Mycophenolic Acid）；ノコダゾール（Nocodazole）；ノガラマイシン（Nogalamycin）；オルマプラチン（Ormaplatin）；オキシスラン（Oxisuran）；パクリタキセル；ペガスパルガス（Pegaspargase）；ペリオマイシン（Peliomycin）；ペンタムスチン（Pentamustine）；硫酸ぺプロマイシン；ペルフォスファミド（Perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン（Piposulfan）；塩酸ピロキサントロン（Piroxantrone Hydrochloride）；プリカマイシン（Plicamycin）；プロメスタン（Plomestane）；ポドフィロクス（Podofilox）；ポルフィマーナトリウム（Porfimer Sodium）；ポルフィロマイシン（Porfiromycin）；プレドニムスチン（Prednimustine）；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン（Pyrazofurin）；リボプリン（Riboprine）；ログレチミド（Rogletimide）；サフィンゴル（Safingol）；塩酸サフィンゴル（Safingol Hydrochloride）；セムスチン（Semustine）；シムトラゼン（Simtrazene）；スパルフォセートナトリウム（Sparfosate Sodium）；スパルソマイシン（Sparsomycin）；塩酸スピロゲルマニウム（Spirogermanium Hydrochloride）；スピロムスチン（Spiromustine）；スピロプラチン（Spiroplatin）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン（Streptozocin）；スロフェヌル（Sulofenur）；タリソマイシン（Talisomycin）；タキソテレ（Taxotere）；テコガランナトリウム（Tecogalan Sodium）；テガファー（Tegafur）；塩酸テロキサントロン（Teloxantrone Hydrochloride）；テモポルフィン（Temoporfin）；テニポシド（Teniposide）；テロキシロン（Teroxirone）；テストラクトン（Testolactone）；チアミプリン（Thiamiprine）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン（Tiazofurin）；チラパザミン（Tirapazamine）；塩酸トポテカン（Topotecan Hydrochloride）；トレミフェンシトレート（Toremifene Citrate）；酢酸トレストロン（Trestolone Acetate）；リン酸トリシリビン（Triciribine Phosphate）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾル（Tubulozole Hydrochloride）；ウラシルマスタード；ウレデパ（Uredepa）；バプレオチド（Vapreotide）；ベルテポルフィン（Verteporfin）；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（Vinepidine Sulfate）；硫酸ビングリシネート（Vinglycinate Sulfate）；硫酸ビンレウロシン（Vinleurosine Sulfate）；ビノレルビンタルトレート（Vinorelbine Tartrate）；および硫酸ビンロシジン（Vinrosidine Sulfate）。
ある実施の形態において、本発明のfugetaxis刺激、fugetaxis抑制、走化性刺激または走化性抑制物質を、他の治療剤と実質的に同時に投与する。「実質的に同時」ということにより、時間的に十分近接して物質が被験者に投与されることが意味され、したがって他の治療剤はfugetaxisのまたは走化性の物質の移動抑制および刺激活性において相乗効果を及ぼす。
Fugetaxisのまたは走化性の物質は、他の治療剤の投与の前、同時、および／または後に投与してもよい。
ここである実施例において本発明は、核酸発現産物の転写または翻訳を阻害するためにアンチセンス分子を投与することにより実施されてもよい。ここで用いたように、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、特定の遺伝子を含むDNAまたはその遺伝子のmRNA産物に生理的条件下でハイブリッド形成し、それによりその遺伝子の転写および／またはそのmRNAの翻訳を抑制するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾したオリゴリボヌクレオチド、または修飾したオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリッド形成に基づき、標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように修飾される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよび標的との相補性の程度が、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含む、選択された特定の標的に依存することが分かるであろう。
好ましくは、生理的条件下で標的と選択的に結合する、すなわち生理的条件下で標的細胞中の任意の他の配列よりも標的配列に実質的により多くハイブリッド形成するように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成および配列する。Fugetaxisまたは走化性において上方制御される分子の同定に基づき（ここに記載される表を参照）、当業者は本発明に従って使用するために多くの適切なアンチセンス分子のいずれも容易に選択し合成することができる。抑制のために十分に選択的で有効であるために、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも10およびより好ましくは少なくとも15の連続した標的に相補的な塩基を有しているが、ある場合には7塩基の長さの修飾されたオリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドとして適切に使用される。Wagner et al., Nat. Med.1(11):1116-1118,1995参照。もっとも好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、20-30塩基の相補的な配列を有する。遺伝子またはmRNA転写物の任意の領域にアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択されてもよいが、好ましい実施の形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳開始、転写開始またはプロモーター部位のようなＮ末端または5’上流部位に対応する。さらに、3’の非翻訳領域は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされてもよい。mRNAスプライシング部位のターゲティングが当該技術において使用されるが、別のmRNAスプライシングが生じる場合は好ましくない。さらに、好ましくは、mRNAの二次構造化が考えられずタンパク質が結合しないと考えられる部位にアンチセンスを標的とする（例えばSainio et al., Cell Mol. Neurobiol.14(5):439-457,1994参照）。
一連の実施の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせから構成されてもよい。すなわち、ある天然ヌクレオチドの5’端および別の天然ヌクレオチドの3’端は、天然におけるように、ホスホジエステルのヌクレオシド間結合により共有結合してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、手動で行われても、また自動化合成器のような当該技術において知られる方法により調製してもよい。これらは、ベクターによる組換えにより産生してもよい。
しかしながら、好ましい実施の形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「修飾された」オリゴヌクレオチドを含んでもよい。すなわち、オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリッド形成することは妨げないが、安定性またはターゲティングを増強するあるいはそうでなければ治療の効果を増強する多くの方法で修飾されてもよい。
ここで用いたように、「修飾されたオリゴヌクレオチド」という用語は、以下の特徴を有するオリゴヌクレオチドを意味する；（１）ヌクレオチドの少なくとも２つが合成ヌクレオシド間結合（すなわちヌクレオチドの5’端と別のヌクレオチドの3’端との間のホスホジエステル結合ではない結合）により共有結合し、（２）核酸分子と通常は結合しない化学基をオリゴヌクレオチドに共有的に結合させる。好ましい合成ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオネート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
「修飾されたオリゴヌクレオチド」という用語には、共有的に修飾された塩基および／または糖が含まれる。例えば、修飾されたオリゴヌクレオチドには、3’位置でヒドロキシル基以外のおよび5’位置でリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合されるバックボーンの糖を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、修飾されたオリゴヌクレオチドには、2’-O-アルキル化リボース基が含まれてもよい。
したがって、本発明は、薬学的に許容できるキャリアとともに修飾されたアンチセンス分子を含有する医薬品を考慮に入れる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬剤の一部として投与してもよい。この後者の実施の形態において、好ましくはゆっくりとした静脈内投与が使用される。そのような薬剤には、当該技術において知られる任意の標準的な生理的におよび／または薬学的に許容できるキャリアと結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。薬剤は無菌性でなければならず、患者への投与に適切な単位の重量または容量において治療に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する。
上述のように、薬剤は有効な量で投与される。有効な量は、投与の様式、治療される特定の条件および所望の結果に依存する。上述のように、有効な量は、病状の段階、患者の年齢および肉体的状態、併用する治療、医師によく知られる要素にも依存する。治療上の投与については、医学的に所望の結果を達成するために十分な量である。ある場合には、これは炎症の局所的（部位特異的）減少である。別の場合には、腫瘍の成長および／または転移の抑制である。さらに別の実施の形態において、有効な量は、感染、または癌の抑制をもたらす免疫応答の刺激に十分な量である。
概して、本発明の活性化合物の投与量は、１日に約0.01mg/kgから1000mg/kgである。50-500mg/kgの投与量が適切であると考えられる。様々の投与経路が使用できる。本発明の方法は、概して、医学的に許容できる任意の投与方法、すなわち、臨床的に許容できない副作用を生じさせずに有効なレベルの活性化合物を産生する任意の方法を使用して実施してもよい。そのような投与の方法には、経口、直腸、局所、鼻、皮膚内、または非経口経路が含まれる。「非経口」という用語には、皮下、静脈内、筋内、または輸液が含まれる。静脈内または筋内経路は、長期間の治療および予防に特に適切ではない。しかしながら、これらは、緊急時に適切である。経口投与は、患者だけでなく投与計画にも便利なので、予防的治療に好ましい。ペプチドを治療に使用する場合、ある実施の形態において所望の投与経路は肺エーロゾル（aerosol）によるものである。ペプチドを含有するエーロゾル剤の調製の技術は、当業者によく知られている。概して、そのような体系は、パラトープ結合能力のような抗体の生物学的特性を著しく弱めることのない化合物を使用する（例えば、ここに引用されるSciarra and Cutie, “Aerosols, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712参照）。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、抗体またはペプチドエーロゾルを産生するための様々の要素および条件を容易に決定できる。
経口投与に適切な組成物は、それぞれ所定の量の活性物質を含有するカプセル、錠剤、トローチ剤のような分離した単位で存在してもよい。他の組成物には、シロップ、エリキシル剤または乳濁液のような水溶液または非水溶液中の懸濁が含まれる。
非経口投与のための製剤には、無菌の水溶性または非水溶性溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。水溶性のキャリアには、生理食塩水および緩衝培地を含む水、アルコール性／水溶性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口の媒介物（vehicle）には塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース（Ringer’s Dextrose）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは不揮発性油が含まれる。静脈内への媒介物には、液体および栄養補充剤（replenisher）、電解質補充剤（例えばリンガーデキストロースに基づく）等が含まれる。例えば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等の防腐剤および他の添加物が存在してもよい。静脈内投与のような他の投与形態により、投与量がより少なくなる。患者における反応が投与された初回量では不十分な場合、患者の許容範囲まで、より高い投与量（または異なる、より局所的な供給経路による効果的なより高い投与量）を使用してもよい。化合物の適切な全身性のレベルを達成するために、１日における複数回投与を考慮してもよい。
