JP2006292680A - Method of analyzing biomolecule interacting each other on solid support body, and solid support body therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、相互作用した生体分子を質量分析することにより分析および解析する方法、およびそのための固体支持体およびキットに関する。 The present invention relates to a method for analyzing and analyzing interacted biomolecules by mass spectrometry, and a solid support and kit therefor.
ペプチド、タンパク質、核酸および糖鎖など生体分子の多くは比較的少数の構成単位が一定の規則で重合してできている。例えば、ペプチドやタンパク質は２０種のＬ-α-アミノ酸がペプチド結合でつながった分子である。これらの構成単位の分子の構造は既にほとんどが明らかになっており、当然、それらの正確な分子量も明らかとなっている。従って、生体分子やその断片の分子量を正確に測定できれば、その構造（配列など）や生体内で受ける様々な修飾反応の解析に大きく寄与しうることから、質量分析法は核酸およびタンパク質等の生体分子の構造解析に欠かせない手段として位置づけられている。質量分析法では、質量分析装置（ＭＳ）を用いて生体分子をイオン化し、得られたイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ値）に従って分離し、その強度を測定することにより、質量を決定する。 Many biomolecules such as peptides, proteins, nucleic acids and sugar chains are formed by polymerizing a relatively small number of structural units according to a certain rule. For example, peptides and proteins are molecules in which 20 types of L-α-amino acids are linked by peptide bonds. Most of the molecular structures of these structural units have already been clarified, and naturally their exact molecular weights have also been clarified. Therefore, if the molecular weight of biomolecules or fragments thereof can be accurately measured, mass spectrometry can greatly contribute to the analysis of the structure (sequence, etc.) and various modification reactions received in vivo. It is positioned as an indispensable means for molecular structure analysis. In mass spectrometry, a mass is determined by ionizing a biomolecule using a mass spectrometer (MS), separating the obtained ions according to a mass-to-charge ratio (m / z value), and measuring the intensity thereof. .
質量分析による生体分子の構造解析／決定には、分析対象を多数の成分に分離精製する必要があり、非常に多数の試料を分析しなければならない。また、遺伝子診断等においては、多数の人間から得た試料を迅速に処理する必要がある。 In the structure analysis / determination of biomolecules by mass spectrometry, it is necessary to separate and purify the analysis target into a large number of components, and a very large number of samples must be analyzed. In genetic diagnosis and the like, it is necessary to rapidly process samples obtained from a large number of humans.
それに対し市販されている一般的な質量分析装置は、精製したそれぞれの試料をサンプルボードに配置し、これを１個ずつ質量分析していくものである。従って、未精製の試料を電気泳動により分離した場合は、泳動後のゲルをバンドごとに切り出してそれぞれ精製してから１種類ずつ質量分析する必要があり、多数の試料を迅速に分析することは非常に困難であった。 On the other hand, a general mass spectrometer commercially available places each purified sample on a sample board and performs mass analysis one by one. Therefore, when an unpurified sample is separated by electrophoresis, it is necessary to cut out the gel after electrophoresis for each band and purify each, and then perform mass spectrometry one by one. It was very difficult.
また、電気泳動した生体分子をゲルからニトロセルロース等のメンブレン上に転写してこれを分析する方法も知られているが、メンブレン上の分析においては、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションを利用した蛍光検出等に限られる。なぜなら、従来使用されているニトロセルロースやＰＶＤＦ等のメンブレンに、例えばレーザを照射するとメンブレン自体の分解が起きる可能性が高く、上記メンブレンから生体分子を直接イオン化することが困難だからである。すなわち、これらのメンブレン上に転写された生体分子をそのまま質量分析装置で分析することは困難である。 In addition, there is also known a method of transferring electrophoretic biomolecules from a gel onto a membrane such as nitrocellulose, and analyzing this. In the analysis on the membrane, fluorescence utilizing antigen-antibody reaction or nucleic acid hybridization is used. Limited to detection. This is because, when a conventionally used membrane such as nitrocellulose or PVDF is irradiated with a laser, for example, the membrane itself is likely to be decomposed, and it is difficult to directly ionize biomolecules from the membrane. That is, it is difficult to analyze the biomolecules transferred on these membranes as they are with a mass spectrometer.
一方、生体分子の相互作用の解析は、生体分子の機能を調べる手段として重要であるが、その手段としては、一方の生体分子を固体表面上に固定化し、候補となる生体分子を接触させて、候補生体分子が固定化された生体分子に結合するかどうかを検出する方法が一般的である。このような方法において、相互作用の有無のみであれば蛍光分析等により検出することができるが、相互作用した生体分子を同定するために質量分析を利用する場合は、上記と同様に、試料から生体分子をそれぞれ精製し、これを固体表面に固定化する必要があるため、迅速な分析が困難であった。 On the other hand, the analysis of the interaction of biomolecules is important as a means for investigating the functions of biomolecules. One method is to immobilize one biomolecule on a solid surface and bring a candidate biomolecule into contact. A general method is to detect whether a candidate biomolecule binds to an immobilized biomolecule. In such a method, if there is only the presence or absence of interaction, it can be detected by fluorescence analysis or the like, but when using mass spectrometry to identify the interacting biomolecule, Since it is necessary to purify each biomolecule and immobilize it on the surface of a solid, rapid analysis was difficult.
本発明の課題は、多数の試料を迅速に分析する手段を提供し、核酸およびタンパク質等の生体分子の相互作用の分析を迅速に実施する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a means for rapidly analyzing a large number of samples, and to provide a method for quickly performing an analysis of interactions between biomolecules such as nucleic acids and proteins.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、試料中の生体分子を電気泳動で分離した後、固体支持体上に固定化し、これを質量分析することにより、生体分子の相互作用を迅速に分析できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have separated biomolecules in a sample by electrophoresis, and then immobilized them on a solid support, followed by mass spectrometry to obtain biomolecules. It has been found that the interaction can be quickly analyzed, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体分子を分析する方法であって、
（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
を含む、前記方法。
（２）固体支持体が表面にカーボン層を有するものである（１）記載の方法。
（３）カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である（２）記載の方法。
（４）カーボン層が化学修飾されているものである（２）または（３）記載の方法。
（５）（ｂ）の工程の後（ｃ）の工程の前に、固体支持体上に固定化された生体分子および／または相互作用した生体分子を酵素で分解することをさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）生体分子がペプチドであり、酵素がプロテアーゼである（５）記載の方法。
（７）質量分析を、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析によって行う（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するための表面にカーボン層を有する固体支持体。
（９）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する固体支持体を含む前記キット。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for analyzing biomolecules,
(A) Immobilizing the biomolecules in the sample on the solid support by separating the biomolecules in the sample by gel electrophoresis and transferring the biomolecules separated in the gel onto the solid support. ,
(B) interacting further biomolecules with the biomolecules immobilized on the solid support, and (c) further biomolecules immobilized on the solid support and / or further interacting with the biomolecules Said method comprising mass spectrometry of the biomolecule.
(2) The method according to (1), wherein the solid support has a carbon layer on the surface.
(3) The method according to (2), wherein the carbon layer is a diamond-like carbon layer.
(4) The method according to (2) or (3), wherein the carbon layer is chemically modified.
(5) After the step of (b) and before the step of (c), further comprising decomposing the biomolecule immobilized on the solid support and / or the interacting biomolecule with an enzyme (1) ) To (4).
(6) The method according to (5), wherein the biomolecule is a peptide and the enzyme is a protease.
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the mass spectrometry is performed by laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry.
(8) A solid support having a carbon layer on the surface for use in the method according to any one of (1) to (7).
(9) A kit for use in the method according to any one of (1) to (7), comprising the solid support having a carbon layer on the surface.
本発明により、生体分子の相互作用の分析を迅速に実施することができる。
従って、本発明は、核酸およびタンパク質等の生体分子の機能解析において非常に有用な手段となる。
According to the present invention, the analysis of the interaction of biomolecules can be performed rapidly.
Therefore, the present invention is a very useful means in functional analysis of biomolecules such as nucleic acids and proteins.
本発明において、分析の対象となる生体分子は生体に由来する分子であり、特に制限されないが、核酸、ペプチドおよび糖鎖、ならびにこれらの誘導体などが含まれる。本明細書において、核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本明細書においてペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの複合体が含まれる。ペプチド誘導体としては、その他のペプチドと融合した融合ペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ペプチド、および翻訳後修飾されたペプチドなどが含まれる。ペプチドの翻訳後修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、グリコシル化、アミド化およびユビキチン化などが挙げられる。 In the present invention, the biomolecule to be analyzed is a molecule derived from a living body, and is not particularly limited, but includes nucleic acids, peptides and sugar chains, and derivatives thereof. As used herein, nucleic acids include DNA and RNA. As used herein, peptides include oligopeptides, polypeptides and proteins and complexes thereof. Peptide derivatives include fusion peptides fused with other peptides, chemically modified peptides bound to polymers such as polyethylene glycol, and post-translationally modified peptides. Post-translational modifications of peptides include phosphorylation, acetylation, methylation, myristoylation, glycosylation, amidation and ubiquitination.
