JP2006505256A - ドセタキセルの化学感受性および化学耐性を予測するための異なる遺伝子発現パターン - Google Patents

Abstract

本発明は、ドセタキセル応答性の異なる遺伝子発現プロフィールに関する。本発明により、ドセタキセル応答または応答の欠如を予測すると考えられる原発性乳癌の分子プロフィールが同定される。本発明は、ドセタキセル応答性の予測方法およびドセタキセル応答性の決定に使用するためのアレイを提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、2002年5月17日提出の米国特許仮出願題60／381，141号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。

（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明を、米国陸軍助成金番号BC000506からの資金を使用して開発した。従って、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

本発明の分野は、乳癌細胞の遺伝子発現プロフィールに関する。本発明の分野はまた、乳癌細胞におけるドセタキセルの感受性または耐性に関する。

乳癌手術後の最良の全身治療（アジュバント治療）は、乳癌の女性の死亡率を減少させる最も重要な要因である。アジュバント化学療法およびホルモン療法は共に乳癌患者の死亡リスクを減少させる。しかし、エストロゲン受容体の状態はホルモン療法に応答して予測され、化学療法の応答についての臨床的に有用な予測マーカーは存在しない。従って、新規の薬物耐性により多数の乳癌患者で治療が失敗する場合でさえも、全ての該当する女性が同一の様式で治療される。タキサン（ドセタキセル（Taxotere（商標））およびパクリタキセル（Taxol（商標）））は、アントラサイクリンのようなより古い薬物よりも有効な新規の抗微小管薬クラスであるが、タキサンおよびアントラサイクリンとの組み合わせによる臨床試験では、患者の小集団しかタキサン添加から恩恵を受けないことが示される。現在、タキサンに応答する可能性が高い患者とそうでない患者とを区別するために利用可能な方法は存在せず、かつ予測される平均的利益が低い場合でさえもほとんどの患者にアジュバント治療を処方することが受け入れられていると仮定すると、アジュバントタキサン療法から恩恵を受ける可能性が最も高い適切な患者を推測的に選択することにより今日の乳癌治療の臨床管理は大きく進展する。アジュバント使用状況にける治療効率の予測因子（predictor）の研究における主な障害は、生存についての代替マーカーの欠如であり、従って、多数の長期追跡患者がこれらの研究を実施する必要がある。

ヒト乳癌における遺伝子発現アレイの有用性に関する刊行物は僅かしかない。プリントしたオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して、van't Veerらは、標準的な臨床基準および組織学的基準と比較した場合、リンパ節陰性乳癌の78人の若年女性の小集団の結果がより正確に予測される遺伝子発現プロフィールを見出した。同一の著者は、その後、295人の患者のコホートにおいてこの70種の遺伝子分類子（classifier）（その多数が最初の研究で見出されなかった）を立証した。不十分な予後特徴には、遺伝子調節細胞周期、侵入、転移、および血管形成が含まれていた。cDNAアレイを使用して、Perouらは、「基底」または「管腔」型と呼ばれる異なる遺伝子発現パターンを同定した。これらの群は、臨床結果に関して互いに異なっていた。本発明の目的は、患者の予後を扱う以前の研究と対照的に、原発性乳癌患者の特定の化学療法への応答または応答の欠如を予測する遺伝子発現パターンを提供することである。

米国特許第6，107，034号は、GATA−3発現のドセタキセルおよび他のタキサンに応答するエストロゲン受容体陽性腫瘍との関連を記載する。

ドセタキセルの感受性および耐性に関連するこれらの遺伝子発現パターンは、非常に複雑である。過去において、化学療法に対する感受性および耐性を評価するために1つの遺伝子生体マーカーを使用する研究は、ほとんど決定的ではない。たとえば、最近の乳癌研究では、一般的に想定される測定および予後マーカー（HER−2、p53、p27、または上皮成長因子受容体）では、これらの選択された生体マーカーとタキサン感受性との間のいかなる相関関係も見出すことができなかった。異なる癌型における公開されている文献により、β−チューブリンイソ型の発現レベルの相違はタキサン耐性の重要かつ複雑な機構を示すことができることが示唆されている。いくつかのβ−チューブリンイソ型の過剰発現は、全てではないがいくつかの腫瘍のドセタキセル耐性に関連する。これらの結果は、感受性および耐性についての遺伝子発現パターンが複数の遺伝子経路に関与し、これらの経路における多数の遺伝子の統合により薬物に対する感受性および耐性が得られることを示す。これにより、いくつかの各遺伝子発現の評価が臨床的乳癌挙動の不均一性の解決に十分に強力でなく、多数の遺伝子の発現パターンによって感受性腫瘍と耐性腫瘍とをより首尾よく区別することができるという考えが支持される。

本発明では、タキサンに対する応答を予測する原発性乳癌標本の遺伝子発現パターンを同定した。ネオアジュバント化学療法（一次手術前の処置）により、遺伝子発現分析用の原発性腫瘍をサンプリングし、最初の数ヶ月の治療時の腫瘍サイズの変化によって化学療法に対する応答を直接評価することができる。ネオアジュバント化学療法に対するこの臨床的腫瘍応答は、有効な生存代替マーカーであることが示されており、穏やかな応答または化学的に明白な化学療法耐性疾患を罹患した患者と比較してネオアジュバント化学療法後に有意に腫瘍が進行した患者で良好な結果が得られる。遺伝子発現の高処理定量の出現により、現在、治療に対する優れた臨床応答と相関し、それによりこれを予測することができる、異なる乳癌の発現パターンを同時に同定するために何千もの遺伝子を評価することが可能である。これらのプロフィールは、この疾患の遺伝的不均一性が理解される可能性が非常に高く、各患者の成功可能性に基づいて異なる治療ストラテジーが優先される。従って、ネオアジュバント化学療法により、化学療法応答の予測マーカーを迅速に発見するための理想的なプラットフォームが得られる。現在の研究では、ネオアジュバントドセタキセルを投与する前に患者の遺伝子発現プロファイリングについて原発性乳癌の針生検を分析した。本発明は、1）遺伝子発現を評価するためにこれらの針生検から十分なRNAが得られること、2）ドセタキセル化学療法に対して感受性または耐性を示す原発性乳癌を区別するために使用する遺伝子群が存在すること、および3）一定の遺伝子経路がドセタキセル耐性機構に重要であることことを証明する。

本発明の実施形態は、患者から腫瘍サンプルを得る工程と、
前記サンプルからRNAを単離する工程と、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも10個の核酸のRNA中の各核酸の相対発現を決定する工程と、
前記各核酸の相対発現をクラスタリングアルゴリズムに供することとを含み、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル耐性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル耐性を示し、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル感受性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル感受性を示す、ドセタキセル治療に応答する患者のスクリーニング方法である。他の実施形態では、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される50個の核酸の発現レベルを決定する。特定の実施形態では、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91の発現レベルを決定する。

特定の実施形態では、配列番号1、配列番号3、配列番号12、配列番号18、配列番号37、配列番号38、配列番号43、配列番号53、配列番号63、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号78、および配列番号87からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル耐性に関連する。さらに特定の実施形態では、過剰発現は少なくとも2．5倍である。

別の特定の実施形態では、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍組織サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル感受性に関連する。

さらに別の特定の実施形態では、前記RNA中の各核酸の相対発現の決定が、固体表面に結合した複数のプローブを得る工程と、前記複数のプローブの少なくとも10個、50個、または91個が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる核酸群から選択される配列と相補的であることと、
前記プローブを前記腫瘍組織サンプルから得たRNAと接触させる工程と、
前記プローブへの前記RNAの結合を検出し、それにより前記核酸の相対発現の相違を同定する工程とを含む。特定の実施形態では、固体表面がガラスまたはニトロセルロースであり、結合の検出は蛍光標識または放射性標識を検出する工程を含む。特定の実施形態では、腫瘍組織サンプルは原発性乳癌である。本発明の別の実施形態では、腫瘍組織サンプルは針生検であり、針生検はパラフィン包埋されている。

本発明の実施形態は、ドセタキセル治療中の種々の時点で患者から腫瘍組織サンプルを得る工程と、
前記サンプルからRNAを単離する工程と、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも50個の核酸の前記サンプル中のRNA中の各核酸の相対発現を決定する工程と、
前記サンプルの各核酸の相対発現をクラスタリングアルゴリズムに供することとを含み、前記クリスタリングアルゴリズムが公知のドセタキセル耐性腫瘍サンプルおよび公知ののドセタキセル感受性腫瘍サンプルの遺伝子発現プロフィール分析に由来し、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル耐性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル耐性を示し、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル感受性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル感受性を示す、ドセタキセル治療を受けた癌患者のモニタリング方法である。特定の実施形態では、任意の各サンプルがデセタキセル耐性に関連する遺伝子発現プロフィールを示す場合、ドセタキセル治療が妨害される。

本発明の実施形態は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも50個の核酸の固体表面に結合した相補的核酸プローブを含むドセタキセル耐性についての患者のスクリーニングアレイである。

上記は、以下の発明の詳細な説明によってより深く理解することができるように、本発明の特徴および技術の利点を比較的広範に概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点を以下に記載する。本発明の同一の目的の実施のための他の構造の修正またはデザインの基礎として、開示の概念および特定の実施形態を容易に利用することができることが当業者に認識されるべきである。このような等価の構築物が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲を逸脱しないことも当業者に認識されるべきである。さらなる目的および利点と共にその機構および操作方法の両方に関する本発明に特有であると考えられる新規の特徴が、添付の図面と併せて考慮した場合に以下の説明からより深く理解される。しかし、各図面は例示および説明の目的で提供されており、本発明を制限する定義として意図されないことが明確に理解される。

特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開書類の副本は、請求および必要な料金の支払い時に特許庁から得られる。本発明のより完全な理解のために、添付の図面と併せて記載の説明の後に引例を示す。

〔I．定義〕
本明細書中で使用される、「a」または「an」は、1つまたは複数を意味し得る。用語「comprising」と共に使用される場合、特許請求の範囲で使用される、用語「a」または「an」は、1つまたは1つを超える複数を意味し得る。本明細書中で使用される、「another」は、少なくとも2つまたはそれ以上を意味し得る。

本明細書中で使用される、用語「アジュバント」は、疾患または病態の一次治療に対するさらなる治療として患者に提供する薬物をいう。

「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリッド形成をいい、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためのハイブリッド形成培地のストリンジェンシーの減少によって適合することができる小さなミスマッチを含む。

用語「バックグラウンド」または「バックグラウンドシグナル強度」は、標識された標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイ成分（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ、調節プローブ、アレイ基質など）との非特異的結合または他の相互作用に起因するハイブリッド形成シグナルをいう。バックグラウンドシグナルを、アレイ成分自体の固有の蛍光によって産生することもできる。アレイ全体について1つのバックグラウンドシグナルを計算するか、各標的核酸の異なるバックグラウンドシグナルを計算することができる。好ましい実施形態では、アレイ中の最も低い5％〜10％のプローブについての平均ハイブリッド形成シグナル強度としてバックグラウンドを計算するか、各遺伝子の最も低い5％〜10％のプローブについて各標的の異なるバックグラウンドシグナルを計算する。もちろん、当業者は、プローブが特定の遺伝子と十分にハイブリッド形成し、それにより標的配列に特異的に結合するようである場合、これらをバックグラウンドシグナル計算で使用すべきでないことを認識する。あるいは、サンプル中に見出される任意の配列に相補的ではないプローブ（たとえば、サンプルが哺乳動物核酸の場合、逆の方向の核酸または細菌遺伝子などのサンプル中に見出されない遺伝子に指向するプローブ）へのハイブリッド形成によって得られた平均ハイブリッド形成シグナル強度としてバックグラウンドを計算することができる。いかなるプローブも欠くアレイ領域によって得られる平均シグナル強度としてバックグラウンドを計算することもできる。分析に依存して、当業者は、どのバックグラウンドシグナル計算を使用するかを理解している。

