JP2006328378A - ポリエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、経済的且つ効率的にポリエステルを製造する方法を提供する。
【解決手段】 ジカルボン酸及び／又はジオールがバイオマス資源から得られたものを用いて、ジカルボン酸とジオールとの反応によりポリエステルを製造する方法において、ポリエステルを更に鎖延長剤を用いて鎖延長する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ジカルボン酸及び／又はジオールを構成成分とするポリエステルの製造方法に関する。詳しくは、原料としてバイオマス資源由来のジカルボン酸成分及び／又はジオール成分を用いたポリエステルの製造方法に関する。

現在、化石燃料資源由来の原料を重縮合することにより製造される代表的なポリマーの一つであるが、近年の化石燃料資源枯渇への危惧や大気中の二酸化炭素増加という地球規模での環境問題の背景から、バイオマス資源からこれらのポリマーの原料を誘導する手法に注目が注がれている。これらの手法は、この資源が再生可能な資源である為、カーボンニュートラルの観点から今後特に重要なプロセスになると予想されている。

これまでに、発酵法を利用したバイオマス資源由来のグルコース、ブドウ糖、セルロース、油脂などからコハク酸、アジピン酸などのジカルボン酸を製造する技術が開発されてきた。（特許文献１、非特許文献１、２参照）。
しかしながら、これらのプロセスは、発酵により一旦ジカルボン酸を有機酸塩として得た後に中和、抽出、晶析等の工程を経て目的とするジカルボン酸を製造するプロセスである為、ジカルボン酸中には、バイオマス資源に含まれる窒素元素の他、発酵菌由来の窒素元素やアンモニアならびに金属カチオン等の多くの不純物が混入する特徴がある。

また、バイオマス資源由来のジオールの成分である１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、エチレングリコールなどは、直接バイオマス資源由来の原料から発酵法により得る方法と、相当するジカルボン酸を上記のような手法で発酵法により製造した後、これを還元触媒により水添して得る方法がある（非特許文献３参照）。
特開２００５−２７５３３号公報 Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｎｏ．５１ （１９９９） ５４５−５５２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｎｏ．１１６ （１９９４） ３９９−４００ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｍｐ． Ｎｏ．１７（１９８６）３５５−３６３

上述したような不純物を多く含有するバイオマス資源由来のジカルボン酸やジオールは、通常、更に精製処理により不純物量を低減させた上で用いられるが、本発明者らは、そのような精製処理を経たジカルボン酸やジオールにおいても、なおバイオマス資源に含まれる窒素元素の他、微生物や酵素由来の窒素元素や精製工程で使用されるアンモニア等の窒素元素、無機酸や有機酸、金属カチオン等が含まれる為、このようなバイオマス資源由来のジカルボン酸成分及び／又はジオール成分を原料として用いると、ポリエステルの熱安定性が低下して製造時の分解が顕著となり、ポリエステルの粘度が上昇しないという問題があった。

そこで、本発明は、バイオマス資源由来のジカルボン酸成分及び／又はジオール成分を原料として用いる場合において、経済的且つ効率的にてポリエステルを製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、上述のような不純物が多く含まれるバイオマス資源由来のジカルボン酸成分及び／又はジオール成分を原料として用いた場合の生成ポリエステルは熱安定性に乏しい為、重合反応時のポリマーの熱分解が著しくなり、製造時の粘度低下が引き起こされる知見を得た。また、その熱安定性に特に影響を与える不純物は原料の精製時に使用する無機酸や有機酸であるとの知見を得た。そこで、これらの酸を中和するような塩基性の鎖延長剤を重合反応時に共存させると、容易に高粘度のバイオマス資源由来のポリエステルを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明の第１の要旨は、ジオール成分、及びジカルボン酸成分を構成成分とするポリエステルであって、ジカルボン酸成分及びジオール成分の少なくとも一方がバイオマス資源から誘導されたものであって、鎖延長剤を用いて該ポリエステルを鎖延長させることを特徴とするポリエステルの製造方法に存する。

本発明によれば、経済的且つ効率的にポリエステルを製造することができる。

以下、本発明につき詳細に説明する。
＜ポリエステル＞
本発明の対象とするポリエステルは、ジカルボン酸単位およびジオール単位を必須成分とする。なお、本発明においてジカルボン酸単位およびジオール単位を構成するジカルボン酸及びジオールは、少なくともいずれかがバイオマス資源から誘導されたものである。
これらバイオマス資源から誘導されたポリエステルでは、脂肪族ジカルボン酸単位及び脂肪族ジオール単位から構成される脂肪族ポリエステルが好ましい。

（１）ジカルボン酸単位
ジカルボン酸単位を構成するジカルボン酸としては、芳香族ジカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸或いはこれらの混合物が挙げられる。芳香族ジカルボン酸としては、テレフタル酸及びイソフタル酸等が挙げられ、芳香族ジカルボン酸の誘導体としては、芳香族ジカルボン酸の低級アルキルエステル、具体的には、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル及びブチルエステル等が挙げられる。この内、芳香族ジカルボン酸としては、テレフタル酸が好ましく、芳香族ジカルボン酸の誘導体としては、ジメチルテレフタレートが好ましい。脂肪族ジカルボン酸成分としては、脂肪族ジカルボン酸又はその誘導体が使用される。脂肪族ジカルボン酸としては、具体的には、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、ドデカン二酸、ダイマー酸ならびにシクロヘキサンジカルボン酸等の、通常、炭素数が２以上４０以下の鎖状或いは脂環式ジカルボン酸が挙げられる。また、脂肪族ジカルボン酸の誘導体として、上記脂肪族ジカルボン酸のメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル及びブチルエステル等の低級アルキルエステルや例えば無水コハク酸等の上記脂肪族ジカルボン酸の環状酸無水物も使用できる。これらの内、脂肪族ジカルボン酸としては、得られる重合体の物性の面から、アジピン酸、コハク酸、ダイマー酸またはこれらの混合物が好ましく、脂肪族ジカルボン酸の誘導体としては、アジピン酸及びコハク酸のメチルエステル、またはこれらの混合物が好ましい。

これらのジカルボン酸は単独でも２種以上混合して使用することもできる。
本発明において、これらのジカルボン酸は、バイオマス資源から誘導されるものが好ましい。
バイオマス資源としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植
物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣であり、最も好ましくはとうもろこし、さとうきび、キャッサバ、サゴヤシである。これらのバイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。

そしてこれらのバイオマス資源は、特に限定はされないが、例えば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その工程には、例えば、通常、特に限定はされないが、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルで粉砕工程が含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸で酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法、微生物や酵素処理による加水分解等生物学的処理が挙げられる。

上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、ペントサン、サッカロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の油脂、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、キシロースが好ましく、特にグルコースが好ましい。より広義の植物資源由来の炭素源としては、紙の主成分であるセルロースが好ましい。

これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりジカルボン酸が合成される。これらの中でも微生物変換による発酵法が好ましい。
微生物変換に用いる微生物としては、ジカルボン酸の生産能を有すれば特に限定されないが、例えば、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属 （米国特許第５１４３８３３
号明細書）等の嫌気性細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（米国特許第５５０４００４号明細書）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（米国特許第５７７０４３５号明細書）等の通性嫌気性細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５７:１４７−１５８）又は
Ｅ．ｃｏｌｉの株の変異体（特表２０００−５００３３３号公報、米国特許第６１５９７３８号明細書）など）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（特開平１１−１１３５８８号公報）などの好気性細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する好気性細菌（特開２００３−２３５５９３号公報）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ等の嫌気性ルーメン細菌などを用いることができる。

