JP2006343127A

JP2006343127A - 代謝性症候群マーカーおよびその利用

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Publication number: JP2006343127A
Application number: JP2005166833A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Yamagishi; 昌一山岸; Tsutomu Imaizumi; 勉今泉
Original assignee: Kurume University
Current assignee: Kurume University
Priority date: 2005-06-07
Filing date: 2005-06-07
Publication date: 2006-12-21

Abstract

【課題】代謝性症候群の指標となる有用な診断マーカーおよび診断マーカーを指標とする代謝性症候群の診断方法を提供する。
【解決手段】酸化ＬＤＬからなる代謝性症候群の診断マーカーであって、酸化ＬＤＬが陰イオン交換クロマトグラフィーにより最も強く保持される画分であり、血液試料中の酸化ＬＤＬを測定することを含み、測定工程が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて酸化ＬＤＬを分画することにより行われる、代謝性症候群の診断方法、代謝性症候群診断マーカーとしての酸化ＬＤＬの使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、代謝性症候群の診断マーカーおよび代謝性症候群の診断方法に関するものである。具体的には、血中酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）を指標とする代謝性症候群の診断方法に関するものである。

低比重リポタンパク質（以下、ＬＤＬと称する）は、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞において酸化的変性を受け易く、酸化的変性により酸化ＬＤＬとなる。酸化ＬＤＬが動脈硬化症の病因において重要な役割を果たしていることはよく知られた事実である（非特許文献１〜５）。酸化ＬＤＬは、動脈壁で発見され、泡沫細胞の形成を刺激するのみならず、数々の炎症性反応を誘発することができ、これにより動脈硬化症の発症および進行に関与する（非特許文献４〜６）。最近、血液中を循環する酸化ＬＤＬが動脈硬化症の生化学的危険マーカーとして見出され、その血中濃度は循環器疾患で上昇している（非特許文献７〜９）。しかしながら、ヒトにおける血中酸化ＬＤＬと他の冠状動脈での危険因子との相関については、明らかにされないままだった。

最近、血中酸化ＬＤＬ濃度を測定するための免疫学的な方法がいくつか開発されている（非特許文献１０〜１１）。しかしながら、当該免疫学的方法は、（ｉ）血液検体を分析する際に、各検体を遠心分離してＬＤＬ画分を得なければならず、このため、不安定かつ再現性のないアッセイである、また、（ｉｉ）マロンジアルデヒドにて修飾されたＬＤＬ等の代表的な血中酸化ＬＤＬしか検出できないという臨床上適用するには問題点があった。