本明細書中で使用される、表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」を交換可能に使用し、全てのこのような表示には子孫が含まれる。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、導入数と無関係の初代対象細胞およびこれに由来する培養物が含まれる。意図的または故意の変異によって全子孫はDNA内容物中で正確に同一でなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞のスクリーニングされたものと同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。明確な表示が意図される場合、文脈から外される。

本明細書中で使用される、用語乳癌の「針生検」は、針生検手段から得た乳房組織の小さな円柱状のサンプルまたは手順自体のいずれかをいう。鎮静する必要がない局所麻酔下で乳房の針生検を行う。針生検ニードルを、乳房の正確な領域に向け、特別にデザインされた装置およびニードルを使用して、罹患領域からいくつかの乳房組織の小さなコアを得る。超音波または定位固定X線ガイダンスのいずれかを使用して正確な乳房組織に針生検ニードルを誘導する。一般に、各細胞のみよりもむしろ乳房組織片が得られるように針生検をデザインする。

本明細書中で使用される、用語「発現プロフィール」または「遺伝子発現プロフィール」は、任意の特定の転写物の相対発現または相対存在量を示すための複数のmRNAの測定を含む。任意の所与のサンプル中の任意の所与の時点でサンプリングされた全mRNA転写物の発現レベルの編集は、遺伝子発現プロフィールを含む。真核細胞内で、相互接続した何百から何千ものシグナル経路が存在する。この理由のために、細胞内のタンパク質のレベルまたは活性の変化は、一次、二次、および時々三次経路に関与する他のタンパク質および他の遺伝子の転写に多くの影響を与える。種々のタンパク質機能の間のこの広範な相互接続は、任意の1つのタンパク質の変化によって多数の他のタンパク質の代償的変化を起こす可能性が高いことを意味する。特に、薬物への曝露または遺伝子コピー数を調整する病態（たとえば、遺伝子変異）などによる細胞内の1つのタンパク質の部分的破壊でさえも十分な他の遺伝子転写の代償的変化が起こり、転写物のこれらの変化を使用して、機能破壊に関する特定の転写の変化の「特徴的発現プロフィール」を定義することができる。たとえば、ドセタキセル耐性を示す腫瘍サンプルは、ドセタキセル感受性腫瘍サンプルの特徴的な遺伝子発現プロフィールと区別することができる特徴的な遺伝子発現プロフィールを有する。

用語「特異的なハイブリッド形成」は、配列が複雑な混合物（たとえば、全細胞DNAまたはRNA）中に存在する場合にストリンジェントな条件下での分子の特定のヌクレオチド配列のみのとの分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成をいう。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的サブシーケンスとハイブリッド形成するが、他の配列とはハイブリッド形成しない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境によって異なる。当業者は、このような条件の選択方法を理解している。温度が高いほどより長い配列が特異的にハイブリッド形成する。一般に、定義したイオン強度およびpHで特定の配列の融点（Tm）より約5℃低いストリンジェントな条件を選択する。Tmは、（定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの50％が標的配列と釣り合ってハイブリッド形成する温度である。（一般に、標的配列は過剰に存在するので、Tmで50％のプローブが釣り合って占める）。典型的には、短いプローブ（たとえば、10〜50個のヌクレオチド）についてのストリンジェントな条件は、pH7．0〜8．3での塩濃度が少なくとも約0．01〜1．0M Naイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が少なくとも約30℃である条件である。ホルムアミドなどの不安定剤を添加してストリンジェントな条件を達成することもできる。

用語「ミスマッチコントロール」は、特定の標的配列に完全に相補的ではないように意図的に選択された配列を有するプローブをいう。ミスマッチコントロールは、典型的には、同一の特定の標的配列に完全に相補的な対応する試験プローブを有する。ミスマッチは、1つまたは複数の塩基を含み得る。ミスマッチをミスマッチプローブのどの場所にも位置付けることができるが、末端ミスマッチは標的配列のハイブリッド形成を防止する可能性が高くないので、末端ミスマッチはあまり望ましくない。特に好ましい実施形態では、試験ハイブリッド形成条件下でミスマッチが標的配列を含む二重鎖を不安定化する可能性が最も高いように、ミスマッチをプローブの中央または中央付近に位置付ける。

用語「mRNA」は、遺伝子の転写物をいう。転写物はRNAであり、たとえば、翻訳する用意のできた成熟伝令RNA、転写物の種々のプロセシング段階の産物が含まれる。転写物のプロセシングには、スプライシングおよび分解が含まれ得る。

用語「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、他で制限しない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能することができる天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。

「オリゴヌクレオチド」は、2塩基長から500塩基長までの範囲の一本鎖核酸である。

用語「過剰発現」は、あるサンプルが別のサンプルと比較して特定の遺伝子の相対発現が高いことを意味する。過剰発現のパラメーターは、必要に応じて特定のアルゴリズムのために変化させることができる。たとえば、遺伝子は、その発現がコントロールサンプルよりも少なくとも1．2倍、1．5倍、2倍、または3倍でない限り、過剰発現されたと見なすことができないことが意図される。

本明細書中で使用される、用語「ポリペプチド」を、用語「タンパク質」と交換可能に使用し、1つを超えるアミノ酸サブユニットを含む分子と定義する。ポリペプチドはタンパク質全体であり得るか、ペプチドまたはオリゴペプチドなどのタンパク質のフラグメントであり得る。ポリペプチドはまた、メチル化またはアセチル化などのアミノ酸サブユニットの代替物を含み得る。

本明細書中で使用される、「プローブ」を、1つまたは複数の化学結合型を介して、通常、相補塩基対合、通常、水素結合形成を介して相補配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドと定義する。本明細書中で使用される、「オリゴヌクレオチドプローブ」には、天然の塩基（すなわち、A、G、C、またはT）または修飾塩基（7−デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれ得る。さらに、当業者は、ハイブリッド形成を妨害しない限り、リン酸結合以外の結合によってオリゴヌクレオチドプローブ中の塩基を連結することができることを認識する。従って、オリゴヌクレオチドプローブは、成分塩基がリン酸ジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって連結するペプチド核酸であり得る。

用語「定量」は、遺伝子の転写レベルの定量の文脈で使用する場合、絶対的または相対的な定量をいうことができる。公知の濃度の1つまたは複数の標的核酸（たとえば、BioBなどのコントロール核酸または既知の量の標的核酸自体を使用する）を含めることおよび公知の標的核酸を使用した未知の核酸のハイブリッド形成強度の参照（たとえば、検量線の作成による）によって絶対的定量を行うことができる。あるいは、ハイブリッド形成強度および含蓄的に転写レベルの変化を定量するための2つまたはそれ以上の遺伝子または2つまたはそれ以上の処理の間のハイブリッド形成シグナルの比較によって相対的定量を行うことができる。

本明細書中で使用される、遺伝子に関連する用語「相対遺伝子発現」または「相対発現」は、異なる細胞型または組織型の同一の遺伝子発現産物（通常、mRNA）の相対存在量をいう。好ましい実施形態では、腫瘍サンプル中の遺伝子発現を、異なる時点で採取した同一の患者由来の腫瘍サンプルと比較するか、異なる患者由来の腫瘍サンプルと比較する。別の好ましい実施形態では、腫瘍サンプルは原発性乳癌であり、相対遺伝子発現を使用してドセタキセル感受性または耐性を決定する。

本明細書中で使用される、用語「サンプル」は、少なくとも1つの細胞を含む患者のサンプルを示す。組織または細胞サンプルを、ほとんどの任意の身体部分から取り出すことができる。ほとんどの適切なサンプル獲得方法は、疑われるか診断された癌の型に依存する。生検法には、針生検、内視鏡生検、および切除生検が含まれる。

「サブシーケンス」は、核酸のより長い配列の一部を含む核酸配列をいう。

用語「標的核酸」は、特異的にハイブリッド結合するようにオリゴヌクレオチドプローブをデザインした核酸（しばしば生体サンプル由来）をいう。検出される標的核酸の有無または定量される標的核酸の量のいずれかである。標的核酸は、標的に指向する対応プローブの核酸配列に相補的な配列を有する。用語「標的核酸」は、プローブが指向するより長い核酸の特定のサブシーケンスまたは検出されることが望ましい発現レベルの配列全体（たとえば、遺伝子またはmRNA）をいうことができる。使用法の相違は文脈から明らかである。

〔II．本発明〕
1つの好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、病態でその発現が変化する核酸の発現（転写）レベルをモニターする。たとえば、特定のマーカーの過剰発現によって乳癌を特徴付けることができる。別の好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、ドセタキセル耐性または感受性などの一定の臨床環境に関連する種々の遺伝子の発現をモニターする。終点の説明が複雑である場合（1つの特定の遺伝子が過剰発現または過少発現したと単純に説明されない場合）、これは特に薬物研究で有用である。したがって、病態または薬物の作用様式が十分に特徴付けられない場合、本発明の方法により特に関連する遺伝子を迅速に決定することが可能である。

本発明は、ドセタキセル感受性または耐性に関連する遺伝子発現パターンを同定および確認する。各腫瘍の遺伝子発現パターンを評価するために、ヒト乳癌由来の小針生検から十分なRNAを得た。本発明は、化学療法に対する応答または応答の欠如を正確に予測するためにヒト原発性乳癌の遺伝子発現パターンを使用して分子プロフィールを同定する。結果は、本明細書中に記載の分子プロフィールにより原発性乳癌患者のドセタキセル応答を正確に予測することができることを示す。

本発明は、容易に測定することができる遺伝子に注目し、かつ任意のサンプルで発現する見込みのない遺伝子を排除することであった。この研究は、ドセタキセル応答／耐性の特定の遺伝子を発見するようにデザインされているのではなく、むしろ乳癌患者の臨床予測試験として多数の遺伝子の発現パターンを使用する複数の遺伝子を検出するためにデザインされた。結果として、AURORA−Aのようないくつかの生物学的に興味深い遺伝子は過剰発現の低さにより排除される。

乳癌は非常に不均一であるが、分別遺伝子リストによりいくつかの腫瘍における感受性および耐性機構についてのいくつかの手がかりが得られる。一般に、耐性腫瘍は、タンパク質翻訳、細胞周期、およびRNA転写機能に関連する遺伝子を過剰発現し、感受性腫瘍は、ストレス／アポトーシス、細胞骨格／接着、タンパク質輸送、シグナル伝達、およびRNAスプライシング／輸送に関与する遺伝子を過剰発現した。タキサン作用のアポトーシス誘導様式と一致して、感受性腫瘍は、アポトーシス関連タンパク質（たとえば、BAX、UBE2M、UBCH10、CUL1）のRNA発現がより高かった。デセタキセル感受性腫瘍におけるDNA損傷関連遺伝子発現（たとえば、CSNK2B、DDB1、ABLの過剰発現およびPRKDCの過少発現）はまた、ドセタキセル感受性に寄与するようである。

さらに、感受性腫瘍では、ストレス関連経路に関与する遺伝子の過剰発現も見出された（特に、熱ショックタンパク質（HSP））。熱ショックタンパク質27（HSP27）の過剰発現は、MDA−MB−231乳癌細胞株におけるアドリアマイシン耐性に関連することが示されている。対照的に、同一の著者は、HSP27過剰発現細胞株はドセタキセルに対して感受性を維持したままであることを証明し、異なる非交差耐性因子が感受性と耐性とで異なる遺伝子パターンを有し得ることが示唆される。したがって、これらの共通に使用される薬物に優先順位をつけるためのツールとして特定の遺伝子発現パターンを利用することができる。

一点除外交差検証手順では、名義値p≦0．001で選択された遺伝子に基づいた分類子によって約90％の癌を感受性または耐性として腫瘍を正確に分類した。さらに、この分類の予測値は、エストロゲン受容体（ER）（事実上、乳癌で唯一確証された予測因子）を非常に優先的に比較する。ERは、約60％のホルモン療法に対する応答についての陽性的中率および約90％の陰性的中率を有する。約70％の乳癌がER＋である場合、ホルモン応答および非応答腫瘍の感受性および特異性はそれぞれ約93％および50％であり、ERのROC曲線下面積は約0．72でしかない。ドセタキセル分類子は、陽性的中率および陰性的中率がそれぞれ92％および83％であり、ROC曲線下面積は0．96であることが見出された（図3）。これは、遺伝子発現ベースの分類子は他の臨床的に認証された予測マーカーと優先的に比較することを示す。