これらの生体分子を含む分析対象となる試料としては、特に制限されないが、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等が挙げられる。 Samples to be analyzed containing these biomolecules are not particularly limited, but include cell extracts, bacterial cell extracts, cell-free synthetic products, PCR (Polymerase chain reaction) products, enzyme-treated products, synthetic DNA, synthesis Examples thereof include RNA and synthetic peptides.
生体分子を固定化するための固体支持体は、分析対象となる生体分子を固定化できるものであれば特に制限されず、公知のものを使用でき、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等からなるものが挙げられる。 The solid support for immobilizing the biomolecule is not particularly limited as long as it can immobilize the biomolecule to be analyzed, and known ones can be used, for example, gold, silver, copper, aluminum, tungsten Metals such as molybdenum, chromium, platinum, titanium and nickel; alloys such as stainless steel, hastelloy, inconel, monel and duralumin; laminates of the above metals and ceramics; glass; silicon; fiber; wood; paper; What consists of plastics etc. is mentioned.
本発明においては、基板の表面にカーボン層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。さらに、カーボン層に特定の化学修飾を施したものが好ましい。特定の化学修飾を施すことにより分析対象となる生体分子を保持しやすくなり、また安定に固定化できるからである。 In the present invention, it is preferable to use a solid support having a carbon layer on the surface of the substrate. Furthermore, what gave the carbon layer a specific chemical modification is preferable. This is because by applying a specific chemical modification, it becomes easier to retain the biomolecule to be analyzed, and it can be stably immobilized.
本発明において基板とはカーボン層を形成させるもととなる基材を意味し、このような基材としては、特に制限されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；およびプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。ガラスまたはプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものを使用することもできる。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。 In the present invention, the substrate means a base material from which the carbon layer is formed, and such a base material is not particularly limited. For example, gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum, chromium, Metals such as platinum, titanium and nickel; alloys such as stainless steel, hastelloy, inconel, monel and duralumin; laminates of the above metals and ceramics; glass; silicon; fibers; wood; paper; plastics such as polycarbonate and fluororesin; Mention may be made of a mixture of plastic and the above metals, ceramics, diamond and the like. It is also possible to use a glass or plastic surface formed with a metal layer made of platinum, titanium or the like. The metal layer can be formed by sputtering, vacuum deposition, ion beam deposition, electroplating, electroless plating, or the like.
固定化された生体分子について、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等によって質量分析を行う場合、固体支持体に高電圧がかかるため、基板は導電性を有するもの、例えば、ステンレス、アルミニウム、チタン等の金属が好ましい。 When the immobilized biomolecule is subjected to mass spectrometry by laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry or the like, since a high voltage is applied to the solid support, the substrate has conductivity, for example, stainless steel, aluminum Metal such as titanium is preferred.
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムまたは炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。 The carbon layer formed on the substrate in the present invention is not particularly limited, but diamond, diamond-like carbon, amorphous carbon, graphite, hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide. , Tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, vanadium carbide and the like, and a diamond-like carbon (DLC) layer is preferable. The carbon layer has excellent chemical stability and can withstand subsequent chemical modification and reaction in the binding to the analyte, and the binding is flexible because it binds to the analyte by electrostatic binding. This is advantageous in that it has no UV absorption, is transparent to the detection system UV, and can be energized during electroblotting. Further, it is advantageous in that nonspecific adsorption is small in the binding reaction with the analyte.
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。 In the present invention, the carbon layer can be formed by a known method. For example, a microwave plasma CVD (Chemical vapor deposition) method, an ECRCVD (Electrical cyclotron resonance) method, an ICP (Inductive coupled plasma) method, a direct current sputtering method, an ICP (Inductive coupled plasma) method, a direct current sputtering method, a direct current sputtering method. Examples thereof include a vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method.
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。 In the high-frequency plasma CVD method, a source gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by a high frequency to synthesize a DLC (diamond-like carbon) layer on a substrate. In the ionization vapor deposition method, the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a carbon layer is formed on the substrate by a bias voltage. The DLC layer may be formed by ionized vapor deposition in a mixed gas composed of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of remaining methane gas.
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。 In the arc evaporation method, an arc discharge is generated in a vacuum by applying a DC voltage between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode), and a plasma of carbon atoms is generated from the cathode to generate an evaporation source. Further, by applying a negative bias voltage to the substrate, carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a carbon layer.
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。 In the laser vapor deposition method, for example, a carbon layer can be formed by irradiating a graphite target plate with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light and melting it, and depositing carbon atoms on a glass substrate.
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。 The thickness of the carbon layer on the surface of the solid support of the present invention is usually from a monomolecular layer to about 100 μm. If it is too thin, the surface of the base substrate may be locally exposed. Therefore, the thickness is preferably 2 nm to 1 μm, more preferably 5 nm to 500 nm. Note that all of the solid support may be made of a carbon material.
質量分析を行うため、本発明の固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。 In order to perform mass spectrometry, the solid support of the present invention preferably has a flat plate shape. The size is not particularly limited, but is usually about 10 to 200 mm wide × 10 to 200 mm long × 0.1 to 20 mm thick.
生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された基板の表面を化学修飾することが好ましい。このような化学修飾は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性化エステル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。 In order to immobilize biomolecules, it is preferable to chemically modify the surface of the substrate on which the carbon layer is formed. Such chemical modification can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited. For example, an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group, and an activated ester group may be introduced. Can be mentioned. It is also effective to introduce metal chelates such as nickel chelates and cobalt chelates.
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガスを、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。 Introduction of amino groups can be carried out, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in ammonia gas. Alternatively, the carbon layer can be chlorinated by irradiation with ultraviolet rays in chlorine gas, and further irradiated with ultraviolet rays in ammonia gas. Alternatively, it can be carried out by reacting a polyvalent amine gas such as methylenediamine or ethylenediamine with a chlorinated carbon layer.
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。 The introduction of the carboxyl group can be carried out, for example, by reacting a suitable polycarboxylic acid with the carbon layer aminated as described above.
エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。 Introduction of an epoxy group can be carried out, for example, by reacting a suitable polyvalent epoxy compound with the carbon layer aminated as described above. Or it can obtain by making an organic peracid react with the carbon = carbon double bond which a carbon layer contains. Examples of the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, performic acid, and trifluoroperacetic acid.
ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。 Introduction of the formyl group can be carried out, for example, by reacting glutaraldehyde with the carbon layer aminated as described above.
ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。 Introduction of hydroxyl groups can be carried out, for example, by reacting water with the carbon layer chlorinated as described above.
活性化エステル基の導入は、例えば、塩素ガス中でカーボン層に紫外線を照射して表面を塩素化し、ついで、アンモニアガス中で紫外線を照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドまたはジカルボン酸無水物を用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の活性化エステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。 The introduction of the activated ester group is, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the surface, and then irradiating with ultraviolet rays in ammonia gas and aminating, and then using an appropriate acid chloride or dicarboxylic acid Carboxylation with an anhydride can be carried out by dehydration condensation of the terminal carboxyl group with carbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide. By this treatment, a group in which an activated ester group such as an N-hydroxysuccinimide ester group is bonded to the end of the hydrocarbon group via an amide bond can be formed (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).
ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基または活性化エステル基を導入するのが好ましい。 When nucleic acids such as DNA and RNA are retained, it is preferable to introduce an amino group, a carbodiimide group, an epoxy group, a formyl group, or an activated ester group.
ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性化エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。 When holding a peptide, it is preferable to introduce an amino group, a carbodiimide group, an epoxy group, a formyl group, a metal chelate or an activated ester group. When a solid support into which a metal chelate is introduced is used, a peptide having a label having an affinity for a metal ion such as a polyhistidine sequence can be immobilized effectively and stably. The metal chelate can be introduced, for example, by chlorinating the substrate on which the carbon layer is formed and then aminating it, and then adding a halocarboxylic acid such as chloroacetic acid to introduce a chelate ligand. Labels such as polyhistidine sequences can be introduced by methods known to those skilled in the art.
また、上記化学修飾は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。 Moreover, you may perform the said chemical modification by forming an electrostatic layer on a surface carbon layer. The electrostatic layer can be formed using a positively charged compound such as an amino group-containing compound.
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。 Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH 2 ), or a compound having an amino group (—NHR; R is a substituent) monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, Ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg, ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acid (glycine, alanine) , Valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, histidine ), Aniline, or polymers thereof (for example, polyallylamine, polylysine) or copolymers; polyamines (polyvalent amines) such as 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, spermidine, spermine, and putrescine ).
静電層は、基板またはカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板またはカーボン層と共有結合させて形成してもよい。 The electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, or may be formed to be covalently bonded to the substrate or the carbon layer.
