JP2006292683A - ケラタン硫酸由来オリゴ糖の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化(ESI)法でイオン化して多段階質量分析(MSn分析)することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のMS1分析を行い、分子量関連イオンのスペクトルデータを得る工程と、前記MS1分析で得られた分子量関連イオンのMS2分析を行い、0,2Arイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記MS2分析で得られた0,2ArイオンのMS3分析を行い、2,4Arイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記MS3分析で得られた2,4ArイオンのMS4分析を行う工程と、を含み、
前記2,4ArイオンのMS4分析により得られたスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【選択図】 なし
Description
ケラタン硫酸は、生体内では軟骨や角膜、脳組織等に存在していることが確認されている。ケラタン硫酸の構造解析は、生体におけるケラタン硫酸の機能や様々な疾患との関連性の解明に重要である。
また、核磁気共鳴(NMR)装置を用いてケラタン硫酸の構造を解析する試みもあるが(非特許文献1参照。)、該手法は配列解析法とは言い難く、しかも比較的多量の試料を必要とする上に長い測定時間を要するという問題がある。
また、非特許文献6においては、ケラタン硫酸関連構造を持つ標準オリゴ糖鎖を多段階質量分析(MSn分析)し、従来のHPLC分析ではピークが重なり合う可能性のあった種々のオリゴ糖鎖を、その分子量を指標として分別検出すること、更には分子量が同じ糖鎖であっても化学構造の異なるそれぞれを、MS2、MS3分析のシグナル・パターンで分別検出できることが報告されている。即ちこれは、標準試料の質量分析によって得られるシグナルのパターン(MS3まで)を予め標準データとして得ておき、照合型同定により未知試料を同定する方法である。
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖を微量試料で正確かつ迅速に同定する方法を提供することである。
1.ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化(ESI)法でイオン化して多段階質量分析(MSn分析)することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のMS1分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記MS1分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
2.前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする上記1に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
3.ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化(ESI)法でイオン化して多段階質量分析(MSn分析)することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のMS1分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記MS1分析で得られた分子量関連イオンのMS2分析を行い、0,2Arイオンを得る工程と、前記MS2分析で得られた0,2ArイオンのMS3分析を行い、2,4Arイオンを得る工程と、前記MS3分析で得られた2,4ArイオンのMS4分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記MS4分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
本発明に係る同定方法の対象となるオリゴ糖は、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖であり、ガラクトース(Gal)とN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)とがβ1−4結合した構造を有する。ケラタン硫酸由来のオリゴ糖としては、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖のみならずケラタン硫酸を分解して得たオリゴ糖の一部の糖を除去又は修飾したものも含まれる。また、本発明の同定対象は、還元糖であることが望ましい。
ケラタン硫酸の分解は、化学的な方法(酸加水分解等)や酵素的な方法(ケラタン硫酸分解酵素による分解等)によって行うことができるが、酵素的な方法を用いることが好ましく、ケラタナーゼIIを用いることがより好ましい。酵素反応は、用いるケラタン硫酸分解酵素の種類に応じて当業者が適宜設定することができるが、例えばケラタナーゼIIを用いる場合、pH5.0〜7.0、温度30〜40℃で、0.1〜48時間反応させることが好ましい。
また、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖における硫酸基を除去したオリゴ糖、非還元末端のシアル酸を除去したオリゴ糖、また、化学的もしくは酵素的に硫酸基を増加せしめたオリゴ糖等も同定対象とすることができる。なお、オリゴ糖の脱硫酸化は、例えば塩酸含有メタノールとの反応(WO98/03524号パンフレット記載の方法)によって行うことができる。また、シアル酸の除去は、オリゴ糖の希硫酸処理またはノイラミニダーゼ処理によって行うことができる。硫酸基の増加は、例えば硫酸基転移酵素を用いた反応や、ジメチルホルムアミド中、三酸化硫黄・ピリジン複合体による処理によって行うことができる。
