JP2013130570A - METHOD FOR SPECIFIC CLEAVAGE OF N-Cα BOND OR Cα-C BOND IN PEPTIDE MAIN CHAIN OF PROTEIN AND PHOSPHORYLATED PEPTIDE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断方法、より詳細には、ナフトール系化合物とレーザー光を利用したタンパク質とリン酸化ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断方法に関する。 The present invention relates to a method for specifically cleaving N-Cα bond or Cα-C bond between peptide backbones of a protein and a phosphorylated peptide, and more specifically, a protein and a phosphorylated peptide backbone using a naphthol compound and laser light. The present invention relates to a method for specifically cleaving N-Cα bond or Cα-C bond.
タンパク質やポリペプチドなどのペプチド主鎖はアミノ酸残基R （-NH-CαH-CO-）を単位とし，α位の炭素 -Cα- にアミノ酸側鎖が結合したポリマーである。アミノ酸のナンバリングはアミノ (N)-末端側から始まり，カルボキシ (C)-末端を最終とする。一文字表記法でn個のアミノ酸残基から成るペプチドまたはタンパク質を表すと，NH2-R1-R2-R3-----Rn-1-Rn-COOH のように書くことができる。タンパク質を同定する際に最も役に立つ情報はこのアミノ酸配列であり，N-末端側でもC-末端側でも，あるいは内部配列でもその部分配列の10残基程度の情報があれば，データベースを使って簡単に同定することができる。各種アミノ酸配列解析法が開発されているが，質量分析法 (mass spectrometry, MS) もその一つに数えられている。質量分析法では、試料をイオン化し、このイオンを真空中で質量／電荷数比(m/z)に従って分離し、各イオンの相対強度を測定する。イオン化の方法としては、電子イオン化法(EI, electron ionization)、化学イオン化法(CI, chemical ionization)、電界脱離法(FD, field desorption)、高速原子衝突法(FAB, fast atom bombardment)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI, matrix associated laser desorption ionization)、エレクトロスプレーイオン化法(ESI, electrospray ionization)など様々な手法が開発されている。イオン化された試料を分離する分析部では、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型(TOF, time-of-flight)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの質量分析計が用いられる。MALDI-TOFの組合せは、高分子量まで適用できるイオン源と高分子量まで適用できる分析計の組合せであるため、ポリマーやタンパク質などの高分子の分析によく用いられている。 Peptide backbones such as proteins and polypeptides are polymers in which the amino acid residue R (-NH-CαH-CO-) is a unit and the amino acid side chain is bonded to the α-position carbon -Cα-. Amino acid numbering starts at the amino (N) -terminal end and ends at the carboxy (C) -terminal end. To represent a peptide or protein consisting of n amino acid residues in single letter notation, it can be written as NH 2 -R 1 -R 2 -R 3 ----- R n-1 -R n -COOH it can. The most useful information for identifying proteins is this amino acid sequence. If there is information on the N-terminal side, C-terminal side, internal sequence, or about 10 residues of the partial sequence, it is easy to use a database. Can be identified. Various amino acid sequence analysis methods have been developed, and mass spectrometry (MS) is one of them. In mass spectrometry, a sample is ionized, the ions are separated in a vacuum according to the mass / charge number ratio (m / z), and the relative intensity of each ion is measured. Ionization methods include electron ionization (EI, electron ionization), chemical ionization (CI, chemical ionization), field desorption (FD), field atomization (FAB), fast atom bombardment (FAB), matrix Various techniques such as assisted laser desorption ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) have been developed. The analyzer that separates the ionized sample uses a mass spectrometer such as a magnetic deflection type, quadrupole type, ion trap type, time-of-flight (TOF), or Fourier transform ion cyclotron resonance type. It is done. Since the combination of MALDI-TOF is a combination of an ion source that can be applied up to a high molecular weight and an analyzer that can be applied up to a high molecular weight, it is often used for analysis of polymers such as polymers and proteins.
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)を使うタンパク質の直接シーケンシングを最初に報告したのは，R.S.BrownとJ.J.Lennonである（非特許文献１)。その後，種々のタンパク質の直接シーケンシングに応用されたが(非特許文献２〜６)，なぜレーザー照射によってタンパク質のアミノ酸配列解析を可能にするような特異的な開裂反応が起こるのか，その機構はまったく理解されていなかった。本発明者らもBrown等の最初の報告とは独立にこの現象に遭遇し，この現象がイオン化とは独立に起こることを示した(非特許文献７)。すなわち，N-Cα結合の開裂は，MALDI条件下でペプチドやタンパク質がプロトンを受け取り生成したプロトン化分子 [M+H]+ が開裂するのではなく，レーザー光照射によってマトリックスから水素ラジカルが発生し、中性試料分子 M に結合することにより開裂が起こる。開裂はイオン化室 (ion source) の内部で起こるため，この現象を in-source decay (ISD) と呼ぶ。 R.S.Brown and J.J.Lennon first reported direct protein sequencing using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (Non-Patent Document 1). After that, it was applied to direct sequencing of various proteins (Non-Patent Documents 2 to 6). The mechanism of the specific cleavage reaction that enables the amino acid sequence analysis of proteins by laser irradiation occurs. It was not understood at all. The present inventors also encountered this phenomenon independently of the first report by Brown et al., And showed that this phenomenon occurs independently of ionization (Non-patent Document 7). In other words, the cleavage of the N-Cα bond does not cleave the protonated molecule [M + H] +, which is generated when peptides and proteins receive protons under MALDI conditions, but generates hydrogen radicals from the matrix by laser light irradiation. Cleavage occurs by binding to the neutral sample molecule M. This phenomenon is called in-source decay (ISD) because cleavage occurs inside the ion source.