物質は、必要に応じて薬学的に許容できるキャリアと結合させてもよい。ここで用いたように「薬学的に許容できるキャリア」という用語は、ヒトへの投与に適切な１つ以上の併用可能な溶液または液体濾過器、希釈剤またはカプセルに包まれた薬剤を意味する。「キャリア」という用語は、活性成分が結合して投与を容易にする天然または合成の有機または無機成分を意味する。薬学的に許容できる組成物の成分はまた、所望の薬学的効果を実質的に害する相互作用のない態様で、本発明の分子とまたは互いに混ざり合うことができる。
他の態様において本発明は、物質の薬学的組成物を含む。投与される場合、本発明の薬剤は、薬学的に許容できる量でおよび薬学的に許容できる組成物で適用される。そのような薬剤は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、両立可能なキャリア、および必要に応じて他の治療剤を含有してもよい。薬剤中で使用される場合、塩は薬学的に許容性でなければならないが、薬学的に許容できない塩は薬学的に許容できる塩の調製のために使用することが都合よく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的におよび薬学的に許容できる塩には、以下の酸から調製されるものが含まれるがこれらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、スクシニル酸等。また、薬学的に許容できる塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製されてもよい。
宿主中に生体外または生体内で核酸を導入したかに依存して、本発明の核酸（例えばアンチセンス核酸）を細胞に導入するために、様々な技術を使用できる。そのような技術には、核酸-CaPO4沈殿物のトランスフェクション、DEAEを伴う核酸のトランスフェクション、関心のある核酸を含むレトロウィルスのトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション等が含まれる。ある用途において、本発明の核酸の細胞への供給に使用される媒介物（例えばレトロウィルス、または他のウィルス；リポソーム）は、それに結合したターゲティング分子を有してもよい。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上のレセプターに対するリガンドのような分子を、核酸供給媒体物に結合させるまたはその中に組み込んでもよい。例えば、リポソームが本発明の核酸の供給に使用される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、ターゲティングおよび／または摂取の促進のためにリポソーム構造中に組み込んでもよい。そのようなタンパク質には、特定の細胞の種類に親和性のカプシドタンパク質またはその断片、循環運動中に内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的化するおよび細胞内半減期を増強するタンパク質等が含まれる。高分子供給システムもまた、当業者に知られるように、細胞への核酸の供給に適切に使用されている。そのようなシステムにより、核酸の経口供給も可能となる。他の供給システムには、徐放性、遅延解除性または持効性システムが含まれる（ここで制御放出として集合的に称される）。そのようなシステムにより、fugetaxisの物質の反復的な投与を避けることができ、患者および医者への利便性を増加する。多くの種類の放出供給システムが利用でき、当業者に知られている。これらには、ポリ（ラクチド-グリコシド）、コポリオキサレート（Copolyoxalates）、ポリカプロラクトン（Polycaprolactones）、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸（Polyhydroxybutyric acid）、およびポリアンヒドライド（Polyanhydrides）が含まれる。薬を含有する前記のポリマーのマイクロカプセルが、例えば米国特許第5075109に記載されている。供給システムには、以下の非ポリマーシステムが含まれる：コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ-、ジ-およびトリ-グリセリドのような天然の脂質を含む脂質である非ポリペプチドシステム；シラスティック（sylastic）システム；ペプチドに基づくシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠；一部融合移植。特定の実施例には、以下のものが含まれるがこれに限定されない：（a）米国特許第4452775号、同4667014号、同4748034号および5239660号に記載されるように、マトリクス内にある形態で抗炎症性物質が含有される侵食システムおよび（b）米国特許第3832253号、および同3854480号に記載されるように、ポリマーからコントロールされた速度で活性成分が浸透する拡散システム。
本発明の好ましい供給システムは、コロイド分散システムである。コロイド分散システムには、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づくシステムが含まれる。本発明の好ましいコロイドシステムはリポソームである。リポソームは、生体内または生体外における供給ベクターとして有用な人工生体膜容器である。0.2-4.0μmの範囲のサイズの大きい単ラメラ容器（LUV）により大きい高分子を被包することができる。RNA、DNA、および無傷のビリオンを、水溶性の内部に被包でき、生物学的に活性の形態で細胞に供給できる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci.,(1981)6:77）。リポソームが有効な遺伝子伝達ベクターとなるために、以下の特徴の１つ以上が存在しなければならない：（１）生物学的活性を保ったまま高い効率での関心のある遺伝子の被包；（２）非標的細胞と比較した標的細胞に対する優先的および実質的結合；（３）高い効率における標的細胞細胞質への小胞の水溶性内容物の供給；および（４）遺伝情報の正確で有効な発現。
リポソームは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質のような特定のリガンドに結合させることにより特定の組織を標的としてもよい。リポソームは、例えば、N-[1-(2,3ジオレイロキシ)-プロピル]-N,N,N-塩化トリメチルアンモニウム(DOTMA)および臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)のような陽イオン脂質の形態であるリポフェクチン（商標）およびリポフェクタス（商標）として、Gibco BRLから購入できる。リポソームを作成する方法は、当該技術においてよく知られており、多くの刊行物に記載されている。リポソームは、Gregoriadis, G. in Trends in Biotechnology, (1985)3:235-241により示されている。
ある重要な実施の形態において、好ましい媒介物は、哺乳類の受容体への移植に適切な生物学的適合性の微粒子またはインプラントである。この方法に従って有用な生物学的適合性のインプラントの例は、国際特許出願／米国／第03307号（「高分子遺伝子供給システム」と題される国際公開第95/24929号パンフレット）に記載されている。国際特許出願／米国／第03307号には、生物学的適合性の、好ましくは適切なプロモーターの調節下での外因性遺伝子を含有する生物分解性高分子マトリクスが記載されている。高分子マトリクスを使用して、患者中の外因性遺伝子の徐放を達成する。本発明によれば、ここに記載されるfugetaxisの物質は、生物学的適合性の、好ましくは国際特許出願／米国／第03307号に開示される生物分解性高分子内に被包または分散される。
好ましくは、高分子マトリクスは、ミクロスフェア（物質が固体の高分子マトリクス中に分散される）またはマイクロカプセル（物質が高分子の殻の中心に格納される）のような微粒子の形態である。物質を含有するための高分子マトリクスの他の形態には、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント、およびステントが含まれる。高分子マトリクス装置のサイズおよび組成物は、マトリクスが導入される組織に好ましい放出動力を生じるように選択される。高分子マトリクスのサイズはさらに、使用される供給の方法に従って選択される。好ましくは、エーロゾル経路が使用される場合、高分子マトリクスおよびfugetaxisの物質は界面活性媒介物中に被包される。高分子マトリクス組成物は、運搬の有効性をさらに増加するために、双方の好ましい分解速度を有し、生物接着性の物質の形態になるように選択されてもよい。マトリクス組成物は、分解しないが、長期間の拡散により放出するように選択されてもよい。
別の重要な実施の形態によれば、本発明の供給システムは、局所的、部位特異的供給に適切な生物学的適合性のミクロスフェアである。そのようなミクロフェアは、Chickering et al., Bioteh, And Bioeng.,(1996)52:96-101およびMathiowitz et al., Nature,(1997)386:410-414に開示されている。
生物分解性でない高分子マトリクスおよび生体分解性の高分子マトリクスの両方が、患者への本発明の物質の供給に使用することができる。生体分解性のマトリクスが好ましい。そのような高分子は、天然または合成ポリマーでよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望である期間、通常は数時間から１年またはそれより長い期間、に基づき選択される。通常、数時間から３-１２ヶ月の期間の放出が最も好ましい。ポリマーは必要に応じて、水中で重量の約９０％まで吸収できるように、ヒドロゲルの形態であり、さらに必要に応じて、多価イオンまたは他のポリマー架橋される。
概して、fugetaxisの物質は、拡散により、またはより好ましくは高分子マトリクスの分解により生物侵食性のインプラントを使用して供給される。生物侵食性の供給システムの形成に使用できる合成ポリマーの実施例には、以下のものが含まれる：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル（poly-binyl halides）、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド（polyglycolides）、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそれらの共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩（cellulose sulphate sodium salt）、ポリ（メタクリル酸メチル）ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルテレフタラート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、および乳酸およびグリコール酸の重合体、ポリ無水物（polyanhydrides）、ポリ（オルト）エステル、ポリ（ブチック酸（butic acid））、ポリ（バレリアン酸）、およびポリ（ラクチド-コカプロラクトン）、およびアルギナートやデキストランおよびセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、それらの化学誘導体（置換、例えばアルキル、アルキレンのような化学基の付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により通常行われる他の修飾）のような天然ポリマー、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、それらの共重合体および混合物。通常、これらの物質は、酵素加水分解または生体内での水への暴露によって、表面またはバルク侵食により分解する。
生物分解性でないポリマーの例には、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、それらの共重合体および混合物が含まれる。
特に関心のある生物接着性のポリマーには、ここにその内容が引用されるH.S.Sawhney, C.P.PathakおよびJ.A.Hubell in Macromolecules,(1993)26:581-587に記載される生物侵食性のヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン（glutin）、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギナート、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
さらに、本発明の重要な実施の形態には、ポンプベースハードウェア供給システム（pump-based hardware delivery systems）が含まれ、そのいくつかは移植に適応できる。そのような移植可能なポンプは、制御放出マイクロチップを含む。好ましい制御放出マイクロチップは、ここにその内容が明白に引用されるSantini, JT Jr., et al., Nature,1999,397:335-338に記載される。
長期的徐放性インプラントは、慢性症状の治療に特に適切である。ここで用いたように、長期的放出とは、治療レベルの活性成分を少なくとも３０日間、好ましくは６０日間供給するように、インプラントが構成され配置されることを意味する。長期的徐放性インプラントは、当業者によく知られており、既述の放出システムのいくつかを含む。
