JP2006275916A - Multiphoton excitation type observation device and light source device for multiphoton excitation type observation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に関するものである。 The present invention relates to a multiphoton excitation observation apparatus and a multiphoton excitation observation light source apparatus.
従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
この特許文献1においては、試料に照射する励起光の強度を調節し、あるいはオンオフするための手段として、音響光学変調器(AOM:Acoust Optical
Modulator)のような音響光学素子を用いることが開示されている。
In Patent Document 1, an acoustic optical modulator (AOM: Acoust Optical) is used as a means for adjusting the intensity of excitation light applied to a sample or turning it on and off.
It is disclosed to use an acousto-optic element such as a Modulator.
音響光学素子は、一般に約1cm角の二酸化テルルやモリブデン酸塩からなる結晶であり、入射されたレーザ光を変調させることができる有効範囲は比較的狭い。一方、音響光学素子に入射させる極短パルスレーザ光は、一般には略平行光であると考えられているが、厳密には、光軸方向に沿う特定の位置に光束径が最も小さくなるビームウエストを備えるとともに、該ビームウエストの位置から離れるに従って、所定の広がり角度で光束径が大きくなるビームダイバージェンスを備えている。 The acousto-optic element is generally a crystal made of tellurium dioxide or molybdate with a square of about 1 cm, and the effective range in which incident laser light can be modulated is relatively narrow. On the other hand, the ultrashort pulse laser beam incident on the acoustooptic device is generally considered to be substantially parallel light, but strictly speaking, a beam waist having the smallest luminous flux diameter at a specific position along the optical axis direction. And a beam divergence that increases the beam diameter at a predetermined spread angle as the distance from the position of the beam waist increases.
したがって、音響光学素子の位置にビームウエストの位置を一致させることができれば、極短パルスレーザ光全体を音響光学素子の有効範囲内に入射させることができる。
しかしながら、音響光学素子に入射される極短パルスレーザ光の位置がビームウエストの位置から大きく離れると、光束径が大きくなって音響光学素子の有効範囲外に外れ、迷光の混入等に起因してビーム形状が劣化するという問題がある。ビーム形状が劣化すると、試料の集光位置における点像分布関数(PSF:Point Spread
Function)が悪化し、試料の集光位置における光子密度が低下し、多光子励起効果を効率よく発生させることができないという問題がある。
Therefore, if the position of the beam waist can be made coincident with the position of the acoustooptic device, the entire ultrashort pulse laser beam can be incident within the effective range of the acoustooptic device.
However, if the position of the ultrashort pulse laser beam incident on the acousto-optic element is far away from the position of the beam waist, the beam diameter becomes larger and falls outside the effective range of the acousto-optic element. There is a problem that the beam shape deteriorates. When the beam shape deteriorates, the point spread function (PSF) at the focal position of the sample
Function) is deteriorated, the photon density at the light collection position of the sample is lowered, and there is a problem that the multiphoton excitation effect cannot be generated efficiently.
また、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置は、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、分散補償光学系による分散補償量等によっても大きく変動するため、その位置を音響光学素子に一致させることが困難であるという不都合もある。 In addition, the position of the beam waist of the ultrashort pulse laser light greatly varies depending on individual differences of the pulse laser light source, the wavelength of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source, the amount of dispersion compensation by the dispersion compensation optical system, and the like. Therefore, there is a disadvantage that it is difficult to make the position coincide with the acoustooptic device.
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、パルスレーザ光源からの極短パルスレーザ光の光束が、音響光学素子の有効範囲外に外れることを防止して、多光子励起効果を効率的に発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる多光子励起型観察装置および多光子励起観察用光源装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and prevents the light flux of the ultrashort pulse laser light from the pulse laser light source from deviating from the effective range of the acousto-optic device, thereby providing a multiphoton excitation effect. An object of the present invention is to provide a multiphoton excitation observation device and a light source device for multiphoton excitation observation that can be efficiently generated and can obtain a clear multiphoton fluorescence image.
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置と、該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察装置を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam, an observation apparatus body that irradiates the sample with an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source, and observes the fluorescence emitted from the sample; An acousto-optic device that is disposed between the pulse laser light source and the observation apparatus main body and performs on / off or output adjustment of an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source, and between the acousto-optic device and the pulse laser light source And a multi-photon excitation observation device provided with an incident correction device arranged to reduce the beam diameter of the ultrashort pulse laser beam so as to be incident within the effective range of the acoustooptic device.
本発明によれば、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光が観察装置本体に供給され、観察装置本体によって、試料に照射されると、試料における多光子励起効果によって、極短パルスレーザ光が集光させられた位置において多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は観察装置本体によって検出され、観察される。極短パルスレーザ光は、観察装置本体に入射される前に、音響光学装置を通過するので、音響光学装置によってオンオフあるいは出力調整される。 According to the present invention, when an ultrashort pulse laser beam emitted from a pulse laser light source is supplied to an observation apparatus body and irradiated on the sample by the observation apparatus body, an ultrashort pulse laser is generated due to the multiphoton excitation effect in the sample. Multiphoton fluorescence is generated at the position where the light is collected. The generated multiphoton fluorescence is detected and observed by the observation apparatus body. Since the ultrashort pulse laser beam passes through the acoustooptic device before entering the observation device main body, it is turned on / off or output adjusted by the acoustooptic device.