本発明は、発現アレイテクノロジーがドセタキセル化学療法に対する応答または耐性によって腫瘍を有効かつ再現可能に分類することができることを証明する。

〔III．遺伝子発現分析〕
一般に、当業者が利用可能な任意の方法で遺伝子発現データを収集することができる。本明細書中に提供した多数の方法が高並列データ収集システムによって得られたデータの強力な分析ツールであるにもかかわらず、より伝統的な方法によって収集したデータの分析に多数のこのような方法が等しく有用である。一般に、いくつか、さらに何千またはそれ以上の異なる転写物とハイブリッド形成するプローブアレイの使用によって遺伝子発現データを得る。このようなアレイを、しばしばマイクロアレイまたはマクロアレイと分類し、この分類はアレイ上の各位置のサイズに依存する。

1つの実施形態では、本発明はまた、核酸プローブを組織化されたアレイ中の固体または半固体支持体上または支持体中に固定する方法を提供する。オリゴヌクレオチドを種々のプロセス（リソグラフィーが含まれる）によって支持体に結合させることができ、支持体が固体の場合、このようなアレイを当該分野で「チップ」というのが当該分野で一般的であるが、この専門用語は、支持体がシリコンであるか任意の有用な導電性を有することを示すことを意図しない。

本発明の1つの実施形態は、（1）1つまたは複数の標的遺伝子のRNA転写物を含む標的核酸またはRNA転写物由来の核酸のプールを得ることと、（2）核酸サンプルをプローブアレイ（コントロールプローブが含まれる）とハイブリッド形成させること、および（3）ハイブリッド形成した核酸を検出し、相対発現（転写）レベルを計算することによる遺伝子発現のモニタリングを含む。

A．核酸サンプルの獲得
当業者は、遺伝子の転写レベル（それによる発現レベル）を測定するために、遺伝子のmRNA転写物を含む核酸サンプルまたはmRNA転写物由来の核酸を得ることが望ましいことを認識する。本明細書中で使用される、「mRNA転写物由来の核酸」は、合成のためにmRNA転写物またはそのサブシーケンスが最終的にテンプレートとして役立つ核酸をいう。したがって、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅DNAから転写されたRNAなどは全てmRNAに由来し、このような誘導産物の検出はサンプル中の元の転写物の存在および／または存在量の指標である。従って、適切なサンプルには、遺伝子のmRNA転写物、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたcRNA、遺伝子から増幅されたDNA、および増幅DNAから転写されたRNAなどが含まれるが、これらに限定されない。

特に好ましい実施形態では、サンプル中の1つまたは複数の遺伝子の転写レベル（およびそれによる発現）を定量することが望ましい場合、核酸サンプルは、遺伝子のmRNA転写物の濃度またはmRNA転写物由来の核酸の濃度はその遺伝子の転写レベル（およびそれによる発現レベル）に比例するものである。同様に、ハイブリッド形成シグナル強度はハイブリッド形成された核酸量に比例することが好ましい。比例が比較的厳密であることが好ましく（たとえば、転写率の倍増によりサンプル核酸プール中のmRNA転写物が倍増し、ハイブリッド形成シグナルが倍増する）、当業者は、比例はより緩和しさらに非線形であり得ることを認識する。従って、たとえば、5倍異なる標的mRNA濃度によりハイブリッド形成強度が3〜6倍異なるアッセイはほとんどの目的で十分である。より正確な定量が必要な場合、本明細書中に記載のように、サンプル調製およびハイブリッド形成で導入されたばらつきを修正するための適切なコントロールを実施することができる。さらに、当業者に周知の方法に従って、「標準的な」標的mRNAの連続希釈物を使用して検量線を作成することができる。もちろん、転写物の有無の簡単な検出を所望する場合、複雑なコントロールまたは補正は必要ない。

最も簡単な実施形態では、このような核酸サンプルは、生体サンプルから単離した全mRNAである。本明細書中で使用される、用語「生体サンプル」は、生物または生物の成分（たとえば、細胞）から得たサンプルをいう。サンプルは、任意の生体組織または流動物であり得る。しばしば、サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」である。このようなサンプルには、唾液、血液、血球（たとえば、白血球）、組織または細いニードルによる生検サンプル、尿、腹水および胸膜液またはその細胞が含まれるが、これらに限定されない。生体サンプルはまた、組織学的目的のために採取した凍結切片などの組織切片を含み得る。

当業者に周知の任意の多数の方法に従って、核酸（ゲノムDNAまたはmRNAのいずれか）をサンプルから単離することができる。当業者は、遺伝子コピー数の変化検出すべきである場合、ゲノムDNAを単離することが好ましいことを認識する。逆に、遺伝子の発現レベルを検出すべきである場合、RNA（mRNA）を単離することが好ましい。

全mRNAの単離方法は、当業者に周知である。たとえば、核酸の単離および精製方法は、Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology： Hybridization With Nucleic Acid Probes，PartI．Theory and Nucleic Acid Preparation，P．Tijssen，ed．Elsevier，N．Y．（1993）、およびChapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology： Hybridization with Nucleic Acid Probes，PartI．Theory and Nucleic Acid Preparation，P．Tijssen，ed．Elsevier，N．Y．（1993））に詳述されている。

好ましい実施形態では、たとえば、酸性グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して全核酸を所与のサンプルから単離し、オリゴdTカラムクロマトグラフィまたは（dT）n磁性ビーズの使用によってポリA mRNAを単離する（たとえば、Sambrookら，Molecular Cloning： A Laboratory Manual （2nd ed．），Vols．1−3，Cold Spring Harbor Laboratory，（1989）またはCurrent Protocols in Molecular Biology，F．Ausubelら，ed．Greene Publishing and Wiley−Interscience，New York （1987）を参照のこと）。

しばしば、ハイブリッド形成前に核酸サンプルを増幅することが望ましい。当業者は、どのような増幅方法を使用しても、定量的結果を必要とする場合、増幅核酸の相対頻度を維持または制御する方法を使用するように注意しなければならないことを認識している。

「定量的」増幅方法は当業者に周知である。たとえば、定量的PCRは、同一のプライマーを使用した既知の量のコントロール配列の同時増幅を含む。これにより、PCR反応の補正に使用することができる内部標準が得られる。次いで、アレイは、増幅核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含み得る。

1つの好ましい内部標準は、合成AW106cRNAである。当業者に公知の標準的な技術に従って、AW106cRNAをサンプルから単離したRNAと組み合わせる。次いで、逆転写酵素を使用してRNAを逆転写してコピーDNAを得る。次いで、標識プライマーを使用して、cDNA配列を増幅する（たとえば、PCRによる）。典型的には電気泳動によって増幅産物を分離し、放射能の量（増幅産物量に比例する）を決定する。次いで、公知のAW106RNA標準によって産生されたシグナルとの比較によってサンプル中のmRNA量を計算する。定量的PCRの詳細なプロトコールは、PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Innisら，Academic Press，Inc．N．Y．，（1990）に記載されている。

他の適切な増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Innis，ら，PCR Protocols．A guide to Methods and Application．Academic Press，Inc．San Diego，（1990））リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace，Genomics，4：560（1989），Landegrenら，Science，241：1077（1988）およびBarringerら，Gene，89：117（1990）を参照のこと）、転写増幅（Kwohら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86：1173（1989））、および自律配列複製（Guatelliら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，87：1874（1990））が含まれるが、これらに限定されない。

特に好ましい実施形態では、サンプルmRNAを逆転写酵素ならびにオリゴdTおよびT7ファージプロモーターをコードする配列からなるプライマーで逆転写して、1つの標準的なDNAテンプレートを得る。DNAポリメラーゼを使用して第2のDNA鎖を重合する。二本鎖cDNAの合成後、T7 RNAポリメラーゼを添加し、cDNAテンプレートからRNAを転写する。各1つのcDNAテンプレートからの連続ラウンドの転写により、増幅RNAが得られる。in vitro重合方法は当業者に公知であり（たとえば、Sambrook、前出を参照のこと）、この特定の方法は、本方法によるin vitro増幅により種々のRNA転写物の相対頻度が保存されることを証明したVan Gelderら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87： 1663−1667 （1990）に詳述されている。さらに、Eberwineら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89：3010−3014は、元の出発材料の10⁶倍を超える増幅を達成し、それにより生体サンプルが制限されている場合でさえも発現をモニターすることが可能なin vitro転写を介した2ラウンドの増幅を使用するプロトコールを提供する。

上記の直接転写法によりアンチセンス（aRNA）プールが得られることが当業者に認識される。アンチセンスRNAを標的核酸として使用する場合、アンチセンス核酸のサブシーケンスに相補的なようにアレイ中で得られたオリゴヌクレオチドプローブを選択する。逆に、標的核酸プールがセンス核酸プールである場合、センス核酸のサブシーケンスに相補的なようにオリゴヌクレオチドプローブを選択する。最後に、核酸プールが二本鎖である場合、標的核酸はセンス鎖およびアンチセンス鎖を両方を含むので、プローブはいずれかの方向であり得る。

上記で引用したプロトコールには、センスまたはアンチセンス核酸プールの作製方法が含まれる。実際、1つのアプローチを使用して、所望のセンスまたはアンチセンス核酸を作製することができる。たとえば、T3およびT7プロモーターに隣接するように、cDNAをベクター（たとえば、Stratageneのp Bluescript II KS（＋）ファージミド）に一方向でクローン化することができる。T3ポリメラーゼを使用したin vitro転写によりある方向のRNAが産生され（インサートの方向に依存する方向）、T7ポリメラーゼを使用したin vitro転写により反対の方向を有するRNAが産生される。他の適切なクローニングシステムには、Cre−loxPプラスミドサブクローニングのためにデザインされたラムダファージベクターが含まれる（たとえば、Palazzoloら，Gene，88：25−36（1990）を参照のこと）。

特に好ましい実施形態では、高活性RNAポリメラーゼ（たとえば、T7について約2500単位／μL（Epicentre Tecdhnologiesから市販されている））を使用する。

B．核酸の標識
好ましい実施形態では、サンプル核酸に結合する1つまたは複数の標識の検出によってハイブリッド形成核酸を検出する。当業者に周知の任意の多数の手段によって、標識を組み込むことができる。しかし、好ましい実施形態では、サンプル核酸調製における増幅工程時に標識を同時に組み込む。したがって、たとえば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、標識増幅産物が得られる。好ましい実施形態では、標識ヌクレオチド（たとえば、フルオレセイン標識UTPおよび／またはCTP）を使用した上記の転写増幅により、転写された核酸に標識が組み込まれる。

あるいは、元の核酸サンプル（たとえば、mRNA、ポリAmRNA、cDNAなど）または増幅後の増幅産物に標識を直接添加することができる。標識を核酸に結合する方法は当業者に周知であり、たとえば、ニック翻訳または核酸のキナーゼ処理（kinasing）およびその後の標識（たとえば、フルオロフォア）へのサンプル核酸の核酸リンカー連結のその後の結合（ライゲーション）による末端標識（たとえば、標識RNAを使用）が含まれる。

本発明での使用に適切な検出可能な標識には、分光器、光化学、生化学、免疫化学、電気、光、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明で有用な標識には、標識されたストレプトアビジン抱合体での染色のためのビオチン、磁性ビーズ（たとえば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（たとえば、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³²P）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAで一般的に使用されている他の酵素）、およびコロイド状の金ビーズ、着色ガラスもしくはプラスチックビーズ（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色分析標識が含まれる。このような標識の使用を教示した特許には、米国特許第3，817，837号；同第3，850，752号；同第3，939，350号；同第3，996，345号；同第4，277，437号；同第4，275，149号；および同第4，366，241号が含まれる。