近年、動脈硬化の危険因子である肥満、高血圧、高血糖および高脂（コレステロール）血症という因子を重複して持つ人は、たとえ個々の異常の程度は軽くても、全く持たない人に比べ、心筋梗塞や脳梗塞の発症リスクが格段に高くなるということがわかってきた。このような状態を代謝性症候群と命名し、ＷＨＯ、米国高脂血症ガイドラインなどで診断基準が定められている。
代謝性症候群はインシュリン抵抗性に強く関連しており、アテローム発生性異脂血症、内臓肥満、高血圧、糖尿病等の冠状動脈での危険因子のクラスターとして認識されている（非特許文献１２）。代謝性症候群の診断に当たっては、従来喫煙の有無、血圧（特に平均動脈圧、ＭＡＰ）、肥満指数（Ｂｏｄｙｍａｓｓｉｎｄｅｘ，ＢＭＩ；体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗にて割り出す）、腰部周囲長／臀部周囲長比（ＷＨＲ；腰部（最も低い肋骨縁と腸骨稜の中間位置）の周囲長と臀部（最も幅の広い転子 (大腿骨付近の骨突起)の部分)の周囲長との比）、血中の総コレステロール値、トリグリセリド値、ＨＤＬ−コレステロール値（ＨＤＬとは、高比重リポタンパク質を意味する）およびＬＤＬ−コレステロール値、糖化ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ）値、インスリン値（後述するように、インスリン抵抗性の恒常性モデルアセスメント（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を用いる）および高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、絶食後の血糖値（グルコース負荷後の測定値も含む）、頚動脈の内膜−中膜の厚さ（ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、ＩＭＴ）等、多岐の項目を測定することにより診断していた。また、診断基準も各国によりまちまちであった。
そのため、これら危険因子の全部または一部（特に、リポタンパク質）の測定に代わり得、また正確かつ簡便な新たな診断項目を探索することが医療現場では希求されていた。
Goldstein JLら、Science、vol.292、p.1310-1312 (2001) Mertens Aら、FASEB J.、vol.15、p.2073-2084 (2001) Ross R、Annu Rev Physiol.、vol.57、p.791-804 (1995) Yla-Herttuala Sら、J Clin Invest.、vol.84、p.1086-1095 (1989) Stockr Rら、Physiol Rev.、vol.84、p.1381-1478 (2004) Hansson GK、Curr Atheoroscler Rep.、vol.1、p.150-155 (1999) Holvoet Pら、Arterioscler Thromb Vasc Biol.、vol.21、p.844-848 (2001) Ehara Sら、Circulation、vol.103、p.1955-1960 (2001) Hulthe Jら、Arterioscler Thromb Vasc Biol.、vol.22、p.1162-1167 (2002) Holvoet Pら、Diabetes、vol.53、p.1068-1073 (2004) Kitano Sら、Analytica Chemica Acta.、vol.509、p.229-235 (2004) Scheen AJ、Minerva Endocrinol.、vol.29、p.31-45 (2004)

代謝性症候群の異脂血症では小さく、密度の高い（small and dense）ＬＤＬ粒子が含まれ、これらは容易に酸化される（Hansel Bら、J Clin Endo Metab.、vol.89、p.4963-4971 (2004)）。代謝性症候群の患者はまた、循環器疾患を発症するリスクが高いことから（Isomaa Bら、Diabetes Care、vol.24、p.683-689 (2001)）、酸化ＬＤＬ濃度が代謝性症候群に関係しているかどうかを、および酸化ＬＤＬ濃度の上昇が循環器疾患における加速された動脈硬化症を説明できることを明らかにすることは疾患の予防または治療および診断に重要であると考えられる。
本発明の目的は、代謝性症候群の指標となる有用なバイオマーカーおよび当該バイオマーカーを指標とする代謝性症候群の診断方法を提供することである。

本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、動脈硬化症の病因において重要な役割を果たしている酸化ＬＤＬが代謝性症候群の診断に有用なバイオマーカーとして用い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
（１）酸化ＬＤＬからなる代謝性症候群の診断マーカー、
（２）酸化ＬＤＬが陰イオン交換クロマトグラフィーにより最も強く保持される画分である、上記（１）記載のマーカー、
（３）血液試料中の酸化ＬＤＬを測定することを含む、代謝性症候群の診断方法、
（４）測定工程が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて酸化ＬＤＬを分画することにより行われる、上記（３）記載の方法、
（５）酸化ＬＤＬが陰イオン交換クロマトグラフィーにより最も強く保持される画分である、上記（４）記載の方法、
（６）代謝性症候群診断マーカーとしての、酸化ＬＤＬの使用。

本発明のマーカーを構成する酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）は、トリグリセリド濃度、ＨＤＬ−コレステロール濃度、腰部周囲長／臀部周囲長比、平均動脈圧、インスリン抵抗性の恒常性モデルアセスメントおよび高感度Ｃ反応性タンパク質等の代謝性症候群の要因と相関関係を有することから、酸化ＬＤＬ単独を代謝性症候群の診断マーカーとして用いることができる。このようなマーカーを指標とする本発明の診断方法は、簡便かつ再現性良く代謝性症候群を診断することができる。