MALDIにおけるイオン化は，マトリックスと試料を混合し形成した結晶系にレーザー光を照射したとき，大過剰のマトリックスが光子を吸収し爆発的に気化する際のイオン分子反応によって起こる。マトリックスは，プロトンの供給源であるとともにプロトン受容体にもなるイオン化試薬である。ペプチドやタンパク質のN-Cα結合を特異的に開裂させるマトリックスには2,5-dihydroxybenzoic acid(2,5-DHB)が適していることが報告されていた(非特許文献８)。同時に、N-Cα結合の開裂は、マトリックスから発生する水素ラジカルがペプチドやタンパク質のラジカル種を生成させる原理が報告された（非特許文献９）。その後、島津製作所の田中耕一氏のグループより優れた試薬1,5-diaminonaphthalene (1,5-DAN) が発表され(非特許文献１０)、海外グループによって確認された (非特許文献１１)。しかし、2,5-DHBは過度に分解を促すホットな性質を持ち、1,5-DANは昇華性と発がん性があるとして、別のさらにすぐれたマトリックスが要望されていた。 Ionization in MALDI occurs due to ion-molecule reactions when a large excess of matrix absorbs photons and vaporizes explosively when a laser beam is irradiated onto a crystal system formed by mixing a matrix and a sample. The matrix is an ionizing reagent that is a proton source and also a proton acceptor. It has been reported that 2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB) is suitable for a matrix that specifically cleaves N-Cα bonds of peptides and proteins (Non-patent Document 8). At the same time, it has been reported that the cleavage of the N-Cα bond is based on the principle that hydrogen radicals generated from the matrix generate peptide and protein radical species (Non-patent Document 9). Subsequently, a superior reagent 1,5-diaminonaphthalene (1,5-DAN) was announced by Koichi Tanaka's group at Shimadzu Corporation (Non-Patent Document 10) and confirmed by an overseas group (Non-Patent Document 11). However, as 2,5-DHB has a hot property that promotes excessive degradation, and 1,5-DAN has sublimation and carcinogenicity, another better matrix has been demanded.
5-アミノサリチル酸(5-ASA, 5-amino salicylic acid)は、発がん性などの著しい毒性がなく、准安定ピークも多価イオンのピークも与えず、さらに、アミノ酸配列解析にとって重要なピークのシャープネスを確保するイオン化試薬である（非特許文献１２、特許文献１）。しかし、この試薬を用いた場合、最適な結晶の作製が必要で、レーザー光照射位置の選択にも熟練が必要であった。 5-aminosalicylic acid (5-ASA, 5-amino salicylic acid) has no significant toxicity such as carcinogenicity, does not give metastable peaks or multivalent ion peaks, and sharpness of peaks important for amino acid sequence analysis Is an ionization reagent that secures (Non-patent Document 12, Patent Document 1). However, when this reagent is used, it is necessary to produce an optimum crystal, and skill is required to select the laser light irradiation position.
ところで、タンパク質，特にリン酸化タンパク質のリン酸化位置を微量で迅速，かつ精密に決定することは困難とされている。特にリン酸化位置の決定には，多量のリン酸化タンパク質が必要であることと同時に、複数の消化酵素を組み合わせてペプチド断片を作成し、その質量を比較しながら決定する必要がある。また、質量分析による衝突誘起解離（CID）法を使ってリン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析を行う場合、リン酸基の脱離が優先し、リン酸化位置を決定するのは困難である。 By the way, it is difficult to quickly and precisely determine the phosphorylation position of proteins, particularly phosphorylated proteins, in a very small amount. In particular, the determination of the phosphorylation position requires a large amount of phosphorylated protein, and at the same time, it is necessary to prepare a peptide fragment by combining a plurality of digestive enzymes and to compare the masses. In addition, when amino acid sequence analysis of a phosphorylated peptide is performed using a collision-induced dissociation (CID) method by mass spectrometry, elimination of a phosphate group has priority and it is difficult to determine the phosphorylation position.
さらに、タンパク質のアミノ酸配列情報を数十残基単位で誰でも容易に決定できる迅速な方法はない。 Furthermore, there is no rapid method that allows anyone to easily determine amino acid sequence information of proteins in units of tens of residues.
上記の状況に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)と組み合わせてペプチド主鎖のN-Cα結合のみを特異的に切断し、その際、リン酸基の脱離を伴わないソフトな切断手法を提供することが求められる。従来報告されていた技術では，リン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析に使用可能な試薬（非特許文献８、１０、１１及び１２）は，高度の技術と豊富な経験を要した。従って、より取扱いが容易な試薬が求められている。 For the above situation, in combination with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), only the N-Cα bond of the peptide backbone is specifically cleaved. There is a need to provide a cutting technique. In the techniques that have been reported in the past, reagents (Non-Patent Documents 8, 10, 11 and 12) that can be used for amino acid sequence analysis of phosphorylated peptides have required advanced techniques and abundant experience. Therefore, there is a need for a reagent that is easier to handle.
本発明は、タンパク質やペプチド、特に、タンパク質とリン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析に適したマトリックス材を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the matrix material suitable for the amino acid sequence analysis of protein and a peptide, especially protein and a phosphorylated peptide.
本発明者らが、5-アミノ-1-ナフトール（AHN, 5-amino-1-naphthol）(AHNは、5,1-ANLと呼ぶこともある)の存在下で、タンパク質やリン酸化ペプチドにレーザー光を照射したところ、タンパク質やリン酸化ペプチド主鎖のN-Cα結合だけが特異的に開裂反応を起こした。反応生成物をMALDI-TOF MSで解析したところアミノ酸配列を決定することができた。また、AHNのナフトール環の5位のアミノ基を電子親和性官能基に置換すれば、タンパク質やリン酸化ペプチド主鎖のCα-C結合を開裂させることができると考えられる。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。 In the presence of 5-amino-1-naphthol (AHN, sometimes referred to as 5,1-ANL), the present inventors have added proteins and phosphorylated peptides. When irradiated with laser light, only the N-Cα bonds of proteins and phosphopeptide backbones caused a specific cleavage reaction. When the reaction product was analyzed by MALDI-TOF MS, the amino acid sequence could be determined. In addition, it is considered that the Cα-C bond of the protein or phosphorylated peptide main chain can be cleaved by substituting the amino group at the 5-position of the naphthol ring of AHN with an electron affinity functional group. The present invention has been completed based on these findings.
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記の一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断する方法。
The gist of the present invention is as follows.
(1) Specifically, N-Cα bond or Cα-C bond of a peptide main chain including irradiating a protein or peptide with laser light in the presence of a compound represented by the following general formula (I) How to disconnect.
（式中、Ｒは官能基を示す。）
（２）上記の一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
（３）一般式(I)で表される化合物がマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析のマトリックスとして使用される請求項２記載の方法。
（４）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断試薬。
（５）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、水素ラジカル放出試薬。
（６）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス試薬。
（７）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス。
（８）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用タンパク質又はペプチドイオン化試薬。
（９）上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用キット。
(In the formula, R represents a functional group.)
(2) In the presence of the compound represented by the above general formula (I), the protein or peptide is irradiated with laser light to specifically cleave the N-Cα bond or Cα-C bond of the peptide main chain. A method for determining an amino acid sequence of a protein or peptide.