ある実施の形態において、本発明の物質は、炎症の部位、例えばリウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化器官の血管等を有する患者の場合の関節に直接供給される。例えば、これは以下の方法により達成できる：物質（核酸またはポリペプチド）をバルーンカテーテルの表面に結合させる；バルーン部分が炎症の部位、例えばアテローム硬化性血管に位置するまでカテーテルを患者に挿入する；閉塞の部位においてバルーンを膨張させバルーン表面を血管壁に接触させる。この方法において、組成物は、特定の炎症部位を局所的に標的とし、これらの部位に免疫細胞を調整することができる。別の局所的投与の例には、そのような治療を必要とする部位における移植可能なポンプが含まれる。好ましいポンプは既述されている。さらなる実施例において、膿瘍の治療を伴う場合、fugetaxisの物質は、例えば軟膏／皮膚形態で局所的に投与されてもよい。必要に応じて、本発明の物質は他の治療剤（例えば抗炎症薬、免疫抑制剤等）と組み合わせて供給される。
本発明は、下記の実施例を参照することによりさらに完全に理解されるであろう。これらの実施例は、単に本発明の実施の形態を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例１
実施例１には、ケモカインの特定の勾配に対するT細胞の双方向性移動反応が、SDF-1/CXCR4情報伝達経路に関係するタンパク質をコードする遺伝子の発現における差別的変化と関係するという実験および発見が記載される。
方法
一次のネズミまたはヒトT細胞をSDF-1の特定の勾配にさらし、生体外および生体内で走化性またはfugetaxisを誘発した。ジグマンド／ハーシュチャンバー（Zigmund/Hirsch chamber）およびマイクロ加工装置並びにアレルギー性腹膜炎のネズミモデルを使用して、生体外および生体内それぞれにおける明確なSDF-1勾配を規定した。これらの系から精製されたT細胞を産生し、ゲノムアレイ技術（アフィメトリクス社（Affymetrix））を使用して増幅されていないRNAを調べた。これらの結果を、RT-PCRおよびノザンブロットにより有効であると確認した。SDF-1にさらされていないまたは勾配の不存在下でケモカインにさらされたT細胞において対照実験を行った。
細胞培養：健康な供与体の抹消血軟膜サンプルからCD4+CD45+RA細胞を得た。
トランスウェルアッセイ（Transwell Assays）：0.4μm孔径のフィルタ（23mm直径でポリカーボネート膜を有する、コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク）を使用してトランスウェルアッセイを行った。0.5％FBS含有IMDM中に懸濁された10×106の細胞を、トランスウェルの上部チャンバーに加えた。正の、負の、均一の、および非勾配を作成するために、0.5％FBS IMDM培地単独でまたはSDF-1を加えた培地を使用した。
全RNA抽出：ギブコ社（Gibco）のトリゾルプロトコル（TRIzol protocol）（GIBC-BRL,Life Technologies, Rocdville, MD）を使用して、10-20×106の細胞につき1mLのトリゾルですべてのサンプルから全RNAを抽出した。全RNAを1μg/μLの濃度にし、5-10μgをアフィメトリクスチップ（Affymetrix chips）に使用した。
cRNA調製およびチップハイブリダイゼーション条件：遺伝子チップ発現分析技術マニュアル（GeneChip Expression Analysis Technical Manual）に従い、および既述のようにして（Warrington et al.,2000）、cRNAプローブを調製した。簡潔にいえば、スーパースクリプトチョイスシステム（SuperScript Choice System）（GIBCO-BRL）およびT7-(dT)-24プライマーを使用し、全RNAの5-10μgを使用して二本鎖cDNAを合成した。このcDNAを、フェースロックゲル（Phase Lock Gel）（5Prime 3Prime, Boulder, CO）を使用しフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出により精製し、EtOH沈殿により濃縮した。製造業者の使用説明書に従いバイオアレイ高率RNA転写物ラベリングキット（BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit）（アフィメトリクス社）を使用して、生体内の転写によりビオチンで標識されたcRNAを産生した。cRNAをT7ポリメラーゼを使用して直線的に増幅させ、ビオチン化cRNAをRNイージーミニキット（RNeasy Mini Kit）（キアゲン社）（Qiagen）により洗浄し、20μgの標識されたcRNAを断片化した（Warrington et al.,2000）。遺伝子チップハイブリダイゼーションオーブン６４０（GeneChip Hybridization Oven 640）（アフィメトリクス社）中で、１６時間４５℃で６０rpmの一定の回転でcRNAの断片をマイクロアレイにハイブリッド形成させた。洗浄した後、アレイをストレプタビジン-フィコエリトリン（モルキュラープローブ社（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）で染色し、遺伝子チップ流体ステーション４００（GeneChip Fluidics Station 400）（アフィメトリクス社）を使用してビオチン化抗ストレプタビジン（ベクターラボラトリー社（Vector Lavoratories）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）により増幅し、遺伝子アレイスキャナー（GeneArray scanner）（アフィメトリクス社）で検査した。アレイのそれぞれの特徴の強度を、標準的なアフィメトリクス社の方法（ワリントン等（Warrington et al.,2000）に従いアフィメトリクス社の遺伝子チップソフトウェア（GeneChip Software）バージョン5.0を使用して記録した。
発現データの統計分析：実験間の比較を可能とするために、アフィメトリクス社のイメージファイル（imgage (.cel)files）をロゼッタレソルバー（Rosetta Resolver）バージョン4.0発現データ分析システムに組み込み、レソルバーエラーモデル（Resolver erro model）に従い正規化した（Waring et al.,2000, Lock et al.,2000参照）。
遺伝子標的のQ-PCR検査：一次T細胞からの全RNAを上述のように単離し、精製し、定量した。SYBRグリーンI（SYBR Green I）（1:30000、分子プローブ社）を含有するブリリアントワンセットQRT-PCRキット（Brilliant One-Step QRT-PCR kit）（ストラタジーン社（Stratagene）、ラホーヤ、カリフォルニア州）、前方および後方プライマー（それぞれ50nM；インビトロゲン社（Invitrogen））、サンプルRNA（転写物の発生量に依存して量は変化する）を使用してQRT-PCRを行った。
結果
ロゼッタレソルバーエラーモデルに基づくソフトウェアを使用し当該方法に記載されるようにして、同じ条件のチップを組み合わせた。その後、異なる組み合わせ間で組み合わされた実験を比較し、下記の前提の識別可能なサブコンポーネント（sub-component）に対処した：M/M基本条件；CM-化学運動性；正のSDF-1勾配中のCT-走化性；および負のSDF-1勾配中のFT-fugetaxis。
走化性を受けたT細胞についての遺伝子発現特性は、いくつかの重要な点でSDF-1の勾配に応じてfugetaxisを受けたT細胞について生じた特性と異なった。遺伝子発現のクラスター分析によって、SDF-1情報伝達に関係することが知られている遺伝子コード分子は、fugetaxisまたは走化性を受けた細胞と比較して、著しく異なって発現した（RNA発現において1.7-21倍の変化についてp≦0.05）。特に注目すべきは、これらの異なって発現した遺伝子は、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ、細胞チロシンキナーゼ、PI-3キナーゼおよびRho GTPアーゼカスケード並びにサイクリックヌクレオチド代謝経路のメンバーをコードする。勾配の不存在下でSDF-1にさらされた対照T細胞についての遺伝子発現特性は、ケモカインの勾配に反応した細胞から産生された特性と異なった。
データは、表1-6（図3-8）に記載されている。
SDF-1の均一な（走化性）勾配中で上方制御されるシグナリング分子には、PTK2（+6.88）およびGタンパク質シグナリング10の調節因子（+2.53）が含まれる。
SDF-1の均一な（走化性）勾配中で下方制御されるシグナリング分子には、ホスホリパーゼC、ベータ３（-2.52）、RAS p21タンパク質活性化因子（GAP）３（-2.20）、Rasグアニル放出タンパク質２（カルシウム／DAG）（-2.16）、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ６（-2.15）、Rho-特異的GEF（p114）（-1.70）、プロテインキナーゼC基質80K-H（-1.70）が含まれる。
方向性（走化性およびfugetaxis）対天然（化学運動性）勾配の存在下で上方制御されるシグナリング分子には、形質転換成長因子、ベータ１（1.92化学運動性対走化性；1.70化学fugetaxis）およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質（1.74化学運動性対走化性；1.78化学運動性対fugetaxis）が含まれる。
方向性（走化性およびfugetaxis）対天然（化学運動性）勾配の存在下で下方制御されるシグナリング分子には、同種移植炎症因子１（-12.9化学運動性対走化性；-11.9化学運動性対fugetaxis）、ホスホセリンホスファターゼ様（-4.24化学運動性対走化性；-5.76化学運動性対fugetaxis）BCR下流シグナリング１（-1.86化学運動性対走化性；-2.14化学運動性対fugetaxis）v-Kit-ras2カーステン（Kirsten）ラット肉腫２ウィルス癌遺伝子（-1.84化学運動性対走化性；-1.95化学運動性対fugetaxis）が含まれる。
シグナリング分子は、SDF-1の正の（走化性）および負の（fugetaxis）勾配間で異なって発現した。
SDF-1の走化性勾配（対fugetaxis勾配）中でより強く発現するシグナリング分子には、PTK2（局所接着キナーゼ）（8.59）、MAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ２（7.30）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（4.59）、PTホスファターゼレセプター（4.20）、CDC42結合タンパク質キナーゼベータ（3.23）、Ral GEF（RalGPS1A）(2.81),
MAPキナーゼ７（2.78）、オートタキシン（Autotaxin）（2.63）、イノシトール1,4,5-トリホスフェートレセプター（2.60）、ホスホイノシチド-3-キナーゼ、ガンマ（2.48）、PTホスファターゼ、非レセプター（2.02）、Ras p21タンパク質活性化因子（GAP）（1.98）、Rasグアニル放出タンパク質２（1.98）およびArp23複合体20kDaサブユニット（1.95）が含まれる。
SDF-1のfugetaxis勾配（対走化性勾配）中でより強く発現するシグナリング分子には、細胞分裂周期42（4.93）、リボソームタンパク質S6キナーゼ（2.91）、BAI1関連タンパク質２（2.84）、FAKに関連するGTPアーゼ調節因子（2.59）、プロテインキナーゼC、ベータ１（2.16）、ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼC-ベータI（1.99）一酸化窒素シンターゼI（1.99）、ホスファチジルイノシトール-4-ホスフェート5-キナーゼ（1.82）およびMAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ４（1.72）が含まれる。
結論
この研究により、SDF-1の勾配に反応した生体外および生体内の双方向性T細胞移動のメカニズムが解明され、走化性のための情報伝達経路と関連する遺伝子発現の調節はfugetaxisと関連するものと異なるものであることが示される。この研究により、生体内でSDF-1の勾配に対するT細胞の走化性またはfugetaxisの応答を選択的に阻害または増強することができる特異的な治療剤のために潜在的な分子標的を同定するための基礎が形成される。
実施例２
実施例２には、ケモカイン、インターロイキン-8に反応した好中球の移動の新しい態様、すなわち双方向性の移動を示す実験および発見が記載される。具体的には、IL-8レセプターであるCXCR2の特異的非ペプチド拮抗薬、およびケモカイン情報伝達の既知の抑制因子を使用することにより、好中球は、IL-8勾配を上方および下方へ方向決定することができ、この決定が勾配の険しさ、好中球がさらされるケモカインの絶対濃度、およびCXCR2レセプターの占有のレベルに依存して決定されるということが示される。さらに、勾配を下方へ移動するための好中球の方向決定は、勾配の上方への移動と比較した場合、情報伝達抑制因子に対し異なった感受性であることが分かった。
方法
一次ヒトT細胞を、IL-8の特定の勾配にさらし、マイクロ加工された装置中で生体外および生体内で走化性またはfugetaxisを誘発した。生体染色顕微鏡法およびデジタル画像分析を使用して、IL-8に反応した好中球の双方向性の移動を調べた。