以下の実験例においても詳細に説明するように、本発明者らは１１９名（男性９０名、女性２９名；平均年齢５７±１歳）の対象者を採用し、その完全な病歴把握および健康診断、血液組成の決定、酸化ＬＤＬ濃度、頚動脈の二重スキャニングを行った。これら対象者は、冠動脈および末梢動脈での疾患症状はなく、投薬も受けていない。一変量分析から、酸化ＬＤＬ濃度がトリグリセリド濃度、ＨＤＬ−コレステロール濃度（逆方向に）、腰部周囲長／臀部周囲長比、平均動脈圧、インスリン抵抗性の恒常性モデルアセスメントおよび高感度Ｃ反応性タンパク質に有意に相関することが明らかとなった。ステップワイズ重回帰分析では、酸化ＬＤＬ濃度がトリグリセリドにｐ＜０．０００１の確率にて、また、ＨＤＬ−コレステロールにｐ＜０．０５の確率にて有意に相関した。ｐ＜０．０００１の確率とは、対象者において酸化ＬＤＬ濃度の四分位値と代謝性症候群の要因数の累計との間で有意な相関を示すことを意味している。さらに、ステップワイズ重回帰分析は、酸化ＬＤＬが頚動脈の内膜−中膜の厚さ（ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、ＩＭＴ）に有意に相関していることを示した（高分解能超音波診断法により測定した）。従って、酸化ＬＤＬは、代謝性症候群の診断マーカーとして有用である。

本発明は、血液試料中の酸化ＬＤＬを測定することを含む、代謝性症候群の診断方法に関する。

本発明の診断方法を適用することができる対象としては、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ミニブタ、無毛ブタなどが挙げられる。好ましくは、対象動物はヒトである。

本発明の検査対象は、特に限定されるものでなく、ヒトにおいては一般の健康診断の対象者であり得る。

本発明の方法に用いられ得る生体試料は、血液試料である。血液としては、全血、血清、血漿のいずれであってもよく、これらは、対象から採取した血液を常法に従って処理することで、適宜、得ることができる。

本発明において、酸化ＬＤＬの測定は、ＥＬＩＳＡ法などの免疫学的手法、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法によって行うことができる。その中でも迅速性、定量性および感度に優れた、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法により測定を行うのが好ましい。

一実施形態では、例えば、血液試料中の酸化ＬＤＬは、以下に示す改良した陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥ−ＨＰＬＣ）法により検出することができる。

改良したＡＥ−ＨＰＬＣ法とは、既報（Haginakaら、J Chromatogr B Biomed Sci Appl.、751(1)、p.161-7（2001）；Yamaguchiら、Atherosclerosis、156(1)、p.109-17（2001）；Yamaguchiら、Eur J Pharmacol.、436(1-2)、p.97-105（2002）；Yamaguchiら、Atherosclerosis、172(2)、p.259-65（2004）を参照）の方法において、以下の点を改良したものである：１）陰イオン交換ゲルの物理化学的特性、２）段階的溶出の条件、および３）ポストカラム反応コイルの材質。具体的には、１）表面が親水性の層から構成され、その陰イオン交換基が主に表面近くに配置しているＤＥＡＥ−陰イオン交換ゲル（Haginakaら、米国特許出願公開ＵＳ２００４０１９１２５および特開２００４−８３５６１を参照）、２）段階的溶出が、下記溶離液ＡおよびＢを用いて行われること、および３）ステンレス製コイルをテフロン（登録商標）コイルに置き換えた、ポストカラムの酵素反応コイル、である。

以下に改良したＡＥ−ＨＰＬＣ法で生体試料中の酸化ＬＤＬを検出する方法を詳述するが、本発明はこれに限定されない。

改良したＡＥ−ＨＰＬＣ法において、例えば、生体試料としてはヒト血液が用いられる。生体試料としてヒト血液を用いる場合、例えば、空腹時の血液を採取し、採取後４時間以内に血漿および血清サンプルを公知の手段により分離し、使用するまで−２０℃で保存することにより、安定したサンプルを供給することができる。