静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。 In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, for example, when the carbon layer is formed, the amino group-containing compound is introduced into the film forming apparatus so as to contain the amino group. A carbon-based film is formed. Ammonia gas may be used as the compound introduced into the film forming apparatus. Further, the surface treatment layer may be a multi-layer structure in which a film containing an amino group is formed after the adhesion layer is formed, and in this case, it may be performed in an atmosphere containing ammonia gas. Film formation can be performed by, for example, a plasma method.
また、静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板またはカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。 In addition, when the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, the above-described non-reflection is performed on the substrate in order to increase the affinity, that is, the adhesion between the electrostatic layer and the substrate or the carbon layer. It is preferable to deposit a compound having a substituted or monosubstituted amino group and a carbon compound. The carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane which are gases at normal temperature are preferable. As a method of vapor deposition, ionized vapor deposition is preferable, and as conditions for ionized vapor deposition, it is preferable that an operating pressure is 0.1 to 50 Pa and an acceleration voltage is in a range of 200 to 1000 V.
静電層を基板またはカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板またはカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記ｒアミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。 In the case where the electrostatic layer is formed by covalent bonding with the substrate or the carbon layer, for example, the surface of the substrate or the substrate provided with the carbon layer is chlorinated by irradiating ultraviolet rays in chlorine gas, and then containing the r amino group Among compounds, for example, polyallylamine, polylysine, 4,4 ', 4 "-triaminotriphenylmethane, triamterene and other polyvalent amines are reacted to introduce an amino group at the end not bonded to the substrate By doing so, an electrostatic layer can be formed.
基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
In the case where an electrostatic layer is formed by immersing the substrate in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, when polyallylamine is used as the amino group-containing compound, the substrate is in close contact with the substrate. This improves the amount of immobilized biomolecules. The electrostatic layer can also be formed by immersing the substrate in a solution in which the silane coupling agent coexists with the amino group-containing compound.
The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.
本発明の生体分子の分析方法においては、
（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
により、生体分子を分析する。
In the biomolecule analysis method of the present invention,
(A) Immobilizing the biomolecules in the sample on the solid support by separating the biomolecules in the sample by gel electrophoresis and transferring the biomolecules separated in the gel onto the solid support. ,
(B) interacting further biomolecules with the biomolecules immobilized on the solid support, and (c) further biomolecules immobilized on the solid support and / or further interacting with the biomolecules Biomolecules are analyzed by mass spectrometry of the biomolecules.
試料の分離に使用できるゲル電気泳動法としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法および二次元電気泳動法などを挙げることができる。当業者であれば、分離の対象となる物質の種類および分子量等から使用する電気泳動法の種類を適宜選択することができる。 The gel electrophoresis method that can be used for sample separation is not particularly limited. For example, agarose gel electrophoresis, sieving agarose gel electrophoresis, denatured agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, SDS polyacrylamide Examples thereof include gel electrophoresis, isoelectric focusing gel electrophoresis, and two-dimensional electrophoresis. A person skilled in the art can appropriately select the type of electrophoresis method to be used from the type and molecular weight of the substance to be separated.
アガロースゲル電気泳動法は、核酸を分離するために最もよく利用される手法である。アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較してゲルの網目構造が大きいため、数十〜数百ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを長さや分子構造の違いで分離することができる。ＤＮＡフラグメント全体の荷電状態は主にリン酸基の数に依存するため、移動度はＤＮＡフラグメントの大きさに比例する。電場方向を断続的に変化させて泳動すると酵母染色体などの巨大ＤＮＡを分離することもできる（パルスフィールド電気泳動）。 Agarose gel electrophoresis is the most commonly used technique for separating nucleic acids. Since an agarose gel has a larger network structure than a polyacrylamide gel, DNA fragments of several tens to several hundreds Kbp can be separated by differences in length and molecular structure. Since the charge state of the entire DNA fragment mainly depends on the number of phosphate groups, the mobility is proportional to the size of the DNA fragment. When electrophoresis is carried out by changing the electric field direction intermittently, it is possible to separate large DNA such as yeast chromosomes (pulse field electrophoresis).
核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＤＮＡフラグメントの解析に主に用いられ、ポリアクリルアミドゲルの微細な網目構造を利用して、アガロースゲル電気泳動の場合に比較して短鎖（〜１Ｋｂｐ）のフラグメントを長さと構造に基づいて分離する手法である。ＤＮＡの立体構造（コンフォメーション）の影響を強く受けるため、ＤＮＡ鎖長の推定は二本鎖ＤＮＡを泳動する場合に限られる。一本鎖ＤＮＡは様々な構造を取ることが予想されるので移動度とそのＤＮＡ鎖長との間に相関は見られず、しばしば複数のバンドとして検出されることもある。ＤＮＡ塩基のわずかな違いでも構造変化がおこり、泳動パターンに反映される。これを利用したＤＮＡフラグメント解析手法（ＳＳＣＰ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も開発され遺伝子変異解析に利用されている。特殊な配列（繰返し配列や塩基の偏りなど）を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構造を歪めることが知られており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法はＤＮＡの構造・機能解析にも使用できる。また、尿素などを含む変性ゲル中では、一本鎖ＤＮＡも構造の影響を受けることなく鎖長に応じて分離できる。 Polyacrylamide gel electrophoresis of nucleic acids is mainly used for the analysis of DNA fragments. By using the fine network structure of polyacrylamide gel, fragments of short chains (~ 1 Kbp) compared to agarose gel electrophoresis are used. Is a method of separating the images based on length and structure. Since it is strongly influenced by the three-dimensional structure (conformation) of DNA, the estimation of the DNA chain length is limited to the case of migrating double-stranded DNA. Since single-stranded DNA is expected to have various structures, there is no correlation between mobility and the length of the DNA strand, and it is often detected as a plurality of bands. Even slight differences in DNA bases cause structural changes that are reflected in the electrophoretic pattern. A DNA fragment analysis method (SSCP: Single-Strand Conformation Polymerism) using this has been developed and used for gene mutation analysis. Double-stranded DNA fragments containing special sequences (repetitive sequences, base biases, etc.) are known to distort DNA structures, and polyacrylamide gel electrophoresis can be used for DNA structure / function analysis. In a denaturing gel containing urea or the like, single-stranded DNA can also be separated according to the chain length without being affected by the structure.
ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、目的タンパク質の高次構造を変性して分子量の違いにより分離する手法である。ポリアクリルアミドゲルは、ゲル中の細孔径が密なため１００〜２００ＫＤａ以下のタンパク質やポリペプチドを分離するのに適している。操作が簡便で再現性が高いので、タンパク質の電気泳動では最もよく用いられている手法である。通常は、泳動サンプルの調製時にβ-メルカプトエタノールやＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などの還元剤を添加してタンパク質のＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を切断する。ＳＤＳの結合量によって分子の電荷がほぼ決まるため、電気泳動によりポリペプチド分子を分子量に従って分離することができる。ＳＤＳは強力な陰イオン界面活性剤なので、膜タンパク質などの不溶性タンパク質の可溶化にも適している。 SDS (Sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE method) is a technique in which a higher-order structure of a target protein is denatured and separated by a difference in molecular weight. Polyacrylamide gel is suitable for separating proteins and polypeptides of 100 to 200 KDa or less because the pore diameter in the gel is dense. It is the most commonly used technique for protein electrophoresis because of its simple operation and high reproducibility. Usually, when preparing an electrophoresis sample, a reducing agent such as β-mercaptoethanol or DTT (Dithiothreitol) is added to cleave the S—S bond (disulfide bond) of the protein. Since the molecular charge is substantially determined by the amount of SDS bound, the polypeptide molecules can be separated by electrophoresis according to the molecular weight. Since SDS is a strong anionic surfactant, it is also suitable for solubilizing insoluble proteins such as membrane proteins.
等電点電気泳動は、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行う泳動手法である。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はｐＨ条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるｐＨの値が等電点となる。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にｐＨ勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のｐＩと同じｐＨに向かってｐＨ勾配を形成したゲル中を移動する。ｐＨ勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてｐＨ勾配を形成する手法と、様々なｐＩの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する手法（ＩＰＧ法：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）とがあり、プロテオミクス研究では、分離能、再現性、添加許容量ともに優れるＩＰＧ法が主に用いられている。ＩＰＧ法専用のプレキャストゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｇｅｌ）が市販されている。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ｐＨ単位の違いでも分離することができる。 Isoelectric focusing is an electrophoretic technique in which the isoelectric point (pI) of proteins is separated to measure and analyze the isoelectric point of the target protein. The charge at the amino acid side chain, amino terminal, and carboxyl terminal constituting the protein varies depending on the pH condition, and the pH value at which the total charge becomes zero is the isoelectric point. In order to perform isoelectric focusing, it is necessary to create a pH gradient in the electrophoresis gel. When a sample is added to an electrophoresis gel and an electric field is applied, each protein moves through the gel that forms a pH gradient toward the same pH as the unique pI. For the preparation of a pH gradient gel, an amphoteric carrier (carrier ampholite) is added to the gel and an electric field is applied to form a pH gradient, and acrylamide derivatives having various pI side chains are used simultaneously with gel preparation. There is a method of forming a pH gradient (IPG method: Immobilized pH gradient), and in the proteomics research, the IPG method which is excellent in resolution, reproducibility, and addition tolerance is mainly used. A precast gel (Immobiline Dry Strip Gel) dedicated to the IPG method is commercially available. The resolution of isoelectric focusing using carrier ampholite is 0.01 to 0.02 pH unit, and the IPG method can be separated even by a difference of 0.001 pH unit.