この場合において、本発明によれば、音響光学装置とパルスレーザ光源との間に、入射補正装置を備えているので、該入射補正装置の作動により、パルスレーザ光源から伝播されてくる極短パルスレーザ光の光束径が縮小されて音響光学装置に入射される。これにより、音響光学装置に入射される極短パルスレーザ光が、音響光学装置を構成する結晶の大きさにより設定される有効範囲から外れることなく完全に入射されるので、結晶の側面における反射光や、結晶に入ることができずに外れた光が迷光となって結晶から出射される極短パルスレーザ光に混合されてしまうことが防止される。その結果、音響光学装置から出力される強度変調等された極短パルスレーザ光の試料の集光位置における点像分布関数が悪化することが防止され、試料において効率的に多光子励起効果を発生させて鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。 In this case, according to the present invention, since the incident correction device is provided between the acousto-optic device and the pulse laser light source, an extremely short pulse propagated from the pulse laser light source by the operation of the incident correction device. The beam diameter of the laser light is reduced and is incident on the acoustooptic device. As a result, the ultrashort pulse laser light incident on the acousto-optic device is completely incident without departing from the effective range set by the size of the crystal constituting the acousto-optic device. In addition, it is possible to prevent light that has not been able to enter the crystal and is removed from being mixed with ultrashort pulse laser light emitted from the crystal as stray light. As a result, it is prevented that the point spread function at the focusing position of the sample of the ultrashort pulse laser beam that is output from the acousto-optic device is modulated and the multi-photon excitation effect is efficiently generated in the sample. And a clear multiphoton fluorescence image can be obtained.
上記発明においては、前記入射補正装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも1枚のレンズを光軸方向に移動させる移動機構を備えることが好ましい。
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、複数の凹面鏡を備えるとともに、該凹面鏡どうしの距離および角度を調節する移動機構を備えることとしてもよい。
In the above invention, it is preferable that the incident correction device includes a plurality of lenses and a moving mechanism that moves at least one of the lenses in the optical axis direction.
In the above invention, the incident correction device may include a plurality of concave mirrors and a moving mechanism that adjusts the distance and angle between the concave mirrors.
このように構成することで、移動機構の作動によりレンズ間距離を調節し、あるいは、複数のレンズを移動させ、または複数の凹面鏡どうしの距離および角度を調節することにより、光束径の縮小率および/またはビームダイバージェンスを調節することができる。したがって、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、分散補償光学系による分散補償量等の変動により、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置が光軸方向に変動しても、移動機構の作動により光束径の縮小率および/またはビームダイバージェンスを調節することができ、音響光学装置の有効範囲内に確実に入射させて、効率的に多光子励起効果を発生させることが可能となる。 With this configuration, the distance between the lenses is adjusted by the operation of the moving mechanism, or a plurality of lenses are moved, or the distance and angle between the plurality of concave mirrors are adjusted, thereby reducing the reduction ratio of the light beam diameter and The beam divergence can be adjusted. Therefore, the position of the beam waist of the ultrashort pulse laser beam is changed by the individual difference of the pulse laser source, the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser source, the dispersion compensation amount by the dispersion compensation optical system, etc. Even if it fluctuates in direction, the reduction mechanism and / or beam divergence of the beam diameter can be adjusted by the operation of the moving mechanism, and the multi-photon excitation effect is efficiently achieved by ensuring that it is incident within the effective range of the acousto-optic device. Can be generated.
上記発明においては、前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて移動機構を作動させる制御装置を備えることが好ましい。
さらに、上記発明においては、前記制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、移動機構の作動状態とを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている作動状態に移動機構を調節することとしてもよい。
In the said invention, it is preferable that the said incident correction apparatus is provided with the control apparatus which operates a moving mechanism according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from a pulse laser light source.
Furthermore, in the above invention, the control device includes a memory device that stores the wavelength of the ultrashort pulse laser beam and the operating state of the moving mechanism in association with each other, and according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam, The moving mechanism may be adjusted to the operating state stored in the memory device.
このように構成することで、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長が変動しても、制御装置の作動により、移動機構が作動せられてレンズ間距離あるいは凹面鏡どうしの距離および角度が自動調節される。また、メモリ装置により、極短パルスレーザ光の波長を得ることで、記憶されている移動機構の作動状態に調節することができ、移動機構の作動状態を検出しながら調節する必要がなく、さらに簡易に鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。 With this configuration, even if the wavelength of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source fluctuates, the movement mechanism is activated by the operation of the control device, and the distance between lenses or the distance and angle between the concave mirrors. Is automatically adjusted. Further, by obtaining the wavelength of the ultrashort pulse laser beam by the memory device, it can be adjusted to the stored operating state of the moving mechanism, and it is not necessary to adjust while detecting the operating state of the moving mechanism. A clear multiphoton fluorescence image can be easily obtained.