血漿および血清サンプルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０倍に希釈し、サンプルの２０μｌアリコートをＡＥ−ＨＰＬＣシステムＣＬＡＳＳＬＣ−１０Ａシリーズ（島津製作所製）に注入する。血漿および血清ＬＤＬは、溶離液Ａ（１ｍＭＥＤＴＡ−３Ｎａを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））および溶離液Ｂ（１ｍＭＥＤＴＡ−３Ｎａを含む０．５ＭＮａＣｌ）を用いた段階的溶出により分離する。分離は２５℃で１．０ｍｌ／分の流速で行う。

ポストカラム反応は、各リポプロテインおよびＬＤＬ画分中の総コレステロール濃度を決定するために行う。ポストカラム反応は、コレステロール試薬（コレステロールエステラーゼ（１２２Ｕ／ｍｌ、０．５ｍｇ／Ｌ）、コレステロールオキシダーゼ（２２Ｕ／ｍｌ、１．０ｍｇ／Ｌ）、ペルオキシダーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ、１０ｍｇ／Ｌ）およびホモバニリン酸（５０ｍｇ／Ｌ）を０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの）を、０．５ｍｌ／分の流速でテフロン（登録商標）コイル（１５ｍ×０．５ｍｍＩ．Ｄ．）（４５℃のカラムオーブン中）に送液することで行う。溶出画分中のコレステロールは、コレステロール試薬中の酵素と反応し、定量的に過酸化水素を生成し、生成した過酸化水素がホモバニリン酸と反応して、蛍光物質が生じる。

次いで、反応液および０．１ＭＮａＯＨ水溶液を、０．５ｍｌ／分の流速でステンレス製の反応コイルに送液し、蛍光検出器（励起波長３２５ｎｍ、放射波長４２０ｎｍ）にて、上記蛍光物質を検出・測定することができる。

上記方法により溶出したＬＤＬの画分は、溶出順にＬＤＬ−１、ＬＤＬ−２、ＬＤＬ−３のサブ画分とすることができる。これらのサブ画分はａｐｏＢを含み、さらにＬＤＬ−２およびＬＤＬ−３には、ａｐｏＢの小断片が見られる。最も強く保持される画分であるＬＤＬ−３は、アガロースゲル電気泳動による分析を行った場合、サブ画分の中で最も早く陽極方向に移動し、ＬＤＬ−２およびＬＤＬ−１がそれに続く。また、生体外で酸化させたＬＤＬは、ＬＤＬ−３の画分に相当する。これらのことは、ＬＤＬ−３画分が酸化ＬＤＬに相当することを示している。

従って、例えば、上記の改良したＡＥ−ＨＰＬＣ法を用いる場合、ＬＤＬ−３画分を検出・測定することにより、酸化ＬＤＬを定量することができる。

血液中に酸化ＬＤＬが一定レベル以上検出された場合、当該血液の由来する対象は、代謝性症候群に罹患する／している可能性が高いと判断することができる。この場合、血液中の酸化ＬＤＬ濃度が高いほど代謝性症候群に罹患する／している確率が高いとすることもできる。逆に、血液中に酸化ＬＤＬが一定レベル未満で検出された場合、当該血液の由来する対象は、代謝性症候群に罹患する／している可能性が低いと判断することができる。

酸化ＬＤＬの血中濃度は、後述の実施例に示されているような４分位値により設定することができる。

血中酸化ＬＤＬ濃度が、約２．５ｍｇ／ｄｌ〜約５ｍｇ／ｄｌ（平均値で示すと約４ｍｇ／ｄｌ）を示す場合は、代謝性症候群に罹患していないと診断することができる。従って、代謝性症候群の判定の目安は、血中酸化ＬＤＬ濃度が約５．５ｍｇ／ｄｌ以上、好ましくは約６．０ｍｇ／ｄｌ以上、より好ましくは約６．５ｍｇ／ｄｌ以上である。

