JP2007132794A - Multiphoton excitation type observation device, and light source device for multiphoton excitation type observation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に関するものである。 The present invention relates to a multiphoton excitation observation apparatus and a multiphoton excitation observation light source apparatus.
従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の観察装置が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
この特許文献1においては、試料に照射する励起光の強度を調節し、あるいはオンオフするための手段として、音響光学変調器(AOM:Acoust Optical
Modulator)を用いることが開示されている。
In
It is disclosed to use Modulator).
AOMは、一般に約1cm角の二酸化テルルやモリブデン酸塩からなる結晶であり、入射されたレーザ光を変調させることができる有効範囲は比較的狭い。AOMに入射される極短パルスレーザ光がAOMの有効範囲から外れると、迷光の混入等に起因してビーム形状が劣化するという問題がある。ビーム形状が劣化すると、試料の集光位置における点像分布関数(PSF:Point Spread
Function)が悪化し、試料の集光位置における光子密度が低下し、多光子励起効果を効率よく発生させることができないという問題がある。
The AOM is generally a crystal made of tellurium dioxide or molybdate having a square of about 1 cm, and the effective range in which incident laser light can be modulated is relatively narrow. If the ultrashort pulse laser beam incident on the AOM is out of the effective range of the AOM, there is a problem that the beam shape is deteriorated due to the mixing of stray light. When the beam shape deteriorates, the point spread function (PSF) at the focal position of the sample
Function) is deteriorated, the photon density at the light collection position of the sample is lowered, and there is a problem that the multiphoton excitation effect cannot be generated efficiently.
また、極短パルスレーザ光は、一般には略平行光であると考えられているが、厳密には、光軸方向に沿う特定の位置に光束径が最も小さくなるビームウエストを備えるとともに、該ビームウエストの位置から離れるに従って、所定の広がり角度で光束径が大きくなるビームダイバージェンスを備えている。したがって、多光子励起効果を効率よく発生させ、鮮明な多光子励起画像を取得するためには、このようにビームウエスト位置に依存して光束径が変化する極短パルスレーザ光の光軸を、AOMの比較的狭い有効範囲内に精度よく一致させる必要がある。すなわち、AOMの狭い有効範囲に極短パルスレーザ光を入射させるための縮小ビームエキスパンダやアライメント調整装置が必要となる。 In addition, although the ultrashort pulse laser light is generally considered to be substantially parallel light, strictly speaking, the ultrashort pulse laser light includes a beam waist having the smallest light beam diameter at a specific position along the optical axis direction, and the beam. A beam divergence that increases the beam diameter at a predetermined spread angle as it moves away from the waist position is provided. Therefore, in order to efficiently generate the multiphoton excitation effect and acquire a clear multiphoton excitation image, the optical axis of the ultrashort pulse laser beam whose beam diameter changes depending on the beam waist position in this way, It is necessary to accurately match within a relatively narrow effective range of AOM. In other words, a reduced beam expander and an alignment adjustment device are required for making the ultrashort pulse laser beam enter the narrow effective range of the AOM.
さらに、AOMは、数ワットの駆動電力を必要とするため、極短パルスレーザ光の入射される有効範囲が極めて狭いことと相俟って、局所的に過大な熱が発生する不都合がある。その結果、AOMから出射される光のポインティングスタビリティが悪化するという不都合がある。 Furthermore, since AOM requires several watts of driving power, there is an inconvenience that excessive heat is locally generated in combination with the extremely narrow effective range in which the ultrashort pulse laser beam is incident. As a result, there is an inconvenience that the pointing stability of the light emitted from the AOM is deteriorated.
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、より簡易な構成で、観察装置本体に入射させる極短パルスレーザ光のポインティングスタビリティを向上し、多光子励起効果を効率的に発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる多光子励起型観察装置および多光子励起観察用光源装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and with a simpler structure, improves the pointing stability of ultrashort pulse laser light incident on the observation apparatus main body, and efficiently multi-photon excitation effect. An object of the present invention is to provide a multiphoton excitation observation device and a light source device for multiphoton excitation observation that can be generated and can obtain a clear multiphoton fluorescence image.
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備える多光子励起型観察装置を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam, an observation apparatus main body that irradiates the sample with an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source, and observes the fluorescence emitted from the sample; Provided is a multiphoton excitation observation device that is disposed between the pulse laser light source and the observation device main body and includes an acousto-optic modulation filter that modulates an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source.