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、複数の波長の極短パルスレーザ光に対し、それぞれ調節された複数レンズまたは複数の凹面鏡からなる複数の補正光学ユニットと、該補正光学ユニットを切り替える切替機構とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、極短パルスレーザ光の波長が変更された場合には、切替機構の作動により、設定された波長の極短パルスレーザ光に対応する補正光学ユニットが選択され、パルスレーザ光源と音響光学装置との間に配置される。これにより、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光が、選択された補正光学ユニットを通過させられることにより、その波長に適した縮小率で光束径を縮小され、有効範囲からはみ出すことなく音響光学装置に入射される。したがって、迷光等の混入によるPSFの悪化を防止して多光子励起効果を効率的に発生させることができる。
In the above invention, the incident correction device switches the correction optical unit to a plurality of correction optical units each composed of a plurality of lenses or a plurality of concave mirrors, which are respectively adjusted for ultrashort pulse laser beams having a plurality of wavelengths. It is good also as providing a switching mechanism.
With this configuration, when the wavelength of the ultrashort pulse laser beam is changed, the correction optical unit corresponding to the ultrashort pulse laser beam having the set wavelength is selected by the operation of the switching mechanism, and the pulse It arrange | positions between a laser light source and an acoustooptic device. As a result, the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source is allowed to pass through the selected correction optical unit, so that the light beam diameter is reduced at a reduction rate suitable for the wavelength, and does not protrude from the effective range. Incident to the acousto-optic device. Therefore, the deterioration of PSF due to mixing of stray light or the like can be prevented, and the multiphoton excitation effect can be efficiently generated.
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて切替機構を作動させる制御装置を備え、該制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、補正光学ユニットとを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている各波長に対応する補正光学ユニットを選択するように切替機構を調節することとしてもよい。 In the above invention, the incident correction device includes a control device that operates a switching mechanism in accordance with the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source, and the control device includes the ultrashort pulse laser beam. And a correction optical unit are stored in association with each other, and the correction optical unit corresponding to each wavelength stored in the memory device is selected according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam. Alternatively, the switching mechanism may be adjusted.
このように構成することで、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長が変更されても、制御装置の作動により、切替機構が作動せられて、変更後の波長に適した補正光学ユニットが自動的に選択される。このとき、極短パルスレーザ光の波長を得ることで、メモリ装置に記憶されている変更後の波長に対応する補正光学ユニットが選択され、簡易に鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。 With this configuration, even if the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source is changed, the switching mechanism is operated by the operation of the control device, and the correction optics suitable for the changed wavelength is obtained. The unit is automatically selected. At this time, by obtaining the wavelength of the ultrashort pulse laser beam, the correction optical unit corresponding to the changed wavelength stored in the memory device is selected, and a clear multiphoton fluorescence image can be easily obtained.
さらに、上記発明においては、前記入射補正装置が、絞り、ピンホール、スリット等の空間フィルタにより構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、入射補正装置に入射される極短パルスレーザ光の光束径を簡易に縮小して、音響光学装置の有効範囲内に入射させることができる。
Furthermore, in the said invention, the said incident correction apparatus is good also as being comprised by spatial filters, such as an aperture stop, a pinhole, and a slit.
With this configuration, it is possible to easily reduce the beam diameter of the ultrashort pulse laser beam incident on the incident correction device and make it incident within the effective range of the acoustooptic device.
また、本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置とを備え、該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察用光源装置を提供する。 The present invention also includes a pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam, and an acoustooptic device that performs on / off or output adjustment of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source. Provided is a multi-photon excitation observation light source device including an incident correction device that is disposed between the pulse laser light source and reduces the beam diameter of the ultrashort pulse laser light so as to be incident within the effective range of the acoustooptic device. .
本発明によれば、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、音響光学装置を通過させられることにより、音響光学装置によってオンオフあるいは出力調整される。この場合において、本発明によれば、極短パルスレーザ光が、音響光学装置に入射される前に入射補正装置を通過させられることにより、その光束径を縮小させられるので、ビームウエスト位置の如何に関わらず、極短パルスレーザ光全体を音響光学装置の有効範囲内に入射させることができる。その結果、音響光学装置から出力される強度変調等された極短パルスレーザ光の試料の集光位置における点像分布関数が悪化することが防止され、試料において効率的に多光子励起効果を発生させて鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。 According to the present invention, the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source is turned on / off or output adjusted by the acoustooptic device by being passed through the acoustooptic device. In this case, according to the present invention, the beam diameter can be reduced by allowing the ultrashort pulse laser beam to pass through the incident correction device before entering the acoustooptic device. Regardless, the entire ultrashort pulse laser beam can be incident within the effective range of the acoustooptic device. As a result, it is prevented that the point spread function at the focusing position of the sample of the ultrashort pulse laser beam that is output from the acousto-optic device is modulated and the multi-photon excitation effect is efficiently generated in the sample. And a clear multiphoton fluorescence image can be obtained.