(3) The method according to claim 2, wherein the compound represented by the general formula (I) is used as a matrix for matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry.
(4) A specific cleavage reagent for N-Cα bond or Cα-C bond of a peptide main chain, comprising the compound represented by the above general formula (I).
(5) A hydrogen radical releasing reagent containing the compound represented by the general formula (I).
(6) A matrix reagent for matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry comprising the compound represented by the above general formula (I).
(7) A matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry matrix comprising the compound represented by the above general formula (I).
(8) A protein or peptide ionization reagent for matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry comprising the compound represented by the above general formula (I).
(9) A matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry kit comprising a compound represented by the above general formula (I).
従来報告されていた技術では，リン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析に使用可能な試薬（非特許文献８、１０、１１及び１２）は，高度の技術と豊富な経験を要した。これに対して，本発明の試薬は，特にリン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析に優位であることが確認されただけでなく，従来より弱いレーザー照射量でも信号を得ることができ，さらに経験が浅くても良質のデータを得ることができる。以上の改善は，従来の試薬よりもイオン収量と分解効率の高い試薬を見いだしたためである。
AHNはプロトン放出性を有するため、ペプチド、タンパク質試料の正イオン測定に適用して、成果を上げることができる（後述の実施例１）他、負イオン測定に適用したところ（後述の実施例２）、試料からプロトンを引き抜く効果も見出され、効率的に脱プロトン化分子[M-H]- を生成することができた（図２２参照）。のみならず、ペプチド主鎖のN-Ca結合を切断する能力も保持しつつ、正イオンで生成するN-末端側のc-イオンからのアミノ酸配列情報を補完することのできる、C-末端側のz-イオンが観測されるようになった（図２３参照）。正イオンと今回の負イオンのデータを補完的に用いることで、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列解析のための有意な情報を得ることができ、解析の精度をあげることができる。また、ペプチド主鎖のAsp(D)の部位で特異的に強く観測されるN-末端側のc11イオンを補完するC-末端側のz11イオンが観測され、負イオンでc/z対イオンが観測されたのは初めてであり、これらはアミノ酸配列解析に有用な情報である。
In the techniques that have been reported in the past, reagents (Non-Patent Documents 8, 10, 11 and 12) that can be used for amino acid sequence analysis of phosphorylated peptides have required advanced techniques and abundant experience. On the other hand, the reagent of the present invention is not only confirmed to be particularly advantageous for amino acid sequence analysis of phosphorylated peptides, but can obtain a signal even with a laser irradiation amount weaker than before, and has little experience. Even good quality data can be obtained. The above improvement is due to the discovery of a reagent with higher ion yield and decomposition efficiency than conventional reagents.
Since AHN has proton-releasing properties, it can be applied to the positive ion measurement of peptides and protein samples (Example 1 described later), and when applied to the negative ion measurement (Example 2 described later). ), An effect of extracting protons from the sample was also found, and a deprotonated molecule [MH]-was efficiently generated (see FIG. 22). As well as retaining the ability to cleave the N-Ca bond of the peptide backbone, the amino acid sequence information from the c-ion on the N-terminal side generated by the positive ion can be complemented. Z- ions were observed (see FIG. 23). By using the positive ion data and the negative ion data in a complementary manner, significant information for amino acid sequence analysis of peptides and proteins can be obtained, and the accuracy of the analysis can be increased. In addition, a C11 terminal z11 ion that complements the N11 terminal c11 ion, which is specifically observed strongly at the Asp (D) site of the peptide main chain, is observed, and the c / z counter ion is a negative ion. This is the first time that it has been observed, and these are useful information for amino acid sequence analysis.
本発明の新規試薬は、従来の試薬と比して、以下のような改善点を有する。
１．これまでの試薬の中で最もリン酸化ペプチドの解析に適し，すなわちアミノ酸配列解析に必要なシグナル数が増した。
２．これまではレーザー光照射の際に最適な結晶部位を試行錯誤で探る必要があったが，どの結晶部位からも優位なシグナルが得られるようになった。この結果，誰でも解析できるようになった。
３．リン酸化ペプチドのみならず，タンパク質からも直接に５０残基以上のアミノ酸配列情報を得られるようになり，その性能はこれまで報告された試薬より優位に高い。
The novel reagent of the present invention has the following improvements compared to conventional reagents.
1. It is most suitable for the analysis of phosphorylated peptides among the reagents so far, that is, the number of signals required for amino acid sequence analysis has increased.
2. In the past, it was necessary to find the optimal crystal site by laser light irradiation by trial and error. However, a superior signal can be obtained from any crystal site. As a result, anyone can analyze it.
3. Amino acid sequence information of 50 residues or more can be obtained directly from not only phosphorylated peptides but also proteins, and its performance is significantly higher than those reported so far.
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
本発明は、下記の一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断する方法を提供する。 The present invention specifically relates to N-Cα bond or Cα-C bond of a peptide main chain, which comprises irradiating a protein or peptide with laser light in the presence of a compound represented by the following general formula (I): Provide a way to cut.
（式中、Ｒは官能基を示す。）
ペプチドは、一般に、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものである。タンパク質は、約２０種のL-α-アミノ酸がペプチド結合により結合したポリペプチドである。ペプチドを構成するアミノ酸の数は、特に限定されるものではないが、２〜２００個が適当であり、１０〜５０個が好ましく、１５〜２５個がより好ましい。ペプチドを構成するアミノ酸の数が１００個よりも多いタンパク質の場合には、トリプシンなどの酵素で消化処理を行い、液体クロマトグラフィで分離・分取してから、本発明のN-Cα結合特異的切断方法に用いてもよいが、タンパク質を本発明の方法で直接切断してもよい。ペプチドを構成するアミノ酸の種類は限定されるものではなく、いかなるアミノ酸であってもよい。また、アミノ酸は、アセチル化、メチル化、リン酸化、グリコシル化などの修飾がなされていてもよい。ペプチドには、タンパク質、タンパク質以外のポリペプチド、オリゴペプチド、グリコペプチド、リポタンパク質などが含まれる。
(In the formula, R represents a functional group.)
A peptide is generally a peptide in which two or more amino acids are linked by peptide bonds. A protein is a polypeptide in which about 20 L-α-amino acids are linked by peptide bonds. The number of amino acids constituting the peptide is not particularly limited, but is suitably 2 to 200, preferably 10 to 50, and more preferably 15 to 25. In the case of a protein having more than 100 amino acids constituting a peptide, digestion with an enzyme such as trypsin, separation and fractionation by liquid chromatography, and then the N-Cα bond-specific cleavage of the present invention Although it may be used in the method, the protein may be cleaved directly by the method of the present invention. The type of amino acid constituting the peptide is not limited, and any amino acid may be used. In addition, the amino acid may be modified such as acetylation, methylation, phosphorylation, glycosylation and the like. Peptides include proteins, polypeptides other than proteins, oligopeptides, glycopeptides, lipoproteins, and the like.