また、それらオリゴ糖は精製されていることが好ましいが、種々のケラタン硫酸由来オリゴ糖を含む混合物の場合でも本発明の方法により同定可能である。
ESI法によって被検オリゴ糖をイオン化することにより、被検オリゴ糖の分子量に起因する1種類又は2種類以上のイオン(以下、分子量関連イオンと呼ぶ。)が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検オリゴ糖の分子量を確定することができる。分子量関連イオンの検出はIT(イオントラップ)型分析装置、QIT−TOF(四重極イオントラップ−飛行時間)型分析装置、またはFT−ICR(フーリエ変換イオンサイクロトロン)型分析装置等を用いることが好ましい。ESI法によるイオン化するIT型分析装置としては、Esquire 3000 plus(ブルカー社製)等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。
このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、MSの1乗スペクトル(以下、「MS1スペクトル」等と略称する。)が得られる。
MS2分析により、シアル化オリゴ糖は脱シアル酸が起きるため、その分子量変化よりオリゴ糖の非還元末端にシアル酸が導入されていたことを同定することができる。また、殆どのオリゴ糖鎖で下記のように脱水イオンと0,2Arイオン(Domon, B.; Costello, C.E. Glycoconjugate Journal 1988, 5, 397-409、ここでは特に還元末端をrとして示した。具体例を図5に示す。)が観測される。
また、2,4Arイオンとは、還元末端糖残基における2位炭素と3位炭素間の結合ならびに4位炭素と5位炭素間の結合の二つの結合が切断されて生じた、非還元末端糖を含むフラグメントイオンを指す。
これらのイオンは、Cross-ring cleavageイオンと呼ばれるイオンである。
本発明の同定方法では、このMS3及びMS4分析操作において、必ず0,2Arイオン及び2,4Arイオンをそれぞれ各プレカーサー・イオンとしてフラグメンテーションさせることが重要である。
即ち、MS1スペクトルにおける分子量関連イオンに沿って観測される同位体イオンのm/z値から、そのイオンの価数(z)が決定される。本発明の測定条件に従う限りは、化合物構造中の硫酸基の数と、価数zが同値となる。すなわち、天然炭素中には12Cのほかに13Cが1%程度含まれるため、糖のように炭素を持つ化合物の場合は、質量が大きいシグナルが同時に弱めに観測される。仮に、分子量100の化合物の場合には101にもシグナルが現れることになる。これが硫酸基を2個持って二価になった場合、m/z値が二分の一になるので、50.0と50.5にシグナルが観測され、これを読むことによって硫酸基の数を決めることができる。
このz値を分子量関連イオンのMS1スペクトルにおけるm/z値に乗じることで測定するケラタン硫酸オリゴ糖の分子量mが決定される。逆に言えば、測定化合物の分子量を硫酸基の数で除した値のm/z位置に、分子量関連イオンが観測される。MS2スペクトルにおいて観測される0,2Arイオンは、分子量m値として必ず101だけ小さくなるため、実際のMS2スペクトル中に化合物分子量から101を減じ、それを硫酸基数で除した値のm/z位置に観測されるのが0,2Arイオンである。
また、MS3スペクトルにおいて生じる2,4Arイオンは、分子量m値として60(還元末端糖が硫酸化されていない場合)もしくは139(還元末端糖が硫酸化されている場合)だけ必ず小さくなるため、実際のMS3スペクトル中に化合物分子量から60もしくは139を減じ、それを硫酸基数で除した値のm/z位置に観測されるのが2,4Arイオンである。
まず、MS4スペクトルにおけるそれぞれのイオンのz値(イオンの価数)を読み、その値をm/z値(質量電化比)に乗じることで、各々のイオンのm値(質量)を決定することができる。
次に、MS4スペクトル上には複数のフラグメントイオンが観測されることが通常であるから、複数のフラグメントイオンのm値を算出し、任意の二つのイオンのm値の差(質量差)が203(N−アセチルグルコサミンの分子量221からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値)であればN−アセチルグルコサミン、162(ガラクトースの分子量180からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値)であればガラクトースが、双方の構造の違い(配列上の差)となっていることを示す。
さらに、ある糖残基が硫酸化されている場合には、m値に79(水酸基と硫酸基の差)の差を生じるため、任意の糖残基の6位の水酸基が硫酸化されているか否かも同時に解読することができる。(ケラタン硫酸の場合、硫酸基の位置はN−アセチルグルコサミンとガラクトースのどちらの場合でも、6位水酸基上であることが既に知られている。)
さらに、オリゴ糖の官能基分布を解析する場合は、MS5以降の分析が必要と考えられる。
[実施例1]
(オリゴ糖の入手及び調製)
(1)L1は生化学工業株式会社より、SL1はフナコシ株式会社より購入した。
ウシ角膜由来のケラタン硫酸I(生化学工業株式会社製)又はサメ軟骨由来のケラタン硫酸II(生化学工業株式会社製)の1mg/200μl水溶液に、0.1Mの酢酸緩衝液で稀釈したケラタナーゼII(生化学工業株式会社より入手)を1mU/μl加え、pH5.0、37℃で2時間反応させた。
この反応溶液を分画分子量10000の遠心フィルター(ミリポア社製)にかけて高分子量成分を取り除き、得られた溶出液をゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)で2分毎に分画した(5mMの酢酸ナトリウム、pH:6.0、0.1ml/min)。GPCカラムは、Superdex Peptide 10/300GL(Amersham Bioscience社)を用いた。