本発明によれば、音響光学装置を通過させられる極短パルスレーザ光が、その有効範囲内に入射されるように入射補正装置によって補正されるので、音響光学装置による極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力変調の際に、迷光が発生して極短パルスレーザ光の試料の集光位置におけるPSFが悪化することを防止できる。したがって、試料におけるビームウエスト位置の変動によるピントずれを防止でき、また、試料のビームウエスト位置における光子密度の低下を防止して、効率的に多光子励起効果を発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the ultrashort pulse laser beam that is allowed to pass through the acoustooptic device is corrected by the incident correction device so as to enter the effective range, on / off of the ultrashort pulse laser beam by the acoustooptic device is achieved. Alternatively, it is possible to prevent the stray light from being generated during output modulation, and the PSF at the condensing position of the sample of the ultrashort pulse laser light from being deteriorated. Therefore, it is possible to prevent the focus shift due to the variation of the beam waist position in the sample, and also to prevent the decrease of the photon density at the beam waist position of the sample, thereby efficiently generating the multi-photon excitation effect, and the clear multi-photon fluorescence image. There is an effect that can be obtained.
以下、本発明の第1の実施形態に係る多光子励起型観察装置について図1〜図4を参照して説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置1は、多光子励起型顕微鏡であって、図1に示されるように、光源装置(多光子励起型観察用光源装置)2と、該光源装置2の後段に配置される蛍光顕微鏡本体(観察装置本体)3とを備えている。
The multiphoton excitation observation apparatus according to the first embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
The multiphoton excitation type observation apparatus 1 according to the present embodiment is a multiphoton excitation type microscope, and as shown in FIG. 1, a light source device (multiphoton excitation type light source device for observation) 2 and the
前記光源装置2は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源4と、該パルスレーザ光源4から発せられる極短パルスレーザ光Lの群速度分散を補償する分散補償光学系5と、分散補償された極短パルスレーザ光Lのオンオフあるいは強度変調する音響光学装置6と、該音響光学装置6とパルスレーザ光源4との間に配置され、音響光学装置6に入射させる極短パルスレーザ光Lを調節する入射補正装置7と、音響光学装置6から出射され、前記蛍光顕微鏡本体3に入射される極短パルスレーザ光Lを調節する顕微鏡入射補正装置8とを備えている。
The
前記分散補償光学系5は、例えば、一対のプリズム9,10とミラー11とから構成されている。あるいはグレーティング対により構成されていてもよい。プリズム9,10どうしの間隔あるいはグレーティングどうしの間隔を調節することで、波長ごとの光路長を調節して、パルスレーザ光源4から蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aに至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。
The dispersion compensation
前記入射補正装置7は、アライメント調節装置12とビーム整形光学系13とを備えている。
前記アライメント調節装置12は、例えば、位置および角度を調節可能な2枚のミラーを備え、極短パルスレーザ光Lの光軸の位置と偏向を調節し、音響光学装置6に対して適正な位置と角度で精度よく入射させるように構成されている。図中、符号14は、パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lを反射して分散補償光学系5に指向させる一方、分散補償光学系5から出力された極短パルスレーザ光Lの光軸から紙面に垂直方向に外れた位置に配置されているミラーである。
The
The
また、ビーム整形光学系13は、分散補償光学系5を通過し、アライメント調節装置12によって位置合わせされた極短パルスレーザ光Lの光束径を絞り、音響光学装置6の結晶15(図2参照)の有効範囲X内に漏れなく入射させるように構成されている。
本実施形態においては、ビーム整形光学系13は、例えば、両凸レンズ16と平凹レンズ17とを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。また、ビーム整形光学系13は、パルスレーザ光源4と音響光学装置6との間に、その中央よりも音響光学装置6側に配置されていることが好ましい。また、ビーム整形光学系13は、音響光学装置6の前方100〜1000mmの位置に配置されていることがさらに好ましい。
Further, the beam shaping
In the present embodiment, the beam shaping
前記音響光学装置6は、図2〜図4に示されるように、例えば、AOMであって、2酸化テルルからなる結晶15と、該結晶15を固定するケース18と、結晶15に接着された圧電素子からなるトランスデューサ19と、該トランスデューサ19に入力する電気信号Eを伝達する音響波発生用電気回路20と、前記結晶15に接着されたヒートシンク(放熱部材)21とを備えている。結晶15とケース18との間、結晶15とヒートシンク21との間には、例えば、シリコーングリースのようなサーマルコンパウンドあるいはインジウム箔からなる界面材22が介在させられている。また、図4中、符号23は、トランスデューサ19から発せられ、結晶15内を伝播した音響波を吸収する吸音材である。