より具体的には、本発明に使用できる細菌の親株は、コリネ型細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌が好ましく、コリ
ネ型細菌がより好ましい。これらの菌は、微生物変換により琥珀酸の生産能を有する。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。

上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ， Ｗ．， Ｅｈｒｍａｎｎ， Ｍ．， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｗ． ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ
， Ｋ． Ｈ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９９１， ｖｏｌ． ４１， ｐ２５５−２６０）、本
発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。

なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現独立法人 産業技術総合研究所 特許寄託
センター)（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６)に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に
基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７が付与されている。

微生物変換における反応温度、圧力等の反応条件は、選択される菌体、カビなど微生物の活性に依存することになるが、ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、通常には中和剤を使用する。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節する。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。

中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。好ましくはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素である。なお上記アルカリ（土類）金属の水酸化物としてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、Ｍｇ（ＯＨ）_２等、或いはこれらの混合物などが挙げられ、アルカリ（土類）金属の炭酸塩としては、Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、ＣａＣＯ_３、ＭｇＣＯ_３、ＮａＫＣＯ_３等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。

ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されるが、一般的には、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９程度の範囲である。
発酵法を含む製造方法により得られるジカルボン酸の精製方法は、電気透析を用いる方
法、イオン交換樹脂を用いる方法、塩交換法等が知られている。例えばジカルボン酸塩を分離し純粋な酸を生成する電気透析および水分解工程を組み合わせて用いることによって製造し、更なる精製を、一連のイオン交換カラムに生成物ストリームを通すことによって達成しても良いし、ジカルボン酸の過飽和溶液に変換するための水分解電気透析を用いても良い（米国特許第５，０３４，１０５号明細書）。また、塩交換法としては、例えばジカルボン酸のアンモニア塩を硫酸水素アンモニウム及び／または硫酸と十分に低いｐＨで混合して反応させジカルボン酸及び硫酸アンモニウムを生成させても良い（特表２００１−５１４９００号公報）。イオン交換樹脂を用いる具体的方法としては、ジカルボン酸の溶液から遠心分離、濾過等により菌体等の固形分を除去した後、イオン交換樹脂で脱塩し、その溶液から結晶化或いはカラムクロマトグラフィーによりジカルボン酸を分離精製する方法が挙げられる。その他の精製方法としては、特開平３−３０６８５に記載のように水酸化カルシウムを中和剤として醗酵し、硫酸により硫酸カルシウムを析出させて除去した後、強酸性イオン交換樹脂、弱塩基性イオン交換樹脂を用いて処理する方法や特開平２−２８３２８９に記載のように発酵法により生成した琥珀酸塩を、電気透析した後、強酸性イオン交換樹脂、弱塩基性イオン交換樹脂を用いて処理する方法が例示される。更には、ＵＳＰ６２８４９０４、ならびに特開２００４−１９６７６８に記載の方法も好適に使用される。すなわち、本発明においては、精製方法はどのような方法を用いても良く、上記の、電気透析を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、硫酸等の酸で処理する方法、水、アルコール、カルボン酸或いはそれらの混合物を用いた晶析ならびに洗浄、ろ過、乾燥などの上記の公知文献や本発明の参考例に記載の任意の単位操作を任意の組み合わせで、必要に応じて繰り返し実施することにより本発明に適した精製されたモノマー原料を製造することができる。これらの中では、特に、コスト、効率の点でイオン交換法又は塩交換法が好ましく、工業的生産性の点で塩交換法が特に好ましい。

精製によりジカルボン酸中に含まれる不純物の窒素化合物や金属カチオンの量を減らすことが、通常、実用的な重合体を得るために必要である。
上述の方法にてバイオマス資源から誘導されたジカルボン酸には、バイオマス資源由来、発酵処理ならびに酸による中和工程を含む精製処理に起因して不純物として窒素元素が含まれてくる。具体的には、アミノ酸、たんぱく質、アンモニウム塩、尿素、発酵菌由来等の窒素元素が含まれてくる。

上述の方法にてバイオマス資源から誘導されたジカルボン酸中に含まれる窒素原子含有量は、ジカルボン酸質量に対して、原子換算にして、上限は通常２０００ｗｔｐｐｍ以下、好ましくは、１０００ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは１００ｗｔｐｐｍ以下、最も好ましくは５０ｗｔｐｐｍ以下である。下限は通常、０．０１ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは、精製工程の経済性の理由から０．１ｗｔｐｐｍ以上である。
本発明でいうｗｔｐｐｍとは質量ｐｐｍである。

窒素原子含有量は、元素分析法等の公知の方法や、アミノ酸分析計を用い、生体アミノ酸分離条件にて試料中のアミノ酸やアンモニアを分離し、これらをニンヒドリン発色させて検出する方法により測定される値である。
窒素原子含有量が上記の範囲にあるジカルボン酸を用いることで、得られるポリエステルの着色の減少に有利になる。また、ポリエステルの重合反応の遅延化を抑制する効果も併せ持つ。

ジカルボン酸中に含まれる不純物のアンモニアの量を効率的に減らす具体的な方法として、目的とするジカルボン酸よりもｐＨの高い弱酸性の有機酸を使用した反応晶析方法が挙げられる。
また、発酵法により製造したジカルボン酸を用いる場合には、酸による中和工程を含む精製処理により硫黄原子が含まれてくる場合が多い。具体的に、硫黄原子が含有される不
純物としては、硫酸、硫酸塩、亜硫酸、有機スルホン酸、有機スルホン酸塩等が挙げられる。その他、酸として塩酸や臭化水素を使用してもよい。

ジカルボン酸中に含まれる硫黄原子含有量は、ジカルボン酸質量に対して、原子換算にして、上限は通常１０００ｗｔｐｐｍ以下、好ましくは、１００ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは、上限が５ｗｔｐｐｍ以下、最も好ましくは、上限は０．５ｗｔｐｐｍ以下である。一方、下限は通常、０．００１ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは、０．０１ｗｔｐｐｍ以上、より好ましくは、０．１ｗｔｐｐｍ以上である。多すぎると、重合反応が遅延化したり、ポリマーの安定性が低下する傾向がある。また、貯蔵容器の腐食の問題も発生する。一方、少なすぎる系は、好ましい形態であるが、精製工程が煩雑となり経済的に不利になる。硫黄原子含有量は、公知の元素分析法により測定される値である。
具体的には、本発明における硫黄原子含有量は、試料を燃焼し発生した硫黄分を過酸化水素水に吸収させ、その硫酸イオンをイオンクロマトグラフを用いることにより測定することができる。

本発明において、上述の方法で得られたバイオマス資源由来のジカルボン酸をポリエステル原料として使用するにあたり、重合系に連結される該ジカルボン酸を貯蔵するタンク内の酸素濃度を一定値以下に制御することが好ましい。これによりポリエステルの不純物である窒素源などの酸化反応による着色を防止することができる。
酸素濃度を制御し原料を貯蔵するためには、通常タンクが用いられる。しかし、タンク以外でも酸素濃度を制御できる装置であれば特に限定されない。貯蔵タンクの種類は具体的には限定は無く、公知の金属製もしくはこれらの内面にガラス、樹脂などのライニングを施したもの、さらにはガラス製、樹脂製の容器などが用いられる。強度の面などから金属製もしくはそれらにライニングを施したものが好んで用いられる。金属製タンクの材としては、公知のものが使用され、具体的には、炭素鋼、フェライト系ステンレス鋼、ＳＵＳ４１０等のマルテンサイト系ステンレス鋼、ＳＵＳ３１０、ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６等のオーステナイト系ステンレス鋼、クラッド鋼、鋳鉄、銅、銅合金、アルミニウム、インコネル、ハステロイ、チタン等が挙げられる。