一般式(I)におけるＲは官能基を示し、官能基は還元性官能基であっても、酸化性官能基であってもよい。還元性官能基は、水素ラジカル放出能が高い官能基であるとよく、具体的には、-NH2、-SH、-OHなどの基を挙げることができる。酸化性官能基は、電子吸引性基であるとよく、具体的には、-CN、-NO2 などの基を挙げることができる。 R in the general formula (I) represents a functional group, and the functional group may be a reducing functional group or an oxidizing functional group. The reducing functional group is preferably a functional group having a high hydrogen radical releasing ability, and specific examples thereof include groups such as —NH 2 , —SH, and —OH. The oxidizing functional group is preferably an electron withdrawing group, and specific examples thereof include groups such as —CN and —NO 2 .
一般式(I)で表される化合物は、公知の合成法により製造してもよいし、市販のものを用いてもよい。 The compound represented by the general formula (I) may be produced by a known synthesis method, or a commercially available product may be used.
後述の実施例では、一般式(I)で表される化合物として、5-amino-1-naphthol（AHN）を用いた。AHNの構造式は以下の通りである。 In the examples described later, 5-amino-1-naphthol (AHN) was used as the compound represented by the general formula (I). The structural formula of AHN is as follows.
AHNは公知の化合物であり、市販されている。 AHN is a known compound and is commercially available.
本発明のペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断方法において、一般式(I)で表される化合物の使用量は、タンパク質又はペプチド１モルに対して、５０００〜５００００モルが適当であり、５０００〜１００００モルが好ましい。 In the specific cleavage method of N-Cα bond or Cα-C bond of the peptide main chain of the present invention, the amount of the compound represented by the general formula (I) is 5000 to 50000 per 1 mol of protein or peptide. Molar is suitable and 5000-10000 mol is preferable.
レーザーとしては、波長337 nmの窒素レーザー、波長226nmのネオジウムYAGレーザーなどの紫外レーザーを用いることができ、このうち、波長337 nmの窒素レーザーが好ましい。生成するイオンの加速電圧は20〜25 kV程度が適当であるが、これに限定されるわけではない。 As the laser, an ultraviolet laser such as a nitrogen laser having a wavelength of 337 nm or a neodymium YAG laser having a wavelength of 226 nm can be used. Among these, a nitrogen laser having a wavelength of 337 nm is preferable. The acceleration voltage of ions to be generated is appropriately about 20 to 25 kV, but is not limited to this.
一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することにより、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断することができる。従って、本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断試薬を包含する。 By irradiating the protein or peptide with laser light in the presence of the compound represented by the general formula (I), the N-Cα bond or Cα-C bond of the peptide main chain can be specifically cleaved. Therefore, the present invention includes a specific cleavage reagent for N-Cα bond or Cα-C bond of the peptide main chain, which comprises the compound represented by the general formula (I).
本発明のペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断方法によって生成したペプチド分解物を質量分析計にかけ、マススペクトルをとることにより、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。従って、本発明は、一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法も包含する。 Determining the amino acid sequence of a protein or peptide by subjecting the peptide degradation product generated by the N-Cα bond or Cα-C bond specific cleavage method of the peptide main chain of the present invention to a mass spectrometer and taking a mass spectrum Can do. Therefore, the present invention specifically cleaves the N-Cα bond or Cα-C bond of the peptide main chain by irradiating the protein or peptide with laser light in the presence of the compound represented by the general formula (I). A method for determining the amino acid sequence of a protein or peptide.
一般式(I)で表される化合物は、質量分析、好ましくはマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI MS)、より好ましくはMALDI-ISDのマトリックスとして使用することができる。また、正イオン測定のみならず、負イオン測定にも適用することができる。従って、本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、MALDI用マトリックス試薬も包含する。 The compound represented by the general formula (I) can be used as a matrix for mass spectrometry, preferably matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI MS), more preferably MALDI-ISD. Moreover, it can be applied not only to positive ion measurement but also to negative ion measurement. Therefore, the present invention also includes a matrix reagent for MALDI containing the compound represented by the general formula (I).
MALDIのマトリックスとして一般式(I)で表される化合物を使用する場合、サンプル（タンパク質又はペプチド）とマトリックス（一般式(I)で表される化合物）の混合物（混晶）にレーザー光を照射する。タンパク質又はペプチドは一般式(I)で表される化合物の結晶表面にあり、ペプチド主鎖上のカルボニル酸素は一般式(I)で表される化合物の水酸基とあらかじめ水素結合している。一般式(I)で表される化合物がレーザー光を吸収すると励起して水素ラジカルとフェノキシラジカルに解離し、水素ラジカルはそのままペプチド主鎖上のカルボニル酸素に結合して、カルボニル酸素が水酸基に、カルボニル炭素がラジカルになる。そして、ラジカル部位に対してα位にあるNH-Cα結合が単純開裂を生じる（α開裂）（図１）。このときの生成イオンはc-イオンとz-イオンである（図２）。このようにイオン化と同時又は直後にイオン化室で生じるペプチドの分解、すなわち、フラグメンテーションはin-source fragmentation又はin-source decay(ISD)と呼ばれる。MALDI-ISDによって生じるペプチドのフラグメントイオンは、主としてN-末端が保存されたラダー状のc-イオンピーク群からなる。それらのピーク群において、隣り合うピーク間の質量差Δ(m/z)がアミノ酸残基の質量を意味するため、ラダー状ピーク群の質量差を順次並べると部分アミノ酸配列が得られる（図３）。ペプチド主鎖のNH-Cα結合の開裂の際、リン酸基の脱離が伴わなければ、質量差Δ(m/z)からリン酸基の位置や有無を知ることができる。一般式(I)で表される化合物は、タンパク質やペプチドのリン酸基の脱離を伴わずに、ペプチド主鎖のNH-Cα結合を開裂することができる。従って、リン酸化ペプチドのアミノ酸配列解析に適している。また、一般式(I)で表される化合物を用いることにより、リン酸化ペプチドのみならず，タンパク質からも直接に５０残基以上のアミノ酸配列情報を得られるようになり，その性能はこれまで報告された試薬より優位に高い。さらにまた、一般式(I)で表される化合物を用いると、データの獲得が容易である。