2 to 4, the
結晶15を挟んで対向するケース18の一対の側壁にはそれぞれ開口部24が設けられており、一の開口部24から極短パルスレーザ光Lを入射させ、結晶15を通過した極短パルスレーザ光Lを他の開口部24から出射させるようになっている。
前記ヒートシンク21は、例えば、アルミニウムあるいはアルミニウム合金のような熱伝導率の高い材質からなり、図3に示されるように、平行間隔をあけて配置される複数の平板状のフィン21aを備えている。
An
The
前記顕微鏡入射補正装置8は、アライメント調節装置25と、視準光学系26とを備えている。
アライメント調節装置25は、アライメント調節装置12と同様の構造を有し、蛍光顕微鏡本体3に入射させる極短パルスレーザ光Lの光軸の位置と偏向を精度よく調節することができるようになっている。
The microscope
The
また、視準光学系26は、例えば、両凸レンズ27と平凹レンズ28とからなり、ビーム整形光学系13と同様のガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。視準光学系26は、ビーム整形光学系13により音響光学装置6の有効範囲Xを漏れなく通過するようにその光束径およびビームダイバージェンスを補正され、かつ、アライメント調節装置25により光軸の位置および偏向を調節された極短パルスレーザ光Lが、蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aの前方の所定の位置(試料Aの所定の位置)にビームウエストを形成するように、出射される極短パルスレーザ光Lの光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。さらに具体的には、視準光学系26は、対物レンズ3aの瞳位置において、極短パルスレーザ光Lが、その瞳径と略同等の光束径を有するように、その光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。
The collimating
前記蛍光顕微鏡本体3は、極短パルスレーザ光Lを2次元的に走査する一対のガルバノミラー29、走査された極短パルスレーザ光Lを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ30、中間像を結像した極短パルスレーザ光Lを略平行光にする結像レンズ31、略平行光にされた極短パルスレーザ光Lを集光して試料Aに結像させる対物レンズ3a、試料Aにおいて発せられ対物レンズ3aにより集光された多光子蛍光Fを極短パルスレーザ光Lから分岐するダイクロイックミラー32、分岐された多光子蛍光Fを集光する集光レンズ33、集光された多光子蛍光Fを検出する光電子増倍管(PMT)34とを備えている。符号35、36はミラーである。
The fluorescence microscope main body 3 includes a pair of galvanometer mirrors 29 that two-dimensionally scans the ultrashort pulse laser light L, and a
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置1の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置1によれば、パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lが分散補償光学系5を通過させられることによって群速度分散を補償された状態で、入射補正装置7に入射される。
The operation of the thus configured multiphoton excitation observation apparatus 1 according to this embodiment will be described below.
According to the multiphoton excitation observation apparatus 1 according to the present embodiment, the group velocity dispersion is compensated by passing the ultrashort pulse laser light L emitted from the pulse
入射補正装置7においては、まず、アライメント調整装置12によって、極短パルスレーザ光Lがその光軸の位置および偏向を調整される。次に、ビーム整形光学系13により、光束径を縮小させられた状態で、音響光学装置6に一方の開口部24から入射される。
In the
この場合において、ビーム整形光学系13は、極短パルスレーザ光Lの光束径を縮小して、音響光学装置6の結晶15の有効範囲X内に入射させるように構成されているので、極短パルスレーザ光Lが漏れなく結晶15を通過させられる。
音響光学装置6においては、音響波発生用電気回路20の作動により、所定周波数の電気信号Eがトランスデューサ19に入力され、トランスデューサ19において発生させられた音響波によって、結晶15内における極短パルスレーザ光Lの音響光学効果が発生する。また、トランスデューサ19により発生する音響波の振幅を変更することにより、結晶15内における極短パルスレーザ光Lの回折強度を変化させ、音響光学装置6から出射される極短パルスレーザ光Lの強度を、音響波の振幅に応じた所定の割合で変調する。
In this case, the beam shaping
In the
これにより、入射された極短パルスレーザ光Lが結晶15を通過してケース18の開口部24から、所定の強度に変調された状態で出射されることになる。
この場合において、ビーム整形光学系13によって極短パルスレーザ光Lが結晶15の有効範囲X内に漏れなく入射されているので、結晶15に入射されない極短パルスレーザ光Lや結晶15の側面によって乱反射等される極短パルスレーザ光Lが存在しない。したがって、これらの極短パルスレーザ光Lが迷光となって、正常に結晶15を通過する極短パルスレーザ光Lに混入することがない。
As a result, the incident ultrashort pulse laser beam L passes through the
In this case, since the ultrashort pulse laser beam L is incident on the
その結果、結晶15から出射される極短パルスレーザ光Lにおける波面の乱れの発生が抑制され、試料Aの集光位置におけるPSFの悪化が抑制される。すなわち、対物レンズ3aの前方に形成される試料Aにおける集光位置において、光子密度の低下が防止され、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。
As a result, the occurrence of wavefront disturbance in the ultrashort pulse laser beam L emitted from the