このような標識の検出方法は当業者に周知である。したがって、たとえば、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して放射性標識を検出することができ、放射光を検出するための光検出器を使用して蛍光マーカーを検出することができる。典型的には、酵素の基質への提供および基質上の酵素作用によって得られた反応の検出によって酵素標識を検出し、着色標識の単純な視覚化によって比色分析標識を検出する。

ハイブリッド形成の前後に標識を標的（サンプル）核酸に添加することができる。いわゆる「直接標識」は、ハイブリッド形成前に標的（サンプル）核酸に直接結合しているか組み込まれている検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接標識」は、ハイブリッド形成後にハイブリッド二重鎖に連結する。しばしば、ハイブリッド形成前に標的核酸に結合していた結合部分に間接標識を結合させる。したがって、たとえば、ハイブリッド形成前に標的核酸をビオチン化することができる。ハイブリッド後、アビジン抱合フルオロフォアはハイブリッド二重鎖を保有するビオチンに結合し、容易に検出される標識が得られる。核酸標識法および標識されたハイブリッド形成核酸の検出方法の詳細な概説については、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol．24： Hybridization With Nucleic Acid Probes，P．Tijssen，ed．Elsevier，N．Y．，（1993）を参照のこと。

蛍光標識が好ましく、in vitro転写反応時に容易に添加される。好ましい実施形態では、蛍光標識されたUTPおよびCTPを、上記のin vitro転写反応で産生されたRNAに組み込む。

C．シグナル／ノイズ比を改良するためのサンプルの修飾
サンプルの複雑さを減少させ、それによりバックグラウンドシグナルを減少させて測定の感度を改良するために、高密度プローブアレイへのハイブリッド形成前に核酸サンプルを修飾することができる。1つの実施形態では、バックグラウンドmRNAの選択的分解によって複雑さを減少させる。アレイ中のプローブが特異的にハイブリッド形成する領域に特異的にハイブリッド形成するDNAオリゴヌクレオチドプールへのサンプルmRNA（たとえば、ポリA RNA）のハイブリッド形成によってこれを行う。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプールは、アレイ上に見出される同一のプローブオリゴヌクレオチドからなる。

オリゴヌクレオチドプールはサンプルmRNAとハイブリッド形成して、多数の二本鎖（ハイブリッド二重鎖）核酸を形成する。次いで、ハイブリッド形成サンプルを、RNアーゼA（一本鎖RNAを特異的に消化するヌクレアーゼ）で処理する。次いで、プロテアーゼおよび／または市販のRNアーゼインヒビターを使用してRNアーゼAを阻害し、二本鎖核酸を消化された一本鎖RNAから分離する。当業者に周知の多数の方法（電気泳動および勾配遠心分離が含まれるが、これらに限定されない）においてこの分離を行うことができる。しかし、好ましい実施形態では、ビーズに結合したDNAオリゴヌクレオチドプールが得られ、それにより核酸アフィニティカラムが形成される。RNアーゼAでの消化後、ハイブリッド形成DNAをハイブリッド二重鎖の変性（たとえば、熱または塩濃度の増加による）および溶離緩衝液での予めハイブリッド形成されたmRNAの洗浄によって簡単に除去する。

次いで、アレイ中のプローブとハイブリッド形成する未消化のmRNAフラグメントを、RNAリガーゼを使用してRNAリンカーに結合したフルオロフォアで末端標識することが好ましい。この手順により、アレイ中のプローブに対応しない核酸が消失し、それによりバックグラウンドシグナルに寄与するように利用可能でない標識サンプルRNAプールが産生される。

別のサンプルの複雑さの減少方法は、アレイプローブが指向する領域のいずれかの端に面する領域とハイブリッド形成するデオキシオリゴヌクレオチドとのmRNAのハイブリッド形成を含む。RNアーゼHでの処理により、二本鎖（ハイブリッド二重鎖）が選択的に消化され、デオキシオリゴヌクレオチドプローブによって前に結合し、かつアレイプローブの標的に対応する短い領域（たとえば、20量体）に対応する一本鎖mRNAおよびアレイプローブの標的の間の領域に対応するより長いmRNA配列のプールが遊離する。次いで、短いRNAフラグメントを長いフラグメントから分離し（たとえば、電気泳動による）、必要に応じて上記のように標識し、その後、高密度プローブアレイとのハイブリッド形成のために準備する。

第3のアプローチでは、サンプルの複雑さの減少は、特定の（予め選択した）mRNAメッセージの選択的除去を含む。特に、アレイ中のプローブによって特異的に探索されない高発現mRNAメッセージを除去することが好ましい。このアプローチは、3’（ポリA）末端に近い予め選択したメッセージと特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブとポリAmRNAのハイブリッド形成を含む。特異性が高くかつ交差反応性が低くなるようにプローブを選択することができる。ハイブリッド形成したメッセージ／プローブ複合体のRNアーゼHでの処理により、二本鎖領域が効率的に消化され、残りのメッセージからポリAテールが有効に除去される。次いで、ポリA RNAを特異的に保持または増幅する方法（たとえば、オリゴdTカラムまたは（dT）n磁性ビーズ）を使用してサンプルを処理する。もはやポリA^＋テールに関連しないので、このような方法によって選択されたメッセージは保持も増幅もされない。これらの高発現メッセージをサンプルから有効に除去し、バックグラウンドの減少したmRNAを有するサンプルが得られる。

IV．ハイブリッド形成アレイのデザイン
A．プローブの組成
当業者は、多数のアレイデザインが本発明の実施に適切であることを認識する。アレイは、典型的には、検出すべき核酸発現物と特異的にハイブリッド形成する多数のプローブを含む。好ましい実施形態では、アレイは、1つまたは複数のコントロールプローブを含む。

1）試験プローブ
その最も簡単な実施形態では、アレイは、「試験プローブ」を含む。約5〜約50ヌクレオチド長、より好ましくは約10〜約40ヌクレオチド長、最も好ましくは約15〜約40ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドが存在する。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、その発現が検出されるようにデザインされた遺伝子の特定のサブシーケンスに相補的な配列を有する。従って、試験プローブは、検出される標的核酸と特異的にハイブリッド形成することができる。

目的の標的核酸に結合する試験プローブに加えて、アレイは多数のコントロールプローブを含み得る。コントロールプローブは、本明細書中で、a）標準化コントロール、b）発現レベルコントロール、およびc）ミスマッチコントロールと呼ばれるの3つのカテゴリーに分類される。

a)標準化コントロール
標準化コントロールは、核酸サンプルに添加した標識基準オリゴヌクレオチドに相補的であることが好ましいオリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリッド形成後に標準化コントロールから得たシグナルにより、種々のハイブリッド形成条件、標識強度、「リーディング」効率、および完全なハイブリッド形成シグナルがアレイ間で変化し得る他の因子についてのコントロールが得られる。好ましい実施形態では、アレイ中の全ての他のプローブから読み取れたシグナル（たとえば、蛍光強度）をコントロールプローブからのシグナル（たとえば、蛍光強度）で割り、それにより測定値が標準化される。

事実上任意のプローブは、標準化プローブとして役立ち得る。しかし、ハイブリッド形成効率は塩基組成およびプローブ長によって変化することが認識される。アレイ中に存在する他のプローブの平均長を反映するように好ましい標準化プローブを選択するが、これらは一定範囲の長さを対象とするように選択することができる。アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように標準化コントロールを選択することもできるが、好ましい実施形態では、たった1つまたは数個の標準化プローブを使用し、これらが十分にハイブリッド形成し（すなわち、二次構造を含まない）、いかなる標的特異的プローブとも適合しないように選択する。

ハイブリッド形成効率の空間的変動性を調節するために、アレイ中の任意の位置またはアレイ中の複数の位置に標準化プローブを局在化することができる。好ましい実施形態では、標準化コントロールを、アレイの角または端および中央に位置付ける。

b）発現レベルコントロール
発現レベルコントロールは、生体サンプル中の構成性に発現する遺伝子と特異的にハイブリッド形成するプローブである。細胞の全体的な健康状態および代謝活性を調節するように発現レベルコントロールをデザインする。標的核酸の発現レベルを使用した発現レベルコントロールの共分散試験は、遺伝子の発現レベルの測定された変化またはばらつきが遺伝子の転写速度の変化または細胞の健康の一般的なばらつきのいずれに起因するのかを示す。したがって、たとえば、細胞の健康状態が悪いか重要な代謝産物を欠く場合、活性標的遺伝子および構成性に発現した遺伝子の両発現レベルは減少したと予測される。その逆もまた真である。したがって、発現レベルコントロールと標的遺伝子の両方の発現レベルが減少または増加するようである場合、この変化は全体として細胞の代謝活性の変化に寄与し得るが、目的の標的遺伝子の異なる発現に寄与しない。逆に、標的遺伝子および発現レベルコントロールの発現レベルが共に変化しない場合、標的遺伝子の発現レベルのばらつきは、この遺伝子の調節の相違に寄与するが、細胞の代謝活性のばらつき全体に寄与しない。

事実上任意の構成性に発現する遺伝子により、発現レベルコントロールのための適切な標的が得られる。典型的には、発現レベルコントロールプローブは、構成性に発現する「ハウスキーピング遺伝子」（β−アクチン遺伝子、トランスフェリン受容体遺伝子、およびGAPDH遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない）のサブシーケンスに相補的な配列を有する。

c）ミスマッチコントロール
標的遺伝子に対するプローブ、発現レベルコントロール、または標準化コントロールのためのミスマッチコントロールを得ることもできる。ミスマッチコントロールは、その対応する試験と同一のオリゴヌクレオチドプローブまたは1つまたは複数のミスマッチ塩基の存在以外のコントロールプローブである。ミスマッチ塩基は、標的配列中の対応する塩基と相補的でないかそうでなければプローブが特異的にハイブリッド形成するように選択された塩基である。適切なハイブリッド形成条件下で（たとえば、ストリンジェントな条件下）、試験またはコントロールプローブがその標的配列とハイブリッド形成するが、ミスマッチプローブとはハイブリッド形成しない（または有意に狭い範囲でハイブリッド形成する）ことが予想されるように1つまたは複数のミスマッチを選択する。好ましいミスマッチプローブは、一定のミスマッチを含む。したがって、たとえば、プローブが20量体である場合、対応するミスマッチプローブは、6位〜14位までの任意の位置での1塩基ミスマッチ（たとえば、AのG、C、またはTへの置換）（中心ミスマッチ）以外は同一の配列を有する。

したがって、ミスマッチプローブにより、プローブが指向される標的以外のサンプル中の核酸への非特異的結合または交差ハイブリッド形成のコントロールが得られる。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリッド形成が特異的であるかどうかを示す。たとえば、標的が存在する場合、完全に適合したプローブは一貫してミスマッチプローブよりも輝いているはずである。さらに、全ての一定の中心ミスマッチが存在する場合、ミスマッチプローブを使用して変異を検出することができる。最後に、完全な適合とミスマッチプローブとの間の強度の相違（I（PM）−I（MM））によりハイブリッド形成物質の濃度が良好に測定されることが本発明の発見でもあった。

2）サンプル調製／増幅コントロール
アレイはまた、サンプル調製／増幅コントロールプローブを含み得る。これらは、通常はアッセイされる特定の生体サンプルの核酸中に存在しないので、選択されたコントロール遺伝子のサブシーケンスに相補的なプローブである。適切なサンプル調製／増幅コントロールプローブには、たとえば、目的のサンプルが真核生物由来の生体物質である細菌遺伝子（たとえば、BioB）に対するプローブが含まれる。

次いで、プロセシング前にサンプル調製／増幅コントロールプローブが指向する既知量の核酸でRNAサンプルをスパイクする。次いで、サンプル調製／増幅コントロールプローブのハイブリッド形成の定量により、プロセシング工程（たとえば、PCR、逆転写、in vitro転写など）に起因する核酸の存在量の変化を測定する。

B．「試験プローブ」の選択および至適化
好ましい実施形態では、使用した特定のハイブリッド形成条件下で最小の非特異的結合または交差ハイブリッド形成に指向する核酸標的に特異的に結合するようにアレイ中のオリゴヌクレオチドプローブを選択する。