好中球の単離：静脈穿刺により、健康な志願者からヒトの全血液を、ナトリウムヘパリンを含有する試験管（ベクトンディキンソン社（Becton Dickinson）、サンノゼ、カリフォルニア州）中に得た。全血液を2400rpmで４分間遠心分離し、血漿を除去した。生じたペレットを、0.5％(w/f)のウシ胎児血清（FCS；セルグロメディアテック社（Cellgro MediaTech））とともにイスコブ修正ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）（IMDM；セルグロメディアテック社（Cllgro MediaTech）、ハーンドン（Herndon）、バージニア州）中に再懸濁した。25mLの懸濁液を10mLのリンパ球分離培地（Lymphocyte Separation Medium）（ICN社、アービン、カリフォルニア州）で層状化し、２２℃において1600rpmで４０分間遠心分離した。上澄みを吸引し、生じたペレットを0.5％の(w/v)FCSおよび2％の(w/v)デキストラン（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、セントルイス、ミズーリ州）とともにIMDM中に再懸濁し、室温で３０分間赤血球を沈殿させた。上澄みを新しい試験管に移し、2000rpmで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、ペレットを冷たいddH2Oと混合して残存しているRBCを低張分解させ、0.5％(w/v)のFCSとともにIMDM中に再懸濁し、95％純粋であり99％生存能力のあることをトリパンブルー排除により特定した。
ミクロ流体直線勾配生成系（Microfluidic Linear Gradient Generator）の作成および調製：既述のような高速プロトタイプおよび穏やかなリソグラフィーを使用して、ミクロ流体直線勾配生成系をポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS；Sugard 184、ダウコーニング社（Dow Corning）、ニューヨーク）中で作成した。簡潔に言えば、高解像度のプリンタを使用して、コンピューター支援画像イメージファイルから透明マスク（transparency mask）を作成した。このマスクをSU-8フォトレジスト（ミクロリソグラフィーケミカル社（Microlithography Cemical Co.）、ニュートン、マサチューセッツ州）とフォトリソグラフィで接触させて使用し、シリコンウエハー上にパターン化されたフォトレジストの陽性レリーフ（relief）を産生した。パターン化されたウエハーに対してPDMSプレポリマーを硬化させることにより、エンボス加工されたチャネルを有するレプリカを製造した。鋭い注射針を使用して、硬化されたPDMSレプリカに培地および細胞懸濁液の入口および出口の穴を開けた。PDMSレプリカおよびガラス基質を、酸素プラズマ発生器（150mTorr、100W）中に１分間置いた。プラズマ処理後すぐに、PDMSレプリカおよびガラスを互いに向き合って配置し、不可逆的に結合させた。ポリエチレンチュービング（polyethylene tubing）（ベクトンディケンソン社（Becton Dickenson））を入口および出口部分に挿入し、液体を連絡させた。チュービングをPHD2000シリンジポンプ（ハーバードアパラタス社（Harvard Apparatus）、ホリストン、マサチューセッツ州）に連絡させ、準備を完了した。止血剤を使用して細胞装填中の流速を制御した。
直線勾配生成系の特徴付け：ミクロ流体装置中の勾配形成の確認は、上述のようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS；セルグロメディアテック社（Cellgro MediaTech））およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC；シグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich））の溶液を使用して行った。ミクロ流体装置中の勾配形成の確認は、上述のようにダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS；セルグロメディアテック社）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC；シグマ-アルドリッチ社）の溶液を使用して行った。様々の定流速度（0.1,1,10,100mm/s）で安定した勾配の蛍光顕微鏡写真を撮影した。移動チャネル中の蛍光強度特性のグラフは、時間的および空間的に安定した直線勾配を示す；低流速における特性は滑らかで連続的であるが、流速が増加すると、流れがより層流になるので段階勾配となる（Li Jeon et al., Nat Biotech,2002; Li Jeon et al., Langmuir,2000）。
ミクロ流体移動アッセイ（Microfluidic Migration Assay）および時間経過顕微鏡顕微鏡法（Timelapse Microscopy）：好中球（1×103細胞）を移動チャネル中に均一に配置し、0.1mm/secの流速で0.5％(w/v)のFCSとともにIMDM中でヒトインターロイキン-8（72a.a；ペプロテック社（PeproTech）、ロッキーヒル、ニュージャージー州）の直線勾配下で移動させた。10×プラン−フルオル対物レンズ（Plan-Fluor objective）（ニコン社）を通してニコンエクリプスTE2000-S顕微鏡（ニコン社、日本）で移動を観察した。IPLab3.6.1（スキャナリティック社（Scanalytics）、フェアファックス、バージニア州）により制御されたC4742-95ハママツデジタルカメラ（ハママツ社、日本）を使用して、３０秒ごとにブライトフィールド（Brightfield）画像を撮影した。移動チャネルに沿った観測点では、細胞移動を常に観察した。この観測点では勾配も修正した。勾配中のすべての細胞につき移動を定量化した。
定量分析のためのデジタルビデオの構成：IPLab3.6.1、フォトショップ6.0（アドーブシステム社、サンノゼ、カリフォルニア州）、およびアップルクイックタイムプロ5.0（アップルコンピュータ社、クパチーノ、カリフォルニア州）を組み合わせて使用して、時間経過ビデオ顕微鏡法ファイル一時的記憶装置またはS-VHSビデオテープからデジタル映像を作製した。MetaMorph4.5（ユニバーサルイメージング社（Universal Imaging）、ダウニントン（Downington）、ペンシルベニア州）物体追跡アプリケーションを使用して移動の追跡を行い、それぞれの追跡された細胞についてデカルト座標データの表が作成された。
直線勾配生成系における細胞移動の解析学：角度相関関数またはコサイン相関関数をそれぞれの実験について算出した。勾配のない実験については、相関関数は時間間隔が増加するとともに指数関数的に減少したが、勾配のある実験については、指数法則により潜在的に指数関数はずっとゆっくりと減少した；すべての場合について時間に対する角度の相関は絶対[IL-8]が増加すると増加した。角度の選択が時間と相関するという事実により、方向性の移動の指数として角度度数分布を比較することができた。
直線勾配生成系内の細胞移動は、偏ったランダムウォークモデル（Moghe etal., J Immun Methods,1995; Tan et al., Biomed Mater Res,2000）に基づき特徴付けられ、したがって映像の連続するフレーム中の追跡位置の間の移動は、長さおよび関連する角度を有するベクターとして考えることができる。MetaMorphからの追跡データをエクセル（マイクロソフト社、アメリカ）およびMATLAB13(マスワーク社（Mathworks, Inc.）)で分析し、平均の方眼移動（squared displacement）、運動係数、角振動数および相関関係、ランダムウォーク路程、および移動速度を特定した。細胞運動は、以下のように特徴付けられる。それぞれの細胞につき、方眼移動R2(t)を時間間隔tで計算した。t0は開始の時間である。
Figure 2006508697
始点はデータセットに従い変化し、移動は重複する時間間隔で平均化した。全体的な平均をすべての細胞につき行い、平均の方眼移動を計算した。関連する偏ったランダムウォークとして細胞移動を数学的にモデル化すると、これは以下のように記載される。SおよびPはそれぞれ移動速度および持続時間の指標である。
Figure 2006508697
時間間隔tが持続時間Pよりずっと大きい場合、平均方眼移動はtに直線的に比例し、ブラウン拡散（Brownian diffusion）に類似する。μは運動係数である。
Figure 2006508697
平均の方眼移動の直線部分に合う最小２乗回帰の傾きおよび切片は、それぞれμおよびPの推定値を与える。さらに、運動の「持続性指数（persistence index）（PI）」または平均自由行路を、細胞の全移動を行路に沿った全距離で割ることにより計算した。PIは旋回行為の指標であり、１は直線中の運動を示し、０は網状移動をしないことを示す。
細胞運動の方向の偏りを、以下のように定量化した。それぞれの細胞につき、角振動数のヒストグラムは、移動の連続的な時間間隔間のそれぞれの移動ベクターと関係する角度の分布を示す。これらのヒストグラムのビニング（binning）は、ランダムウォークと関係する確率論的ノイズを減少させることができる。これらのヒストグラムのx軸は、３６０°中の角振動数を示す円ヒストグラムを作成するために一点の周りに配置される。角度相関関数（またはコサイン相関関数）は下記のように計算した。φ(t)は勾配の方向に関して移動ベクターが形成する角度である。
Figure 2006508697
時間間隔の増加に伴うこの関数の減少は、連続的な旋回角度間の相関を示し、細胞の方向の持続性または記憶の指標である。規定された勾配に関する方向の偏りを定量化するために、移動した全距離で割った規定勾配の方向に関する細胞により横断された網状経路の長さとして定義され、方向性の正確さの指標である「平均化学屈性指数」を計算した。
Figure 2006508697
それぞれの細胞についての指数を計算し、全母集団につき平均化した。平均の化学屈性指数は、細胞が勾配を直接上方に移動する場合は１であり、好ましい方向性がない場合には０であり、勾配を直接下方に移動する場合は−１である。
情報伝達経路抑制因子：細胞を、百日咳毒素（100ng/mL；３７℃で３０分間）、ワートマニン（wortmannin）（1μM、10μM；３７℃で２０分間）、8-Br-cAMP（1mM；室温で１５分間）、8-Br-cGMP（1mM；室温で１５分間）（シグマ-アルドリッチ社）、またはCXCR2非ペプチド拮抗薬、SB225002（1pM、100pM、1nM、または1μMを３７℃で１５分間；カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州）で処理した。処理の直後、ミクロ流体装置の移動チャネル中に細胞を播種し、上述のように移動させた。
生体染色顕微鏡法：オスのスプラーゲドーリー（Sprague Dawley）ラット（200-300g）をハーランオラック社（Harlan-Olac）（ビセスター（Bicester）、イギリス）から購入した。オスのラットを生体染色顕微鏡法のために準備した。簡単には、i.m.ヒプノーム（i.m.Hypnorm）（フェンタニル-フルアニソン（fentanyl-fluanisone）混合物、0.1ml；ジャンセンキラン社（Jansen-Cilang）、ハイウィカム、イギリス）による沈静後、動物をi.v.ペントバルビタールナトリウム（30mg/kg負荷量後30mg/kg/h；ローンメリエクス社（Rhone Merieux）、ハーロー、イギリス）で麻酔した。カスタムビルト（custom-built）の加熱した顕微鏡ステージ上に動物を３７℃で維持した。正中腹部切開の後、回腸終端部に隣接する腸間膜を注意深く顕微鏡ステージのガラス窓上に配置し、所定の位置に固定した。タイロード（Tyrode）平衡塩類溶液（シグマアルドリッチ社）を継続的に使用することにより、腸間膜を暖かく湿った状態に保った。腸間膜後毛細管細静脈（直径15-40μm）が、浸水対象に適合した垂直固定ステージ顕微鏡（アキソスコプFS（Axioskop FS）、カールツアイス社（Carl Zeiss）、ウェルウィンガーデンシティ（Welwyn Garden City）、イギリス）で観察された。モニター（PVM-1453MD、ソニーU.K.社（Sony U.K.）、ウェーブリッジ、イギリス）上で観察するために画像をデジタルカメラ（C5810-01、ハママツフォトニクスU.K.社（Hamamatsu Photonics U.K.）、エンフィールド、イギリス）で取り込み、ビデオカセットレコーダー（AG-MD830E、パナソニックU.K.社（Panasonic U.K.）、ブラックネル、イギリス）により記録した。生体染色顕微鏡法の結果は、白血球の異なる部分母集団間で確定的な区別をしないので、すべての反応を白血球の行動の点で定量化する。回転する白血球は流れている赤血球よりもゆっくりと動いていると定められるので、回転流量を4-5分間で平均化し、１分間に細静脈壁上の固定点を通過する回転細胞の数として定量化した。堅く付着した白血球は、小静脈の100μm部分内に少なくとも３０秒間静止したままであるものとして定義される。管外に遊出された白血球は、隣接する細静脈組織中のものであるが、研究中の100μmの長さの血管部分の150μmの距離内に維持されているものと定義した。回転の基礎的読み出しの後、接着性および移動を取得した；10-9、M10-8Mまたは10-7Mの最終濃度のCINC-1（ペプロテック社（Peprotech））を、過溶解緩衝液中で腸間膜組織に局所的に投与した。選択された血管内の白血球の反応を、CINC-1の局所的投与が維持される間である180分間まで定量化した。それぞれの動物において、適切な血管からの複数の血管部分を定量化した。上述のようにして、定量的および数学的分析のために移動している細胞の映像を作成した；ある生体内実験の終わりにおいて、腸間膜を核色素であるアクリジンオレンジ（シグマアルドリッチ社）で染色し、アルゴンレーザーから産生された488nmのレーザー線で走査し、共焦点顕微鏡（LSM5 PASCAL、AxioskopIIFS、カールツアイス社）により観察して移動している細胞が好中球であることを確認した。