本発明の方法は、対象が代謝性症候群に罹患する／している可能性があるか否かを、簡便かつ高い精度で判断し得る。例えば、本発明の方法において、代謝性症候群に罹患する可能性が高いと判断された対象に対し、代謝性症候群を予防するための対策（例えば、生活習慣の改善）を講じることができるので、本発明は代謝性症候群を予防するための診断方法としても有用である。

以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

検査試験例
（１）試験検査方法は以下のとおりである。
（ａ）試験デザイン
２６から７７歳の１２１名の治験ボランティアを集め、通常の医療診断、すなわち、完全な病歴把握および健康診断、血清組成、心電図および胸のＸ線写真診断を行った。
これらボランランティアは、投薬を受けていないし、冠動脈または末梢動脈の疾患症状を示していなかった。しかし、２名の血清クレアチニン値が≧１．５ｍｇ／ｄＬを示し、腎不全と診断されたことから除き、残りの１１９名（男性：９０名、女性：２９名）について、治験を行った。なお、本治験にあたり、久留米大学倫理委員会の事前の承認を得、かつこれら１１９名の対象者各人よりインフォームドコンセントを得た。
一夜絶食後の翌朝、仰向け状態で少なくとも５分休憩後、右腕で水銀血圧計を用いて少なくとも２回血圧を測定した。収縮期血圧および拡張期血圧をコロトコフ音の第１点および第５点として測定し、平均動脈圧（ＭＡＰ）を計算した。絶食血液サンプルを脂質プロファイル測定（酸化ＬＤＬ、総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ−コレステロール、およびＨＤＬ−コレステロール）、糖化ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ）、インスリン、および高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）のため得た後、７５ｇの経口的グルコース負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）を各人に行った。血漿グルコース濃度を測定するために血液検体をグルコース負荷と同時（０分）、負荷後、６０分および１２０分に採取した。血漿グルコース値の時間と共に増加する範囲（Σグルコース）をグルコース負荷の指標として計算した。本治験エントリー時点での喫煙者およびエントリー前３ヶ月以内に中止した者を含め、喫煙者として定義した。腰部周囲長／臀部周囲長比（ＷＨＲ）を上記定義にしたがい測定した。インスリン抵抗性は、インスリン抵抗性の恒常性モデルアセスメント（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を用いて、絶食時の血中グルコースとインスリン濃度から次式により求めた。ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（絶食時の血漿インスリン濃度［μＵ／ｍＬ］×絶食時の血漿グルコース濃度［ｍｍｏｌ／Ｌ］）／２２．５。

（ｂ）酸化ＬＤＬの測定
ヒト血漿リポタンパク質をＹａｍａｇｕｃｈｉＹｅｔａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１９９８；１３９：３２３−３３１に記載の方法に準じてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）型陰イオン交換ゲルカラムを用いた改変高速液体クロマトグラフィーにて段階的溶出にて分離した。即ち、空腹時の血液を採取し、採取４時間以内に血漿および血清サンプルを公知の手段により分離し、使用するまで−２０℃で保存した。血漿サンプルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０倍に希釈し、サンプルの２０μｌアリコートをＡＥ−ＨＰＬＣシステムＣＬＡＳＳＬＣ−１０Ａシリーズ（島津製作所製）に注入した。血漿ＬＤＬは、溶離液Ａ（１ｍＭＥＤＴＡ−３Ｎａを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））および溶離液Ｂ（１ｍＭＥＤＴＡ−３Ｎａを含む０．５ＭＮａＣｌ）を用いた段階的溶出により分離した。分離は２５℃で１．０ｍｌ／分の流速で行った。この方法では、ＬＤＬはその負電荷によりＬＤＬ−１、ＬＤＬ−２およびＬＤＬ−３に分画された。カラムに最も強く保持される画分であるＬＤＬ−３は、アガロースゲル電気泳動による分析を行った場合、その分子での負の正味電荷を反映して陽極方向へ素早く移動した。ＬＤＬ−３でのアポリポプロテインＢが最も断片化された。さらに、試験管内にて調製した様々な種類の酸化ＬＤＬがＬＤＬ−３の位置へ移動することから、ＬＤＬ−３を生体内で循環する酸化ＬＤＬとして規定した。本発明者らは、この手法が正確かつ再現性があり（日内精度＜３．６％、日間精度＜４．９％）、かつ、アッセイに先だってリポタンパク質を抽出することが不要であることから、時間が節約できるということを確認した。