二次元電気泳動法は、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する方法である。一般的に一次元目は等電点電気泳動によりタンパク質を分離し、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量で分離する。いずれの手法も分離能が非常に高いので、細胞全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができる。再現性と解像度に優れた固定化ｐＨ勾配法（ＩＰＧ法）を一次元目泳動に用いることが一般的である。また、より多くのスポットを得るために、幅広いｐＨレンジの分離結果を基にしてＮａｒｒｏｗ ｐＨ ＩＰＧゲルで目的ｐＨ部分のみを分離したり、２０ｃｍ以上の大型ゲルを用いて二次元目電気泳動を行うこともできる。 Two-dimensional electrophoresis is a method of separating proteins in two dimensions by two-stage electrophoresis. In general, the first dimension separates proteins by isoelectric focusing, and the second dimension separates by molecular weight by SDS-PAGE. Since both methods have very high resolution, it is possible to separate the whole cell protein into thousands of spots. In general, an immobilized pH gradient method (IPG method) excellent in reproducibility and resolution is used for the first-dimensional electrophoresis. In addition, in order to obtain more spots, only the target pH portion is separated with a narrow pH IPG gel based on the separation results in a wide pH range, or the second dimension electrophoresis is performed using a large gel of 20 cm or more. You can also
本発明においては、核酸を分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法および二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。 In the present invention, when separating nucleic acids, it is preferable to use agarose gel electrophoresis, and when separating peptides, it is preferable to use SDS polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional electrophoresis. .
電気泳動後、ゲルを、固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された生体分子を本発明の固体支持体上に転写する。固体支持体への転写方法としては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法を使用することができる。例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティングおよび電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。 After electrophoresis, the gel is cut into a size on a solid support, the gel and the solid support are brought into close contact, and the biomolecule separated in the gel is transferred onto the solid support of the present invention. The transfer method to the solid support is not particularly limited, and a method usually used in this technical field can be used. For example, capillary blotting utilizing capillary action, vacuum blotting using a pump, and electroblotting using an electrical technique may be mentioned. When transferring nucleic acids, it is preferable to use capillary blotting. When transferring peptides, it is preferable to use electroblotting.
エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式およびセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、当技術分野で通常用いられているエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。 In electroblotting, any of tank type, semi-dry type, and semi-wet type can be used, but it is preferable to use semi-dry type electro-blotting from the viewpoint of a small amount of buffer used and a short reaction time. . As a blotting apparatus, an electroblotting apparatus usually used in this technical field can be used. The energization conditions in electroblotting are a constant voltage, 200 V or less, preferably 0.1 to 10 V, and 1 to 500 minutes, preferably 5 to 100 minutes. However, if the voltage is higher than the oxidation potential of the metal substrate, metal elution occurs. Therefore, it is preferable that the voltage be lower than the oxidation potential of the substrate metal.
以下に、試料中のペプチドを分析する場合の本発明における電気泳動および転写の一態様を示す。まず、試料中のペプチドを可溶化する。すなわち、試料に存在するペプチド分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってペプチドを効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。 Hereinafter, one embodiment of electrophoresis and transcription in the present invention when analyzing a peptide in a sample will be described. First, the peptide in the sample is solubilized. That is, the peptide-degrading enzyme present in the sample is inactivated and heat-treated in boiling water for a certain period of time for the purpose of effectively denaturing the peptide with SDS and β-mercaptoethanol. Next, a certain amount is injected into each lane of the SDS-polyacrylamide gel, and electrophoresis is performed at a constant voltage for a certain time using a glycine-Tris buffer containing SDS as a migration buffer. After electrophoresis, the gel is immersed in glycine-Tris buffer (transfer buffer) containing methanol, which has been cooled in advance, for equilibration.
続いて、ゲルを陰極側、転写用固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧で一定時間転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、および陽極と固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、ホウ酸、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。ホウ酸、Ｔｒｉｓおよびε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。また、陽極側のろ紙は、存在しなくてもよい。 Subsequently, the gel is attached to the electroblotting apparatus with the cathode side and the solid support for transfer as the anode side. A transfer buffer is added to the transfer tank, and transfer is performed at a constant voltage for a certain time under ice cooling. At this time, from the viewpoint of increasing the transfer efficiency, it is preferable to dispose a filter paper containing a buffer or ion exchange water between the cathode and the gel and between the anode and the solid support. Examples of the buffer contained in the filter paper on the cathode side include those containing boric acid, Tris, ε-aminocaproic acid, acetic acid, EDTA, phosphoric acid, tartaric acid, SDS and the like. When a buffer containing boric acid, Tris and ε-aminocaproic acid is used, the concentration of ε-aminocaproic acid is usually 1000 mM or less, preferably 1 μM to 1000 mM, more preferably 1 to 300 mM. The filter paper on the anode side preferably contains ion exchange water. Further, the filter paper on the anode side may not exist.
さらなる生体分子の相互作用は、上記のようにして生体分子が固定化された固体支持体上に、相互作用する可能性のある生体分子を含む試料を接触させることにより実施することができる。相互作用させた後は、相互作用しないその他の生体分子を除去するため、固体支持体を洗浄する。 Further interaction of biomolecules can be carried out by bringing a sample containing biomolecules that may interact with each other onto the solid support on which the biomolecules are immobilized as described above. After the interaction, the solid support is washed to remove other biomolecules that do not interact.
本発明の生体分子の分析方法は、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に直接転写する場合だけでなく、メンブレンを介して転写する場合も包含する。従って、本発明の分析方法の一実施形態においては、ゲル中に分離された生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化することもできる。すなわち、生体分子のゲルから固体支持体への転写において、固体支持体に直接転写するのではなく、一度生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を固体支持体上に転写してもよい。 The biomolecule analysis method of the present invention includes not only the case where the biomolecule separated in the gel is directly transferred onto the solid support, but also the case where it is transferred via a membrane. Accordingly, in one embodiment of the analysis method of the present invention, a biomolecule separated in a gel is transferred onto a membrane, and the biomolecule transferred onto the membrane is transferred onto a solid support, thereby The biomolecules therein can also be immobilized on a solid support. In other words, in the transfer of a biomolecule from a gel to a solid support, the biomolecule is not transferred directly to the solid support, but once transferred onto the membrane, and the biomolecule transferred onto the membrane is transferred onto the solid support. You may transfer to.
この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロンおよびポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写およびメンブレンから固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから固体支持体への転写においても、エレクロトブロッティングを利用するのが好ましい。 Examples of the membrane material that can be used in this case include nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride), nylon, and positively charged nylon. In protein transcription, PVDF having the highest protein binding ability is preferably used, and in nucleic acid transcription, PVDF with less non-specific adsorption of nucleic acid is preferably used. Transfer of the electrophoretic substance from the gel to the membrane and transfer from the membrane to the solid support can be performed by the same method as described above. In the transfer from the gel to the membrane, electroblotting is preferably used, and the energization conditions in electroblotting are 0.1 to 50 V, preferably about 5 to 120 minutes. It is preferable to use electroblotting also in the transfer from the membrane to the solid support.
本発明の一実施形態では、固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させた後、質量分析する前に、固体支持体に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用した生体分子を酵素で分解する。そして酵素分解により得られた分解物を質量分析してもよい。 In one embodiment of the present invention, the biomolecule immobilized on the solid support and / or the biomolecule immobilized on the solid support and / or the Biomolecules that interact with biomolecules are degraded by enzymes. The degradation product obtained by enzymatic degradation may be subjected to mass spectrometry.