生体内における連続勾配の数学的モデル化：後毛細血管細静脈の球状モデルに適用された古典拡散方程式および内皮細胞によるケモカインのレセプター依存性輸送が後毛細血管細静脈周辺の勾配を産生する主要なメカニズムであるという仮定に基づいて、新しい生体内モデルを使用して定常状態における腸間膜中のケモカイン濃度特性を予測した。定常状態の溶液を、以下の２つの境界条件で、同種培地中のスフェアの周りの濃度勾配について算出した：１）スフェアから遠い濃度が一定である、および２）スフェアの表面のケモカイン流量も一定である。CINC-1およびIL-8の低い脂肪溶解度および血管作用シグナルの不存在下における内皮細胞間の密接な細胞間結合のために、組織からのケモカイン輸送の他のメカニズムはあまり重要でないと考えられた（Middleton et al., Cell,1997）。したがって、毛細管壁からの距離rにおける定常状態濃度Cは、下記のように計算された。C0は潅流溶液中のケモカイン濃度であり（10または100nM）、aは血管の半径であり（12.5μm）、F0はケモカイン摂取の速度であり、Dは拡散係数である。
Figure 2006508697
内皮細胞によるケモカイン摂取の速度は、他のタンパク質についてのエンドサイトーシス速度（Schwartz, Annu Rev Immunol,1990）と比較することにより1000から10000分子／細胞／分の範囲であると評価された。腸間膜におけるCINC-1（分子量7800）の拡散係数についての0.6×10-7という数値は、同様の組織において実験的に特定されたアルブミン（分子量66000）の拡散係数（Parameswaran et al., Microcirculation,1999）から補間された。
結果
好中球が双方向性の移動をすることができるかを調べるために、マイクロ加工された装置中で険しさの変化するIL-8の連続勾配を、既述されるように作成した（Li Jeon, N., et al., (2002)Nat Biotechnol.20(8):826-30）。マイクロ加工された装置による以前の研究により、0-50nMおよび0-100nM間の組み換えヒトIL-8の勾配中における一次ヒト好中球の強い走化性が示された（Li Jeon, N., et al., (2002)Nat Biotechnol.20(8):826-30）。T細胞はケモカインのより高い濃度においてfugetaxisを受けることが以前に示されているので、IL-8について0-12nM、0-120nMおよび0-2.4μMの勾配におけるSDF-1をさらに調べた。図１０AからDまでに示されるようにおよび以前に記載されるように（Li Jeon, N., et al.,(2002)Nat Biotechnol. 20(8):826-30）して、最初にそれぞれの勾配を修正し特徴付けた。移動チャネルの周りにおけるケモカインの差別的濃度は、0.0267nM／ミクロンから5.34nM／ミクロンまでの範囲であるかまたは10ミクロンの長さの好中球の長さ方向における0.267nM／ミクロンまたは50.34 nM／ミクロンのケモカイン濃度における差異と等しかった。好中球はまた、移動チャネル中でケモカインを含まないまたは12nM、120nMまたは1.2μMの均一濃度のIL-8を含む対照条件にさらした。ヒト好中球を装置に入れ、MatLabソフトウェアと共にMetaMorphソフトウェアを使用してその移動を追跡した（図１０EからHまで）。移動チャネル中の細胞の最初および最後の密度をそれぞれの条件についてプロットし、MetaMorphを使用してすべての方向性の移動の角振動数を特定した（図１０IからLまで）。移動チャネル中の均一濃度において非ケモカインまたはケモカインにさらされた細胞は、全方向における角振動数により特徴付けられる化学運動性を受けた。反対に、0-12nMおよび0-120nMの勾配中に配置された細胞は主に、勾配中のケモカインのピーク濃度の方向に生じる顕著な角振動数を有する走化性を示した（図１０MからP）。驚くべきことに、0-1
.2μMの最も険しいケモカイン勾配に細胞をさらした場合、移動行動はより複雑であった。下から三分の一の勾配中の細胞は、より高いレベルのケモカインの方向へ化学走化したが、上から三分の一の勾配中に起因する細胞は、勾配の下方へのfugetaxisを受け、ケモカインのピーク濃度から遠ざかった。最初に勾配の中央の三分の一に位置した細胞は、化学運動性を受けた。好中球の移動の前および後における移動チャネル中の細胞密度は、この勾配の中央の三分の一へ無作為に配置された細胞の再分配を示す（図１０L）。さらに、勾配についての角振動数の分布は、この勾配においてケモカインから遠ざかる顕著な動きを示す（図１０P）。研究した最も険しいケモカイン勾配（0-2.4μM）にさらされた細胞は、勾配内の位置に関わらず化学運動性を受けた（データは示されていない）。このようにして、険しい時間的および空間的に安定したIL-8の勾配中における強い双方向性の好中球の移動が観察された。
さらに、MetaMorphソフトウェアを使用してIL-8勾配中を移動する細胞の映像を分析し、それぞれのフレーム中の各細胞のそれぞれの位置を、フレーム内の一定の座標により定めた。したがって、それぞれの細胞の移動経路を示す定量的パラメーターを調べることができた。ランダムウォークモードを使用して、細胞移動を定量化し、平均速度、無作為運動性および持続時間の予め定められたパラメーターを使用して「拡散性の」または「弾道の」細胞移動を特定し、平均の化学屈性指数を使用してケモカインに向かうまたはそれから遠ざかる移動の方向性を特定した。ケモカインの不存在下におけるまたは走化性（0-12nMおよび0-120nM）またはfugetaxis（0-1.2μM）である勾配内における細胞移動についての平均速度および平均方眼移動が広く示されている（図１１Aおよび１１B）。平均速度の特定により、0-120nMの勾配において走化性または0-1.2μMの勾配においてfugetaxisを受ける細胞は同様の速度で移動するということが示される。平均方眼移動により、細胞の無作為ウォークの方向の偏りが示される。走化性およびfugetaxisを受けている細胞は、それぞれ0-120nMおよび0-1.2μMの勾配中を移動する場合に方向の偏りを指数関数的に増加することを示す。それぞれの実験的および対照条件において移動する細胞についての平均方眼移動プロットの直線部分の勾配は、細胞異動についての変量運動係数を定める（図１５、表８）。変量運動係数は、化学運動性が優位である120nMの均一濃度のIL-8の存在下におけるよりも、0-120nMおよび0-1.2μM勾配において方向性の移動を受ける細胞中において著しく高い。平均方眼移動プロットの直線部分のy切片は、「弾道の」細胞移動がどの程度かを特定する持続時間を示す（図１５、表８）。険しさの変化する直線勾配中の細胞移動の持続時間は、ケモカインの不存在下のまたは均一濃度のケモカイン下の細胞についてよりも大きい。走化性（21.5分間）またはfugetaxis（10.9分間）が見られるIL-8勾配中の細胞移動についての持続時間は、勾配の不存在下（0分間）または均一濃度のIL-8下（4.5分間）において化学運動性を受ける細胞についてのものよりも大きい。定められたIL-8勾配の上方または下方の走化性またはfugetaxisは「弾道」移動に近づくが、ケモカイン勾配の不存在下における細胞移動はより「拡散性」である。
細胞移動のランダムウォークモデル内の細胞の移動の分析によると、ケモカインに向かうまたはそれから遠ざかる移動の方向性は特定されない。さらに、勾配内のすべての細胞を等しく処理することにより、すべての細胞は同じ勾配中で同じように行動すると想定される。細胞は、勾配中の正確な位置に依存した方法で勾配を上方または下方に移動することができるということが確認されたので、平均化学屈性指数（MCI）の特定を利用して、勾配の上方（正の値）または下方（負の値）への移動およびそれぞれの勾配の分析された細胞移動の３つの任意の領域の方向性を定めた（図１５、表８）。120nMの均一濃度のケモカインにさらされた細胞またはケモカインにさらされていない細胞は、それぞれ-0.020+/-0.01および0.00+/-0.02のMCI値を有した。0-12nMおよび0-120nMの勾配中で走化性を受ける細胞は、それぞれ+0.32および+0.39のMCIを示した。反対に、0-1.2μMのより険しい勾配にさらされた細胞は、-0.13の負のMCIを示し、勾配中の細胞の顕著な移動はIL-8のピーク濃度から遠ざかっていたという考えを支持する。最も険しい0-2.4μMの勾配を移動する細胞は、化学運動性を示した。ケモカイン勾配の勾配の険しさおよび絶対濃度の影響の効果をさらに分析するために、それぞれの勾配を３つの等しい部分に分割し、それぞれの部分における細胞母集団および開始した移動を別々に分析した。0-12nMおよび0-120nMの勾配の全ての部分を移動する細胞は、+0.21から+0.44までの正のMCIを示した。これに対して、0-1.2μM勾配のより低い部分を移動する細胞は+0.2の平均部分のMCIを有し、勾配の中央三分の一および上から三分の一における細胞は、-0.14および-0.22の負のMCIを有する。ランダムウォークの偏りおよび方向を調べるこれらの定量的データにより、双方向性の好中球の移動の発見が確認された。さらに、これらの定量的データにより、勾配の上方または下方への細胞の方向決定は、勾配の険しさおよび勾配内でさらされるケモカインの絶対濃度により決定されるということが確かめられた。
走化性を受けている真核細胞との関連で、方向決定および勾配検出においてレセプター占有部がある役割を果たしていることが知られているので、ケモカインによるケモカインレセプター占有部もまたケモカイン勾配を上方または下方へ移動するために細胞の方向においてある重要な役割を果たしていることが前提とされた。したがって、IL-8レセプターであるCXCR2の特異的非ペプチド拮抗薬であるSB25002を使用して、この前提を調べた。好中球を1pMから1μMまでの濃度のSB225002で前処理し、既述のようにマイクロ加工された装置中で0-1.2μM勾配のIL-8にさらした。MetaMorphおよびMathLabソフトウェアを使用して細胞移動の映像を分析し、勾配の３つの部分のそれぞれにおいて移動する細胞について特定された正規化角振動数を計算した。抑制因子の不存在下では、正規化角振動数は1.0であったのに対し、fugetaxisまたは走化性の角振動数の抑制により正規化振動数は1.0未満となり、それぞれの方向性の反応の増強により1より大きい値になった。この分析により、勾配の上方または下方へ移動する細胞の方向決定における所定の抑制因子の濃度の効果が正確に定量化できる。最も低濃度のSB225002（1pMおよび100pM）により、fugetaxisの著しい抑制（p=0.0037および0.0210）が生じたのに対し、走化性はこれらの条件下で増加した（図１２）。徐々にXB225002の濃度が増加することにより、最終的にはfugetaxisおよび走化性の両方が抑制された。これらのデータは、レセプター占有部は、険しいIL-8勾配の上方または下方へ移動する細胞の方向決定において重要な役割を果たすということを示す。さらに、細胞表面においてIL-8はCXCR2およびCXCR1の両方に結合するが、ヒト好中球の双方向性シグナリングは明らかにCXCR2に依存した。
走化性についての情報伝達経路は化学相反（chemorepulsion）またはfugetaxisについてのものと別個のものであることは以前に示されている。標準移動アッセイ（standard transmigration assay）においてSDF-1に反応したT細胞fugetaxisは、細胞質内サイクリックヌクレオチド作用薬8-Br-cAMPによる抑制に対して、走化性よりも差別的に感受性であるということが知られている。さらに、T細胞走化性は、チロシンキナーゼ抑制因子であるゲニステインによる抑制に対して、fugetaxisよりも差別的に感受性であるということが示されている。マイクロ加工された装置中の好中球の移動の研究により、正確に定められたおよび安定したケモカイン勾配との関連で細胞の方向の偏りを含む細胞移動の定量的パラメーターにおけるこれらの抑制因子の効果を正確に調べることができる。一次ヒト好中球を、百日咳毒素、ワートマニン、ゲニステイン、8-Br-cAMPおよび8-Br-cGMPを含むケモカイン情報伝達経路の既知の抑制因子で前処理し、走化性およびfugetaxisが見られたIL-8勾配にさらした。ケモカインに向かうまたはそれから離れる方向性の移動における抑制因子の効果を、これらの勾配との関連で移動する細胞の方向性運動指数の特定により定量化した。勾配の上方への移動に対応する移動ベクター角を（30-150度-図１３参照）、走化性として定め、勾配の下方への移動に対応する特定された移動ベクター角を（210-330度-図参照）、fugetaxisとして定めた。その結果、ケモカイン勾配の上方または下方へ移動する細胞の方向の選択を、抑制因子の存在および不存在下で比較した。方向感覚の選択的抑制を伴う活発な移動は、fugetaxis領域と走化性領域との間の角振動数の分布において逆の関係であることが明らかである；fugetaxisが抑制される場合（＜１）、走化性は標準よりも増大される（＞１）。方向感覚の排除は、０に向かう両方の領域の角振動数の分布の減少として明らかである。このようにして、好中球の走化性およびfugetaxisはどちらも、百日咳毒素により著しく抑制されたということが示された（それぞれp=0.007およびp=0.003）。8-Br-cAMPもまたfugetaxisを選択的に抑制するが（p=4.6×10-6）、同濃度のこの細胞質内ヌクレオチド作用薬は、走化性を増大させた（p=0.0008）。0-120nMまたは0-1.2μM勾配中に配置する前に細胞をワートマニンにより前処理することにより、予想されたよりも複雑な結果が生じた。ワートマニンは、0-120nM勾配中では走化性を著しく抑制し（p=0.0020）fugetaxisを増強したが（p=＜0.0001）、これと対照的に、0-1.2μMのIL-8勾配の状況では走化性を増大し（p＜0.0001）走化性を抑制した（p＜0.0001）。