（ｃ）その他の化学的分析
総コレステロール値、トリグリセリド値、ＬＤＬ−コレステロール値およびＨＤＬ−コレステロール値は、市販されているキット（和光純薬（株））を用いて酵素的に決定した。ＨｂＡ_１ｃは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＡ−８１６０、アークレイ（株））にて分析した。ｈｓＣＲＰは、ベーリングダイアグノスティック社からの比濁測定キットにて測定した。血漿グルコース値は、グルコースデヒドロゲナーゼ紫外試験（メルクリキッドグル；関東化学（株））により測定した。インスリンは、ダコダイアグノスティック社からの酵素免疫測定キットにて定量した。

（ｄ）代謝性症候群の要因
ＴｈｉｒｄＲｅｐｏｒｔｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）ＥｘｐｅｒｔＰａｎｅｌｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＨｉｇｈＢｌｏｏｄＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎＡｄｕｌｔｓ（ＡｄｕｌｔｓＴｒｅａｔｍｅｎｔＰａｎｅｌＩＩＩ）：ｆｉｎａｌｒｅｐｏｒｔ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２；１０６：３１４３−３４２１）によると、代謝性症候群（腹部肥満）は次の５要因に分類されている。すなわち、腰部周囲長（男性：＞１０１．６ｃｍ、女性：＞８８．９ｃｍ）、トリグリセリド値（≧１５０ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ−コレステロール値（男性：＜５０ｍｇ／ｄＬ、女性：＜４０ｍｇ／ｄＬ）、血圧（≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ）および絶食時グルコース値（≧１１０ｍｇ／ｄＬ）にて同定される。しかしながら、日本人は欧米人より一般的に小さいことから、上記基準を適用することは相応しくなく、本発明者らは、ＷＨＯによりＤｉａｂｅｔＭｅｄ．２００４；２１：３８３−３８７に提案されたように、ＷＨＲを採用し、男性では＞０．９、女性では＞０．８５である場合を腹部肥満と定義した。

（ｅ）ＩＭＴの測定
通常の頚動脈のＩＭＴ値は、１０ＭＨｚの変換器を備えた二重超音波診断装置（ＳＳＡ−３８０Ａ、東芝（株））を用いて求めた。測定対象者の背景に関する情報を与えていない一人の熟練した技能者が、心周期の拡張期相での断面Ｂモード画像を記録した。高分解ライン記録器（ＬＳＲ−１００Ａ、東芝(株)）を用いて画像を拡大し、印刷した。ＩＭＴの測定は、頸部分岐に最も近い１から３ｃｍの場所にある横壁および中間壁の３レベルを精密なスライド式カリパスを用いて前記技能者が行った。これら６回の測定値の平均値をＩＭＴ値として採用した。相互および内部の観測変動係数は、それぞれ３．８％、４．２％であった。

（ｆ）統計解析
結果は、平均値±ＳＥＭにて表わす。循環酸化ＬＤＬレベルにおけるそれぞれの危険因子ポテンシャルの効果について、連続変数（トリグリセリド値、ＨＤＬ−コレステロール値、ＷＨＲ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、およびｈｓＣＲＰ）に対する直線回帰を用いて一変量分析を行った。危険因子と酸化ＬＤＬ値の相関関係は、ステップワイズ重回帰分析を用いて検討した。代謝性症候群の要因の数によって層別化した酸化ＬＤＬの平均値は、共変数を用いて比較した。危険因子、酸化ＬＤＬ値およびＩＭＴ値の相互作用は、ステップワイズ重回帰分析によって検討した。統計的有意性を示す水準としてｐ＜０．０５の有意確率を採用した。