質量分析装置において分析できる生体分子の分子量には制限があるため、高分子量の生体分子を解析するには、上記のように酵素分解を行うのが好ましい。高分子量の生体分子、例えば高分子量ペプチド、すなわちタンパク質を特定のプロテアーゼで分解し、得られたペプチド断片を質量分析し、得られたデータと公知の断片データとを比較することによりペプチドを同定することができる。このような方法は、マスフィンガープリンティング法とも称される。当該方法は、高分子量の生体分子、例えば分子量５〜２００ｋＤａ、好ましくは５〜１００ｋＤａの生体分子の分析において特に好適である。また、相互作用させる生体分子が高分子である場合に特に好適である。 Since there is a limit to the molecular weight of biomolecules that can be analyzed by a mass spectrometer, it is preferable to perform enzymatic degradation as described above in order to analyze high molecular weight biomolecules. High molecular weight biomolecules, for example, high molecular weight peptides, ie, proteins are decomposed with a specific protease, the obtained peptide fragments are subjected to mass spectrometry, and the peptides are identified by comparing the obtained data with known fragment data be able to. Such a method is also called a mass fingerprinting method. This method is particularly suitable for the analysis of high molecular weight biomolecules, for example biomolecules with a molecular weight of 5 to 200 kDa, preferably 5 to 100 kDa. Moreover, it is particularly suitable when the biomolecule to be interacted is a polymer.
生体分子を分解するための酵素は、マスフィンガープリンティング法で使用できるものであれば特に制限されず、当業者であれば、分析対象となる生体分子に応じて選択することができる。核酸を分析する場合は、酵素としてヌクレアーゼ、特に制限酵素（例えば、ＲＥＢＡＳＥのデータベースに記載のもの）を使用する。ヌクレアーゼとしては、例えば、Ｓ１ ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンカビヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、膵臓ＤＮａｓｅI、Ｂａｌ３１、ＥｘｏI、ＥｘｏIII、ＥｘｏVII、λエキソヌクレアーゼ、ＡａｒI、ＡａｔII、ＡｃｃI、ＡｃｅIII、ＡｃｉI、ＡｃｌI、ＡｃｙI、Ｈｉｎ１I、ＡｆｌII、ＡｆｌIII、ＡｇｅI、ＡｈａIII、ＡｌｆI、ＡｌｏI、ＡｌｕI、ＡｌｗＮI、ＡｐａI、ＡｐａＢI、ＡｐａＬI、ＡｐｏI、ＡｓｃI、ＡｓｐＣＮI、ＡｓｕI、Ｃｆｒ１３I、ＡｓｕII、ＢｓｐＴ１０４I、ＡｖａI、ＡｖａII、ＶｐａＫ１１ＢI、ＥｃｏＴ２２I、ＢｌｎI、ＢｂｖII、ＢｂｖＣI、ＢｃｃI、ＢｃｅｆI、Ｂｃｅ８３I、ＢｃｇI、ＢｃｉＶI、ＦｂａI、ＢｅｔI、ＢｆｉI、ＢｇｌI、ＢｇｌII、ＢｉｎI、ＢｍｇI、ＢｐｌI、Ｂｐｕ１０I、ＢｓａＡI、ＢｓａＢI、ＢｓａＸI、ＢｓｂI、ＢｓｃＧI、ＢｓｅＭII、ＢｓｅＰI、ＢｓｅＲI、ＢｓｅＳI、ＢｓｅＹI、ＢｓｇI、ＢｓｉＹI、ＢｓｍI、ＢｓｍＡI、ＢｓｐＧI、ＢｓｐＨI、ＢｓｐＬＵ１１I、ＢｓｐＭI、ＢｓｐＧII、ＢｓｐＮＣI、Ｂｓｐ２４I、Ｂｓｐ１４０７I、ＢｓｒI、ＢｓｒＢI、ＢｓｒＤI、ＢｓｔＥII、ＢｓｔＰI、ＥｃｏＯ６５I、ＢｓｔＸI、ＢｔｇＺI、ＢｔｒI、ＢｔｓI、Ｃａｃ８I、ＣａｕII、ＢｃｎI、ＣｄｉI、ＣｆｒI、ＥａｅI、Ｃｆｒ１０I、ＣｊｅI、ＣｊｅＰI、ＣｌａI、ＣｖｉＪI、ＣｖｉＲI、ＣｄｅI、ＤｐｎI、ＤｒａII、ＤｒａIII、ＤｒｄI、ＤｒｄII、ＤｓａI、Ｅａｍ１１０５I、ＥｃｏＮI、ＥｃｉI、ＥｃｏＮI、ＥｃｏＲI、ＥｃｏＲII、ＭｖａI、ＥｃｏＲＶ、Ｅｃｏ３１I、Ｅｃｏ４７III、Ａｏｒ５１ＨI、Ｅｃｏ５７I、Ｅｃｏ５７ＭI、ＥｓｐI、Ｂｐｕ１１０２I、Ｅｓｐ３I、ＦａｌI、ＦａｕI、ＦｉｎI、ＦｎｕＤII、ＡｃｃII、Ｆｎｕ４ＨI、ＦｏｋI、ＦｓｅI、ＦｓｐＡI、ＧｄｉII、ＧｓｕI、ＨａｅI、ＨａｅII、ＨａｅIII、ＨａｅIV、ＨｇａI、ＨｇｉＡI、ＨｇｉＣI、ＢｓｐＴ１０７I、ＨｇｉＥII、ＨｇｉＪII、ＢａｎII、ＨｈａI、ＨｉｎｄII、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｆI、Ｈｉｎ４I、Ｈｉｎ４II、ＨｐａI、ＨｐａII、ＨａｐII、ＭｓｐI、ＨｐｈI、Ｈｐｙ９９I、Ｈｐｙ１７８III、Ｈｐｙ１８８I、ＫｐｎI、Ｋｓｐ６３２I、ＭａｅI、ＸｓｐI、ＭａｅII、ＭａｅIII、ＭｂｏI、Ｓａｕ３ＡI、ＭｂｏII、ＭｃｒI、ＭｆｅI、ＭｕｎI、ＭｊａIV、ＭｌｕI、ＭｍｅI、ＭｎｌI、ＭｓｔI、ＮｓｂI、ＭｗｏI、ＮａｅI、ＮａｒI、ＢｂｅI、ＮｃｏI、ＮｄｅI、ＮｈｅI、ＮｌａIII、ＮｌａIV、ＮｏｔI、ＮｒｕI、ＮｓｐI、ＮｓｐＢII、ＯｌｉI、ＰａｃI、ＰｆｌＭI、Ｐｆｌ１１０８I、ＰｆｏI、ＰｌｅI、ＰｍａＣI、ＰｍｅI、ＰｐｉI、ＰｐｕＭI、ＰｓｈＡI、ＰｓｉI、ＰｓｒI、ＰｓｔI、ＰｖｕI、ＰｖｕII、ＲｌｅＡI、ＲｓａI、ＡｆａI、ＲｓｒII、ＣｐｏI、ＳａｃI、ＳａｃII、ＳａｌI、ＳａｎＤI、ＳａｐI、ＳａｕI、Ｅｃｏ８１I、ＳｃａI、ＳｃｒＦI、ＳｄｕI、Ｂｓｐ１２８６I、ＳｅｃI、ＳｅｘＡI、ＳｆａＮI、ＳｆｅI、ＳｆｉI、ＳｇｆI、ＳｇｒＡI、ＳｉｍI、ＳｍａI、ＳｍｌI、ＳｎａI、ＳｎａＢI、ＳｐｅI、ＳｐｈI、ＳｐｌI、ＳｒｆI、Ｓｓｅ８３８７I、Ｓｓｅ８６４７I、ＳｓｐI、Ｓｔｈ１３２I、ＳｔｕI、ＳｔｙI、ＥｃｏＴ１４I、ＳｗａI、ｔａｑI、ｔａｑII、ｔａｔI、ＴａｕI、ＴｆｉI、ＴｓｅI、ＴｓｐＤＴI、ＴｓｐＥI、ＴｓｐＧＷI、ＴｓｐＲI、Ｔｓｐ４ＣI、Ｔｓｐ４５I、Ｔｔｈ１１１I、Ｔｔｈ１１１II、ＵｂａＤI、ＵｂａＥI、ＵｂａＧI、ＵｂａＨI、ＵｂａＮI、ＵｂａＰI、ＶｓｐI、ＰｓｈＢI、ＸｂａI、ＸｃｍI、ＸｈｏI、ＸｈｏII、ＭｆｌI、ＸｍａIII、Ｅｃｏ５２IおよびＸｍｎI等が挙げられる。 The enzyme for degrading the biomolecule is not particularly limited as long as it can be used in the mass fingerprinting method, and those skilled in the art can select it according to the biomolecule to be analyzed. When analyzing nucleic acids, nucleases, particularly restriction enzymes (for example, those described in the REBASE database) are used as enzymes. Examples of the nuclease include S1 nuclease, snake venom nuclease, spleen phosphodiesterase, staphylococcal nuclease, brown bean nuclease, red bread fungus nuclease, RNase H, pancreatic DNaseI, Bal31, ExoI, ExoIII, ExoVII, λ exonuclease, AarI, AatII, AccI AceIII, AciI, AclI, AcyI, Hin1I, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AlfI, AloI, AluI, AlwNI, ApaI, ApaBI, ApaLI, ApoI, AscI, AspCN, As13 VpaK11BI, EcoT22I, BlnI, BbvII, BbvCI, BccI, BcefI, Bce83I, BcgI, BciVI, FbaI, Be tI, BfiI, BglI, BglII, BinI, BmgI, BplI, Bpu10I, BsaAI, BsaBI, BsaXI, BsbI, BscGI, BseMII, BsePI, BseRI, BseSI, BseYs, BsYI, BsYI, BsY BspMI, BspGII, BspNCI, Bsp24I, Bsp1407I, BsrI, BsrBI, BsrDI, BstEII, BstPI, EcoO65I, BstXI, BtgZI, BtrI, BtsI, Cac8I, CauII, Bcn CviJI, CviRI, CdeI, DpnI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, Eam1105I, EcoNI, EciI, EcoNI, EcoRI, EcoR II, MvaI, EcoRV, Eco31I, Eco47III, Aor51HI, Eco57I, Eco57MI, EspI, Bpu1102I, Esp3I, FalI, FauI, FinI, FnuDII, AccII, Fnu4HI, FokI, FseI, FspI HaeIV, HgaI, HgiAI, HgiCI, BspT107I, HgiEII, HgiJII, BanII, HhaI, HindII, HincII, HindIII, HinfI, Hin4I, Hin4II, HpaI, HpaII, HapII, HpII, HpII, HpII MaeI, XspI, MaeII, MaeIII, MboI, Sau3AI, MboII, McrI, MfeI, MunI, MjaIV, MluI, MmeI, MnI, stI, NsbI, MwoI, NaeI, NarI, BbeI, NcoI, NdeI, NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruI, NspI, NspBII, OliI, PacI, PflMI, Pfl1pI, PfoI, PleP PshAI, PsiI, PsrI, PstI, PvuI, PvuII, RleAI, RsaI, AfaI, RsrII, CpoI, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, SauI, Eco81I, ScaI, SdSrS SfeI, SfiI, SgfI, SgrAI, SimI, SmaI, SmlI, SnaI, SnaBI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, SspI, Sth132I, StuI, Styl EcoT14I, SwaI, taqI, taqII, tatI, TauI, TfiI, TseI, TspDTI, TspEI, TspGWI, TspRI, Tsp4CI, Tsp45I, Tth111I, Tth111II, UbaDI, UbaEI, UbaDI, UbaEI, UbG XcmI, XhoI, XhoII, MflI, XmaIII, Eco52I, XmnI and the like can be mentioned.