WO96/16973号パンフレットに記載の方法によって調製した。
上記(2)で得られたL2L2及びL2L4をそれぞれ特開2000−256385号公報に記載の如くβ−ガラクトシダーゼで処理することによって調製した。
L3は特開2001−089493号公報に記載の方法、G1L1及びL1L1はWO98/03524号パンフレットに記載の方法によって、それぞれ調製した。
上記で得られたオリゴ糖のMSn分析を行った。まず、上記オリゴ糖を、酢酸の終濃度が1mMかつメタノール含量が50%の溶媒に、10pmol/μLの濃度になるように溶解し、マイクロシリンジを用いて360μL/時間の速度で装置に注入した。その際のキャピラリー電圧は−3.8kVであり、窒素ドライガスの速度を4.0 L/min、キャピラリー温度は300°Cに設定した。
MSn分析は、Esquire 3000 plus(ブルカー社製)を用い、ネガティヴ・イオン・モードで測定した。
MS2分析は、MS1分析において観測された分子量関連イオン([M−nH]n−フラグメントイオン)を、1.00Vのフラグメント・エネルギーでフラグメンテーションすることによって生じたフラグメントイオンを観測することによって得た。なお、MS1スペクトル上においてイオン化に伴って脱硫酸化もしくは脱シアル化が認められたL4L4、L2L4及びSL2L4については、前記の酢酸濃度を前記の1/10に設定して測定した。
MS2分析において観測された種々のイオンのうち、0,2ArイオンをMS3分析した。さらに、MS3分析において観測された種々のイオンのうち2,4ArイオンをMS4分析した。
図4に示すMS4スペクトルにおいて、L3、L4、G4L2、G4L4、L2L2、L2L4、L4L4、L2L2L2では、オリゴ糖鎖の配列に対応した開裂様式が観測されることがわかった(図6)。これにより、2,4ArイオンのMS4スペクトルデータから、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖を同定できることがわかる。
次に、上記実施例で用いたオリゴ糖のうち任意に1種類のオリゴ糖を選び、配列が未知のオリゴ糖を同定した例を示す。なお、本実施例において得られたMSnスペクトルのデータを図7に示す。
まず、この被検オリゴ糖を上記実施例1と同様にしてMS1スペクトルを得た。MS1スペクトルにおけるm/z値は453.0であった。なお、同位体イオンがm/z値は453.5に確認されたことから、この被検オリゴ糖は硫酸基を2個持ち、分子量は453.0×2(価数)+2(イオン化による脱プロトン数)=908であることが判明した。また、この分子量から、被検オリゴ糖の構造は二硫酸化四糖であると推定された。
次に、このm/z値:453.0の分子量関連イオンについてMS2分析を行ったところ、m/z値が138.8、402.5、443.9、623.9、665.9等のイオンが観測された。453.0(プリカーサーイオン)×2(価数)−101を2(価)で除した値が402.5であることから、m/z値が402.5のイオンが0,2Arイオンであると決定された。
次に、この0,2ArイオンについてMS3分析を行ったところ、m/z値が138.8、393.4、665.9等のイオンが観測された。402.5(プリカーサーイオン)×2(価数)−139=666であることから、m/z値が665.9のイオンが2,4Arイオンであると決定された。
さらに、この2,4ArイオンについてMS4分析を行ったところ、m/z値が443.9、503.8等のイオンが観測された。ここで推定構造を絞ると、前者は非還元末端側二糖中に硫酸基1個を有する配列(B2イオン)を示し、後者は還元末端側三糖のうち還元末端ともう1個の硫酸基を持つ配列(Y3イオン)に合致する。両条件に合う配列は、四糖のうち還元末端側から一番目と三番目の糖に硫酸基を持つ構造であることがわかり、未知のオリゴ糖はL2L2であることがわかった。
Claims (3)
- ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化(ESI)法でイオン化して多段階質量分析(MSn分析)することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のMS1分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記MS1分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。 - 前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする請求項1に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
- ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化(ESI)法でイオン化して多段階質量分析(MSn分析)することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のMS1分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記MS1分析で得られた分子量関連イオンのMS2分析を行い、0,2Arイオンを得る工程と、前記MS2分析で得られた0,2ArイオンのMS3分析を行い、2,4Arイオンを得る工程と、前記MS3分析で得られた2,4ArイオンのMS4分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記MS4分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
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