ジカルボン酸の貯蔵タンク内の酸素濃度は、貯蔵タンク全体積に対して、下限は特に限定されないが、通常０．００００１ｖｏｌ％以上、好ましくは０．０１ｖｏｌ％以上である。一方、上限が１６ｖｏｌ％以下、好ましくは１４ｖｏｌ％以下、より好ましくは、１２ｖｏｌ％以下である。酸素濃度が低すぎる場合には、設備や管理工程が煩雑になり経済的に不利であり、一方、高すぎる場合には、製造されるポリマーの着色が増加する傾向がある。

ジカルボン酸の貯蔵タンク内の温度は、下限が通常−５０℃以上、好ましくは０℃以上である。一方、上限が通常２００℃以下、好ましくは１００℃以下、より好ましくは、５０℃以下であるが、温度管理の必要がない理由から室温で貯蔵する方法が最も好ましい。温度が低すぎる場合には、貯蔵コストが増大する傾向があり、また、高すぎる場合には、カルボン酸の脱水反応等が併発する傾向がある。

ジカルボン酸の貯蔵タンク内の湿度は、下限は特に限定されないが、通常０．０００１％Ｒ．Ｈ．以上、好ましくは、０．００１％Ｒ．Ｈ．以上であり、より好ましくは、０．０１％Ｒ．Ｈ．以上、最も好ましくは、０．１％Ｒ．Ｈ．以上であり、上限が８０％Ｒ．Ｈ．以下、好ましくは６０％Ｒ．Ｈ．以下、より好ましくは４０％Ｒ．Ｈ．以下、更に好ましくは３０％Ｒ．Ｈ．以下、最も好ましくは１０％Ｒ．Ｈ．以下である。湿度が低すぎる場合には、管理工程が煩雑で経済的に不利になる傾向があり、また、高すぎる場合には、貯蔵タンクや配管へのジカルボン酸の付着、ジカルボン酸のブロック化、貯蔵タンクが金属製の場合にはタンクの腐食等が問題になる傾向がある。 特に、不純物硫黄原子含有
量が高くなる程その傾向が増大する傾向がある。

ジカルボン酸の貯蔵タンク内の圧力は、通常、大気圧（常圧）である。
（２）ジオール単位
本発明においてジオール単位とは、芳香族ジオール及び／又は脂肪族ジオールから誘導されるものであり、公知の化合物を用いることができるが、脂肪族ジオールを使用するのが好ましい。

脂肪族ジオールとは、２個のＯＨ基を有する脂肪族及び脂環式化合物であれば特に制限はされないが、炭素数の下限値が２以上であり、上限値が通常１０以下、好ましくは６以下の脂肪族ジオールが挙げられる。
脂肪族ジオールの具体例としては、例えば、エチレングリコール、１，３−プロピレングリコ−ル、ネオペンチルグリコール、１，６−ヘキサメチレングリコール、デカメチレングリコール、１，４−ブタンジオール及び１，４−シクロヘキサンジメタノール等が挙げられる。これらは、単独でも２種以上の混合物として使用してもよい。

この内、エチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロピレングリコ−ル及び１，４−シクロヘキサンジメタノ−ルが好ましく、その中でも、エチレングリコール及び１，４−ブタンジオ−ルが好ましく、更には、１，４−ブタンジオ−ルが特に好ましい。
芳香族ジオールとしては、２個のＯＨ基を有する芳香族化合物であれば、特に制限はされないが、炭素数の下限値が６以上であり、上限値が通常１５以下の芳香族ジオールが挙げられる。芳香族ジオールの具体例としては、例えば、ヒドロキノン、１，５−ジヒドロキシナフタレン、４，４‘−ジヒドロキシジフェニル、ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）メタン及びビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）―２，２―プロパン等が挙げられる。本発明において、ジオール全量中、芳香族ジオールの含有量は、通常、３０モル％以下、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下である。

また、両末端ヒドロキシポリエーテルを上記の脂肪族ジオールと混合して使用してもよい。両末端ヒドロキシポリエーテルとしては、炭素数は下限値が通常４以上、好ましくは１０以上であり、上限値が通常１０００以下、好ましくは２００以下、更に好ましくは１００以下である。
両末端ヒドロキシポリエーテルの具体例としては、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリ１，３−プロパンジオール及びポリ１，６−ヘキサメチレングリコール等が挙げられる。また、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合ポリエーテル等を使用することもできる。これらの両末端ヒドロキシポリエーテルの使用量は、ポリエステル中の含量として、通常９０重量％以下、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは３０重量％以下に計算される量である。

本発明において、これらのジオールは、バイオマス資源から誘導されたものを用いてもよい。具体的には、ジオール化合物はグルコース等の炭素源から発酵法により直接製造してもよいし、発酵法により得られたジカルボン酸、ジカルボン酸無水物、環状エーテルを化学反応によりジオール化合物に変換しても良い。
例えば１，４−ブタンジオールをコハク酸、コハク酸無水物、コハク酸エステル、マレイン酸、マレイン酸無水物、マレイン酸エステル、テトラヒドロフラン、γ−ブチロラクトン等から化学合成により１，４−ブタンジオールを製造しても良いし、発酵法により得られた１，３−ブタジエンから１，４−ブタンジオールを製造してもよい。この中でもコハク酸を還元触媒により水添して１，４−ブタンジオールを得る方法が効率的で好ましい。

コハク酸を水添する触媒の例として、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ及びその化合物が挙げられ、より具体的には、Ｐｄ／Ａｇ／Ｒｅ、Ｒｕ／Ｎｉ／Ｃｏ／ＺｎＯ、Ｃｕ／Ｚｎ酸化物、Ｃｕ／Ｚｎ／Ｃｒ酸化物、Ｒｕ／Ｒｅ、Ｒｅ／Ｃ、Ｒｕ／Ｓｎ、Ｒｕ／Ｐｔ／Ｓｎ、Ｐｔ／Ｒｅ／アルカリ、Ｐｔ／Ｒｅ、Ｐｄ／Ｃｏ／Ｒｅ、Ｃｕ／Ｓｉ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｍｎ、ＲｅＯ／ＣｕＯ／ＺｎＯ、ＣｕＯ／ＣｒＯ、Ｐｄ／Ｒｅ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｐｄ／ＣｕＯ／ＣｒＯ₃、リン酸Ｒｕ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｃｏ／Ｒｕ／Ｍｎ、Ｃｕ／Ｐｄ／
ＫＯＨ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｚｎが挙げられる。この中でもＲｕ／Ｓｎ又はＲｕ／Ｐｔ／Ｓｎが触媒活性の点で好ましい。

更に、バイオマス資源から公知の有機化学触媒反応の組み合わせによりジオール化合物を製造する方法も積極的に用いられる。例えば、バイオマス資源としてペントースを利用する場合には公知の脱水反応、触媒反応の組み合わせで容易にブタンジオール等のジオールを製造できる。
バイオマス資源由来から誘導されたジオールには、バイオマス資源由来、発酵処理ならびに酸による中和工程を含む精製処理に起因して不純物として窒素原子が含まれてくる場合がある。この場合、具体的には、アミノ酸、蛋白質、アンモニア、尿素、発酵菌由来の窒素原子が含まれてくる。