ペプチド、特にタンパク質を分析する場合は、酵素としてプロテアーゼを使用する。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼI（ＡＰI、リジルエンドペプチダーゼ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、トロンビン、アミノペプチダーゼＭ、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＣ、キモトリプシンＡ、クロストリパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｎｅｕｔｒａｌ）、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（プロテアーゼＶ８）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子、フィシン、ロイシンアミノペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トロンビンを使用することができる。タンパク質をプロテアーゼで分解する場合、通常２５〜４２℃、より好ましくは３５〜３９℃で、１〜２４時間反応を行う。 When analyzing peptides, especially proteins, proteases are used as enzymes. Examples of the protease include trypsin, Achromobacter protease I (API, lysyl endopeptidase), Staphylococcus aureus V8 protease, endoproteinase Asp-N, thrombin, aminopeptidase M, bromelain, carboxypeptidase A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, cathepsin C, chymotrypsin A, clostripain, collagenase, dispase (protease neutral), elastase, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Glu-C (protease V8), endoproteinase Lys-C, factor Xa, ficin , Leucine aminopeptidase, papain, pe Psin, plasmin, pronase, proteinase K, pyroglutamate aminopeptidase, subtilisin, thermolysin, thrombin can be used. When degrading a protein with a protease, the reaction is usually performed at 25 to 42 ° C, more preferably at 35 to 39 ° C for 1 to 24 hours.
ここで分解物とは、生体分子を酵素で分解することによって得られる小分子を意味し、長鎖核酸分子を酵素分解して得られる核酸断片、およびポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質を酵素分解して得られるペプチド断片が包含される。 The degradation product means a small molecule obtained by degrading a biomolecule with an enzyme, and a nucleic acid fragment obtained by enzymatic degradation of a long-chain nucleic acid molecule, and a polypeptide, oligopeptide or protein. Peptide fragments obtained are included.
酵素分解では、塩はイオン化を阻害するため、塩濃度を薄くするか、揮発性の塩を使用するのが好ましい。また、酵素分解反応中の溶液乾燥は切断反応を停止させるため、湿度を保って乾燥を防ぐのが好ましい。 In the enzymatic degradation, since the salt inhibits ionization, it is preferable to reduce the salt concentration or use a volatile salt. Further, since solution drying during the enzymatic decomposition reaction stops the cleavage reaction, it is preferable to keep the humidity and prevent drying.
本発明では、マスフィンガープリント法により、固体支持体上に固定化された生体分子をおよび／または該生体分子と相互作用した生体分子を同定することができる。すなわち、生体分子の酵素分解物に含まれる多数の消化断片に由来するイオンの質量を測定し、既知のデータベースと比較することにより、生体分子を同定することができる。さらに、低分子化処理により、ＭＡＬＤＩ特有のポストソースディケイ（ＰＳＤ）解析ができるようになるためＭＳ／ＭＳ解析で容易にアミノ酸配列等を決定できる。このため、データベースサーチにＭＳ／ＭＳ解析のデータを使ったデータベース検索ができる。 In the present invention, biomolecules immobilized on a solid support and / or biomolecules interacting with the biomolecule can be identified by mass fingerprinting. That is, the biomolecule can be identified by measuring the mass of ions derived from a large number of digested fragments contained in the enzymatic degradation product of the biomolecule and comparing it with a known database. Furthermore, post-source decay (PSD) analysis peculiar to MALDI can be performed by low molecular weight treatment, so that amino acid sequences and the like can be easily determined by MS / MS analysis. For this reason, database search using MS / MS analysis data for database search is possible.
ペプチドを同定するためのデータベースとしては、例えば、Ｍａｓｃｏｔ、ＭＳ−Ｔａｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ、ＰｅｐＦｒａｇ、ＳＥＱＵＥＳＴなどが挙げられる（実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座２、プロテオーム解析法、羊土社（２０００））。 Databases for identifying peptides include, for example, Mascot, MS-Tag, Peptide Search, PepFrag, SEQUEST, etc. (Experimental Medicine Separate Volume, Experimental Course 2 in the Post-Genome Era, Proteome Analysis Method, Yodosha (2000 )).
既に述べたような方法により、タンパク質が固体支持体上に固定化される場合は、該タンパク質に対する抗体または抗体断片を反応させて複合体を形成し、タンパク質に結合した抗体または複合体をイオン化することにより質量分析を行うことができ、該タンパク質に対する特異的な抗体の同定や抗体のエピトープ部位を決定することができる。また、抗体断片が固体支持体上に固定化される場合は、タンパク質（抗原）を反応させて複合体を形成し、タンパク質または複合体をイオン化することにより質量分析を行うこともできる。 When a protein is immobilized on a solid support by a method as described above, an antibody or antibody fragment against the protein is reacted to form a complex, and the antibody or complex bound to the protein is ionized. Thus, mass spectrometry can be performed, and identification of an antibody specific to the protein and determination of an epitope site of the antibody can be performed. In addition, when the antibody fragment is immobilized on a solid support, mass spectrometry can be performed by reacting a protein (antigen) to form a complex and ionizing the protein or complex.
さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸が固体支持体上に固定化される場合は、該核酸に対して相補的な核酸を固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせ、形成した二本鎖をイオン化して質量分析を行うことができる。その他の相互作用としては、例えば、リガンドと受容体の相互作用、酵素と基質の反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等が挙げられる。相互作用によって形成した複合体または相互作用した生体分子の質量分析を行うことにより、プローブ分子に特異的に相互作用したターゲット分子を同定し、その塩基配列またはアミノ酸配列を解析することができる。 Further, when a nucleic acid such as DNA or RNA is immobilized on a solid support, a nucleic acid complementary to the nucleic acid is hybridized to the nucleic acid on the solid support, and the formed double strand is ionized. Mass spectrometry can be performed. Examples of other interactions include ligand-receptor interaction, enzyme-substrate reaction, biotin-streptavidin interaction, and the like. By performing mass spectrometry of the complex formed by the interaction or the interacting biomolecule, the target molecule that specifically interacts with the probe molecule can be identified, and its base sequence or amino acid sequence can be analyzed.
本発明の別の態様においては、生体分子の相互作用を分析することを目的として、溶液中で相互作用する生体分子の複合体を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を固体支持体上に固定化し、固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象分子の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。 In another aspect of the present invention, for the purpose of analyzing the interaction of biomolecules, a complex of biomolecules that interact in solution is formed, and then subjected to electrophoresis and separated by electrophoresis. Mass spectrometry can also be performed by immobilizing the prepared complex on a solid support and ionizing the complex on the solid support. Since such an analysis method forms a complex in a solution, it is advantageous for an analysis that needs to maintain a high degree of three-dimensional structure of a molecule to be analyzed, such as protein analysis.