これまではレーザー光照射の際に最適な結晶部位を試行錯誤で探る必要があったが，どの結晶部位からも優位なシグナルが得られるようになった。この結果，誰でも解析ができるようになった。また、一般式(I)で表される化合物はマトリックスとしての機能が明確である。すなわち、ナフトール水酸基が、レーザー光照射による励起一重項状態において酸性度が増し、試料のプロトン化を促進する。ナフトールの還元性官能基（一般式(I)で表される化合物がAHNである場合には、アミノ基）が、水素原子放出能を有し、NH-Cα結合の切断を促進する。一般式(I)で表される化合物中のナフトール環の5位の官能基が還元性官能基である場合には、以上のようなNH-Cα結合の開裂が生じるが、一般式(I)で表される化合物中のナフトール環の5位の官能基が酸化性官能基である場合には、Cα-C結合の開裂が生じると考えられる。ペプチド主鎖のCα-C結合の開裂は、サリチル酸誘導体マトリックスを用いたときに観察されている（J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) 22:1224-1233）。 When a compound represented by general formula (I) is used as a MALDI matrix, laser light is irradiated to a mixture (mixed crystal) of the sample (protein or peptide) and the matrix (compound represented by general formula (I)). To do. The protein or peptide is on the crystal surface of the compound represented by the general formula (I), and the carbonyl oxygen on the peptide main chain is previously hydrogen bonded to the hydroxyl group of the compound represented by the general formula (I). When the compound represented by the general formula (I) absorbs laser light, it is excited and dissociated into a hydrogen radical and a phenoxy radical, the hydrogen radical is directly bonded to carbonyl oxygen on the peptide main chain, and the carbonyl oxygen becomes a hydroxyl group. Carbonyl carbon becomes a radical. The NH-Cα bond at the α position with respect to the radical site undergoes simple cleavage (α cleavage) (FIG. 1). The generated ions at this time are c- ions and z- ions (FIG. 2). Peptide degradation that occurs in the ionization chamber at the same time or immediately after ionization, that is, fragmentation, is called in-source fragmentation or in-source decay (ISD). The peptide fragment ions generated by MALDI-ISD mainly consist of a ladder-like c-ion peak group in which the N-terminus is conserved. In these peak groups, since the mass difference Δ (m / z) between adjacent peaks means the mass of amino acid residues, partial amino acid sequences can be obtained by sequentially arranging the mass differences of ladder-shaped peak groups (FIG. 3). ). When cleavage of the NH—Cα bond of the peptide main chain is not accompanied by elimination of a phosphate group, the position and presence of the phosphate group can be known from the mass difference Δ (m / z). The compound represented by the general formula (I) can cleave the NH—Cα bond of the peptide main chain without elimination of the phosphate group of the protein or peptide. Therefore, it is suitable for amino acid sequence analysis of phosphorylated peptides. In addition, by using the compound represented by the general formula (I), it becomes possible to obtain amino acid sequence information of 50 residues or more directly from not only phosphorylated peptides but also proteins, and the performance has been reported so far. Significantly higher than the reagents made. Furthermore, the use of the compound represented by the general formula (I) makes it easy to obtain data. In the past, it was necessary to find the optimal crystal site by laser light irradiation by trial and error. However, a superior signal can be obtained from any crystal site. As a result, anyone can perform analysis. The compound represented by the general formula (I) has a clear function as a matrix. That is, the naphthol hydroxyl group increases the acidity in the excited singlet state by laser light irradiation and promotes protonation of the sample. The reducing functional group of naphthol (in the case where the compound represented by the general formula (I) is AHN, an amino group) has a hydrogen atom releasing ability and promotes cleavage of the NH—Cα bond. When the functional group at the 5-position of the naphthol ring in the compound represented by the general formula (I) is a reducing functional group, the NH-Cα bond is cleaved as described above, but the general formula (I) It is considered that cleavage of the Cα-C bond occurs when the functional group at the 5-position of the naphthol ring in the compound represented by the formula is an oxidizing functional group. Cleavage of the Cα-C bond of the peptide main chain has been observed when using a salicylic acid derivative matrix (J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) 22: 1224-1233).
一般式(I)で表される化合物は、MALDIマトリックス機能（タンパク質又はペプチドのイオン化能）と水素ラジカル放出能を併せ持つ。しかも、一般式(I)で表される化合物は水素ラジカル移動反応(ISD)能が高い。従って、本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、水素ラジカル放出試薬を包含する。また、本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、MALDI用タンパク質又はペプチドイオン化試薬を包含する。 The compound represented by the general formula (I) has both a MALDI matrix function (ionization ability of protein or peptide) and a hydrogen radical releasing ability. Moreover, the compound represented by the general formula (I) has a high hydrogen radical transfer reaction (ISD) ability. Therefore, the present invention includes a hydrogen radical releasing reagent containing the compound represented by the general formula (I). The present invention also includes a protein for MALDI or a peptide ionization reagent containing the compound represented by the general formula (I).