上述の方法により製造したジオール中に含まれる窒素原子含有量は、ジオール質量に対して、原子換算にして、上限は通常２０００ｗｔｐｐｍ以下、好ましくは、１０００ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは１００ｗｔｐｐｍ以下、最も好ましくは５０ｗｔｐｐｍ以下である。下限は特に制限されないが、通常、０．０１ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは、精製工程の経済性の理由から０．１ｗｔｐｐｍ以上である。

発酵法により製造したジオールを用いる場合には、酸による中和工程を含む精製処理により硫黄原子が含まれてくる場合がある。この場合、具体的に、硫黄原子が含有される不純物としては、硫酸、亜硫酸、有機スルホン酸塩等が挙げられる。
ジオール中に含まれる硫黄原子含有量は、ジオール質量に対して、原子換算にして、上限は通常１００ｗｔｐｐｍ以下、好ましくは、１０ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは、上限が５ｗｔｐｐｍ以下、最も好ましくは、上限は０．５ｗｔｐｐｍ以下である。一方、下限は特に制限されないが、通常、０．００１ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは、０．０１ｗｔｐｐｍ以上、より好ましくは、０．１ｗｔｐｐｍ以上である。多すぎると、重合反応が遅延化したり、製造するポリマーの安定性が低下する傾向がある。一方、硫黄原子含有量が少ない程、好ましい形態であるが、精製工程が煩雑となり経済的に不利になる。硫黄原子含有量は、公知の元素分析法により測定される値である。

本発明において、上述の方法で得られたバイオマス資源由来のジオールをポリエステル原料として使用するにあたり、上記不純物に起因するポリエステルの着色を抑制するため、重合系に連結されるジオールを貯蔵するタンク内の酸素濃度や温度を制御してもよい。この制御により、不純物により促進されるジオールの酸化反応が抑制され、不純物自身の着色やジオール酸化生成物によるポリエステルの着色を防止することができる。

酸素濃度を制御し原料を貯蔵するためには、通常タンクが用いられる。しかし、タンク以外でも酸素濃度を制御できる装置であれば特に限定されない。貯蔵タンクの種類は具体的には限定は無く、公知の金属製もしくはこれらの内面にガラス、樹脂などのライニングを施したもの、さらにはガラス製、樹脂製の容器などが用いられる。強度の面などから金属製もしくはそれらにライニングを施したものが好んで用いられる。金属製タンクの材としては、公知のものが使用され、具体的には、炭素鋼、フェライト系ステンレス鋼、ＳＵＳ４１０等のマルテンサイト系ステンレス鋼、ＳＵＳ３１０、ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１
６等のオーステナイト系ステンレス鋼、クラッド鋼、鋳鉄、銅、銅合金、アルミニウム、インコネル、ハステロイ、チタン等が挙げられる。

ジオールの貯蔵タンク内の酸素濃度は、貯蔵タンク全体積に対して、下限は特に限定されないが、通常０．００００１vol％以上、好ましくは ０．０００１vol％以上であり、より好ましくは、０．００１vol％以上、最も好ましくは、０．０１vol％以上であり、上限が通常１０vol％以下、好ましくは ５vol％以下、より好ましくは、１vol％以下、最
も好ましくは、０．１vol％以下である。酸素濃度が低すぎる場合には、管理工程が煩雑
となり経済的に不利になる傾向があり、また、高すぎる場合には、ジオールの酸化反応生成物によるポリマーの着色が増大する傾向がある。

ジオールの貯蔵タンク内の貯蔵温度は、下限が通常１５℃以上、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは、５０℃以上、最も好ましくは、１００℃以上であり、上限が２３０℃以下、好ましくは２００℃以下、より好ましくは、１８０℃以下、最も好ましくは、１６０℃以下である。温度が低すぎる場合には、ポリエステル製造時の昇温に時間を要し、ポリエステル製造が経済的に不利になる傾向があるばかりかジオールの種類によっては固化してしまう場合がある。一方、高すぎる場合には、ジオールの気化により高圧対応の貯蔵設備が必要となり経済的に不利になるばかりかジオールの劣化が増大する傾向がある。

ジオールの貯蔵タンク内の圧力は、通常大気圧（常圧）である。圧力が低すぎたり、高すぎる場合には、管理設備が煩雑になり経済的に不利となる。
本発明においては、上記のジオール成分とジカルボン酸成分に加えて、共重合成分を加えてもよい。
共重合成分の具体的な例としては、２官能のオキシカルボン酸や、架橋構造を形成するために３官能以上の多価アルコール、３官能以上の多価カルボン酸及び／又はその無水物並びに３官能以上のオキシカルボン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の多官能化合物が挙げられる。これらの共重合成分の中では、高重合度のポリエステルが容易に製造できる傾向があるため、特に２官能及び／又は３官能以上のオキシカルボン酸が好適に使用される。その中でも、３官能以上のオキシカルボン酸の使用は、後述する鎖延長剤を使用することなく、極少量で容易に高重合度のポリエステルを製造できるのでもっとも好ましい方法である。

２官能のオキシカルボン酸としては、具体的には、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシカプロン酸、２−ヒドロキシ３，３−ジメチル酪酸、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸等が挙げられるが、これらはオキシカルボン酸のエステルやラクトン、或いはオキシカルボン酸重合体等の誘導体であっても良い。また、これらオキシカルボン酸は単独でも、二種以上の混合物として使用することもできる。これらに光学異性体が存在する場合には、Ｄ体、Ｌ体、またはラセミ体のいずれでもよく、形態としては固体、液体、または水溶液であってもよい。これらの中では、入手の容易な乳酸またはグリコール酸が特に好ましい。形態は、３０〜９５％の水溶液のものが容易に入手することができるので好ましい。高重合度のポリエステルを容易に製造する目的で２官能のオキシカルボン酸を共重合成分として使用する場合、その効果が発現する使用量の下限としては、通常、原料モノマーに対して通常、０．０２モル％以上、好ましくは０．５モル％以上、より好ましくは１．０モル％以上である。一方、使用量の上限は、通常３０モル％以下、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下である。

３官能以上の多価アルコールとしては、具体的には、グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール等が挙げられ、単独でも、二種以上の混合物として使用する
こともできる。
３官能以上の多価カルボン酸またはその無水物としては、具体的には、プロパントリカルボン酸、無水ピロメリット酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸無水物、シクロペンタテトラカルボン酸無水物等が挙げられ、単独でも、二種以上の混合物として使用することもできる。

３官能以上のオキシカルボン酸としては、具体的には、リンゴ酸、ヒドロキシグルタル酸、ヒドロキシメチルグルタル酸、酒石酸、クエン酸、ヒドロキシイソフタル酸、ヒドロキシテレフタル酸等が挙げられ、単独でも、二種以上の混合物として使用することもできる。特に、入手のし易さから、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸ならびにその混合物が好ましい。

上記の３官能以上の多官能化合物単位の量は、ゲルの発生原因となるため通常、ポリエステルを構成する全単量体単位１００モル％に対して、上限値が通常、５モル％以下、好ましくは１モル％以下、更に好ましくは、０．５０モル％以下、特に好ましくは０．３モル％以下である。一方、高重合度のポリエステルを容易に製造する目的で３官能以上の化合物を共重合成分として使用する場合、その効果が発現する使用量の下限値としては、通常、０．０００１モル％以上、好ましくは、０．００１モル％以上、より好ましくは、０．００５モル％以上、特に好ましくは０．０１モル％以上である。