本発明によれば、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光が観察装置本体に供給され、観察装置本体によって、試料に照射されると、試料における多光子励起効果によって、極短パルスレーザ光が集光させられた位置において多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は観察装置本体によって検出され、観察される。極短パルスレーザ光は、観察装置本体に入射される前に、音響光学変調フィルタを通過するので、音響光学変調フィルタによってオンオフあるいは変調され、所望の光強度の極短パルスレーザ光として観察装置本体に入射される。 According to the present invention, when an ultrashort pulse laser beam emitted from a pulse laser light source is supplied to an observation apparatus body and irradiated on the sample by the observation apparatus body, an ultrashort pulse laser is generated due to the multiphoton excitation effect in the sample. Multiphoton fluorescence is generated at the position where the light is collected. The generated multiphoton fluorescence is detected and observed by the observation apparatus body. The ultrashort pulse laser beam passes through the acousto-optic modulation filter before being incident on the observation device body. Therefore, the ultra-short pulse laser beam is turned on / off or modulated by the acousto-optic modulation filter, and the ultra-short pulse laser beam having a desired light intensity is obtained. Is incident on.
この場合において、本発明によれば、音響光学変調フィルタを使用することによって、AOMの場合とは異なり結晶への入射の有効範囲が広いので、音響光学変調フィルタへの入射に先立って、光束径を絞ったり、精密にアライメント調整したりしなくて済む。したがって、音響光学変調フィルタの前段に縮小ビームエキスパンダやアライメント調整装置が不要となり、装置の構成を簡易化することができる。また、音響光学変調フィルタはAOMと比較すると駆動電力が低くて済むので、局所的に発生する熱の問題が少なく、ポインティングスタビリティを向上することができる。 In this case, according to the present invention, by using the acoustooptic modulation filter, unlike the AOM, the effective range of incidence on the crystal is wide. There is no need to squeeze or precisely adjust the alignment. Therefore, a reduced beam expander and an alignment adjustment device are not required before the acoustooptic modulation filter, and the configuration of the device can be simplified. In addition, since the acousto-optic modulation filter requires lower driving power than the AOM, there are few problems of heat generated locally, and pointing stability can be improved.
上記発明においては、前記パルスレーザ光源が、複数の異なる波長の極短パルスレーザ光を出射可能であり、該パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度と出射角度を調節する制御装置を備えることとしてもよい。
このようにすることで、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長が変更されても、制御装置の作動により、音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度と出射角度が調節されることによって、所望の方向に極短パルスレーザ光を出射させることができる。したがって、異なる波長の極短パルスレーザ光を適正な強度および同一出射角度で安定して出射させることができる。
In the above invention, the pulse laser light source can emit a plurality of ultrashort pulse laser beams having different wavelengths, and the acoustooptic modulation is performed according to the wavelength of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source. It is good also as providing the control apparatus which adjusts the intensity | strength and emission angle of the ultra-short pulse laser beam radiate | emitted from a filter.
In this way, even if the wavelength of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source is changed, the intensity and emission angle of the ultrashort pulse laser light emitted from the acousto-optic modulation filter by the operation of the control device. Is adjusted, the ultrashort pulse laser beam can be emitted in a desired direction. Therefore, it is possible to stably emit ultrashort pulse laser beams having different wavelengths with an appropriate intensity and the same emission angle.
また、上記発明においては、前記制御装置が、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長と、音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、制御装置がパルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長情報を受け取ると、記憶部に記憶されている駆動信号の周波数および振幅が選択され、音響光学変調フィルタに供給される。これにより、極短パルスレーザ光の波長が変更されても、迅速に、所望の強度と出射角度で極短パルスレーザ光を出射させることができる。
In the above invention, the control device stores the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source and the frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acoustooptic modulation filter in association with each other. It is good also as providing.
In this way, when the control device receives the wavelength information of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source, the frequency and amplitude of the drive signal stored in the storage unit are selected, and the acousto-optic modulation filter To be supplied. Thereby, even if the wavelength of the ultrashort pulse laser beam is changed, the ultrashort pulse laser beam can be quickly emitted with a desired intensity and an emission angle.
また、上記発明においては、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度が、指定された強度となるように前記音響光学変調フィルタを制御する制御装置を備えることとしてもよい。
このようにすることで、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光が、音響光学変調フィルタを通過させられる際に、制御装置の作動により、指定された強度の極短パルスレーザ光に変調されて出力される。したがって、試料において所望の強度の極短パルスレーザ光を用いた多光子励起効果を発生させ、高い精度で観察を行うことができる。
In the above invention, a control device may be provided that controls the acousto-optic modulation filter so that the intensity of the ultrashort pulse laser beam emitted from the acousto-optic modulation filter becomes a specified intensity.