また、トランスデューサ19により結晶15に入力する音響波をオンオフすることにより、極短パルスレーザ光Lの出射と遮断とを切り替えてオンオフすることができる。例えば、蛍光顕微鏡本体3のガルバノミラー29による極短パルスレーザ光Lの2次元的な走査と同期させて極短パルスレーザ光Lをオンオフすることにより、試料Aに対して所定の走査範囲のみに極短パルスレーザ光Lを照射することが可能となる。
Further, by turning on and off the acoustic wave input to the
また、極短パルスレーザ光Lは音響光学装置6の結晶15内を通過させられる際に音響光学効果によって回折させられる。このとき、結晶15にはトランスデューサ19から音響波が入力されるので、そのエネルギによって結晶15が局所的に発熱する。
The ultrashort pulse laser beam L is diffracted by the acoustooptic effect when it passes through the
本実施形態に係る多光子励起型観察装置1によれば、結晶15自体の熱容量が小さいが、該結晶15に熱容量の大きなヒートシンク21が接着されているので、結晶15において発生した熱はヒートシンク21によって吸収される。また、ヒートシンク21には複数のフィン21aが設けられているので、結晶15から吸収した熱は、これらのフィン21aを介して外気に効率的に放散される。これにより、結晶15の局所的な温度上昇が抑制され、結晶15内の屈折率の変動が大幅に抑制されることになる。
According to the multiphoton excitation observation apparatus 1 according to the present embodiment, the heat capacity of the
結晶15の屈折率が変動すると、結晶15内における極短パルスレーザ光Lの回折が変化するため、音響光学装置6からの出射方向が変化する。したがって、何ら対策を施さない場合には、アライメント調節装置12,25によって極短パルスレーザ光Lの光軸の位置と偏向を厳密に調節しておいても、トランスデューサ19から入力される音響波によって、結晶15の温度が経時的に変化し、それによって結晶15からの出射方向がずれて適正な位置に出射されなくなってしまうことになる。
When the refractive index of the
また、結晶15に入力する音響波の振幅は、その強度変調の程度やオンオフの頻度等の使用状態によって相違するため、使用状態ごとに極短パルスレーザ光Lの出射方向が変化する。
特に、AOMの場合には、音響波を発生させるためにトランスデューサ19に入力する駆動電力が高いこと、および、極短パルスレーザ光Lを入射させる有効範囲の面積が小さいことにより、対策を施さない場合には結晶15内は局所的に加熱される。
Further, since the amplitude of the acoustic wave input to the
In particular, in the case of AOM, no measures are taken due to the high drive power input to the
本実施形態によれば、熱容量の大きなヒートシンク21によって結晶15の温度変化が抑制されるので、音響波を発生させるためにトランスデューサ19に入力する駆動電力が高くても、結晶15における局所的な加熱状態が防止され、極短パルスレーザ光Lの出射方向を一定に維持することができる。その結果、結晶15の経時的な温度変化を検出したり、検出された結晶15の温度に基づいてアライメント調節装置25をその都度調節したりする必要がなく、簡易な構成で、観察開始時に設定されたアライメント状態のままで、試料Aの適正な照射範囲に極短パルスレーザ光Lを照射して、蛍光観察を行うことができる。
なお、本実施形態においては、ヒートシンク21の形態として、平板状のフィン21aを備えるものを例示したが、これに代えて、他の任意の形態のヒートシンク21を採用することができる。
According to the present embodiment, since the temperature change of the
In the present embodiment, the
音響光学装置6から出射された変調後の極短パルスレーザ光Lは、顕微鏡入射補正装置8に入射される。顕微鏡入射補正装置8においては、アライメント調節装置25の作動により、その光軸の位置および偏向を調節された状態で、視準光学系26に入射される。
視準光学系26においては、パルスレーザ光源4から発せられ、分散補償光学系5、アライメント調節装置12、ビーム整形光学系13、音響光学装置6およびアライメント調節装置25を通過してきた極短パルスレーザ光Lの光束径およびビームダイバージェンスを再度補正し直すことにより、蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aの瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正する。これにより、パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lを最も無駄なく効率的に試料Aに集光させ、試料A内に形成されるビームウエスト位置における光子密度を向上させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。
The modulated ultrashort pulse laser beam L emitted from the
In the collimation
なお、本実施形態に係る多光子励起型観察装置1および多光子励起型観察用光源装置2においては、ガリレイ型のビーム整形光学系13および視準光学系26を採用したが、これに代えて、複数の両凸レンズを有するケプラー型のビーム整形光学系13および視準光学系26を採用してもよい。また、図5に示されるように、一対の凹面鏡37,38を対向配置することによりビーム整形光学系13を構成してもよい。このように構成することで反射光学系によって極短パルスレーザ光Lの光束径を縮小させるので、ビーム整形光学系13を通過する際に群速度分散を生じることがなく、パルス幅が広がることを防止できる。
In the multiphoton excitation observation apparatus 1 and the multiphoton excitation observation
また、図6に示すように、ビーム整形光学系13として、絞り39(あるいはスリットまたはピンホール等の空間フィルタ)を採用してもよい。このようにすることで、簡易な構成により極短パルスレーザ光Lの光束径を縮小させることができ、また調節も簡単であるという利点がある。
Further, as shown in FIG. 6, a diaphragm 39 (or a spatial filter such as a slit or a pinhole) may be employed as the beam shaping