また、ポリエステルの融点の下限は、通常、５０℃以上あり、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、８０℃以上である。また上限は、脂肪族ポリエステルの場合、１４０℃以下であり、好ましくは１３０℃以下である。
本発明においては、溶融テンションを高めるために、少量のパーオキサイドを添加してもよい。また本発明においては、ポリエステル末端基をカルボジイミド、エポキシ化合物、単官能性のアルコール又はカルボン酸で封止しても良い。

＜ポリエステルの製造方法＞
ジオール単位及びジカルボン酸単位を主体とするポリエステルの製造は、公知の技術で行うことができる。このポリエステルを製造する際の重合反応は、従来から採用されている適切な条件を設定することができ、特に制限されない。具体的には、上記のジカルボン酸成分とジオール成分、更にオキシカルボン酸単位や３官能以上の成分を導入する場合には、それらの成分も含めたジカルボン酸成分とジオール成分とのエステル化反応及び／又はエステル交換反応を行った後、減圧下での重縮合反応を行うといった溶融重合の一般的な方法や、有機溶媒を用いた公知の溶液加熱脱水縮合方法によって製造することができるが、経済性ならびに製造工程の簡略性の観点から、無溶媒下で行う溶融重合法が好ましい。

ポリエステルを製造する際に用いるジオールの使用量は、ジカルボン酸またはその誘導体１００モルに対し、実質的に等モルであるが、一般には、エステル化及び／又はエステル交換反応及び／又は縮重合反応中の留出があることから、０．１〜２０モル％過剰に用いられる。
また、重縮合反応は、重合触媒の存在下に行うのが好ましい。重合触媒の添加時期は、重縮合反応以前であれば特に限定されず、原料仕込み時に添加しておいてもよく、減圧開始時に添加してもよい。

重合触媒としては、一般には、周期表で、水素、炭素を除く１族〜１４族金属元素を含む化合物が挙げられる。具体的には、チタン、ジルコニウム、錫、アンチモン、セリウム、ゲルマニウム、亜鉛、コバルト、マンガン、鉄、アルミニウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、ナトリウム及びカリウムからなる群から選ばれた、少なくとも１
種以上の金属を含むカルボン酸塩、アルコキシ塩、有機スルホン酸塩又はβ−ジケトナート塩等の有機基を含む化合物、更には前記した金属の酸化物、ハロゲン化物等の無機化合物及びそれらの混合物が挙げられる。

これらの中では、チタン、ジルコニウム、ゲルマニウム、亜鉛、アルミニウム、マグネシウム及びカルシウムを含む金属化合物、並びにそれらの混合物が好ましく、その中でも、特に、チタン化合物及びゲルマニウム化合物が好ましい。また、触媒は、重合時に溶融或いは溶解した状態であると重合速度が高くなる理由から、重合時に液状であるか、エステル低重合体やポリエステルに溶解する化合物が好ましい。

チタン化合物としては、テトラアルキルチタネートが好ましく、具体的には、テトラ−ｎ−プロピルチタネート、テトライソプロピルチタネート、テトラ−ｎ−ブチルチタネート、テトラ−ｔ−ブチルチタネート、テトラフェニルチタネート、テトラシクロヘキシルチタネート、テトラベンジルチタネート及びこれらの混合チタネートが挙げられる。また、チタン（オキシ）アセチルアセトネート、チタンテトラアセチルアセトネート、チタン（ジイソプロキシド）アセチルアセトネート、チタンビス（アンモニウムラクテイト）ジヒドロキシド、チタンビス（エチルアセトアセテート）ジイソプロポキシド、チタン（トリエタノールアミネート）イソプロポキシド、ポリヒドロキシチタンステアレート、チタンラクテート、チタントリエタノールアミネート、ブチルチタネートダイマー等も好んで用いられる。更には、酸化チタンや、チタンと珪素を含む複合酸化物（例えば、Ａｃｏｒｄｉｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｉｂｅｒｓ社製のチタニア／シリカ複合酸化物（製品名：Ｃ−９４））も好んで用いられる。これらの中では、テトラ−ｎ−プロピルチタネート、テトライソプロピルチタネート及びテトラ−ｎ−ブチルチタネート、チタン（オキシ）アセチルアセトネート、チタンテトラアセチルアセトネート、チタンビス（アンモニウムラクテイト）ジヒドロキシド、ポリヒドロキシチタンステアレート、チタンラクテート、ブチルチタネートダイマー、酸化チタン、チタニア／シリカ複合酸化物（例えば、Ａｃｏｒｄｉｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｉｂｅｒｓ社製の製品名：Ｃ−９４）が好ましく、テトラ−ｎ−ブチルチタネート、チタン（オキシ）アセチルアセトネート、チタンテトラアセチルアセトネート、ポリヒドロキシチタンステアレート、チタンラクテート、ブチルチタネートダイマー、チタニア／シリカ複合酸化物（例えば、Ａｃｏｒｄｉｓ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｆｉｂｅｒｓ社製の製品名：Ｃ−９４）がより好ましく、特に、テトラ−ｎ
−ブチルチタネート、ポリヒドロキシチタンステアレート、チタン（オキシ）アセチルアセトネート、チタンテトラアセチルアセトネート、チタニア／シリカ複合酸化物（例えば、Ａｃｏｒｄｉｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｉｂｅｒｓ社製の製品名：Ｃ−９４）が好ましい。

ジルコニウム化合物としては、具体的には、ジルコニウムテトラアセテイト、ジルコニウムアセテイトヒドロキシド、ジルコニウムトリス（ブトキシ）ステアレート、ジルコニルジアセテイト、シュウ酸ジルコニウム、シュウ酸ジルコニル、シュウ酸ジルコニウムカリウム、ポリヒドロキシジルコニウムステアレート、ジルコニウムエトキシド、ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシド、ジルコニウムテトライソプロポキシド、ジルコニウムテトラ−ｎ−ブトキシド、ジルコニウムテトラ−ｔ−ブトキシド、ジルコニウムトリブトキシアセチルアセトネートならびにそれらの混合物が例示される。更には、酸化ジルコニウムや、例えばジルコニウムと珪素を含む複合酸化物も好適に使用される。これらの中では、ジルコニルジアセテイト、ジルコニウムトリス（ブトキシ）ステアレート、ジルコニウムテトラアセテイト、ジルコニウムアセテイトヒドロキシド、シュウ酸ジルコニウムアンモニウム、シュウ酸ジルコニウムカリウム、ポリヒドロキシジルコニウムステアレート、ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシド、ジルコニウムテトライソプロポキシド、ジルコニウムテトラ−ｎ−ブトキシド、ジルコニウムテトラ−ｔ−ブトキシドが好ましく、ジルコニルジアセテイト、ジルコニウムテトラアセテイト、ジルコニウムアセテイトヒドロキ
シド、ジルコニウムトリス（ブトキシ）ステアレート、シュウ酸ジルコニウムアンモニウム、ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシド、ジルコニウムテトラ−ｎ−ブトキシドがより好ましく、特にジルコニウムトリス（ブトキシ）ステアレートが着色のない高重合度のポリエステルが容易に得られる理由から好ましい。

ゲルマニウム化合物としては、具体的には、酸化ゲルマニウムや塩化ゲルマニウム等の無機ゲルマニウム化合物、テトラアルコキシゲルマニウムなどの有機ゲルマニウム化合物が挙げられる。価格や入手の容易さなどから、酸化ゲルマニウム、テトラエトキシゲルマニウム及びテトラブトキシゲルマニウムなどが好ましく、特に、酸化ゲルマニウムが好ましい。