しかし、特定のmRNAに固有でない20量体サブシーケンスが存在し得る。これらのサブシーケンスに指向するプローブは、サンプルゲノム中の他の領域中に発生した相補配列と交差ハイブリッド形成すると予想される。同様に、他のプローブは、ハイブリッド形成条件下で簡単に有効にハイブリッド形成することができない（二次構造または基質もしくは他のプローブとの相互作用による）。したがって、好ましい実施形態では、このような低い親和性またはハイブリッド形成効率を示すプローブを同定し、アレイ自体（たとえば、アレイの構築中）またはハイブリッド形成後データ分析のいずれにおいても含めることができない。

したがって、1つの実施形態では、本発明は、特定の遺伝子の検出のためのプローブ組を至適化する方法を提供する。一般に、本方法は、標的遺伝子によって転写されたmRNAのサブシーケンスに相補的な非常に多数の1つまたは複数の特定の長さのプローブを含むアレイを提供する工程を含む。1つの実施形態では、アレイは特定のmRNAに相補的な特定の長さの各プローブを含み得る。次いで、アレイプローブを、その標的核酸のみとハイブリッド形成させ、その後プローブに相補的な標的を含まない複雑性の高い高濃度の核酸サンプルとハイブリッド形成させる。したがって、たとえば、標的核酸がRNAである場合、プローブを最初にその標的核酸のみとハイブリッド形成させ、その後ハイブリッド形成されたRNAの方向が標的核酸と反対である（高複雑性サンプルがプローブの標的を含まないことを確実にするため）cDNAライブラリーから作製されたRNA（たとえば、逆転写されたポリAmRNA）とハイブリッド形成させる。その標的と強いハイブリッド形成シグナルを示し、かつ高複雑性サンプルとほとんどまたは全く交差ハイブリッド形成しないプローブが、本発明のアレイで使用される好ましいプローブである。

アレイは、さらに、試験すべき各プローブのためのミスマッチコントロールを含み得る。好ましい実施形態では、ミスマッチコントロールは中心ミスマッチを含む。ミスマッチコントロールおよび標的プローブの両方が高レベルのハイブリッド形成を示す場合（たとえば、ミスマッチとのハイブリッド形成は対応する試験プローブとのハイブリッド形成とほぼ等しいかそれ以上である）、試験プローブはアレイ中で使用されないことが好ましい。

特に好ましい実施形態では、標的核酸のサブシーケンスに相補的な非常に多数のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイを得る。オリゴヌクレオチドプローブは、1つの長さであるか、5〜50ヌクレオチドの範囲の種々の長さであり得る。アレイは、特定のmRNAに相補的な特定の長さの各プローブを含み得るか、特定のmRNAの種々の領域から選択されたプローブを含み得る。各標的特異的プローブのために、アレイはまた、ミスマッチコントロールプローブ、好ましくは中心ミスマッチコントロールプローブを含む。

オリゴヌクレオチドプローブに相補的なサブシーケンスを有する標的核酸を含むサンプルにオリゴヌクレオチドアレイをハイブリッド形成させ、各プローブとそのミスマッチコントロールとの間のハイブリッド形成強度の相違を決定する。プローブとそのミスマッチコントロールとの間の相違がハイブリッド形成強度のしきい値（たとえば、好ましくは10％を超えるバックグラウンドシグナル強度、より好ましくは20％を超えるバックグラウンドシグナル強度、最も好ましくは50％を超えるバックグラウンドシグナル強度）を超えるプローブのみを選択する。したがって、そのミスマッチコントロールと比較して強いシグナルを示すプローブのみを選択する。

プローブ至適化手順は、任意選択的に、第2ラウンドの選択を含み得る。この選択では、オリゴヌクレオチドプローブアレイを、プローブと相補的な配列を含むと予想されない核酸サンプルとハイブリッド形成させる。したがって、たとえば、プローブがRNAセンス鎖に相補的である場合、アンチセンスRNAサンプルが得られる。もちろん、特定の遺伝子を欠くことが公知であるか、特定の遺伝子を発現しないことが公知の生物または細胞株などの由来のサンプル他のサンプルを得ることができる。

プローブおよびそのミスマッチコントロールの両方がしきい値未満のハイブリッド形成強度（たとえば、約5倍未満のバックグラウンドシグナル強度、好ましくは約2倍またはそれ以下のバックグラウンドシグナル強度、より好ましくは1倍またはそれ以下のバックグラウンドシグナル強度、最も好ましくは1／2倍またはそれ以下のバックグラウンドシグナル強度）を示すプローブのみを選択する。この方法では、最小の非特異的結合を示すプローブを選択する。最後に、好ましい実施形態では、両選択基準を満たし、各標的遺伝子の最も高いハイブリッド形成強度を有するnプローブ（nは各標的遺伝子に望ましいプローブ数）をアレイ中の組み込みのために選択するか、アレイ中に既に存在する場合、その後のサブシークエンス配列のデータ分析のために選択する。もちろん、当業者は、プローブ選択のためにいずれかの選択基準を単独で使用することができることを認識する。

この様式における20量体プローブのための1組のハイブリッド形成規則は、以下である：a）Aの数が9個未満であること、b）Tの数が10個未満であり、かつ0個を超えること、c）A、G、またはTの最大の一続き（run）が連続して4塩基未満であること、d）任意の2種の塩基の最大の一続きが11塩基未満であること、e）パリンドロームスコアが6未満であること、f）凝集（clumping）スコアが6未満であること、g）Aの数＋T数が14未満であること、h）Aの数＋Gの数が15未満であること。規則dに関して、11個未満の塩基であるべき任意の2つの塩基の最大の一続きが必要であることは、任意の12個の連続するヌクレオチド内に少なくとも3つ異なる塩基が存在することを証明する。オリゴヌクレオチドが自己相補性を最大にする時点で折りたたまれた場合、パリンドロームスコアは最大相補塩基数である。従って、たとえば、完全に自己相補的な20量体のパリンドロームスコアは10である。凝集スコアは、所与の配列中の同一塩基の3量体の最大数である。したがって、たとえば、5個の同一塩基の一続きの凝集スコアは3である（塩基1−3、塩基2−4、および塩基3−5）。任意のプローブがこれらの基準（a〜h）のうちの1つを満たさない場合、プローブはチップ上に位置付けられたプローブのサブセットのメンバーではない。たとえば、仮定上のプローブは、5'−AGCTTTTTTCATGCATCTAT−3'であり、4個またはそれ以上の塩基の一続きを有するので（すなわち、一続きが6個）、プローブはチップ上で合成されない。20量体について開発された交差ハイブリッド形成規則は以下であった：a）Cの数は8個未満であること、b）8個の塩基の任意のウィンドウ中のCの数が4個未満であること。したがって、任意のプローブがハイブリッド形成規則（a〜h）または交差ハイブリッド形成規則（a〜b）のいずれかを満たさない場合、プローブはチップ上に位置付けられたプローブのサブセットのメンバーではない。これらの規則により、強固に交差ハイブリッド形成するか低ハイブリッド形成を示す多数のプローブが消去される。

C．核酸の固体表面への結合
核酸またはアナログを、ガラス、プラスチック（たとえば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製することができる固体支持体に結合させる。核酸の表面への好ましい結合方法は、一般に、Schenaら，1995 （Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray，Science 270： 467−470）に記載のガラスプレートへの印刷による。この方法は、特に、cDNAマイクロアレイの調製に有用である。DeRisiら，1996（Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer，Nature Genetics 14：457−460；Shalonら，1996，A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two−color fluorescent probe hybridization，Genome Res．6：639−645；およびSchenaら，1995，Parallel human genome analysis；microarray−based expression of 1000 genes，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93：10614−10619）も参照のこと。上記の各論文は、その全体が全ての目的のために参考として援用される。

第2の好ましいマイクロアレイ作製方法は、高密度オリゴヌクレオチドアレイの作製による。in situ合成のための写真平板技術を使用した表面上の定義された位置での定義された配列に相補的な何千ものオリゴヌクレオチドを含むアレイの産生技術（たとえば、Fodorら，1991，Light−directed spatially addressable parallel chemical synthesis，Science 251：767−773；Peaseら，1994，Light−directed oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：5022−5026；Lockhartら，1996，Expression monitoring by hybridization to high−density oligonucleotide arrays，Nature Biotech 14：1675；米国特許第5，578，832号；同第5，556，752号；および同第5，510，270号（それぞれ全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）または定義したオリゴヌクレオチドの他の迅速な合成方法および沈殿方法（Blanchardら，1996，High−Density Oligonucleotide arrays，Biosensors ＆ Bioelectronics 11： 687−90）が公知である。これらの方法を使用する場合、既知の配列のオリゴヌクレオチド（たとえば、20量体）を、誘導体化ガラススライドなどの表面に直接合成する。通常、作製されたアレイは冗長であり、RNAあたり数個のオリゴヌクレオチド分子を有する。選択的スプライシングされたmRNAを検出するために、オリゴヌクレオチドプローブを選択することができる。別の好ましいマイクロアレイの作製方法は、固相に直接オリゴヌクレオチドを合成するためのインクジェット印刷プロセスの使用による。

マイクロアレイの他の作製方法（たとえば、マスキングによる（Maskos and Southern，1992，Nuc．Acids Res．20：1679−1684））も使用することができる。原則的に、任意のアレイ型（たとえば、ナイロンハイブリッド形成メンブレン上のドットブロット）（Sambrookら，Molecular Cloning−−A Laboratory Manual （2nd Ed．），Vol．1−3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989（全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）を使用することができるが、当業者に認識されるように、ハブリッド形成体積が小さいので非常に小さなアレイが好ましい。

V．マイクロアレイデータ分析
マイクロアレイ分析によりRNAサンプル中の何千もの遺伝子の発現レベルが決定されるが、これら遺伝子のうちの数個のみが特定の変動性（variable）の移入時に異なって発現される。本発明の場合、乳房組織はドセタキセル感受性または耐性のいずれかである。臨床結果を予測するための分類に必要な遺伝子の同定は本発明の目的である。

クラスター分析による遺伝子組の分類
本発明の多数の適用のために、広範な種々の条件によって同時調節される基本的遺伝子組を見出すことが望ましい。これにより、本発明の方法は予想される性質があまり制限されていないプロフィールの巨大なクラスのために十分に作用する。このような基本遺伝子組を同定するための好ましい実施形態は、当業者に周知のクラスタリングアルゴリズムを含む。（クラスタリングアルゴリズムの概説については、たとえば、Fukunaga，1990，Statistical Pattern Recognition，2nd Ed．，Academic Press，San Diego；Everitt，1974，Cluster Analysis，London：Heinemann Educ．Books；Hartigan，1975，Clustering Algorithms，New York：Wiley；Sneath and Sokal，1973，Numerical Taxonomy，Freeman；Anderberg，1973，Cluster Analysis for Applications，Academic Press：New Yorkを参照のこと）。

広範な種々の条件によって同時に変化する遺伝子を含む基本遺伝子組を得るために、複数の遺伝子を分析する。好ましい実施形態では、少なくとも10個またはそれ以上、好ましくは少なくとも50個の遺伝子を分析する。他の実施形態では、少なくとも91個の遺伝子を分析する。クラスター分析は、次元m×k（mは、集団化する総群数（本発明では、2つの群（ドセタキセル耐性およびドセタキセル感受性）が意図される）であり、kは測定した遺伝子数である）を有するデータテーブルで操作する。

多数のクラスタリングアルゴリズムは、クラスタリング分析に有用である。クラスタリングアルゴリズムは、クラスターを形成した場合のオブジェクト間の非類似性または距離を使用する。いくつかの実施形態では、使用した距離は、多次元空間（I（x，y）は遺伝子Xと遺伝子Yとの間の距離であり、X_iおよびY_iは摂動i下での遺伝子発現応答である）中の（当業者に公知の）ユークリッド距離である。さらに離れたオブジェクト上に段階的に増大する重みを置くためにユークリッド距離を二乗することができる。あるいは、距離測定は当業者に公知のたとえば遺伝子Xと遺伝子Yとの間のマンハッタン距離であり得る。また、X_iおよびY_iは摂動i下での遺伝子発現応答である。いくつかの他の距離の定義は、チェビセフ距離、パワー距離、および不一致率である。細胞応答の文脈で特に有用な別の有用な距離の定義I＝1−r（rは応答ベクターX、Yの間の相関係数である）もまた標準化ドット積XY／｜X｜｜Y｜と呼ばれる。