さらに、ワートマニンおよび8-Br-cAMPに対する好中球の走化性およびfugetaxisの差別的な感受性が示された。PI3KおよびcAMPはどちらも、ディクチオステリウム（Dictyostelium）、好中球、ニューロンおよびT細胞を含む真核細胞における勾配検出および方向決定において重要な役割を果たすことが示された。細胞質内cAMPレベルは、fugetaxisまたは化学相反を差別的に抑制するということも示され、このことは真核生物のニューロンおよびT細胞における従来の発見と一致する。ワートマニン系は、勾配中の対照条件下において観察された移動の顕著な方向を抑制し、対照条件下では以前顕著に見られなかった反対方向の決定を増強した。細胞の前縁または後縁へのPI3KおよびPTENの分布は、真核細胞の走化性に関連した方向決定において重要な役割を果たすと考えられる。走化性は、予想されたように浅い0-120nMの勾配においてワートマニンに関連して下方制御されるが、驚くべきことにfugetaxisは増強される。より険しいIL-8勾配においてワートマニンによりfugetaxisが抑制される場合、走化性が増強される。このデータにより、好中球の方向決定を支配するPI3K依存性経路を示す以前の研究が支持され、前縁および後縁は互換性があり、PI3Kおよび／またはPTENのような二次タンパク質の局在によりPI3K活性の不存在下において方向決定が特定できるということが示される。
生体外における定められたIL-8勾配への好中球の強い双方向性の移動が示されたので、この観察を生体内で確かめた。IL-8オルトローグ（orthologue）であるサイトカインにより誘発される好中球の化学誘引物質-1（CINC-1）に対する好中球の移動をラットモデルで評価した。CINC-1およびIL-8は既知であり、ネズミ好中球およびCXCR2によるシグナル移動についての強い誘引物質である。ラットIL-8と異なりラットCINC-1はクローン化されており、市販されている。麻酔された動物において体外に出された腸間膜中の小静脈に隣接する組織において、拡散性のケモカイン勾配を定めた。拡散性の勾配は、ピーク濃度が過溶解の点に隣接し、マトリクスタンパク質によるケモカインの吸収、レセプターへのケモカインの結合およびケモカイン／レセプター複合体の内部化および内皮細胞の管腔（luminal）表面におけるケモカインの表示の結果として小静脈に向かい減少する。ケモカイン勾配は、組織による予測可能な吸収および拡散速度に基づき本明細書において数学的にモデル化することができる（図１４AからC）。この勾配モデルは、ケモカイン過溶解の供給源と血管壁との間の勾配形状がすべてのピークのケモカイン濃度について同じ形状であることを予測しているということに言及することが重要である。したがって、過溶解されたケモカインと血管壁との間の任意の固定点における勾配の険しさは一定であるのに対し、その点において見られるケモカインの絶対濃度は変化する。したがって、生体内モデルは、生体内における細胞の方向決定における勾配の険しさおよび絶対濃度の効果の特定において有用であることが示される。
このモデルにおいて、２種類の実験を確立した。まず、1nM、10nMまたは100nMの固定濃度で９０分間ケモカインで小静脈に隣接する腸間膜組織を過溶解した。続いて、時間経過ビデオ顕微鏡法により好中球の移動を記録し、アクリジンオレンジ染色により移動する好中球を明確に同定した（図１４D）。これらの条件下において、血液からの好中球のピークの経内皮（transendothelial）移動が、10nMのケモカインのピーク濃度に向かって生じた。1nMの濃度により、小静脈の管腔表面への好中球の接着および移動は最小となり、100nMの濃度により、CINC-1のピーク濃度に向かい移動することなく血管の周りに好中球が蓄積した（データは示していない）。第二の実験において、10nM（図１４Eおよび映像６）または100nMのピーク濃度を有するケモカイン勾配を４５分間適用した後、100nM（図１４Fおよび映像７）または10nMのピーク濃度を有する勾配に換え、潜在的な走化性勾配をfugetaxis勾配に換えた。MetaMorphソフトウェアを使用して既述のように細胞移動を追跡した（図１４I）。
既述のようにして、隣接する組織において腸間膜小静脈から10nMのケモカインのピーク濃度に向かう走化性を受けている細胞を観察した（図１２H）。しかしながら、対照的に、それまでのより低いケモカイン濃度を、過溶解点において100nMのピーク濃度を有する勾配と換えると、好中球が腸間膜小静脈の方へ引き返して移動するのが観察された（図１４I）。勾配の上方または下方への方向性の移動を、生体内において規定の勾配中を移動する細胞について既述のようにして定量化した。これらの条件下で、10nMから100nMまでのケモカインのピーク濃度に向かってまたはそれから遠ざかって移動する好中球の細胞速度および変量運動係数は、7.70-7.87／分および64.57-135.11μm2／分の間で変化した（図１６、表９）。これらの速度および変量運動係数は、生体外においてケモカインの同様の険しさおよび絶対濃度の勾配中で移動する細胞について見られるものと著しくは異ならず、2.0-5.1／分および504.11-831.33μm2／分の間で変化した。興味深いことに、生体内を移動する細胞についての持続時間は、10nM-100nMおよび12nM-120nMのピーク濃度を有する勾配において生体外で見られる値（11.1-14.6分間）よりも生体内において著しく少なく（2.31-5.25分間）、これは生体外における条件と比較して生体内において細胞が移動する表面の複雑さを示すかもしれない。平均化学屈性指数を含む、生体内における勾配中の細胞の方向の偏りの最終的な定量的特定により、細胞は+0.32+/-0.06のMCIを有し10nMのピーク濃度を有するCINC-1の拡散性勾配に向かい大部分が移動するが、この勾配を-0.35+/-0.12のMCIを有し100nMのCINC-1のピーク濃度を有する勾配と換えた場合には細胞は遠ざかるように移動することが示された。
結論
上述される生体外および生体内の実験により、ケモカイン勾配を上方または下方へ移動する好中球の能力が厳格に示される。正のケモトカティック（chemotocatic）物質の結果として好中球のみが組織中に入ると主張する現在のパラダイムと対照的に、これらの発見により、好中球を積極的に排除する好中球化学忌避薬の存在により健康で感染していない組織が形成されるということが示される。最終的に、これらの発見により、特定の解剖学的部位から好中球を積極的に排除する新しい種類の抗炎症薬の作製の可能性が増加する。
等価物
既述される明細書は、当業者が本発明を実施するために十分であると考えられる。実施例は本発明の一つの態様の単一の説明として意図されており他の機能的に等価な実施の形態が本発明の範囲内であるため、本発明は提供される実施例により範囲を限定されるものではない。ここに示され記載されるものに加えて本発明の様々の改良が、既述の明細書から当業者にとって明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本発明の長所および目的は、本発明のそれぞれの実施の形態に必ずしも含まれるものではない。
T細胞の移動の分析における走化性、化学運動性、およびfugetaxisを示す概略図 細胞表面におけるケモカインの会合後に生じる推定上の流れを示す概略図 細胞表面におけるケモカインの会合後に生じる推定上の流れを示す概略図 図３は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図３は、SDF-1の培地対化学運動性勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表１を示す。正の値は化学運動性において上方制御されている；負の値は化学運動性において下方制御されている；ｐ≦0.05 図４は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図４は、SDF-1のfugetaxis対走化性勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表２を示す。正の値はfugetaxisにおいて上方制御されている；負の値は走化性において下方制御されている；ｐ≦0.05 図５は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図５は、SDF-1の化学運動性対走化性勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表３を示す。正の値は走化性において上方制御されている；負の値は走化性において下方制御されている；ｐ≦0.05 図６は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図６は、SDF-1の化学運動性対fugetaxis勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表４を示す。正の値はfugetaxisにおいて上方制御されている；負の値はfugetaxisにおいて下方制御されている；ｐ≦0.05 図７は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図７は、SDF-1の培地対走化性勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表５を示す。正の値は走化性において上方制御されている；負の値は走化性において下方制御されている；ｐ≦0.05 図８は、SDF-1の異なる勾配条件下で著しく（ｐ値≦0.05；倍数変化≧1.7）差別的に制御された遺伝子を示す。図８は、SDF-1の培地対fugetaxis勾配において差別的に制御された遺伝子を示す表４を示す。正の値は走化性において上方制御されている；負の値は走化性において下方制御されている；ｐ≦0.05 図９は、異なるSDF-1の勾配条件下で、差別的に制御されたアクチン／細胞骨格、細胞外マトリクス／接着、T細胞活性化および移動関連タンパク質を示す表７を示す。 図１０Ａから１０Ｐは、マイクロ加工された装置中の連続的な（0、12nm、120nMまたは1.2mM）直線的勾配におけるヒト好中球の移動を示す。IL-8の均一の濃度または連続的な勾配における細胞移動（MetaMorphソフトウェアを用いて記録された）が図１０Ｅから１０Ｈに示される。移動チャネルを通る正規化細胞濃度（MetaMorphソフトウェアにより特定された）が図１０Ｉから１０Ｌに示される。すべての時点でのすべての細胞についての移動ベクトル角が図１０Ｍから１０Ｐに示される。 図１１Ａおよび１１Ｂは、IL-8の不存在下または12nM、120nMおよび1.2mMのピーク濃度におけるケモカインの連続的で直線的な勾配において移動する細胞の、映像中を通った細胞についての平均速度（１１Ａ）および平均方眼移動（１１Ｂ）のプロットを示す。 図１２は、IL-8に向かうおよびIL-8から遠ざかる好中球の方向的な移動におけるSB225002の効果を示す。 図１３は、IL-8の一定の連続的な勾配における方向的なヒト好中球の移動におけるケモカイン情報伝達経路抑制物質の効果を示す。 図１４Ａから１４Ｉまでは、IL-8相同分子種であるCINC-1の連続的な拡散勾配に反応したラット好中球の移動の生体内顕微鏡定量化を示す。拡散連続勾配は、数学的にモデル化され、図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃに示される。時間経過映像の最初のフレームに由来する単一の顕微鏡写真が図１４Ｄ（映像５）、１４E（映像６）および１４F（映像７）に示される。図１４Ｇ、１４Ｈおよび１４Ｉは、始点に正規化された細胞軌跡を示し、方向的および無作為的な細胞の移動には図１４で同じ色のコードを使用する。 図１５は、IL-8の不存在下（IL-8不存在）、一定濃度のケモカイン（120nMのIL-8非勾配）、およびマイクロ加工された装置内で12nM、120nMおよび1.2mMのピーク濃度のIL-8を持つ３つの連続的で直線的な勾配条件における、好中球移動の映像中を通った細胞の細胞移動の方向的偏りおよび方向付けの特定のために定められた定量的パラメーターを示す（表８）。 図１６は、生体内における拡散連続CINC-1勾配に反応したラット好中球の移動についての定量化運動性パラメーターを示す（表９）。

Claims (121)

  1. 濃度依存的態様で発現される核酸を同定する方法であって、
    物質濃度勾配中の第一の位置における第一の細胞の第一の核酸発現特性を特定し、
    前記物質濃度勾配中の第二の位置における第二の細胞の第二の核酸発現特性を特定し、
    前記第一および第二の発現特性の間の違いを特定する工程を含み、
    前記物質濃度勾配中の前記第一の位置が物質の第一の濃度に対応し、前記物質濃度勾配中の前記第二の位置が物質の第二の濃度に対応し、少なくとも前記第二の細胞が前記物質濃度勾配中を移動することを特徴とする方法。
  2. 前記核酸発現特性がmRNA発現特性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 前記物質濃度勾配がリガンド濃度勾配であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 前記物質濃度勾配がケモカイン濃度勾配であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 前記ケモカイン濃度勾配が、SDF-1α、SDF-1β、IP-10、MIG、GROα、GROβ、GROγ、IL-8、PF4、MCP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ（マウス）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、RANTES、フラクタルカイン、リンホタクチン、CXC、IL-8、GCP-2、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、HCC-1、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）およびITAC濃度勾配からなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
  6. 前記物質濃度勾配がサイトカイン濃度勾配であることを特徴とする請求項３記載の方法。
  7. 前記サイトカイン濃度勾配が、PAF、N-ホルミルペプチド、C5a、LTB4およびLXA4、CXC、IL-8、GCP-2、GRO、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、HCC-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、MIP-1γ（マウス）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）、SDF-1α、SDF-1β、メチオニン-SDF-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、TGF-β、FLT-3リガンド、VEGF、DMDA、エンドセリンおよびCD40リガンド濃度勾配からなる群より選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