これらの重合触媒として金属化合物を用いる場合の触媒添加量は、生成するポリエステルに対する金属原子質量として、下限値が通常５ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは１０ｗｔｐｐｍ以上であり、上限値が通常３００００ｗｔｐｐｍ以下、好ましくは１０００ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは２５０ｗｔｐｐｍ以下、特に好ましくは１３０ｗｔｐｐｍ以下である。使用する触媒量が多すぎると、経済的に不利であるばかりでなくポリマーの熱安定性が低くなるのに対し、逆に少なすぎると重合活性が低くなり、それに伴いポリマー製造中にポリマーの分解が誘発されやすくなる。

ジカルボン酸成分とジオール成分とのエステル化反応及び／又はエステル交換反応の反応温度は、下限が通常１５０℃以上、好ましくは１８０℃以上、上限が通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下である。反応雰囲気は、通常、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下である。反応圧力は、通常、常圧〜１０ｋＰａであるが、常圧が好ましい。
反応時間は、下限が通常１時間以上であり、上限が通常１０時間以下、好ましくは、４時間以下である。

ジカルボン酸成分とジオール成分とのエステル化反応及び／又はエステル交換反応後の重縮合反応は、圧力を、下限が通常０．０１×１０³Ｐａ以上、好ましくは０．０５×１
０³Ｐａ以上であり、上限が通常１．４×１０³Ｐａ以下、好ましくは０．４×１０³Ｐａ
以下の真空度下として行う。この時の反応温度は、下限が通常１５０℃以上、好ましくは１８０℃以上であり、上限が通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下の範囲である。反応時間は、下限が通常２時間以上であり、上限が通常１５時間以下、好ましくは１０時間以下である。

本発明においてポリエステルを製造する反応装置としては、公知の縦型あるいは横型撹拌槽型反応器を用いることができる。例えば、同一又は異なる反応装置を用いて、溶融重合のエステル化及び／又はエステル交換の工程と減圧重縮合の工程の２段階で行い、減圧重縮合の反応器としては、真空ポンプと反応器を結ぶ減圧用排気管を具備した攪拌槽型反応器を使用する方法が挙げられる。また、真空ポンプと反応器とを結ぶ減圧用排気管の間には凝縮器を結合し、該凝縮器にて重縮合反応中に生成する揮発成分や未反応ジカルボン酸を回収する方法が好んで用いられる。

本発明においては、ポリエステルの製造方法として、従来の、上記の脂肪族ジカルボン酸を含むジカルボン酸成分と脂肪族ジオール成分とのエステル化反応及び／又はエステル交換反応を行った後、減圧下で、ポリエステルのアルコール末端のエステル交換反応により生成するジオールを留去しながらポリエステルの重合度を高める方法、或いは、ポリエステルの脂肪族カルボン酸末端から脂肪族ジカルボン酸及び／又はその酸無水物環状体を留去させながらポリエステルの重合度を高める方法が用いられる。後者の場合、脂肪族カルボン酸及び／又はその無水物環状体の除去は、通常、上記溶融重合工程における後段の減圧下での重縮合反応中に脂肪族ジカルボン酸及び／又はその酸無水物環状体を加熱留出
させる方法が採られるが、重縮合反応条件下では、脂肪族ジカルボン酸は容易に酸無水物環状体になりやすいため、酸無水物環状体の形態で加熱留出させる場合が多い。また、その際、ジオールから誘導される鎖状又は環状エーテル及び／又はジオールもまた脂肪族ジカルボン酸及び／又はその酸無水物環状体と共に除去されてもよい。更に、ジカルボン酸成分とジオール成分の環状単量体を共に留去させる方法は、重合速度が向上するため、好ましい態様である。

また、ポリエステルの製造工程の途中、又は製造されたポリエステルには、その特性が損なわれない範囲において各種の添加剤、例えば、可塑剤、紫外線安定化剤、着色防止剤、艶消し剤、消臭剤、難燃剤、耐候剤、帯電防止剤、糸摩擦低減剤、離型剤、抗酸化剤、イオン交換剤あるいは着色顔料等として無機微粒子や有機化合物を必要に応じて添加してもよい。着色顔料としては、カーボンブラック、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄などの無機顔料の他、シアニン系、スチレン系、フタロシアイン系、アンスラキノン系、ペリノン系、イソインドリノン系、キノフタロン系、キノクリドン系、チオインディゴ系などの有機顔料等を使用することができる。また、炭酸カルシウムやシリカなどの改質剤も使用することができる。

本発明において、縮重合反応終了後、鎖延長剤を用いて鎖延長を行うことが必須である。
鎖延長剤となるカーボネート化合物としては、具体的には、ジフェニルカーボネート、ジトリールカーボネート、ビス（クロロフェニル）カーボネート、m-クレジルカーボネート、ジナフチルカーボネート、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネート、エチレンカーボネート、ジアミルカーボネート、ジシクロヘキシルカーボネートなどが例示される。その他、フェノール類、アルコール類のようなヒドロキシ化合物から誘導される、同種、または異種のヒドロキシ化合物からなるカーボネート化合物が使用可能である。

鎖延長剤となるジイソシアネート化合物としては、具体的には、２,４−トリレンジイ
ソシアネート、２,４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネート
との混合体、ジフェニルメタンジイソシアネート、１，５−ナフチレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、水素化キシリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等の公知のジイソシアネートなどが例示される。

また、その他の鎖延長剤として、ジオキサゾリン、珪酸エステルなどを使用してもよい。珪酸エステルとしては、具体的には、テトラメトキシシラン、ジメトキシジフェニルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジフェニルジヒドロキシラン等が例示される。
これらの中では、塩基性の高いジイソシアネート化合物が好ましく、その中では、２,
４−トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、１，５−ナフチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートが好ましく、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートがより好ましい。これらの鎖延長剤は、２種以上用いてもよい。

その使用量は、通常、ポリエステルを構成する全単量体単位に対し、カーボネート結合ならびにウレタン結合が１０重量％以下である。好ましくは、ポリエステルを構成する全単量体単位に対し、５重量％以下、より好ましくは、３重量％以下、更に好ましくは１重量％以下である。その効果が発現する使用量の下限値としては、通常、０．０００１重量％以上、好ましくは、０．００１重量％以上、より好ましくは、０．０１重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。

これらの鎖延長剤（カップリング剤）を用いた高分子量ポリエステルの製造は従来の技術を用いて製造することが可能である。鎖延長剤は、重縮合終了後、均一な溶融状態で無溶媒で反応系に添加し、重縮合により得られたポリエステルと反応させる。
より具体的には、ジオールとジカルボン酸（またはその無水物）とを触媒反応させて得られる、末端基が実質的にヒドロキシル基を有し、重量平均分子量（Ｍｗ）が２０，０００以上、好ましくは４０，０００以上のポリエステルに上記鎖延長剤を反応させることにより、より高分子量化したポリエステル系樹脂を得ることができる。重量平均分子量が２０，０００以上のプレポリマーは、少量のカップリング剤の使用で、溶融状態といった苛酷な条件下でも、残存する触媒の影響を受けないので反応中にゲルを生ずることなく、高分子量のポリエステルを製造することができる。

したがって、例えば鎖延長剤として上記のジイソシアナートを用いて更に高分子量化をする場合には、ジオールとジカルボン酸からなる重量平均分子量が２０，０００以上、好ましくは４０，０００以上のプレポリマーが、ジイソシアナートに由来するウレタン結合を介して連鎖した線状構造を有するポリエステルが製造される。
鎖延長時の圧力は、通常、０．０１ＭＰａ以上、１ＭＰａ以下、好ましくは、０．０５ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下、より好ましくは、０．０７ＭＰａ以上、０．３ＭＰａ以下であるが、常圧が最も好ましい。