（２）結果
（ａ）対象者
対象者中、非喫煙者は７９名で、喫煙者は４０名（喫煙者の定義については上記したとおり）であった。ＭＡＰは、９３±１ｍｍＨｇであった。平均総コレステロール値、トリグリセリド値、ＨＤＬ−コレステロール値および酸化ＬＤＬ値は、それぞれ２１０±３ｍｇ／ｄＬ、１２５±６ｍｇ／ｄＬ、５８±１ｍｇ／ｄＬおよび５．２±０．２ｍｇ／ｄＬであった。絶食時の平均血漿グルコース濃度、ΣグルコースおよびＨｂＡ_１ｃ濃度はそれぞれ１０３±３ｍｇ／ｄＬ、４０８±１１ｍｇ／ｄＬ×時間および６．０±０．２％であった。ＢＭＩの平均値は２３±０．３（体重（ｋｇ）／身長（ｍ）^２）であった。

（ｂ）循環酸化ＬＤＬ濃度と代謝性症候群の誘発危険因子との関係
一変量分析から、図１に示すように、血中循環酸化ＬＤＬ濃度とトリグリセリド値（ｒ＝０．４２２，ｐ＜０．０００１）、ＨＤＬ−コレステロール値（ｒ＝−０．４６９，ｐ＜０．０００１，逆方向に）、ＷＨＲ（ｒ＝０．３１７，ｐ＝０．０００６）、ＭＡＰ（ｒ＝０．１１，ｐ＝０．０００３）、ＨＯＭＡ−ＩＲ（ｒ＝０．２１６，ｐ＝０．０３）およびｈｓＣＲＰ（ｒ＝０．３１２，ｐ＝０．０００７）との間で有意な相関関係があることが明らかとなった。血中循環酸化ＬＤＬ濃度は、女性よりも男性（ｐ＝０．００１６）に、また、非喫煙者よりも喫煙者（ｐ＝０．０３７７）に有意に高い値が示された。しかしながら、総コレステロール値、ＬＤＬ−コレステロール値、血漿グルコース濃度、Σグルコース値、およびＨｂＡ_１ｃ濃度には相関しなかった。図１に示した因子について、ステップワイズ重回帰分析（表１、ｒ^２＝０．４１）を行った。

この解析から、トリグリセリド値（Ｆ＝７３．１，ｐ＝０．００１）およびＨＤＬ−コレステロール値（Ｆ＝５．６，ｐ＝０．０２）は、酸化ＬＤＬに対し、有意のままであり、また、それぞれ独立して有意に相関していることが明らかとなった。さらに、図２に示すように、血中循環酸化ＬＤＬ濃度の四分位値と代謝性症候群の要因の数の累計との間にｐ＜０．０００１で有意な関連が観察された。

（ｃ）循環酸化ＬＤＬ濃度とＩＭＴとの関係
検査対象者の平均ＩＭＴ値は、０．５９±０．０１ｍｍ（測定値の幅は０．３６〜０．９４）であった。ステップワイズ重回帰分析（表２、ｒ^２＝０．４１）によると、ＩＭＴは、酸化ＬＤＬ濃度（Ｆ＝５．２，ｐ＝０．０２５）、年齢（Ｆ＝４９．４，ｐ＝０．００１）および総コレステロール値（Ｆ＝５．２，ｐ＝０．０２５）と有意に相関した。