質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析方法は、イオンの生成・分離・検出の３つの工程を含む。 As a mass spectrometric method, a technique of analyzing atomic / molecular ions based on a difference in mass using electrical interaction can be used. Such a mass spectrometry method includes three steps of ion generation, separation, and detection.
固体支持体上に固定化された生体分子の酵素分解物を質量分析する方法としては、特に制限されず、当技術分野で公知のものを使用できる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、レーザー脱離法、特にマトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなαまたはβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形または非線形反射飛行時間型（ＴＯＦ）、単一または多重四重極型、単一または多重磁気セクター型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）型、イオン捕獲型、高周波型ならびにイオン捕獲／飛行時間型等が挙げられ、線形または非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）型、高周波およびイオン捕獲／飛行時間型を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ、ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ等が挙げられる。生体分子などの高分子物質をイオン化し、固体支持体上の複数の分子を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用するのが好ましい。 The method for mass spectrometry of the enzymatic degradation product of the biomolecule immobilized on the solid support is not particularly limited, and those known in the art can be used. Examples of ionization methods that can be used for mass spectrometry include laser desorption, especially matrix-assisted laser desorption (MALDI), ionization by electron impact (EI), electrospray ionization (ESI), and photoionization. , Ionization method using α- or β-rays with large LET emitted from radioisotopes, secondary ionization method, fast atom collision ionization method, field ionization ionization method, surface ionization ionization method, chemical ionization (CI) method, field Examples thereof include an ionization (FI) method and an ionization method by spark discharge, and a matrix-assisted laser desorption (MALDI) method is preferable. As separation modes, linear or nonlinear reflection time-of-flight (TOF), single or multiple quadrupole, single or multiple magnetic sector, Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR), ion capture, high frequency Type and ion capture / time-of-flight type and the like, and those using linear or non-linear reflection time-of-flight (TOF) type, high frequency and ion capture / time-of-flight type are preferable. Mass spectrometry can be performed by combining the ionization method as described above with a detection mode such as separation mode, electrical recording and photographic recording. Specifically, MALDI-TOF MS, ESI Q-TOF MS, MALDI Q-TOF MS, etc. are mentioned. From the viewpoint of ionizing a macromolecular substance such as a biomolecule and analyzing a plurality of molecules on a solid support, it is preferable to use laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry, particularly MALDI-TOF MS. .
以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたペプチドの質量分析の手順を説明する。 Hereinafter, as one embodiment of the present invention, a procedure for mass spectrometry of a peptide using MALDI-TOF MS will be described.
分析対象が固定化された本発明の固体支持体にマトリックス溶媒を添加し、乾燥させる。マトリックス溶媒としては、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などを含むものを使用できる。本発明においては、０．５〜８０％、好ましくは１〜５０％のα-シアノヒドロキシ桂皮酸、１〜８０％、好ましくは２０〜７０％のアセトニトリルを含むマトリックス溶媒を用いるのが好ましい。マトリックス溶媒はさらにトリフルオロ酢酸を含んでいてもよい。このようなマトリックスを用いることによりマトリックス溶媒がレーザーのエネルギーを効果的に吸収して、そのエネルギーが間接的にペプチドに伝わり、イオン化が起こる。次ぎに該固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセスおよびデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。 A matrix solvent is added to the solid support of the present invention on which the analyte is immobilized and dried. As the matrix solvent, those containing α-cyanohydroxycinnamic acid, sinapinic acid and the like can be used. In the present invention, it is preferable to use a matrix solvent containing 0.5 to 80%, preferably 1 to 50% α-cyanohydroxycinnamic acid, 1 to 80%, preferably 20 to 70% acetonitrile. The matrix solvent may further contain trifluoroacetic acid. By using such a matrix, the matrix solvent effectively absorbs the energy of the laser, the energy is indirectly transmitted to the peptide, and ionization occurs. Next, this solid support body is installed in the flat target of MALDI-TOF MS. Then, mass spectrometry is started using MassLynx software or the like. MassLynx can control all measurements and analyses. During measurement, a parameter file for automatic measurement, a process file for data processing and database analysis performed after measurement, a sample list, and the like are created. Data processing can be performed on MassLynx using ProteinLynx software. A mass spectrum is created from the acquired data, and the created spectrum is converted to monoisotopic peak data after the accuracy is improved by MaxEnt 3 software (Micromass). Subsequently, calibration is performed to obtain final data with a mass error of about 50 ppm.
固体支持体にペプチドが固定化され、該ペプチドにさらなるペプチドが相互作用で結合している場合、質量分析に続いてペプチドのアミノ酸配列分析および同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、ペプチドのアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、ペプチドを同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳにペプチドが固定化された固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、ペプチドを同定することができる。 If the peptide is immobilized on a solid support and further peptides are bound to the peptide by interaction, amino acid sequence analysis and identification of the peptides can be performed following mass spectrometry. The analysis mode of MALDI-TOF MS is set to a mode capable of detecting a post-source decay (PSD) spectrum, and the amino acid sequence of the peptide is analyzed. Subsequently, the SWISSPROT database is searched based on the amino acid sequence data to identify peptides. Alternatively, the peptide can be identified by installing a solid support on which the peptide is immobilized on MALDI-TOF / TOF MS or MALDI Q-TOF MS and analyzing the amino acid sequence.
本発明はまた、上記の生体分子の分析方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する固体支持体を含むキットに関する。本発明のキットは、表面にカーボン層を有する固体支持体を含み、本発明の分析方法に使用するためのものであることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。表面にカーボン層を有する固体支持体に加え、例えば、生体分子を分解するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。 The present invention also relates to a kit for use in the above-described biomolecule analysis method, comprising a solid support having a carbon layer on the surface. The kit of the present invention comprises a solid support having a carbon layer on the surface, and is constituted by each element used in a publicly known kit except that it is used for the analysis method of the present invention. Can do. In addition to the solid support having a carbon layer on the surface, for example, an enzyme for decomposing biomolecules, a buffer solution, a matrix solvent, a washing buffer, a sample diluent, a reaction stop solution, a standard substance and the like can be included.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
ステンレス基板にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ステンレス基板は、平滑性と蛍光バックグラウンドを下げるために、予めバフ研磨後、更に電解研磨を施した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。また、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入し固体支持体を作成した。
(Example 1) Detection of protein-peptide interaction A diamond-like carbon layer was formed on a stainless steel substrate. The stainless steel substrate was subjected to electrolytic polishing after buffing in advance in order to lower the smoothness and the fluorescent background. The diamond-like carbon layer was formed by the ionization vapor deposition method under the following conditions. The thickness of the produced diamond-like carbon layer was 20 nm. Further, an amino group was introduced by ammonia plasma treatment to prepare a solid support.
ダイズ由来の４３ｋＤａプロテイン（Basic 7S Globulin Precursor、ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｓ０６７５０）は細胞膜付近に局在しており、４ｋＤａペプチド（leginsulin precursor、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＢＡＡ０４２１９）やインスリンと結合することが知られている（Possible physiological function and the tertiary structure of a 4-kDa peptide in legumes. Eur. J. Biochem. 270, 1269-1276, 2003.を参照）。ダイズから精製した４３ｋＤａプロテイン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を上記固体支持体にスポットした。湿箱にて３７℃で３０分間反応させ、超純水で洗浄し、乾燥させた。 43 kDa protein derived from soybean (Basic 7S Globulin Precursor, NCBI accession number: S06750) is localized near the cell membrane, and is known to bind to 4 kDa peptide (leginsulin precursor, NCBI accession number: BAA04219) and insulin. (See Possible physiological function and the tertiary structure of a 4-kDa peptide in legumes. Eur. J. Biochem. 270, 1269-1276, 2003.) 43 kDa protein purified from soybean (1 μg and 100 ng, manufactured by SIGMA) was spotted on the solid support. The mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes in a wet box, washed with ultrapure water, and dried.
４ｋＤａペプチド（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、４３ｋＤａプロテインを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定を行った。検出されたシグナルは質量スペクトルより４ｋＤａペプチド由来のものであることが確認された。 A 4 kDa peptide (100 μg, manufactured by SIGMA) was dissolved in 3 mL of an interaction buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl), and allowed to interact with a solid support on which a 43 kDa protein was immobilized for 3 hours. The plate was washed twice with a washing buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) for 10 minutes, washed with ultrapure water, and dried. A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS measurement was performed. It was confirmed from the mass spectrum that the detected signal was derived from a 4 kDa peptide.