鎖延長時の反応温度は、下限が通常１００℃以上、好ましくは、１５０℃以上、より好ましくは１９０℃以上、最も好ましくは２００℃以上であり、上限が通常２５０℃以下、好ましくは２４０℃以下、より好ましくは２３０℃以下である。反応温度が低すぎると粘度が高く均一な反応が難しく、高い攪拌動力も要する傾向があり、また高すぎると、ポリエステルのゲル化や分解が併発する傾向がある。

鎖延長を行う時間は、下限が通常０．１分以上、好ましくは1分以上であり、より好ま
しくは、５分以上であり、上限が通常５時間以下、好ましくは1時間以下、より好ましく
は、３０分以下、最も好ましくは、１５分以下である。時間が短すぎる場合には、添加効果が発現しなくなる傾向があり、また、長すぎる場合には、ポリエステルのゲル化や分解が併発する傾向がある。

＜ポリエステルの物性＞
なお、ポリエステルは下記の物性を示すポリエステルから得られるものである。
本発明のポリエステルの数平均分子量は、ポリスチレン換算で通常、下限が通常５０００以上、好ましくは１万以上、より好ましくは、１．５万以上であり、上限が通常５０万以下、好ましくは３０万以下である。

本発明のポリエステル中の硫黄原子含有量は、ポリエステルに対して、質量比で上限が、５００wtｐｐｍ以下、好ましくは、５０ｗｔｐｐｍ以下、より好ましくは、３ｗｔｐｐｍ以下、最も好ましくは、０．３ｗｔｐｐｍ以下である。一方、下限は、特に限定されないが、０．０００１ｗｔｐｐｍ以上、好ましくは、０．００１ｗｔｐｐｍ以上、より好ましくは、０．０１ｗｔｐｐｍ以上であり、最も好ましくは、０．１ｗｔｐｐｍ以上である。硫黄含有量が多すぎるとポリエステルの熱安定性や耐加水分解性が低下する傾向があり、少なすぎる系は精製コストが著しく高くなりポリエステルの製造においては経済的に不利になる傾向がある。

ジイソシアナートのような窒素原子を含む鎖延長剤を用いた場合、その共有結合された官能基以外でポリエステル中に含まれる窒素原子含有量は、０．０１ｗｔｐｐｍ以上が好ましい。より好ましくは０．０５ｗｔｐｐｍ以上、さらに好ましくは０．１ｗｔｐｐｍ以上、特に好ましくは１ｗｔｐｐｍ以上である。
本発明で製造されるポリエステルの還元粘度（ηsp／ｃ）値は、実用上十分な力学特性が得られる理由から、下限は１．４以上であり、１．６以上が好ましく、更には１．８以上が好ましく、２．０以上が特に好ましい。還元粘度（ηsp／ｃ）値の上限は、ポリエステルの重合反応後の抜き出し易さならびに成形のし易さ等の操作性の観点から、通常、６．０以下、好ましくは５．０以下、更に好ましくは４．０以下である。

本発明でいう還元粘度は以下の測定条件により測定されたものである。
〔還元粘度（ηsp／ｃ）測定条件〕
粘度管：ウベローデ粘度管
測定温度：３０℃
溶媒：フェノール／テトラクロロエタン（１：１重量比）溶液
ポリエステル濃度：０．５ｇ／ｄｌ
本発明のポリエステルは、ポリエステル（０．５ｇ）をフェノール／テトラクロロエタン（１：１重量比）溶液（容量：１ｄｌ）に室温で溶解させた際、均一に溶解するポリエステルが好ましく、ポリエステルの不溶成分が生じる場合、通常、不溶成分量は全ポリエステル中、１重量％以下、より好ましくは、０．１重量％以下、特に好ましくは０．０１重量％以下であることが好ましい。

本発明のポリエステルのカルボキシル基末端濃度は、通常、１００当量／トン以下であるが、より好ましくは、その濃度は、５０当量／トン以下、特に、３５当量／トン以下、更には２５当量／トン以下であることが好ましく、０．１当量／トン以上、好ましくは０．５当量／トン以上、特に１当量／トン以上が好ましい。この量が多くなると、ポリマーの成形時の熱安定性や比較的長期の使用・保管時の耐加水分解性が低下する傾向があり、カルボキシル基が少なすぎるポリマーは、より好ましい形態ではあるが、このようなポリマーを製造するには極めて高額の設備投資を要する他、多大な製造時間を要するなど経済的に不利な点である。末端カルボキシル基量は、通常、公知の滴定方法により算出されるが、本発明においては、得られたポリエステルをベンジルアルコールに溶解し０．１Ｎ
ＮａＯＨにて滴定した値であり、１×１０⁶ｇ当たりのカルボキシル基当量である。

本発明で製造されるポリエステルは、通常、着色の少ないポリエステルであることが好ましい。本発明のポリエステルの黄色度（ＹＩ値）は、その上限が、通常、５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは２０以下、更に好ましくは１５以下、特に好ましくは１０以下であり、一方、その下限は、特には限定されないが、通常−２０以上、好ましくは、−１０以上、より好ましくは、―５以上、特に好ましくは−３以上、最も好ましくはー１以上である。高いＹＩ値を示すポリエステルは、フィルムやシート等の使用用途が制限される欠点を有する。一方、低いＹＩ値を示すポリエステルは、より好ましい形態ではあるが、このようなポリマーを製造するには製造プロセスが煩雑で極めて高額の設備投資を要するなど経済的に不利な点がある。本発明において、ＹＩ値は、ＪＩＳ Ｋ７１０５に基づく方法で測定される値である。

＜ポリエステル組成物の用途＞
本発明に係るポリエステルは、射出成形法、中空成形法および押出成形法などの汎用プラスチック成形法などにより、フィルム、ラミネートフィルム、シート、板、延伸シート、モノフィラメント、マルチフィラメント、不織布、フラットヤーン、ステープル、捲縮繊維、筋付きテープ、スプリットヤーン、複合繊維、ブローボトル、発泡体などの成形品に利用可能である。その際、結晶核剤、酸化防止剤、滑剤、着色剤、離型剤、フィラー、他のポリマーなど、必要に応じ添加することができる。

さらに、本発明に係るポリエステルは、従来の石油由来のポリマーに比較し環境に対する負荷が少ないため今後、ショッピングバッグ、ゴミ袋、農業用フィルム、化粧品容器、
洗剤容器、漂白剤容器、釣り糸、漁網、ロープ、結束材、手術糸、衛生用カバーストック材、保冷箱、クッション材、医療材料、電気機器材料、家電筐体、自動車材料などの用途への使用が期待される。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これら実施例に限定されるものではない。なお、以下の例における特性値は、次の方法により測定した。
希薄溶液粘度（還元粘度）：ポリエステルを濃度０．５ｇ／ｄＬとなるようにフェノール／テトラクロロエタン（１／１（質量比）混合液）に溶解し、溶液が３０℃の恒温槽中で粘度管を落下する時間ｔ（ｓｅｃ）を測定した。また溶媒のみの落下する時間ｔ₀（ｓ ｅｃ）を測定し３０℃での還元粘度η_sp／Ｃ（＝（ｔ−ｔ₀）／ｔ₀・Ｃ）を算出した（Ｃは溶液の濃度）。