MALDIのマトリックスとして一般式(I)で表される化合物を使用する場合には、0.05〜0.5％（好ましくは、0.1%）のTFAを含むアセトニトリル水溶液(40〜70％（好ましくは、50%）, v/v)に溶解し、その飽和溶液をマトリックス溶液として使用するとよい。マトリックス溶液中の一般式(I)で表される化合物濃度は、1〜20 pmol/μLが適当であり、5〜10 pmol/μLが好ましい。マトリックス溶液には、バッファー、ピコリン酸などを添加してもよい。ペプチド試料との混合に際しては、一般式(I)で表される化合物とペプチドのモル比が、5000〜50000程度、好ましくは、5000〜10000程度になるように調製するとよい。マトリックス溶液とペプチド試料との混合溶液をプレートに滴下し、自然乾燥させ、溶媒を除去するとよい。一般式(I)で表される化合物を使うと針状結晶が成長し、この時、ペプチド分子はマトリックスの結晶表面を覆うようになる。マトリックス結晶表面には一般式(I)で表される化合物分子の水酸基またはアミノ基などの官能基が露出しているため、タンパク質又はペプチド分子はそれら官能基群の上に乗るような形で覆っている。本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、MALDI用のマトリックスを包含する。マトリックスには、一般式(I)で表される化合物の他、バッファー成分、ピコリン酸などが含まれていてもよい。本発明は、質量分析、特に、MALDI-TOF MSを利用するタンパク質又はペプチドの直接シーケンシングに利用可能であり、プロテオミスク分野やタンパク質化学分野に応用できる。とりわけ、プロテオミクス分野の翻訳後修飾タンパク質の解析に有利である。 When the compound represented by the general formula (I) is used as a matrix of MALDI, an acetonitrile aqueous solution (40 to 70% (preferably 50%) containing 0.05 to 0.5% (preferably 0.1%) of TFA is used. , v / v), and the saturated solution may be used as the matrix solution. The concentration of the compound represented by the general formula (I) in the matrix solution is appropriately 1 to 20 pmol / μL, and preferably 5 to 10 pmol / μL. A buffer, picolinic acid or the like may be added to the matrix solution. When mixing with the peptide sample, the molar ratio of the compound represented by the general formula (I) to the peptide is about 5000 to 50000, preferably about 5000 to 10000. A mixed solution of the matrix solution and the peptide sample may be dropped on the plate, air dried, and the solvent removed. When the compound represented by the general formula (I) is used, a needle crystal grows, and at this time, the peptide molecule comes to cover the crystal surface of the matrix. Since the functional group such as the hydroxyl group or amino group of the compound molecule represented by the general formula (I) is exposed on the surface of the matrix crystal, the protein or peptide molecule is covered so as to ride on the functional group group. ing. The present invention includes a matrix for MALDI containing a compound represented by the general formula (I). In addition to the compound represented by the general formula (I), the matrix may contain a buffer component, picolinic acid and the like. The present invention can be used for mass spectrometry, particularly direct protein or peptide sequencing using MALDI-TOF MS, and can be applied to the field of proteomics and protein chemistry. In particular, it is advantageous for analysis of post-translationally modified proteins in the field of proteomics.
また、本発明は、一般式(I)で表される化合物を含む、MALDI用キットを提供する。 The present invention also provides a MALDI kit comprising a compound represented by the general formula (I).
このキットには、さらに、他のマトリックス試薬（例えば、1,5-diaminonaphthalenre(1,5-DAN)、5-aminosalicylic acid (5-ASA)、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)、sinapinic acid、2,5-dihydroxybenzoic acid(2,5-DHB)、3-hydroxypicolinic acid、ferulic acidなど）、バッファー、ピコリン酸、キットの使用方法、注意書、内容物などを記した説明書、標準ペプチドなどを含めてもよい。 This kit further includes other matrix reagents (eg, 1,5-diaminonaphthalenre (1,5-DAN), 5-aminosalicylic acid (5-ASA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), sinapinic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB), 3-hydroxypicolinic acid, ferulic acid, etc.), buffer, picolinic acid, kit usage instructions, instructions, contents, etc., standard peptide Etc. may be included.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
実験方法：質量分析装置には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法を搭載した飛行時間型（TOF）の質量分析計 AXIMA-CFR（島津製作所、京都）を使用し、レーザーには波長337nmの紫外窒素レーザーを用いた。測定はすべて正イオンモードで行った。生成したイオンの加速電圧は20kVであった。試料ペプチドには副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）のフラグメント ACTH18-35、ACTH18-35の２リン酸化体およびβ-カゼイン由来の４リン酸化ペプチドを用いた。これらペプチドはペプチド研究所（箕面、大阪）から購入したものをそのまま使用した。試料タンパク質にはHorse Apo-myoglobin、Bovine Serum Albumin(BSA)、Equine Cytochrome c、Bovine Cytochrome c はSigma Aldrich (Steinheim, Germany)から購入、Cucumber Green Mottle Mosaic Virus （CGMMV）、Tobbaco Mosaic Virus （TMV）は、つくば分子生物学研究所 野津祐三博士から提供された。マトリックスである5-amino-1-naphthol(AHN)、2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)、1,5-diaminonaphthalene (DAN)、1,5-dihydroxynaphthalene(DHN)は東京化成（東京）から購入し、再結晶することなく使用した。ペプチドおよびタンパク質試料の水溶液は、その５μＬをマトリックス溶液（各マトリックスの５０％アセトニトリル水溶液の飽和溶液）５μＬと混合し、混合後の試料溶液１μＬを試料ターゲットに塗布し、自然乾燥により試料結晶を作成した。試料結晶を塗布したターゲットを質量分析計に導入した。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1]
Experimental method: The mass spectrometer uses a time-of-flight (TOF) mass spectrometer AXIMA-CFR (Shimadzu Corporation, Kyoto) equipped with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), and the laser has a wavelength of 337 nm. Ultraviolet nitrogen laser was used. All measurements were made in positive ion mode. The acceleration voltage of the generated ions was 20 kV. As a sample peptide, a corticotropin (ACTH) fragment ACTH18-35, a 2-phosphorylated ACTH18-35, and a 4-phosphorylated peptide derived from β-casein were used. Those peptides purchased from Peptide Institute (Mino, Osaka) were used as they were. Sample proteins include Horse Apo-myoglobin, Bovine Serum Albumin (BSA), Equine Cytochrome c, and Bovine Cytochrome c purchased from Sigma Aldrich (Steinheim, Germany). Cucumber Green Mottle Mosaic Virus (CGMMV) and Tobbaco Mosaic Virus (TMV) Provided by Dr. Yuzo Nozu, Tsukuba Molecular Biology Laboratory. Matrix 5-amino-1-naphthol (AHN), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), 1,5-diaminonaphthalene (DAN), and 1,5-dihydroxynaphthalene (DHN) were purchased from Tokyo Kasei (Tokyo). Used without recrystallization. 5 μL of peptide and protein sample aqueous solution is mixed with 5 μL of matrix solution (saturated solution of 50% acetonitrile aqueous solution of each matrix), 1 μL of sample solution after mixing is applied to the sample target, and sample crystals are prepared by natural drying did. The target coated with the sample crystal was introduced into the mass spectrometer.
結果と考察：
異なる４種類のマトリックスDHN, AHN, DAN, DHBを用いてペプチド試料ACTH18-35の正イオンMALDI-ISDスペクトルの評価を行った（図５）。得られたISDスペクトルにはアミノ酸配列を反映するｃイオンがc7〜c17まで観測され、これらISDスペクトルの質をcイオンピークのS/N値で評価した。その結果、ACTH18-35ではDANが最も高いS/N値を示し優れた結果を与えた（図４）。
Results and discussion:
The positive ion MALDI-ISD spectrum of the peptide sample ACTH18-35 was evaluated using four different types of matrices DHN, AHN, DAN, and DHB (FIG. 5). In the obtained ISD spectrum, c ions reflecting the amino acid sequence were observed from c7 to c17, and the quality of these ISD spectra was evaluated by the S / N value of the c ion peak. As a result, ACTH18-35 showed the highest S / N value with DAN (Fig. 4).