また、図7に示されるように、ビーム整形光学系13および/または視準光学系26を構成する両凸レンズ16,27および平凹レンズ17,28に、それぞれ、移動機構40,41を設け、両凸レンズ16,27または平凹レンズ17,28を光軸方向に移動させることとしてもよい。このように構成することで、パルスレーザ光源4の交換による個体差、パルスレーザ光源4から出射される極短パルスレーザ光Lの波長の変更あるいは、複数のパルスレーザ光源4を切り替える場合の極短パルスレーザ光Lの波長の変更等、または、これらの変更による分散補償量の変更等によって、ビーム整形光学系13あるいは視準光学系26に入射する極短パルスレーザ光Lの光束径とビームダイバージェンスとが変化しても、移動機構40,41を作動させて、両凸レンズ16,27または平凹レンズ17,28の少なくとも一方を光軸方向に移動させることで、出射される光束径とビームダイバージェンスとが一定となるように整形することができる。
Further, as shown in FIG. 7, the
したがって、波長等が変更されても、ビーム整形光学系13から出射される極短パルスレーザ光Lを、音響光学装置6の結晶15の有効範囲X内に漏れなく入射させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。また、波長等が変更されても、視準光学系26から出射される極短パルスレーザ光Lを、対物レンズ3aの前方の所定の位置に集光させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。また、異なる波長の極短パルスレーザ光Lのビームウエスト位置が光軸方向にずれるのを防止でき、波長にかかわらず、試料Aの同一位置にピントを合わせることができる。
Therefore, even if the wavelength or the like is changed, the ultrashort pulsed laser light L emitted from the beam shaping
また、ビーム整形光学系13が、2以上のレンズにより構成される場合には、移動機構40,41はその少なくとも1つのレンズを光軸方向に移動させるように構成されていればよい。
また、ビーム整形光学系13が、2つの凹面鏡37,38により構成される場合には、移動機構40,41は、2つの凹面鏡37,38の距離を変更するのみならず、2つの凹面鏡37,38の角度をも変更するように構成されている必要がある。このように構成することで、上記と同様の効果を奏する。
When the beam shaping
When the beam shaping
さらに、移動機構40,41の作動により、レンズ16,17,27,28の位置や凹面鏡37,38の位置および角度等を調節する場合、手動により調節することとしてもよいが、極短パルスレーザ光Lの波長に基づいて移動機構40,41の作動状態を調節する制御装置42を備えることにしてもよい。
図8に示される例は、波長可変のパルスレーザ光源4を備え、該パルスレーザ光源4から出射される極短パルスレーザ光Lの波長が変更されたときに、分散補償光学系5、アライメント調節装置12,25、ビーム整形光学系13、音響光学装置6、視準光学系26等の各調節装置を制御装置42によりそれぞれ調節する多光子励起型観察装置1である。
Furthermore, when adjusting the positions of the
The example shown in FIG. 8 includes a tunable pulsed
制御装置42には、パルスレーザ光源4から出射される極短パルスレーザ光Lの波長λとその波長λが選択されたときの前記各調節装置の最適な作動状態Y、例えば、分散補償光学系5の分散補償量(プリズムやグレーティングの間隔寸法)、アライメント調節装置12,25を構成するミラーの位置および角度、ビーム整形光学系13および視準光学系26を構成するレンズ16,17,27,28や凹面鏡37,38の位置や角度、音響光学装置6に入力する音響波の周波数等とを対応づけて記憶するメモリ装置43が備えられている。各調節装置の作動状態Yは相互に関連している場合があるので、全ての調節装置に対して、波長λと作動状態Yとが設定されていることが好ましい。
The
そして、パルスレーザ光源4から出射される極短パルスレーザ光Lの波長λが、例えば、パルスレーザ光源Lから出力される波長情報(あるいは、外部から入力される極短パルスレーザ光の波長情報)λによって取得されると、制御装置42は、取得された波長情報λに基づいてメモリ装置43内を検索し、波長λに対応する作動状態Yとなるように各調節装置を自動調節する。これにより、パルスレーザ光源4の波長λの変化にかかわらず、簡易かつ精度よく極短パルスレーザ光Lを漏れなく音響光学装置6の結晶15の有効範囲X内に通過させ、あるいは、対物レンズ3aの瞳位置に瞳径と略同等の極短パルスレーザ光Lを入射させて、試料Aにおける多光子励起効果を効率的に発生させることができる。
The wavelength λ of the ultrashort pulse laser light L emitted from the pulse
なお、採用し得る波長λが予め定められている場合には、上述したように、メモリ装置43に波長λと作動状態Yとを対応づけて記憶しておくことにより、最も簡易かつ精度よく制御できる。しかしながら、この発明は、これに限定されるものではなく、ビーム整形光学系13に入力される極短パルスレーザ光Lあるいはビーム整形光学系13から出力される極短パルスレーザ光Lの光束径を測定し、その測定結果に基づいて、ビーム整形光学系13による光束径の縮小率やビームダイバージェンスが達成できるように制御装置42により移動機構40,41を自動調節することにしてもよい。
When the wavelength λ that can be adopted is determined in advance, as described above, the wavelength λ and the operating state Y are stored in the
また、制御装置42による調節は、波長λの変更により生ずるアライメントのずれ、ビームウエスト位置の移動、ビームダイバージェンスの変動を検出し、それぞれ所望のアライメント、ビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが達成できるように各調節装置に対して行われてもよい。
In addition, the adjustment by the
さらに、極短パルスレーザ光Lの採用し得る波長λが有限個に限られる場合には、図9に示されるように、各波長λに適合する距離や角度に予め調節された状態に固定されたレンズ群あるいは凹面鏡からなる複数の補正光学ユニット13A,13B,13Cと、該補正光学ユニット13A,13B,13Cを切り替える切替機構44とを備えるものとしてもよい。この場合においても、波長λと補正光学ユニット13A,13B,13Cとを対応づけてメモリ装置43に記憶しておき、得られた波長情報λに基づいてメモリ装置43内を検索して対応する補正光学ユニット13A,13B,13Cを選択し、切替機構44により切り替えることとすれば、上記と同様に、簡易に高精度の多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