  8. 前記第一の物質濃度がゼロ濃度であり、前記第二の物質濃度がゼロ濃度でないことを特徴とする請求項１記載の方法。
  9. 前記第一の物質濃度が前記第二の物質濃度よりも高いことを特徴とする請求項１記載の方法。
  10. 前記第一の細胞が前記物質濃度勾配中を移動することを特徴とする請求項１記載の方法。
  11. 前記物質濃度勾配中の移動がfugetaxisの移動であることを特徴とする請求項１または１０記載の方法。
  12. 前記物質濃度勾配中の移動が走化性の移動であることを特徴とする請求項１または１０記載の方法。
  13. 前記核酸発現特性をノザン分析により特定することを特徴とする請求項１記載の方法。
  14. 前記核酸発現特性をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析により特定することを特徴とする請求項１記載の方法。
  15. 前記核酸発現特性を核酸チップ分析により特定することを特徴とする請求項１記載の方法。
  16. 前記勾配が段階勾配であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  17. 前記勾配が連続勾配であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  18. 前記勾配が第一の勾配と共存する第二の勾配を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  19. 前記第一および第二の細胞が成熟した細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  20. 前記第一および第二の細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  21. 前記第一および第二の細胞が一次細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  22. 前記第一および第二の細胞が造血細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  23. 前記第一および第二の細胞がTリンパ球であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  24. 前記第一および第二の細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  25. 一つ以上の物質濃度勾配中の細胞移動を調節することができる化合物を同定する方法であって、
    ある物質濃度勾配中の遊走細胞をテスト化合物と接触させ、
    前記細胞中の核酸発現特性を特定し、
    遺伝子発現産物の発現の変化を同定する、各工程を含むことを特徴とする方法。
  26. 前記細胞移動が走化性移動であり、前記遺伝子発現産物が走化性特有の遺伝子発現産物であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  27. 前記細胞移動がfugetaxisの移動であり、前記遺伝子発現産物が走化性特有の遺伝子発現産物であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  28. 前記核酸発現特性がmRNA発現特性であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  29. 前記物質濃度勾配がリガンド濃度勾配であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  30. 前記物質濃度勾配がケモカイン濃度勾配であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  31. 前記ケモカイン濃度勾配が、SDF-1α、SDF-1β、IP-10、MIG、GROα、GROβ、GROγ、IL-8、PF4、MCP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ（マウス）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、RANTES、フラクタルカイン、リンホタクチン、CXC、IL-8、GCP-2、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、HCC-1、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）およびITAC濃度勾配からなる群より選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
  32. 前記物質濃度勾配がサイトカイン濃度勾配であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  33. 前記サイトカイン濃度勾配が、PAF、N-ホルミルペプチド、C5a、LTB4およびLXA4、CXC、IL-8、GCP-2、GRO、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、NAP-2、IP-10、MIG、I-TAC、SDF-1α、BCA-1、PF4、ボレカイン、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、HCC-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5（マウス）、ロイコタクチン-1（HCC-2、MIP-5）、エオタキシン、エオタキシン-2（MPIF2）、エオタキシン-3（TSC）、MDC、TARC、SLC（エクソダス-2、6CKine）、MIP-3α（LARC、エクソダス-1）、ELC（MIP-3β）、I-309、DC-CK1（PARC、AMAC-1）、TECK、CTAK、MPIF1（MIP-3）、MIP-5（HCC-2）、HCC-4（NCC-4）、MIP-1γ（マウス）、C-10（マウス）、Cリンホタクチン、およびCX3Cフラクテルカイン（ニューロタクチン）、SDF-1α、SDF-1β、メチオニン-SDF-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、TGF-β、FLT-3リガンド、VEGF、DMDA、エンドセリンおよびCD40リガンド濃度勾配からなる群より選択されることを特徴とする請求項３２記載の方法。
  34. 前記核酸発現特性を物質の二つの異なる濃度で特定することを特徴とする請求項２５記載の方法。
  35. 前記物質の二つの異なる濃度がゼロ濃度およびゼロでない濃度であることを特徴とする請求項３４記載の方法。
  36. 前記勾配のゼロ濃度における前記細胞が該勾配中を移動することを特徴とする請求項３５記載の方法。
  37. 前記核酸発現特性をノザン分析により特定することを特徴とする請求項２５記載の方法。
  38. 前記核酸発現特性をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析により特定することを特徴とする請求項２５記載の方法。
  39. 前記核酸発現特性を核酸チップ分析により特定することを特徴とする請求項２５記載の方法。
  40. 前記勾配が段階勾配であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  41. 前記勾配が連続勾配であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  42. 前記勾配が前記第一の勾配と共存する第二の勾配を含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
  43. 前記細胞が成熟した細胞であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  44. 前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  45. 前記細胞が一次細胞であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  46. 前記細胞が造血細胞であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  47. 前記細胞がTリンパ球であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  48. 前記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
  49. 細胞のfugetaxisを抑制する方法であって、fugetaxisを受けているまたは受ける可能性がある細胞を、fugetaxis特有の遺伝子発現を抑制するfugetaxisの抑制に有効な量の物質と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  50. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物が核酸またはペプチドであることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  51. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物がシグナリング分子であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  52. 前記シグナリング分子が、細胞分裂周期42、アネキシンA3、Rap1グアニンヌクレオチド交換因子、アデニル酸シクラーゼ1、JAK結合タンパク質、およびRho GDP解離抑制剤アルファからなる群より選択されることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  53. 前記シグナリング分子が、細胞分裂周期42（cdc42）、リボソームタンパク質S6キナーゼ、BAI1結合タンパク質2、FAKと結合したGTPアーゼ調節因子、タンパクキナーゼC-ベータ1、ホスホイノシチド特有のホスホリパーゼC-ベータ1、一酸化窒素シンターゼ1、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸5-キナーゼ、およびMAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ4からなる群より選択されることを特徴とする請求項５２記載の方法。
  54. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物が細胞外マトリクス関連分子であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  55. 前記細胞外マトリクス関連分子が、キチナーゼ3-様1（軟骨組織糖タンパク質-39）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子6、マトリクスメタロプロテイナーゼ8（好中球コラゲナーゼ）、インテグリン細胞領域結合タンパク質1、フィコリン（コラーゲンフィブリノーゲン領域含有）1、上皮V-様抗原1、血管内皮成長因子（VEGF）、フィブリン1、癌胎児性抗原結合細胞接着分子3、およびリソソーム結合膜タンパク質1からなる群より選択されることを特徴とする請求項５４記載の方法。
  56. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物が細胞骨格関連分子であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  57. 前記細胞骨格関連分子が、アンキリン1（赤血球型）、S100カルシウム結合タンパク質A12（カルグラヌリンC）、プレクチン1（中間フィラメント結合タンパク質、500kD）、微小管結合タンパク質RPEB3、微小管結合タンパク質1A様タンパク質（MILP）、キャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、ゲルゾリン様）、およびアンキリン2（神経型）からなる群より選択されることを特徴とする請求項５６記載の方法。
  58. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物が細胞周期分子であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  59. 前記細胞周期分子が、v-キットハーディ-ズッカーマン（v-kit Hardy-Zuckerman）4ネコ肉腫ウィルス性癌遺伝子相同体2、リポカリン2（癌遺伝子24p3）、レクチン、（ガラクトシド結合ガレクチン3）RAB31（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー）、disabled（Drosophila）相同体2（マイトジェン応答リンタンパク質）、RAB9（RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー、偽遺伝子1）、および成長分化因子8からなる群より選択されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