（実施例２）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（カルモジュリン）は細胞内で他のタンパク質やペプチドとカルシウム依存的な相互作用を示すことが知られている。カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）はカルモジュリンとの結合部位認識部位を持つペプチドである。カルモジュリン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１で作成した固体支持体にスポットした。湿箱にて３７℃で３０分間反応させ、超純水で洗浄し、乾燥させた。
(Example 2) Detection of protein-peptide interaction Calmodulin (calmodulin) is known to show calcium-dependent interactions with other proteins and peptides in cells. Calmodulin-binding peptide (CBP) is a peptide having a binding site recognition site for calmodulin. Calmodulin (1 μg and 100 ng, manufactured by SIGMA) was spotted on the solid support prepared in Example 1. The mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes in a wet box, washed with ultrapure water, and dried.
ＣＢＰ（１００μｇ、東レリサーチセンター社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、カルモジュリンを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルよりＣＢＰ由来のものであることが確認された。 CBP (100 μg, manufactured by Toray Research Center) was dissolved in 3 mL of an interaction buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) and allowed to interact with a solid support on which calmodulin was immobilized for 3 hours. The plate was washed twice with a washing buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) for 10 minutes, washed with ultrapure water, and dried. A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS was measured. It was confirmed from the mass spectrum that the detected signal was derived from CBP.
（実施例３）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
ダイズから精製した４３ｋＤａプロテイン（１μｇ及び１００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）による電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。
Example 3 Detection of Protein-Peptide Interaction 43 kDa protein (1 μg and 100 ng) purified from soybean was subjected to electrophoresis by the SDS-PAGE method (NA-1010, manufactured by Aido Japan). A 10% polyacrylamide gel was used as the gel for electrophoresis. The electrophoresis buffer was a glycine-Tris buffer containing 0.1% SDS, and the electrophoresis was performed at 150 V for 60 minutes.
泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、４３ｋＤａプロテインを固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。 After the electrophoresis, the gel was taken out, cut into a size to be placed on the solid support prepared in Example 1, washed with 10% methanol, then replaced with fresh 10% methanol, and further washed for 30 seconds. After washing, the gel was placed on the solid support of Example 1 so that no bubbles would enter, and a dialysis membrane and a filter paper containing 1M H 3 BO 3 buffer (pH 8.0) were placed on the gel support. The cathode and the solid support side were set as the anode, and it was installed in a semi-driving device. Then, electricity was applied at 2 V for 60 minutes to transfer the 43 kDa protein to the solid support. The gel, dialysis membrane, and filter paper were removed from the solid support after blotting, washed with ultrapure water, and dried.
４ｋＤａペプチド（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、４３ｋＤａプロテインが固定化された固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。
マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルより４ｋＤａペプチド由来のものであることが確認された。
A 4 kDa peptide (100 μg, manufactured by SIGMA) was dissolved in 3 mL of an interaction buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) and allowed to interact with a solid support on which a 43 kDa protein was immobilized for 3 hours. The plate was washed twice with a washing buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) for 10 minutes, washed with ultrapure water, and dried.
A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS was measured. It was confirmed from the mass spectrum that the detected signal was derived from a 4 kDa peptide.
（実施例４）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
カルモジュリン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）による電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。
(Example 4) Detection of protein-peptide interaction Calmodulin (1 μg and 100 ng, manufactured by SIGMA) was subjected to electrophoresis by SDS-PAGE method (NA-1010 model manufactured by Nippon Aido). A 10% polyacrylamide gel was used as the gel for electrophoresis. The electrophoresis buffer was a glycine-Tris buffer containing 0.1% SDS, and the electrophoresis was performed at 150 V for 60 minutes.
泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように、実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。 After the electrophoresis, the gel was taken out, cut into a size to be placed on the solid support prepared in Example 1, washed with 10% methanol, then replaced with fresh 10% methanol, and further washed for 30 seconds. After washing, a gel is placed on the solid support of Example 1 so that bubbles do not enter, and a dialysis membrane and a filter paper containing 1M H 3 BO 3 buffer (pH 8.0) are placed on the gel side. Was set as a cathode and the solid support side was set as an anode in a semi-drive lotting apparatus. Then, electricity was applied at 2 V for 60 minutes to transfer the protein complex to the solid support. The gel, dialysis membrane, and filter paper were removed from the solid support after blotting, washed with ultrapure water, and dried.
ＣＢＰ（１００μｇ、東レリサーチセンター社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、カルモジュリンを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルよりＣＢＰ由来のものであることを確認した。 CBP (100 μg, manufactured by Toray Research Center) was dissolved in 3 mL of an interaction buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) and allowed to interact with a solid support on which calmodulin was immobilized for 3 hours. The plate was washed twice with a washing buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) for 10 minutes, washed with ultrapure water, and dried. A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS was measured. It was confirmed from the mass spectrum that the detected signal was derived from CBP.
（実施例５）タンパク質−タンパク質間相互作用の検出
Ｃｙ３−プロテインＡ（１μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）とＬＭＷ分子量マーカー（１０μｇ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ社製）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）により電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。
(Example 5) Detection of protein-protein interaction Cy3-Protein A (1 μg, manufactured by SIGMA) and LMW molecular weight marker (10 μg, manufactured by Amersham Bioscience) were analyzed by SDS-PAGE (NA-1010 manufactured by Aido Japan). Was subjected to electrophoresis. A 10% polyacrylamide gel was used as the gel for electrophoresis. The electrophoresis buffer was a glycine-Tris buffer containing 0.1% SDS, and the electrophoresis was performed at 150 V for 60 minutes.
泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように、実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。 After the electrophoresis, the gel was taken out, cut into a size to be placed on the solid support prepared in Example 1, washed with 10% methanol, then replaced with fresh 10% methanol, and further washed for 30 seconds. After washing, a gel is placed on the solid support of Example 1 so that bubbles do not enter, and a dialysis membrane and a filter paper containing 1M H 3 BO 3 buffer (pH 8.0) are placed on the gel side. Was set as a cathode and the solid support side was set as an anode in a semi-drive lotting apparatus. Then, electricity was applied at 2 V for 60 minutes to transfer the protein to the solid support. The gel, dialysis membrane, and filter paper were removed from the solid support after blotting, washed with ultrapure water, and dried.
リジルエンドペプチダーゼ消化液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１ｕｇ／ｍＬ リジルエンドペプチダーゼ）をスポットし、３７℃で５時間にわたり酵素消化した。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。それぞれのエリアから得られた質量スペクトルを用い、Ｍａｓｃｏｔにてデータベースサーチを行ったところ、プロテインＡ、アルブミン、オブアルブミン、カーボニックアンヒドラーゼ、トリプシンインヒビター、αラクトアルブミン由来のものであることが明らかになり、固体支持体に転写されたタンパク質の同定を行うことができた。 Lysyl endopeptidase digest (5 mM Tris-HCl, pH 9.0, 1 ug / mL lysyl endopeptidase) was spotted and enzymatically digested at 37 ° C. for 5 hours. A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% TFA) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS was measured. A database search using Mascot using the mass spectrum obtained from each area revealed that it was derived from protein A, albumin, ovalbumin, carbonic anhydrase, trypsin inhibitor, and α-lactalbumin. Thus, the protein transferred to the solid support could be identified.
更に、Ｃｙ５−ＩｇＧ（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、Ｃｙ３−プロテインＡが固定化された固体支持体（酵素消化する前のもの）と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。 Furthermore, Cy5-IgG (100 μg, manufactured by SIGMA) was dissolved in 3 mL of interaction buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl), and a solid support on which Cy3-protein A was immobilized (before enzyme digestion) ) For 3 hours. The plate was washed twice with a washing buffer (20 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl) for 10 minutes, washed with ultrapure water, and dried.
リジルエンドペプチダーゼ消化液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１ｕｇ／ｍＬ リジルエンドペプチダーゼ）をスポットし、３７℃で５時間にわたり酵素消化した。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。それぞれのエリアから得られた質量スペクトルを用い、Ｍａｓｃｏｔにてデータベースサーチを行ったところ、ＩｇＧ由来のものであると同定された。すなわち、本発明の方法により固体支持体上で相互作用したタンパク質を検出および同定できることが示された。 Lysyl endopeptidase digest (5 mM Tris-HCl, pH 9.0, 1 ug / mL lysyl endopeptidase) was spotted and enzymatically digested at 37 ° C. for 5 hours. A matrix solvent (1 mg / mL α-cyanohydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 0.1% TFA) was spotted, and after natural drying, MALDI-TOF MS was measured. Using a mass spectrum obtained from each area and performing a database search at Mascot, it was identified to be derived from IgG. That is, it was shown that the protein interacted on the solid support can be detected and identified by the method of the present invention.
Claims (9)
（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
を含む、前記方法。 A method for analyzing biomolecules, comprising:
(A) Immobilizing the biomolecules in the sample on the solid support by separating the biomolecules in the sample by gel electrophoresis and transferring the biomolecules separated in the gel onto the solid support. ,
(B) interacting further biomolecules with the biomolecules immobilized on the solid support, and (c) further biomolecules immobilized on the solid support and / or further interacting with the biomolecules Said method comprising mass spectrometry of the biomolecule.
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