上記と同様のマトリックスを用い、ACTH18-35のチロシンとセリン残基がリン酸化されたACTH18-35の２リン酸化体の正イオンMALDI-ISDスペクトルを得た（図７）。本スペクトルではリン酸基が保持されたままのｃイオンがc7〜c17まで観測され、リン酸化の部位を推定することが可能であった。本リン酸化ペプチドの場合、各ｃイオンピークのS/N値はマトリックスAHNにおいて最も高い値を示した（図６）。 Using the same matrix as described above, a positive ion MALDI-ISD spectrum of the 2-phosphorylated ACTH18-35 phosphorylated on the tyrosine and serine residues of ACTH18-35 was obtained (FIG. 7). In this spectrum, c ions with the phosphate group retained were observed from c7 to c17, and it was possible to estimate the site of phosphorylation. In the case of this phosphorylated peptide, the S / N value of each c ion peak showed the highest value in the matrix AHN (FIG. 6).
上記と同様のマトリックスを用い、リン酸化タンパク質であるβカゼインに由来する４リン酸化ペプチドの正イオンMALDI-ISDスペクトルを得た（図９、図１０）。マトリックスDHNを除き、いずれのマトリックスも高いプロトン化分子[M+H]+ のピークを与え（図９）、なかでもAHNは明瞭なｃイオンをc7〜c19まで与えた（図１０）。スペクトルの質を評価するため、各ｃイオンのS/N値を比較したところ、マトリックスAHNが圧倒的に高い値を示し、最も優れたマトリックスであった（図８）。 Using a matrix similar to the above, positive ion MALDI-ISD spectra of 4-phosphorylated peptides derived from β-casein, which is a phosphorylated protein, were obtained (FIGS. 9 and 10). Except for the matrix DHN, all matrices gave high protonated molecule [M + H] + peaks (FIG. 9), among which AHN gave clear c ions from c7 to c19 (FIG. 10). When the S / N value of each c ion was compared in order to evaluate the quality of the spectrum, the matrix AHN showed an overwhelmingly high value and was the most excellent matrix (FIG. 8).
上記のマトリックスを用い、各種タンパク質試料の正イオンMALDI-ISDスペクトルを得た（図１１〜図２０）。馬心筋アポミオグロビンのISDスペクトルは、マトリックスAHNとDHBにおいて高いプロトン化分子 [M+H]+ (m/z 16958)を与え（図１１）、アミノ酸配列情報であるcイオンを同数程度与えたが、各シグナルピークのシャープネス（ピーク幅）はAHNが優れていた。 Using the above matrix, positive ion MALDI-ISD spectra of various protein samples were obtained (FIGS. 11 to 20). The ISD spectrum of equine myocardial apomyoglobin gave high protonated molecules [M + H] + (m / z 16958) in matrix AHN and DHB (Fig. 11), and gave the same number of c ions as amino acid sequence information. AHN was excellent in the sharpness (peak width) of each signal peak.
牛チトクロムｃのISDスペクトルをマトリックスAHNとDHBを用いて得たところ（図１２〜図１５）、いずれもアミノ酸配列情報であるｃイオンをc26〜c97まで示し、７２残基の内部アミノ酸配列を読むことができた。ISDスペクトルの質を各ｃイオンピークの強度、S/N値、cイオンの数、ピーク幅で評価したところ、いずれもAHNが有意に優れていた（図１２〜図１５）。同様の結果は、馬チトクロムｃのISDスペクトルでも確認された（図１６、図１７）。 When ISD spectra of bovine cytochrome c were obtained using matrices AHN and DHB (FIGS. 12 to 15), the c ions, which are amino acid sequence information, were shown from c26 to c97, and the internal amino acid sequence of 72 residues was read. I was able to. When the quality of the ISD spectrum was evaluated by the intensity of each c ion peak, the S / N value, the number of c ions, and the peak width, AHN was significantly superior (FIGS. 12 to 15). Similar results were confirmed in the ISD spectrum of equine cytochrome c (FIGS. 16 and 17).
上記のように、リン酸化ペプチドの正イオンMALDI-ISDスペクトルの獲得に優れた性能を示したマトリックスAHNは、タンパク質でも優れた性能を示しアミノ酸配列情報を与えた。本マトリックスを２種のウイルスコートタンパク質であるキュウリ紫斑病ウイルスタンパク質（CGMMV）とタバコモザイクウイルス（TMV）に適用したところ、いずれのタンパク質でも明瞭なプロトン化分子 [M+H]+ を示しただけでなく、多数のｃイオンも与えた（図１８，図１９）。特にCGMMVではc9〜c60まで５０残基以上の内部アミノ酸配列を読むことができた（図１９）。 As described above, matrix AHN, which showed excellent performance in obtaining positive ion MALDI-ISD spectra of phosphorylated peptides, also showed excellent performance in proteins and gave amino acid sequence information. When this matrix was applied to two kinds of viral coat proteins, cucumber purpura virus protein (CGMMV) and tobacco mosaic virus (TMV), both proteins showed clear protonated molecules [M + H] +. In addition, a large number of c ions were also given (FIGS. 18 and 19). In particular, CGMMV was able to read the internal amino acid sequence of 50 residues or more from c9 to c60 (FIG. 19).
上記結果は相対分子質量２０，０００Ｄａ以下のタンパク質への適用であったので、より相対分子質量の大きな牛血清アルブミン（BSA,６６，４３７Ｄａ）に４種類のマトリックスDHN, AHN, DAN, DHBを適用し、性能を比較した（図２０、図２１）。いずれのマトリックスもc10〜c33までのイオンピークを示したが、各ｃイオンのS/Nおよびピーク幅で優れていたのはAHNとDANであった（図２１）。BSAは３４番目にジスルフィド結合（S-S）をもつシステイン残基が存在するためにc34以上のシグナルは観測されないが、MALDI-ISDはタンパク質の質量にほとんど上限なく有用な方法であることが判明した。 Since the above results were applied to proteins with a relative molecular mass of 20,000 Da or less, four types of matrices DHN, AHN, DAN, and DHB were applied to bovine serum albumin (BSA, 66, 437 Da) with a larger relative molecular mass. The performance was compared (FIGS. 20 and 21). All matrices showed ion peaks from c10 to c33, but AHN and DAN were superior in S / N and peak width of each c ion (FIG. 21). Since BSA has a cysteine residue having a disulfide bond (S-S) at the 34th position, no signal above c34 is observed, but MALDI-ISD was found to be a useful method with almost no upper limit on the mass of the protein.