（考察）
上記試験例により、ステップワイズ重回帰分析によると、血中酸化ＬＤＬ濃度はトリグリセリド値およびＨＤＬ−コレステロール値に有意に相関し、代謝性症候群の要因の数に強く関連したことが明らかとなった。小さく、かつ密度の高い（Small, dense：ＳＤ）ＬＤＬフェノタイプは、最も頻繁に高トリグリセリド血症、ＨＤＬ−コレステロール濃度の低下およびインスリン抵抗性に付随しており、容易に酸化される（Hansel Bら、J Clin Endo Metab.、vol.89、p.4963-4971 (2004)およびLamarche Bら、Diabetes Metab.、vol.25、p.199-211（1999））。したがって、血中酸化ＬＤＬと代謝性症候群との臨床的関連性の分子レベルでのメカニズムの解明が残されてはいるが、ＳＤＬＤＬの増加は代謝性症候群に罹患した患者での酸化ＬＤＬ濃度の上昇に寄与し得る。トリグリセリドとＨＤＬ−コレステロールとの比は、糖尿病患者でのＬＤＬ粒子のサイズの指標となることが報告され、トリグリセリド対ＨＤＬ−コレステロールのモル比が＞１．３３を示す患者の９０％がＳＤＬＤＬを有していると言われている（ＢｏｉｚｅｌＲｅｔａｌ．ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ．２０００；２３：１６７９−１６８５）。本試験例では、血中酸化ＬＤＬ濃度はトリグリセリド対ＨＤＬ−コレステロールのモル比が＞１．３３を示す者の方が、同比が≦１．３３の者よりも高い値（前者が、５．９±０．２ｍｇ／ｄＬを、後者が３．５±０．２ｍｇ／ｄＬ、ｐ＜０．０００１）を示し、血中酸化ＬＤＬが代謝性症候群でのＳＤＬＤＬと関連する可能性を示した。また、表２に示したステップワイズ重回帰分析から、血中酸化ＬＤＬ濃度が頚動脈ＩＭＴ値に有意に関連していることが判明した。ところで、超音波で測定された頚動脈ＩＭＴは、循環器系疾患の存在と関連し、臨床上明確な疾患がない患者の循環器疾患発症の予知ができる。また、頚動脈ＩＭＴ値は動脈硬化症の代理マーカーとして汎用されている（ＫａｓｔｅｌｅｉｎＪＪ，ｅｔａｌ．ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅＳｕｐｐｌ．２００３；４：３１−３６）。したがって、本発明結果は、血中酸化ＬＤＬ濃度の上昇が、代謝性症候群患者での加速した動脈硬化症および循環器疾患に対するリスクの増加を説明可能であることを示唆する。

本発明により、酸化ＬＤＬ、特に血中酸化ＬＤＬは代謝性症候群の発症危険因子と密接に関係しているので、当該酸化ＬＤＬは代謝性症候群の診断マーカーとして用い得ることが見出された。当該酸化ＬＤＬを代謝性症候群の診断マーカーとして用いることにより、有効かつ簡便な代謝性症候群の診断方法が提供される。

一変量分析により解析した血中酸化ＬＤＬ濃度と代謝性症候群の誘発危険因子との相関関係を示す図である。図中、（ａ）はトリグリセリド値、（ｂ）はＨＤＬ−コレステロール値、（ｃ）はＷＨＲ、（ｄ）はＭＡＰ、（ｅ）はＨＯＭＡ−ＩＲ、および（ｆ）はｈｓＣＰＲを意味する。血中酸化ＬＤＬ濃度の平均値が代謝性症候群の要因の数によって層別化されていることを示す図である。傾向に対し、ｐ＜０．０００１。

Claims

酸化ＬＤＬからなる代謝性症候群の診断マーカー。
酸化ＬＤＬが陰イオン交換クロマトグラフィーにより最も強く保持される画分である、請求項１記載のマーカー。
血液試料中の酸化ＬＤＬを測定することを含む、代謝性症候群の診断方法。
測定工程が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて酸化ＬＤＬを分画することにより行われる、請求項３記載の方法。
酸化ＬＤＬが陰イオン交換クロマトグラフィーにより最も強く保持される画分である、請求項４記載の方法。
代謝性症候群診断マーカーとしての、酸化ＬＤＬの使用。