種々のクラスター連結規則は、本発明の方法に有用である。単連結法（最短距離法）は、2つの最も近いオブジェクト間の距離を決定する。対照的に、完全連結法は、異なるクラスター中の任意の2つのオブジェクト間の最も遠い距離によって距離を決定する。この方法は、遺伝子または他の細胞構成要素が天然に異なる「クランプ」を形成する場合、特に有用である。あるいは、加重群平均法は、2つの異なるクラスターの全オブジェクト対間の平均距離として距離を定義する。この方法はまた、天然に異なる「クランプ」を形成する遺伝子または他の細胞構成要素のクラスタリングに非常に有用である。最後に、重み付き平均法を使用することもできる。この方法は、各クラスターのサイズを重みとして使用すること以外は群平均法と同一である。この方法は、特に、クラスターサイズが非常に多様であると疑われる実施形態に有用である（Sneath and Sokal，1973，Numerical taxonomy，San Francisco．W．H．Freeman & Co．）。重心法および重み付き重心法ならびにウォード法などの他のクラスター連結規則もまた本発明のいくつかのの実施形態で有用である。たとえば、Ward，1963，J．Am．Stat Assn．58： 236，Hartigan，1975，Clustering algorithms，New York：Wileyを参照のこと。

hclustルーチンを使用して、クラスター分析を行うことができる（たとえば、ソフトウェアパッケージS−Plus，MathSoft，Inc．，Cambridge，Mass．の「hclust」ルーチンを参照のこと）。樹状図の多数の最も小さな枝または異なるレベルでの樹状図を横切る切断による少数のより大きな枝に基づいて遺伝子組を定義することができる（図6の破線を引いた例を参照のこと）。予想される異なる応答経路数に適合するようにカットレベルを選択することができる。経路数に関して利用可能な情報が全くまたはほとんど利用可能でない場合、樹状図を真に異なるほどの枝に分けるべきである。「真に異なる」を、異なる枝の間の最短距離値によって定義することができる。好ましくは、「真に異なる」を、樹状図中の各分岐点の統計的有意性の客観試験を使用して定義することができる。本発明の1つの態様では、実験組にわたる各細胞構成要素の応答についての各実験見出し（index）のモンテカルロ無作為化を使用して、客観試験を定義する。

組織分類に有意に寄与する重要な遺伝子を同定するためのマイクロアレイ実験の実施後の何千ものデータポイントを、種々の方法で分析することができる。1つのアプローチは、実験をとおして類似の挙動を有する相関遺伝子組を同定するが、樹上図様構造中に何千ものクラスターが得られる階層的クラスタリングなどの監視下の(supervized)クラスタリング技術であり得る。自己組織化マップ（SOM）は、クラスターの事前に特定した数および初期空間構造（initial spatial structure）が必要である。

本発明の好ましい実施形態では、監視下の(supervized)クラスタリングアルゴリズムによって乳房組織サンプル由来のマイクロアレイデータを分析する。任意の適切な数のアルゴリズムを使用することができる。たとえば、Dettlingら，2002を参照のこと。このようなアルゴリズムをユーザーがデザインすることができ、マイクロアレイデータ分析ソフトウェアシステムに予めパッケージングすることができる。

R−SVMは、マイクロアレイ遺伝子発現データを使用した監視下の(supervized)パターン認識（分類）を実施するためのサポートベクターマシン（SVM）ベースの方法である。この方法は、分類におけるその相対的起用にしたがった関連遺伝子サブセットの分類および選択に有用である。このプロセスは回帰的であり、独立した試験データセットの分類精度を評価するか、同一のデータセットを交差検証することができる。R−SVMはまた、能力の有意性を評価するための順列検定のオプションを含む。

VI．遺伝子の説明
本発明に記載の遺伝子は、ドセタキセルに感受性を示す乳癌とドセタキセルに耐性を示す乳癌との間の所定量によってその発現が変化する遺伝子である。以下は、本発明の目的の遺伝子の詳細な説明を提供する。遺伝子のホモログおよび多形変異体も意図されることに留意のこと。上記のように、これらの遺伝子の相対発現への寄与を、マイクロアレイ分析によって測定することができる。しかし、他の遺伝子発現決定方法も意図される。全長遺伝子の任意の適切なフラグメントを使用して以下の遺伝子のプローブをデザインすることができることも留意のこと。

〔実施例〕

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態の証明を含む。以下の実施例に開示の技術が本発明の実施で十分に機能することを本発明者によって発見された技術を示し、それによりその好ましい実施様式を構成すると見なすことができることが当業者は認識すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示の特定の実施形態の多数の変更形態を獲得し、かつこれらが本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを認識する。より詳細には、本明細書中に記載の薬剤を化学的および生理学的に関連する一定の薬剤に置換することができる一方で、同一または類似の結果が得られることが明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の代替物および修正形態は、添付の特許請求の範囲に定義の本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。

（研究デザイン）
1999年9月から2001年6月まで、局所進行性乳癌患者（4cmを超える原発性癌または臨床的に明らかな腋窩転移）に、ネオアジュバントであるドセタキセルを使用した第II相試験が考慮された。臨床試験対象基準は、1）18歳超であり、針生検によって確認された乳癌診断、2）適切な避妊法を伴う月経前状態、3）適切なパフォーマンス状態、および4）適切な肝機能および腎機能試験（全て正常値の上限の1．5倍以内）であった。臨床試験除外基準は、1）重篤な潜在的慢性疾病または疾患、および2）研究中の他の化学療法薬での治療を含んでいた。

治療開始時、各周期、および4サイクルの化学療法の完了後に臨床病期および原発性腫瘍サイズを記録した。4サイクルのネオアジュバント化学療法の前後に測定した腫瘍サイズ（2つの最も巨大な垂直直径の産物）を使用して、残存疾患率を計算した。次いで、残存疾患の中央値を計算し、遺伝子発現分析前にこの応答度を使用して癌をほぼ同数の感受性および耐性カテゴリーの2群に分けた。

ネオアジュバント治療として1つの薬剤であるドセタキセルの投与前に、原発性癌の針生検を行った。100mg／m²のドセタキセルを3週間毎に全部で4サイクル投与し、4サイクル後（12週間後）に臨床応答を評価した。ケアの標準として、25％を超える腫瘍サイズの増加と定義される疾患の進行が認められない限り、4サイクルにわたり患者にネオアジュバント化学療法を継続した。ネオアジュバントデセタキセルの完了後、一次手術および標準的なアジュバント療法を行った。十分な組織が得られる可能性を最大にするために、Bard MaxCore Biopsy Instrument （＃MC1410）を使用して、約6つの針生検を採取した。同一の侵入点を使用したが、新しい方向にニードルを刺し、局所麻酔下で生検を行った。cDNAアレイ分析のために、その直後に2つまたは3つの針生検標本を−80℃で瞬間冷凍した。診断および可能な免疫組織化学分析のために残りの標本をホルマリンで固定した。

（RNAの抽出および増幅）
GeneChip（商標）試験のために、Affymetrix（Santa Clara，CA）によって推奨されたプロトコールに従って、凍結針生検標本から全RNAを単離した。TRIzol試薬（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）を使用して、全RNAを単離した。その後、RT反応およびハイブリッド成形の質に影響を与えることが示された（ECW、未公開データ）小フラグメントの制御のためにサンプルをQiagen RNeasyカラム（Qiagen，Valencia，CA）に通した。各針生検から、3〜6μgの全RNAが得られた。RNA回収後、100pm／μLの濃度のオリゴdTおよびT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むキメラオリゴヌクレオチドによって二本鎖cDNAを合成した。市販の緩衝液およびタンパク質（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）を使用し、Affymetrix（Santa Clara，CA）によって推奨されているプロトコールに従って、逆転写を行った。逆転写反応産物のフェノール−クロロホルムによる清浄化後にビオチン標識および約250倍の線形増幅を行い、8時間の反応時間でin vitro転写（Enzo Biochem，New York，NY）を行った。プレハイブリッド形成、ハイブリッド形成、洗浄、およびストレプトアビジン−フィコエリトリン（SAPE）での染色について推奨される手順にしたがって、各生検由来の15μgの標識cRNAを、Affymetrix U95Av2GeneChip（商標）上にハイブリッド形成した。ヤギIgG（Sigma，St．Louis，MO）ブロッキング抗体を含むビオチン結合抗ストレプトアビジン抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA）を使用して抗体を増幅させた。さらなる洗浄工程の後に第2のSAPEを適用した。自動化染色および洗浄プロトコール（AffymetrixプロトコールEukGE−2v4）後、アレイをAffymetrix GeneChip Scanner（Agilent，Palo Alto，CA）によってスキャニングし、Micreo Array Suite V5．0（Affymetrix，Santa Clara，CA）を使用して定量した。Affymetrix U95Av2 GeneChip（商標）は、約12，635個のプローブ組（それぞれ約16個のパーフェクトマッチおよび対応するミスマッチ（25量体のオリゴヌクレオチドプローブ）を含む）を含み、そのほとんどが機能または疾患関連に関して特徴付けられている配列（遺伝子）を示す。最終標準化およびモデリングのために、dChipによって非標準化プローブレベルの生データを分析した。強度の中央値を、24アレイの標準化で使用し、パーフェクトマッチ／ミスマッチ（PM／MM）モデリングアルゴリズムを使用した。

（半定量RT−PCR）
GeneChipとハイブリッド形成した同一の増幅cRNAを使用して、遺伝子発現レベルの半定量RT−PCR（QRT−PCR）測定を行った。発現レベルにおける高いばらつきに基づいた分析のために20個の遺伝子を選択した。自由に利用可能な配列およびプライマーデザイン用のPrimer3アルゴリズムを使用して、これらの遺伝子座についてプライマーをデザインした。cDNAの質に比例して変化する条件下で作用する能力を最大にするために、産物サイズを短く（150bp未満）に維持した。6つのサンプルの逆転写混合物を使用して、プライマーを至適化した。15個の二連の反応物を調製し、sqRT−PCR反応産物が確実に線形範囲の蓄積であるように15と33との間でサイクル数を変化させてサンプルを調製した。次いで、これらのサンプルを昇順に配置し、10μLローディング緩衝液で希釈し、3μLの各サンプルを6％変性アクリルアミドゲルにロードした。60Wで2時間またはキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー染色で十分に分離されるまで電気泳動を行った。次いで、ゲルを固定し、下のプレートを除去し、濾紙に移し、乾燥させた。これらの乾燥ゲルを最初にオートラジオグラフィ（約8時間の曝露、増強せず）によって評価し、分析可能なゲルをリン光結像スクリーンに曝露した。1つのきれいなバンドが得られなかったプライマーを、アニーリング温度を変化させて再度試みた。

この方法に適切であることが証明された選択した25個のプライマーのうちの15個から、分析用のきれいな1つのバンドが得られた。残りの5個は適切に至適化できず、いかなるさらなる分析にも含めなかった。高サイクルサンプルは必然的にピクセル飽和が達成され、各組内の全サイクルの大部分で有益な範囲内に強度を維持するために曝露時間が最小になるように注意した。15個のプライマーについての収集された絶対強度の線形範囲を、Excelベースのグラフ作成機能を使用して決定した。次いで、Phosphorimager定量分析（Bio−Rad Laboratories，Hercules，CA）を行い、RT−PCR産物のバンド強度を、Affymetrix GeneChipデータ由来の標準化したモデルベースの発現評価と定量的に比較した。