  60. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物が免疫応答関連分子であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  61. 前記免疫応答関連分子が、主要組織適合遺伝子複合体（クラスII、DRアルファ）、S100カルシウム結合タンパク質A8（カルグラヌリンA）、小誘導性サイトカインサブファミリーA（システイン-システイン）、真核生物翻訳開始因子5A、小誘導性サイトカインサブファミリーB（システイン-X-システイン）（メンバー6、顆粒球走化性タンパク質2）、IgG結合タンパク質のFcフラグメント、CD24抗原（小細胞肺癌クラスター4抗原）、MHCクラスII転写促進因子、T細胞レセプター（アルファ鎖）、T細胞活性剤（後期発現の増加）、MKP-1様タンパク質チロシンホスファターゼ、T細胞レセプターガンマ定常部2、T細胞レセプターガンマ遺伝子座、シトクロムP450（サブファミリーIVF、ポリペプチド3、ロイコトリエンB4オメガヒドロキシラーゼ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項６０記載の方法。
  62. 前記細胞が免疫細胞であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  63. 前記接触が、異常な免疫応答を有するまたは有する危険のある被験者の体内で起こることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  64. 前記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  65. 前記fugetaxis特有の遺伝子発現産物がケモカイン（C-X3-C）レセプター1であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  66. 細胞の走化性を抑制する方法であって、走化性を受けているまたは受ける可能性のある細胞を、走化性特有の遺伝子発現産物を抑制する走化性の抑制に有効な量の物質と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  67. 前記走化性特有の遺伝子発現産物が核酸またはペプチドであることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  68. 前記細胞が免疫細胞であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  69. 前記接触が、異常な免疫応答を有するまたは有する危険のある被験者の体内で起こることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  70. 前記異常な免疫応答が炎症性応答であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  71. 前記異常な免疫応答が自己免疫応答であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  72. 前記自己免疫応答が、リウマチ様関節炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（SLE）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（MG）、ハシモト甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば尋常性天疱瘡）、グレイブ病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水泡性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病からなる群より選択されることを特徴とする請求項７１記載の方法。
  73. 前記異常な免疫応答が移植片対宿主反応であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  74. 前記走化性特有の遺伝子発現産物がシグナリング分子であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  75. 前記シグナリング分子が、Gタンパク質結合レセプターキナーゼ6、ワクシニア関連キナーゼ1、PTK2タンパク質チロシンキナーゼ2、SH3およびITAM領域2を含有するSTAM様タンパク質、シグナル誘導増殖関連遺伝子1、CD47抗原（Rh関連抗原、インテグリン関連シグナル変換因子）、およびタンパク質チロシンホスファターゼ（非レセプター型12）からなる群より選択されることを特徴とする請求項７４記載の方法。
  76. 前記シグナリング分子が、PTK2（局所接着キナーゼ）、MAPキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ2、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、PTホスファターゼ（レセプター）、cdc42-結合タンパク質キナーゼベータ、RalGEF（RalGPS1A）、MAPキナーゼ7、オートタキシン、イノシトール1,4,5-トリホスフェートレセプター、ホスホイノシチド-3-キナーゼガンマ、PTホスファターゼ（非レセプター）、RAS p21タンパク質アクチベーター（GAP）、RASグアニル放出タンパク質、およびArp23複合体20kDaサブユニットからなる群より選択されることを特徴とする請求項７４記載の方法。
  77. 前記走化性特有の遺伝子発現産物が細胞外マトリクス関連分子であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  78. 前記細胞外マトリクス関連分子が、スポンジン1（f-スポンジン、細胞外マトリクスタンパク質）、コラーゲン型XVIII（アルファ1）、CD31接着分子、テトラスパン3、糖タンパク質A33、および血管関連遊走細胞タンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項７７記載の方法。
  79. 前記走化性特有の遺伝子発現産物が細胞骨格関連分子であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  80. 前記細胞骨格関連分子が、アクチン関連タンパク質23複合体（サブユニット4、20kD）、トロポミオシン2（ベータ）、クロマチンのSWISNF関連マトリクス関連アクチン依存調節因子（サブファミリーa、メンバー5）、スペクトリンベータ（非赤血球型1）、ミオシン軽鎖ポリペプチド5（調節型）、ケラチン1、プラコフィリン4、およびキャッピングタンパク質（アクチンフィラメント、筋Z線、アルファ2）からなる群より選択されることを特徴とする請求項７９記載の方法。
  81. 前記走化性特有の遺伝子発現産物が細胞周期分子であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  82. 前記細胞周期分子が、FGFレセプター活性化タンパク質1、v-maf筋腱膜性繊維肉腫（ニワトリ）癌遺伝子相同体、サイクリン依存性キナーゼ（CDC2様）10、TGFB誘発性初期成長応答2、レチノイン酸レセプターアルファ、後期促進複合体サブユニット10、RAS p21タンパク質アクチベーター（GTPアーゼ活性化タンパク質、3-Ins-1,3,4,5-P4結合タンパク質）、細胞分裂周期27、プログラム細胞死2、c-myc結合タンパク質、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ1、TGFベータレセプターIII（ベータグリカン、300kDa）、およびG1期からS期までの遷移1からなる群より選択されることを特徴とする請求項８１記載の方法。
  83. 前記走化性特有の遺伝子発現産物が免疫応答関連分子であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  84. 前記免疫応答関連分子が、主要組織適合遺伝子複合体クラスIIDQベータ1、骨髄間質性細胞抗原2、バーキットリンパ腫レセプター1（GTP結合タンパク質、CXCR5）、CD7抗原（p41）、Stat2タイプa、T細胞免疫調節因子1、およびインターロイキン21レセプターからなる群より選択されることを特徴とする請求項８３記載の方法。
  85. 前記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
  86. 細胞のfugetaxisを促進する方法であって、細胞を、fugetaxisを促進する有効な量の非走化性物質と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  87. 前記接触が、fugetaxisがないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で起こることを特徴とする請求項８６記載の方法。
  88. 前記細胞が造血細胞であることを特徴とする請求項８６記載の方法。
  89. 前記造血細胞がTリンパ球であることを特徴とする請求項８８記載の方法。
  90. 前記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項８６記載の方法。
  91. 細胞の走化性を促進する方法であって、細胞を、走化性を促進する有効な量の非走化性物質と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  92. 前記接触が、fugetaxisがないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で起こることを特徴とする請求項９１記載の方法。
  93. 前記細胞が造血細胞であることを特徴とする請求項９１記載の方法。
  94. 前記造血細胞がTリンパ球であることを特徴とする請求項９３記載の方法。
  95. 前記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項９１記載の方法。
  96. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージからなる群より選択されることを特徴とする請求項６２または６８記載の方法。
  97. 前記免疫細胞が、好中球、好塩基球、好酸球およびマスト細胞からなる群より選択される炎症細胞であることを特徴とする請求項９６記載の方法。
  98. 前記造血細胞が免疫細胞であり、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージからなる群より選択されることを特徴とする請求項８８または９３記載の方法。
  99. 前記免疫細胞が、好中球、好塩基球、好酸球およびマスト細胞からなる群より選択される炎症細胞であることを特徴とする請求項９８記載の方法。
  100. 好中球の走化性を促進する方法であって、好中球を、走化性の促進に有効な量のIL-8と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  101. 前記好中球を低濃度のIL-8と接触させることを特徴とする請求項１００記載の方法。
  102. 前記IL-8の低濃度が、約10ng/mlから約500ng/mlまでの間であることを特徴とする請求項１０１記載の方法。
  103. 前記接触が、好中球の走化性がないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で起こることを特徴とする請求項１００記載の方法。
  104. 前記疾患が、細菌感染および肉芽腫性疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項１０３記載の方法。
  105. 前記IL-8が、IL-8で被われた物質表面上で被験者に提供されることを特徴とする請求項１０３記載の方法。
  106. 前記物質の表面が被験者の体内に埋め込まれることを特徴とする請求項１０５記載の方法。
  107. 前記IL-8が、制御放出形式で被験者に提供されることを特徴とする請求項１０３記載の方法。
  108. 好中球のfugetaxisを促進する方法であって、好中球を、fugetaxisの促進に有効な量のIL-8と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  109. 前記好中球を高濃度のIL-8と接触させることを特徴とする請求項１０８記載の方法。
  110. 前記IL-8の濃度が、約1μg/mlから約10μg /mlまでの間であることを特徴とする請求項１０９記載の方法。
  111. 前記接触が、好中球のfugetaxisがないことにより特徴付けられる疾患を有する被験者の体内で起こることを特徴とする請求項１０８記載の方法。
  112. 前記疾患が、炎症性または免疫性の間接疾患、移植された臓器または組織の拒絶、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患および喘息からなる群より選択されることを特徴とする請求項１１１記載の方法。
  113. 前記IL-8が、IL-8で被われた物質表面上で被験者に提供されることを特徴とする請求項１０８記載の方法。
  114. 前記物質表面が被験者の体内に埋め込まれることを特徴とする請求項１１３記載の方法。
  115. 前記IL-8が、制御放出形式で被験者に提供されることを特徴とする請求項１０３記載の方法。
  116. IL-8により誘発された好中球の走化性を抑制する方法であって、好中球を、走化性の抑制に有効な量のワートマニンと接触させ、必要に応じて好中球によりfugetaxisを誘発する工程を含むことを特徴とする方法。
  117. IL-8により誘発された好中球の走化性を抑制する方法であって、好中球を、fugetaxisの抑制に有効な量のLY294002と接触させ、必要に応じて好中球により走化性を誘発する工程を含むことを特徴とする方法。
  118. 前記ケモカイン濃度勾配がSDF-1濃度勾配であることを特徴とする請求項４または３０記載の方法。
  119. 前記ケモカイン濃度勾配がIL-8濃度勾配であることを特徴とする請求項４または３０記載の方法。
  120. 前記サイトカイン濃度勾配がSDF-1濃度勾配であることを特徴とする請求項６または３２記載の方法。
  121. 前記サイトカイン濃度勾配がIL-8濃度勾配であることを特徴とする請求項６または３２記載の方法。
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