Furthermore, when the wavelength λ that can be used by the ultrashort pulse laser beam L is limited to a finite number, as shown in FIG. 9, the wavelength λ is fixed in a state adjusted in advance to a distance and angle suitable for each wavelength λ. A plurality of correction
なお、同様にして、視準光学系26についても、複数の補正光学ユニットとこれらを切り替える切替機構とを有する構造のものを採用することとしてもよい。
また、視準光学系26,ビーム整形光学系13のレンズ構成は、いずれも図示のような両凸レンズと平凹レンズとの組合せに限られるものではなく、正または負のパワーを持つ任意のレンズの組合せにより構成されるものであってもよい。
Similarly, the collimating
Further, the lens configurations of the collimating
A 試料
F 蛍光
L 極短パルスレーザ光
X 有効範囲
Y 作動状態
λ 波長
1 多光子励起型観察装置
2 多光子励起型観察用光源装置
3 蛍光顕微鏡本体(観察装置本体)
4 パルスレーザ光源
6 音響光学装置
7 入射補正装置
13 ビーム整形光学系(入射補正装置)
13A,13B,13C 補正光学ユニット
16,17 レンズ
37,38 凹面鏡
39 絞り(空間フィルタ)
40,41 移動機構
42 制御装置
43 メモリ装置
44 切替機構
A Sample F Fluorescence L Ultrashort pulse laser beam X Effective range Y Operating state λ Wavelength 1 Multiphoton excitation
4 Pulse
13A, 13B, 13C Correction
40, 41
Claims (9)
該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置と、
該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察装置。 A pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam;
An observation apparatus main body for irradiating the sample with an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source and observing fluorescence emitted from the sample;
An acousto-optic device that is disposed between the pulse laser light source and the observation device main body and performs on / off or output adjustment of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source;
A multi-photon excitation observation device that is disposed between the acoustooptic device and the pulse laser light source and includes an incident correction device that reduces the beam diameter of the ultrashort pulse laser beam so that the beam diameter can enter the effective range of the acoustooptic device. .
該制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、補正光学ユニットとを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている各波長に対応する補正光学ユニットを選択するように切替機構を調節する請求項6に記載の多光子励起型観察装置。 The incident correction device includes a control device that operates a switching mechanism according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source,
The control device includes a memory device that stores the wavelength of the ultrashort pulse laser beam and the correction optical unit in association with each other, and stores each of the memory devices stored in the memory device according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam. The multiphoton excitation observation apparatus according to claim 6, wherein the switching mechanism is adjusted so as to select a correction optical unit corresponding to the wavelength.
該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置とを備え、
該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察用光源装置。 A pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam;
An acoustooptic device that performs on / off or output adjustment of the ultrashort pulsed laser light emitted from the pulsed laser light source,
For multiphoton excitation observation, comprising an incident correction device disposed between the acousto-optic device and the pulsed laser light source and capable of reducing the beam diameter of the ultrashort pulsed laser beam so that it can enter the effective range of the acoustooptic device. Light source device.
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