（統計分析）
本研究で使用した分析アプローチ（図1）は、当業者に公知の方法と類似していた。MicroArray Suite（Affymetrix，Santa Clara，CA）を使用したスキャニングおよび低レベル定量後、DNA−Chip Analyzerを使用して、共通のベースラインにアレイを標準化し、LiらのPM−MMモデルを使用して発現を評価した。少なくとも30％のサンプル中に「存在」しない遺伝子を消去し、さらなるフィルタリングおよび分析のために残りの6，849個の遺伝子についての発現データをBRB Arraytoolsにエクスポートした。Pm−MMモデルでは、14〜20個のプローブ対を使用して各遺伝子を調査し（interrrogate）、各プローブ対はパーフェクトマッチ（PM）およびミスマッチ（MM）シグナルを有し、プローブ組中の全プローブ対についてのPM−MM相違の平均（「平均相違」と呼ばれる）を、標的遺伝子の発現指数として使用する。モデルにより、各プローブ特異的効果が明らかとなり、外れ値および画像アーティファクトを自動検出可能である。対数による全てのデータの変換後、全24サンプルの変動性によって遺伝子に順位を付け、分散の中央値よりも有意に変化する遺伝子を保持した（N＝1，628）。

いくつかの工程で分析を進行させた。発現の異なる遺伝子の数が偶然と予想される数を超えるかどうかを最初に決定した。発現の異なる遺伝子を、2サンプルのt検定を使用してフィルタリングした遺伝子リストから選択した。認められた有意な遺伝子数が偶然起こった尤度の全体的な複数の比較を用いない評価のために全体的（global）並べ替え検定を使用した。この検定では、認められた有意に発現の異なる遺伝子の数を、サンプル標識の並べ替えおよび特定の有意レベルでのt検定の再計算の繰り返しによって得られた発現の異なる遺伝子の数の分布と比較した。

次に、応答を予想するための分類子を開発した。識別遺伝子およびその関連するt値のリストが得られた場合、Radmacher らのCompound Covariate Predictor法を使用して、線形分類子を構築した。再置換により、分類の成功を評価し、これの作製に使用したものと同一のサンプルに分類子を適用した場合、常に偏る。従って、外部交差検証手順により、分類の成功がより偏ることなく評価された。いかなるクラスの構成要素に関することなくフィルタリングした分散の中央値よりより有意に変動する1，628個の遺伝子から開始し、分類子のパフォーマンスを評価するために、一点除外交差検証において遺伝子選択プロセス全体および分類子構築プロセスを繰り返した。最後に、認められた首尾の良い分類度が偶然に得られる尤度を評価するために、全交差検証手順を、N＝2000回繰り返し、毎回サンプル標識を並べ替えた。次いで、得られた交差検証分類成功率を、並べ替え分析における分類成功分布と比較した。認められた感受性および特異性によって交差検証したパフォーマンスをまとめ、正確な二項信頼区間と関連付けた。再置換分類子値を使用して、受信者動作特性曲線（ROC曲線）も作製し、曲線下面積を評価した。

同一の臨床試験で処置した6人の患者の独立した連続組に対して分類子を部分的に認証した。トレーニングサンプルのために上記のように前処理生検からRNAを獲得し、Affymetrix HgU95av2 GeneChipsと正確にハイブリッド形成させた。プローブレベルデータを、トレーニングセットと同一のベースラインアレイに標準化し、トレーニングサンプルから計算した以前に評価したプローブ感受性値を使用して、遺伝子発現値を計算した。新規の各サンプルの応答を予測するために、91遺伝子の分類子を適用した。

（臨床応答の評価）
この第II相ネオアジュバント研究に登録した24人の患者の臨床的特徴を、表1に含める。処置前に、腫瘍サイズの中央値は8cm（4〜30cmの範囲）であった。遺伝子発現分析の前に、処置後の残存疾患率に基づいて感受性および耐性を定義した。化学療法後の残存疾患の中央値が30％であると決定した。次いで、このカットオフは統計的比較のためにほとんど同数の患者を2つの群に分けるので、感受性腫瘍は残存疾患が25％またはそれ以下のものであり、耐性腫瘍は残存疾患が25％を超えるものであると任意に定義した。さらに、存在する腫瘍は、本研究の局所的に進行した乳癌で巨大であり、化学療法後に少なくとも75％の腫瘍の後退はほぼ臨床的に応答性を示す疾患であろう。ネオアジュバント化学療法後の巨大腫瘍の後退は、長期生存の確率と直接相関することが示された。

これら24人の患者のうち、11人（46％）がドセタキセル感受性を示し、13人（54％）が耐性を示した。感受性腫瘍のうち、5人の患者（5／11、45％）の残存疾患が最小であり（残存疾患10％未満）、耐性腫瘍のうち7人の患者の残存腫瘍は60％以上であり（7／13、58％）、これらの女性のうちの3人（3／13、23％）の残存腫瘍はベースラインの100％またはそれ以上であった。

（針生検およびRNA収量）
処置前に、各原発性乳癌から6つの針生検を得た。その直後にcDNAアレイ分析のために2つまたは3つの針生検標本を−80℃で瞬間凍結し、残りの針生検を病理学的評価のために処理した。各針生検を、1mmごとに約1cm測定した。これらの生検が顕微解剖には小さすぎるので、前処置針生検の腫瘍の細胞性を確認した。一般に、針生検は、良好な腫瘍細胞性を示し、腫瘍細胞性の中央値は75％（40％〜100％の範囲）であった。

各凍結針生検から、3〜6μgの全RNAが得られ、製造者の標準的なプロトコールを使用したAffymetrix U95Av2 GeneChipとのハイブリッド形成に必要な約20μgの標識cRNAの作製の十分量を超えていた。

（識別遺伝子の選択）
2群間で有意に発現の異なる遺伝子を同定するために、感受性腫瘍および耐性腫瘍の発現データを比較した（図2）。第1に、均一に低発現の遺伝子またはその発現がサンプルを通して有意に変化しない遺伝子を消去するためのシグナル強度のフィルタリングによって候補遺伝子のサブセットを選択し、1，628個の遺伝子が残った。対数変換後、t検定を使用して、識別遺伝子を選択した。複数の比較による誤った結果の可能性を評価するために、認められた発現の異なる遺伝子数（またはそれ以上）が偶然起こる統計的確率を評価する全体的並べ替え検定を行った。名義P値0．001、0．01、および0．05のt検定により、それぞれ91個、300個、および551個の遺伝子が「発現が異なる」として選択された。これらの遺伝子数が偶然選択される確率は、それぞれたった0．0015、0．001、および0．001未満と評価された。

（識別遺伝子の機能分類）
名義P値＜0．001で最も有意に「発現の異なる」と分類された91個の遺伝子を、表1に列挙する。これらの遺伝子は、耐性腫瘍と感受性腫瘍の発現で4．2〜2．6倍減少または2．5〜15．7倍増加を示した。これらの発現の異なる遺伝子の機能クラスは、ストレス／アポトーシス（21％）、細胞接着／細胞骨格（16％）、タンパク質輸送（13％）、シグナル伝達（12％）、RNA転写（10％）、RNAスプライシング／輸送（9％）、細胞周期（7％）、およびタンパク質翻訳（3％）を含んでおり、残り（9％）は未知の機能を有していた。

それぞれ未知の機能、タンパク質翻訳、細胞周期、およびRNA転写を含む主要なカテゴリーを有する耐性クラスターにおいて91個の遺伝子のうちの14個しか過剰発現しなかった。β−チューブリンイソ型は、デセタキセル耐性に関連していた。配列番号1、配列番号3、配列番号12、配列番号18、配列番号37、配列番号38、配列番号43、配列番号53、配列番号63、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号78、配列番号87によって記載される遺伝子は、耐性クラスターで過剰発現した。

デセタキセル感受性腫瘍で過剰発現した77個の遺伝子の腫瘍なカテゴリーは、ストレス／アポトーシス、接着／細胞骨格（耐性腫瘍では過剰発現されない）、タンパク質輸送、シグナル伝達、およびRNAスプライシング／輸送であった。感受性腫瘍では、アポトーシス（たとえば、BAX、UBE2M、UBCH10、CUL1の過剰発現）およびDNA損傷関連遺伝子発現（たとえば、CSNK2B、DDB1、およびABLの過剰発現ならびにPRKDCの過少発現）に関与する遺伝子は、ドセタキセル感受性に寄与するようである。

本分析は、低発現のいくつかの異なる遺伝子を排除する。たとえば、紡錘体チェックポイント機能障害がヒト癌の異数性の重要な原因であることが提案された。セリン−トレオニンキナーゼ遺伝子AURORA−Aは、紡錘体チェックポイント調節障害機構を構成することができ、その増幅によりタキサン耐性が予測されている。それにもかかわらず、この遺伝子は、その低発現全体に起因する91遺伝子分類リストの一部ではなかった。この分類リストは、ドセタキセル感受性および耐性に関連する遺伝子を全て含まないが、むしろ、予測臨床試験として使用することができる多数の遺伝子パターンが同定される。

（一点除外交差検証）
0．001またはより良好な名義P値を使用した遺伝子に基づく線形分類子を使用した表現型の予測の可能性を、一点除外交差検証を使用して試験した。選択の偏りを克服するために、1，628個の全てのフィルタリングした遺伝子（上記）からこの分析を開始した。その後、各所見を「除外」し、残りのサンプルを使用して、発現の異なる遺伝子を選択し、化合物共変量予測（compound covariate predictor）を構築し、これを使用して、除外サンプルを分類した。11個の感受性腫瘍のうちの10個（特異性＝91％、正確な二項式95％CIは0．59〜1．00）および13個の耐性腫瘍のうちの11個（感受性＝85％、95％CIは0．55〜0．98）が88％の全体精度で（95％CI＝68％〜97％）正確に分類された。並べ替え検定は、このような高交差検証分類精度が非常に有意である（P＝0．008）ことを示す。全24サンプルを使用して予め選択した91個の遺伝子を使用して構築した類似の予測により、首尾よく同一の分類が得られた。この予測を使用して、ドセタキセル応答についての正および負の予測値はそれぞれ92％および83％であり、受信者動作特性曲線（ROC曲線）下面積は0．96であった（図3）。

（発現測定値の確認）
RNAレベルの測定値を確認するために、標準化Affymetrixデータ由来の発現値を、15個の発現の異なる遺伝子の半定量RT−PCR（QRT−PCR）の値と相関させた。スペアマンの順位相関は、13遺伝子で正であり、15遺伝子のうち6遺伝子で有意に正であった。

（独立コホートでの検証）
91個の予測分類子を部分的に評価するために、この予想（prospective）臨床試験に登録した6人のさらなる患者を研究した。この小集団では、6人の患者は全員感受性腫瘍（25％未満の残存疾患）を有し、この分類子で正確に分類された。

本明細書中に記載の全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が参考として援用されるように明確かつ個別に示されているかのように本明細書中で参考として援用される。

特許：
第6，107，034号
第6，203，987号
第5，510，270号
第5，811，231号
第5，645，988号

非特許文献：
Aapro MS．Adjuvant therapy of primary breast cancer：a review of key findings from the 8th international conference，St．Gallen．The Oncologist 2001；6：376−385．

Ambroise C，McLachlan GJ．Selection bias in gene extraction on the basis of microarray gene−expression data．Proc Natl Acad Sci USA 2002； 99 （10）：6562−6．

Anand S，Penrhyn−Lowe S，Venkitaraman AR．AURORA−A amplification overrides the mitotic spindle assembly checkpoint，inducing resistance to Taxol．Cancer Cell 2003；3（1）：51−62．

Chan S，Friedrichs K，Noel Dら，Prospective randomized trial of docetaxel versus doxorubicin in patients with metastatic breast cancer．The 303 Study Group．J Clin Oncol 1999；17（8）：2341−54

Dettling M，Buehlmann P Supervised clustering of Genes Genome Biology 2002 3 （12）：0069．1−0069．15

Dumontet C，SikicBI．Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents：microtubule dynamics，drug transport，and cell death．J Clin Oncol 1999 ；17（3）：1061−70．