以上に示した結果から、マトリックスAHNは既報の他のマトリックスに比較して、以下の評価項目に対する総合評価として、特にリン酸化ペプチドに最も優れていることが判明した。
１．イオンシグナルのS/N値
２．イオンシグナルのシャープネス（ピーク幅）
３．アミノ酸配列情報獲得に有用なイオンシグナルの数
４．データ獲得の容易さ（スイートスポット無し）
From the results shown above, it was found that the matrix AHN was most excellent for phosphorylated peptides as a comprehensive evaluation for the following evaluation items as compared to other previously reported matrices.
1. 1. S / N value of ion signal Ion signal sharpness (peak width)
3. 3. Number of ion signals useful for obtaining amino acid sequence information Easy data acquisition (no sweet spot)
また、マトリックスAHNはリン酸化ペプチドだけでなく、タンパク質に対しても優れた性能を示したことから、これまでに報告されているマトリックスの中で、トップダウンプロテオミクスに適するMALDI-ISD法の最良のマトリックスである。トップダウンプロテオミクスは、タンパク質を酵素消化することなく、そのままでアミノ酸配列情報を獲得する戦略である。
〔実施例２〕
実験方法：質量分析装置には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法を搭載した飛行時間型（TOF）の質量分析計 AXIMA-CFR（島津製作所、京都）を使用し、レーザーには波長337nmの紫外窒素レーザーを用いた。測定はすべて負イオンモードで行った。生成したイオンの加速電圧は20kVであった。試料ペプチドには副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）のフラグメント ACTH18-39を用いた。ペプチドはペプチド研究所（箕面、大阪）から購入したものをそのまま使用した。5-amino-1-naphthol(AHN)は東京化成（東京）から購入し、再結晶することなく使用した。ペプチド試料の水溶液は、その５μＬをマトリックス溶液（アセトニトリル７０％、水３０％の混合溶液にDHNを飽和溶解させたもの）５μＬと混合し、混合後の試料溶液１μＬを試料ターゲットに塗布し、自然乾燥により試料結晶を作成した。試料結晶を塗布したターゲットを質量分析計に導入した。
In addition, since matrix AHN showed excellent performance not only for phosphorylated peptides but also for proteins, among the previously reported matrices, the best MALDI-ISD method suitable for top-down proteomics Matrix. Top-down proteomics is a strategy for acquiring amino acid sequence information as it is without enzymatic digestion of the protein.
[Example 2]
Experimental method: The mass spectrometer uses a time-of-flight (TOF) mass spectrometer AXIMA-CFR (Shimadzu Corporation, Kyoto) equipped with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), and the laser has a wavelength of 337 nm. Ultraviolet nitrogen laser was used. All measurements were made in negative ion mode. The acceleration voltage of the generated ions was 20 kV. As a sample peptide, a corticotropin (ACTH) fragment ACTH18-39 was used. The peptide purchased from Peptide Institute (Mino, Osaka) was used as it was. 5-amino-1-naphthol (AHN) was purchased from Tokyo Kasei (Tokyo) and used without recrystallization. The aqueous solution of the peptide sample is mixed with 5 μL of the matrix solution (saturated DHN dissolved in a mixed solution of 70% acetonitrile and 30% water), and 1 μL of the mixed sample solution is applied to the sample target. Sample crystals were prepared by drying. The target coated with the sample crystal was introduced into the mass spectrometer.
結果と考察：
AHNマトリックスを用いてペプチド試料ACTH18-39の負イオンMALDI-ISDスペクトルの評価を行った。得られた負イオンISDスペクトルにはペプチド試料からプロトンが放出して生成した脱プロトン化分子[M-H]- が高い強度で観測された（図２２）。本スペクトルは、AHNマトリックスがペプチドの負イオン測定にも適することを示すものである。また、脱プロトン化分子のピークより低質量領域には、ペプチド主鎖のN-Ca結合の特異的分解に由来するN-末端側のアミノ酸配列を反映するc-イオンがc11〜c17まで観測された（図２３）。本c-イオンシリーズは、ACTH18-39の１１番目のグルタミン酸（E）（図２２参照）からプロトンが放出されて負イオンになったために観測されたものと考えられる。さらに同じ負イオンスペクトル中には、従来、本ペプチド試料では観測できなかったC-末端側のアミノ酸配列を反映するz-イオンがz9〜z19まで観測された。Z-イオンは、図２２に示すアミノ酸配列のC-末端側から数えて9番目から19番目までの配列に相当し、その生成はプロトンを放出して負イオンになりやすい酸性官能基（E, D）がC-末端側に存在していることに由来する。負イオンが感度高く観測できる本結果は、AHNマトリックスが、プロトン放出能の他にプロトン引き抜きの性質も有することを示すものである。
Results and discussion:
The negative ion MALDI-ISD spectrum of peptide sample ACTH18-39 was evaluated using AHN matrix. In the obtained negative ion ISD spectrum, deprotonated molecules [MH] − generated by releasing protons from the peptide sample were observed with high intensity (FIG. 22). This spectrum shows that the AHN matrix is also suitable for measuring negative ions of peptides. In the lower mass region than the peak of the deprotonated molecule, c-ions reflecting the amino acid sequence on the N-terminal side derived from the specific degradation of the N-Ca bond in the peptide main chain were observed from c11 to c17. (FIG. 23). It is considered that this c-ion series was observed because protons were released from the 11th glutamic acid (E) of ACTH18-39 (see FIG. 22) to become negative ions. Furthermore, in the same negative ion spectrum, z-ions reflecting the amino acid sequence on the C-terminal side that could not be observed in the present peptide sample were observed from z9 to z19. The Z-ion corresponds to the 9th to 19th sequences counted from the C-terminal side of the amino acid sequence shown in FIG. 22, and its generation releases an acidic functional group (E, E, which tends to release a proton and become a negative ion). This is because D) is present on the C-terminal side. This result that negative ions can be observed with high sensitivity indicates that the AHN matrix has a proton-extracting property in addition to the proton-releasing ability.
本発明は、プロテオミクス分野やタンパク質化学分野に利用可能である。特に、プロテオミクス分野の翻訳後修飾タンパク質の解析に有利である。 The present invention can be used in the field of proteomics and protein chemistry. In particular, it is advantageous for analysis of post-translationally modified proteins in the field of proteomics.
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