窒素原子含有量：試料数１０ｍｇを石英ボートへ採取して、全窒素分析計（三菱化学社製ＴＮ−１０型）を用いて試料を燃焼し、化学発光法により決定した。
硫黄原子含有量：試料約０．１ｇを白金製ボートに採取して石英管管状炉（三菱化学社製ＡＱＦ−１００(濃縮システム)）で燃焼し、燃焼ガス中の硫黄分を０．１％−過酸化水素水で吸収させた。その後、吸収液中の硫酸イオンをイオンクロマトグラフ（Ｄｉｏｎｅｘ社製 ＩＣＳ−１０００型）を用いて測定した。
ＹＩ値：ＪＩＳ Ｋ７１０５の方法に基づいて測定した。

参考例１
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを
蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／
１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。

次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液
５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。

（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。

反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。

増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用
いて行った。

回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イース
トエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した
。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。

（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ユニットを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲ
ーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。

一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、
ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。

（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０
．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。

反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。

（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化
により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。

参考例２
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ
、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体から上記参考例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。

（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ １μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、
１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。

反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製 ）を用いて行った。

回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ
寒天培地に塗抹した。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した参考例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した 。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。

ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１４４， ｐ．１８１−１８５， １９９３）によ
って行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［
トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。

次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。

上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。

次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の
活性測定に供した。

ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に酸化されるのを、３４０ｎｍの 吸光度変化として測定した［Ｌ． Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９， ４２０２ （１９６４）］。反応は、５０ｍＭ カリウム
−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗
酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。

参考例３
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。

反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。

増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。

回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部
位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Gal
を含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。

（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
参考例４
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。

反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。

増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。

回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ
寒天培地に塗抹した。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。また、アミノ酸配列のみを配列番号１６に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。

（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した、参考例３にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。

ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, Ｖｏｌ．１４４， ｐ．１８１−１８５， １９９３
）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天
培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０
ｍｌで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、 ０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム 、５ｍＭ アデノシン三リン酸ナトリウム、０．３２ ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１
．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃にて反応させることにより行った。1Uは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は ０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。なお親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。

参考例５
＜発酵液の調製＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、参考例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。

尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で本培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。

硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：600μｇ、塩酸チアミン：600μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：５ｍｌ及び蒸留水：１．５Ｌの培地を３Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌した菌体を添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液１．５Ｌとあらかじめ滅菌した２０％グルコース溶液１．５Ｌを５Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分５００ｍＬで通気、毎分３００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約５０時間でグルコースがほぼ消費されていた。コハク酸が５７ｇ／L蓄積されていた。この発酵液を１００００
ｇ、５分間の遠心分離、限外濾過（日東電工（株）製 ＮＴＵ−３０００−Ｃ１Ｒ）により菌体と上清に分離した。以上の操作を３０回行うことにより、コハク酸発酵液上清を１０３Ｌ得ることが出来た。

＜コハク酸醗酵液からの琥珀酸精製＞
上記のようにして得られたコハク酸発酵液上清を１０３Ｌ（琥珀酸含有量５．８７ｋｇ）を、減圧しながらジャケット付き攪拌槽にて濃縮し、琥珀酸の濃度が３２.９％、アン
モニア１１．９％の濃縮液：１７．８ｋｇ（計算値）を得た。これに酢酸（ダイセル化学社製）を８．５８ｋｇ加えて３０℃まで冷却し、更にメタノール（キシダ化学社製）を４．０ｋｇ加えて１５℃まで冷却し１時間攪拌した後、２０℃にて４時間攪拌を継続した。

結晶が析出しており、これを遠心ろ過器にてろ過を行い、琥珀酸を７４．６％、酢酸３
．５％、アンモニア１２．２％を含有する結晶４．９５ｋｇを得た。
酢酸１１．３ｋｇに得られた結晶４．９ｋｇをいれ、８５℃にて溶解し、直ちに２０℃まで冷却した。既に結晶は析出していたが、そのまま更に３時間攪拌を続けた後、遠心ろ過器にてろ過を行い、琥珀酸８７．９％、酢酸８．４％、アンモニア０．６％を含有する結晶２．４４ｋｇを得た。

５℃に冷やした脱塩水３．５Ｌにて得られた結晶を懸洗し、これを遠心ろ過器にてろ過すると、琥珀酸９０％、酢酸１．７％、アンモニア０．０５％（およそ５００ｐｐｍ）含有する２．０８ｋｇの結晶が得られた。
この粗琥珀酸結晶２．０ｋｇを２８．５Ｌの脱塩水に溶解し、１Lのイオン交換樹脂（
三菱化学社製ＳＫ１ＢＨ）をつめた塔にＳＶ＝２にて通液し、約３３Ｌの処理液を得た。これを減圧したロータリーエバポレータに連続フィードしながら、およそ５．２Ｌまで濃縮した。この段階で既に結晶が析出していた。更に、５℃に冷却し、２時間攪拌を継続した後、これをろ過すると、琥珀酸９６．７％の結晶１．７６ｋｇを得た。
これを真空乾燥機にて乾燥すると１．６８ｋｇの琥珀酸を得る事が出来た。

実施例１
＜窒素原子含有量１２ｗｔｐｐｍ、硫黄原子含有量 ５ｗｔｐｐｍのバイオマス資源由
来コハク酸を用いたポリエステルの製造＞
攪拌装置、窒素導入口、加熱装置、温度計及び減圧用排気口を備えた反応容器に、原料としてグルコースから発酵法で得られた窒素原子含有量１２ｗｔｐｐｍ、硫黄原子含有量５ｗｔｐｐｍのコハク酸１００重量部、１，４―ブタンジオール８８．６重量部ならびに触媒として二酸化ゲルマニウムを予め０．９８重量％溶解させた８８％乳酸水溶液５．４重量部を仕込み、窒素―減圧置換によって系内を窒素雰囲気下にした。

次に、系内を撹拌しながら２２０℃に昇温し、この温度で１時間反応させた。次に、３０分かけて２３０℃まで昇温し、同時に１．５時間かけて０．０７×１０³Ｐａになるよ
うに減圧し、同減圧度で１時間反応を行い白色のポリエステルを得た（黄色度ＹＩは２４）。反応器を常圧に復圧後、ヘキサメチレンジイソシアネート２重量部を添加して１０分間攪拌した。得られたポリエステルの還元粘度（ηsp／ｃ）は２．６であった。

比較例１
反応器を常圧に復圧した後、ヘキサメチレンジイソシアネート２重量部を添加する操作を行わず、そのまま減圧下で縮重合を続けた以外は実施例１と同様に実施した。縮重合時間は８時間を要し、得られたポリエステルの還元粘度（ηsp／ｃ）は１．８であり、それ以上の粘度の上昇は無かった（黄色度ＹＩは３４）。

ｐＫＭＢ１の構築の概略を示す。 ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築の概略を示す。 ｐＴＺベクターの構築の概略を示す。 ｐＭＪＰＣ１の構築の概略を示す。

Claims (4)

1. ジオール成分、及びジカルボン酸成分を構成成分とするポリエステルであって、ジカルボン酸成分及びジオール成分の少なくとも一方がバイオマス資源から誘導されたものであって、鎖延長剤を用いて該ポリエステルを鎖延長させることを特徴とするポリエステルの製造方法。
2. 鎖延長剤がジイソシアネートである、請求項１に記載のポリエステルの製造方法。
3. バイオマス資源が植物資源であることを特徴とする請求項１または２に記載のポリエステルの製造方法。
4. ポリエステルの還元粘度（ηsp／ｃ）が１．４以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエステルの製造方法。
   
   

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