The Early Breast Cancer Trialists'Collaborative Group．Systemic treatment of early breast cancer by hormonal，cytotoxic or immune therapy：133 randomised trials involving31，000 recurrences and 24，000 deaths among 75，000 women．Lancet 1992；339：1−15，71−85．

The Early Breast Cancer Trialists'Collaborative Group E．Tamoxifen for early breast cancer： an overview of the randomised trials．Lancet 1998；351（9114）：1451−1467．

The Early Breast Cancer Trialists'Collaborative Group．Polychemotherapy for early breast cancer： an overview of the randomised trials．Lancet 1998；352：930−942．

Henderson IC BD，Demetri Gら，Improved disease free survival and overall survival from the addition of sequential paclitaxel but not from escalation of doxorubicin in the adjuvant chemotherapy of patients with node−positive primary breast cancer．Proc Am Soc Clin Onco 1998；17：101．

Fisher B，Bryant J，Wolmark Nら，Effect of preoperative chemotherapy on the outcome of women with operable breast cancer．Journal of Clinical Oncology 1998；16（8）：2672−2685．

Hansen RK，ParraI，Lemieux P，Oesterreich S，Hilsenbeck SG，Fuqua SA．Hsp27 overexpression inhibits doxorubicin−induced apoptosis in human breast cancer cells．Breast Cancer Res Treat 1999；56（2）：187−96．

Hortobagyi GN．Docetaxel in breast cancer and a rationale for combination therapy．Oncology 1997 ；11（6）：11−15．

Khan J，Simon R，Bittner Mら，Gene expression profiling of alveolar rhabdomyosarcoma with cDNA microarrays．CancerResearch 1998；58（22）：5009−5013．

Kikuchiら，Expression profiles of non−small cell lung cancers on cDNA microarrays： Identification of genes for prediction of lymph−node metastasis and sensitivity to anti− cancer drugs．Oncogene 2003，22：2192−2205．

Li C，Wong WH．Model−based analysis of oligonucleotide arrays： expression index computation and outlier detection．Proc Natl Ac d Sci USA 2001；98（1）：31−6．

Li C，Wong WH．Model−based analysis of oligonucleotide arrays： model validation，design issues and standard error application．Genome Biology 2001；2（8）：research0032．1−0032．11．

Lockhart DJ，Dong H，Byrne MCら，Expression monitoring by hybridization to high−density oligonucleotide arrays．Nature Biotechnology 1996；14：1675−1680．

Mamounas EP．Preoperative doxorubicin plus cyclophosphamide followed by preoperative or postoperative docetaxel．Oncology 1997；11（6（Suppl 6））：37−40．

Nabholtz JM，Patterson A，Dirix L，Dewar J，Chap Lら，A phase III trial comparing docetaxel（T），doxorubicin （A） and cyclophosphamide（C）（TAC） to （FAC） as first line chemotherapy for patients with metastatic breast cancer．Proceedings of the American Society of Clinical Oncologists 2001；20：22a．

Osborne CK，Yochmowitz MG，Knight WA，3rd，McGuire WL．The value of estrogen and progesterone receptors in the treatment of breast cancer．Cancer 1980；46（12Suppl）：2884−8．

Perou CM，Jeffrey SS，van de Run Mら，Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers．Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 1999；96：9212−9217．

Perou CM，Sorlie T，Eisen MBら，Molecular portraits of human breast tumours．Nature 2000；406（6797）：747−52．

Radmacher MD，McShane LM，Simon R．A paradigm for class prediction using gene expression profiles．J ComputBiol 2002；9（3）：505−11．

Schadt EE，Li C，Ellis B，Wong WH．Feature extraction and normalization algorithms for high−density oligonucleotide gene expression array data．J Cell Biochem Suppl 2001；Suppl 37：120−5．

Schena M，Shalon D，Davis RW，Brown PO．Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray．Science 1995；270（5235）：467−470．

Sgroi DC，Teng S，Robinson G，LeVangie R，Hudson JR，Elkahloun AG．In vivo gene expression profile analysis of human breast cancer progression．Cancer Research 1999；59（22）：5656−5661．

Simon R，Radmacher MD，Dobbin K，McShane LM．Pitfalls in the use of DNA microarray data for diagnostic and prognostic classification．J Natl Cancer Inst 2003；95（1）：14−8．
23．McNeil BJ，Hanley JA．Statistical approaches to the analysis of receiver operating characteristic （ROC） curves．Med Decis Malcing 1984；4（2）：137−50．

Sorlie T，Perou CM，Tibshirani Rら，Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications．Proc Natl Acad Sci USA 2001；98（19）：10869−74．

van de Vijver MJ，He YD，van't Veer LJら，A gene−expression signature as a predictor of survival in breast cancer．NEngl J Med 2002；347（25）：1999−2009．

Van Poznak C，Tan L，Panageas KSら，Assessment of molecular markers of clinical sensitivity to single−agent taxane therapy for metastatic breast cancer．J Clin Oncol 2002；20（9）：2319−26．

van't Veer LJ，Dai H，van De Vijver MJら，Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer．Nature 2002；415（6871）：530−536．

Yoo GHら，Docetaxel induced gene expression patterns in head and neck squamous cell carcinoma using cDNA microarray and PowerBlot．Clin Cancer Res 2002 12：3910−21．
本発明およびその利点が詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書中で種々の変更、置換、および変形を行うことができると理解すべきである。さらに、本発明の範囲は、本明細書中に記載のプロセス、機械、製造物、物質の組成、手段、方法、および工程の特定の実施形態に制限されることを意図しない。本発明の開示から当業者に容易に認識されるので、本明細書中に記載の対応する実施形態と実質的に同一の機能を発揮するか、実質的に同一の結果が得られる既存または後に開発されるプロセス、機械、製造物、物質の組成、手段、方法、または工程を本発明にしたがって使用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、これらの範囲内にこのようなプロセス、機械、製造物、物質の組成、手段、方法、または工程を含めることを意図する。

van't Veerら，2002によって使用された方法と比較した統計分析アプローチのアルゴリズムを示す図である。van't Veerらによって使用された予後分析は、25，000個の遺伝子を含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用し、そのうちの5，000個の発現の変化する遺伝子をフィルタリングによって選択した。これらのうち、231個の遺伝子は、予後結果に有意に関連することが見出された（｜r｜＜3）。次いで、これらの231個の遺伝子を、相関係数の大きさに基づいて並べ、最も小さな至適分類子（classifier）を構築するために5つ一組で選択した。次いで、70個の遺伝子の分類組を選択するために、結果と相関するN＝231遺伝子を使用して一点除外分析を行った。対照的に、本発明の分析では、一様に低発現の遺伝子またはその発現がサンプル毎に有意に変化しない遺伝子を除外するためにシグナル強度に基づくフィルタリングによって1，628個の遺伝子サブセットを選択した。対数変換後、t検定を使用して91個の識別（discriminatory）遺伝子を選択した。1，628個のフィルター遺伝子から出発して、分類子の能力を推定するために外部一点除外交差検証で全遺伝子選択および分類子の構築プロセスを繰り返し、精度88％の分類子を得た。 ドセタキセル応答に相関する遺伝子の階層的クラスタリングを示す図である。感受性腫瘍（S）を、25％以下の疾患残存と定義し（青色バーとして示す）、耐性腫瘍（R）を、25％超の疾患残存と定義する（赤色バーとして示す）。発現レベルを赤色（平均を超える遺伝子発現レベル）および青色（平均未満の遺伝子発現レベル）で示す。カラースケール（図の下を参照のこと）は、平均未満の3つ（またはそれ以上）の標準偏差（濃青色）から平均を超える3つの標準偏差（濃赤色）までの範囲である。アフィメトリックスプローブ組識別子および対応する遺伝子シンボルを、右側に示す。 陽性および陰性予測値がそれぞれ92％および83％である91個の遺伝子分類子を使用してドセタキセルに対する予測応答のための受信者動作特性（ROC）曲線を示す図である。曲線下面積は、0．96である。

【配列表】

Claims (26)

1. 患者から腫瘍サンプルを得る工程と、
   前記サンプルからRNAを単離する工程と、
   配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも10個の核酸のRNA中の各核酸の相対発現を決定する工程と、
   前記各核酸の相対発現をクラスタリングアルゴリズムに供することとを含み、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル耐性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル耐性を示し、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル感受性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル感受性を示す、ドセタキセル治療に応答する患者のスクリーニング方法。
2. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも50個の核酸のRNA中の各核酸の相対発現を決定する、請求項1に記載の方法。
3. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91の相対発現を決定する、請求項1に記載の方法。
4. 配列番号1、配列番号3、配列番号12、配列番号18、配列番号37、配列番号38、配列番号43、配列番号53、配列番号63、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号78、および配列番号87からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル耐性に関連する、請求項1に記載の方法。
5. 前記過剰発現が少なくとも2．5倍である、請求項4に記載の方法。
6. 配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍組織サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル感受性に関連する、請求項1に記載の方法。
7. 前記過剰発現が少なくとも2．5倍である、請求項6に記載の方法。
8. 前記クラスタリングアルゴリズムが、監視下の(supervized)クラスタリングアルゴリズムである、請求項1に記載の方法。
9. 前記RNA中の各核酸の相対発現の決定が、
   固体表面に結合した複数のプローブを得る工程と、前記複数のプローブの少なくとも10個が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる核酸群から選択される配列と相補的であることと、
   前記プローブを前記腫瘍組織サンプルから得たRNAと接触させる工程と、
   前記プローブへの前記RNAの結合を検出し、それにより前記核酸の相対発現の相違を同定する工程とを含む、請求項1に記載の方法。
10. 前記複数のプローブの少なくとも50個が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる核酸群から選択される配列に相補的である、請求項9に記載の方法。
11. 前記複数のプローブの少なくとも91個が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる核酸群から選択される配列に相補的である、請求項9に記載の方法。
12. 前記固体表面がガラスまたはニトロセルロースである、請求項9に記載の方法。
13. 前記結合の検出が蛍光標識または放射性標識を検出する工程を含む、請求項9に記載の方法。
14. 前記腫瘍組織サンプルが原発性乳癌である、請求項1に記載の方法。
15. 前記腫瘍組織サンプルが針生検である、請求項1に記載の方法。
16. 前記針生検がパラフィン包埋されている、請求項15に記載の方法。
17. ドセタキセル治療中の種々の時点で患者から腫瘍組織サンプルを得る工程と、
    前記サンプルからRNAを単離する工程と、
    配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも50個の核酸の前記サンプル中のRNA中の各核酸の相対発現を決定する工程と、
    前記サンプルの各核酸の相対発現をクラスタリングアルゴリズムに供することとを含み、前記クラスタリングアルゴリズムの結果が前記サンプル中の各核酸の相対発現がドセタキセル耐性腫瘍に特有であることを示す場合、前記サンプルはドセタキセル耐性を示す、ドセタキセル治療を受けた癌患者のモニタリング方法。
18. 各サンプルがデセタキセル耐性に関連する遺伝子発現プロフィールを示す場合、ドセタキセル治療が妨害される、請求項18に記載の方法。
19. 配列番号1、配列番号3、配列番号12、配列番号18、配列番号37、配列番号38、配列番号43、配列番号53、配列番号63、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号78、および配列番号87からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル耐性に関連する、請求項17に記載の方法。
20. 前記過剰発現が少なくとも2．5倍である、請求項15に記載の方法。
21. 配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも1つの核酸の腫瘍組織サンプル中の相対過剰発現がドセタキセル感受性に関連する、請求項14に記載の方法。
22. 前記過剰発現が少なくとも2．5倍である、請求項17に記載の方法。
23. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも10個の核酸の固体表面に結合した相補的核酸プローブを含むドセタキセル耐性についての患者のスクリーニングアレイ。
24. 前記アレイが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91からなる群から選択される少なくとも50個の核酸を含む、請求項23に記載のアレイ。
25. 前記アレイが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、および配列番号91を含む、請求項23に記載のアレイ。
26. 前記固体表面がガラスまたはニトロセルロースを含む、請求項23に記載のアレイ。

Images