In this way, when the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source is passed through the acousto-optic modulation filter, it is modulated into the ultrashort pulse laser light of the specified intensity by the operation of the control device. Is output. Therefore, a multiphoton excitation effect using an ultrashort pulse laser beam having a desired intensity can be generated in the sample, and observation can be performed with high accuracy.
また、上記発明においては、前記制御装置が、極短パルスレーザ光の強度と、音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、制御装置が極短パルスレーザ光の強度を指定されると、記憶部に記憶されている駆動信号の周波数および振幅が選択され、音響光学変調フィルタに供給される。これにより、迅速に指定された強度の極短パルスレーザ光を出射させることができる。
In the above invention, the control device may further include a storage unit that stores the intensity of the ultrashort pulse laser beam and the frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acoustooptic modulation filter in association with each other.
In this way, when the control device specifies the intensity of the ultrashort pulse laser beam, the frequency and amplitude of the drive signal stored in the storage unit are selected and supplied to the acousto-optic modulation filter. As a result, it is possible to emit an extremely short pulse laser beam having a designated intensity quickly.
また、上記発明においては、前記制御装置が、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度を検出する検出器を備え、該検出器により検出された強度に基づいて、該強度が指定された強度となるように、前記音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅を調節することとしてもよい。
このようにすることで、パルスレーザ光源から出力される極短パルスレーザ光の強度を検出器により検出してフィードバックすることにより、精度よく設定された強度の極短パルスレーザ光を試料に照射することが可能となる。
Moreover, in the said invention, the said control apparatus is equipped with the detector which detects the intensity | strength of the ultrashort pulse laser beam radiate | emitted from the said acousto-optic modulation filter, and this intensity | strength is based on the intensity | strength detected by this detector. The frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acousto-optic modulation filter may be adjusted so that becomes the specified intensity.
By doing so, the intensity of the ultra-short pulse laser beam output from the pulse laser light source is detected by the detector and fed back, so that the sample is irradiated with the ultra-short pulse laser beam having a precisely set intensity. It becomes possible.
また、上記発明においては、可視レーザ光を出射する可視レーザ光源と、該可視レーザ光源と前記観察装置本体との間に配置され、可視レーザ光源から発せられ観察装置本体に入射される可視レーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、観察装置本体に入射させる可視レーザ光および極短パルスレーザ光を同様の方法で変調することができる。
Moreover, in the said invention, the visible laser light source which radiates | emits visible laser light, The visible laser light which is arrange | positioned between this visible laser light source and the said observation apparatus main body, and is emitted from a visible laser light source and injects into an observation apparatus main body And an acousto-optic modulation filter that modulates.
By doing so, the visible laser light and the ultrashort pulse laser light incident on the observation apparatus main body can be modulated by the same method.
また、上記発明においては、前記音響光学変調フィルタが、温度調節装置またはヒートシンクのような内部温度安定化手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、音響光学変調フィルタの過熱を防止し、極短パルスレーザ光のポインティングスタビリティをさらに向上することができる。
Moreover, in the said invention, the said acousto-optic modulation filter is good also as providing an internal temperature stabilization means like a temperature control apparatus or a heat sink.
By doing so, it is possible to prevent overheating of the acousto-optic modulation filter and further improve the pointing stability of the ultrashort pulse laser beam.
また、本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備える多光子励起型観察用光源装置を提供する。
本発明によれば、音響光学変調フィルタを使用することによって、AOMの場合とは異なり結晶への入射の有効範囲が広いので、音響光学変調フィルタへの入射に先立って、光束径を絞ったり、精密にアライメント調整したりしなくて済む。したがって、音響光学変調フィルタの前段に縮小ビームエキスパンダやアライメント調整装置が不要となり、装置の構成を簡易化することができる。また、音響光学変調フィルタはAOMと比較すると駆動電力が低くて済むので、局所的に発生する熱の問題が少なく、高いポインティングスタビリティを有する極短パルスレーザ光を出射することができる。
The present invention also provides a multi-photon excitation observation light source device comprising a pulse laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam and an acousto-optic modulation filter that modulates the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source. I will provide a.
According to the present invention, by using an acousto-optic modulation filter, unlike the case of AOM, the effective range of incidence on the crystal is wide. There is no need for precise alignment. Therefore, a reduced beam expander and an alignment adjustment device are not required before the acoustooptic modulation filter, and the configuration of the device can be simplified. In addition, since the acoustooptic modulation filter requires lower driving power than the AOM, there are few problems of locally generated heat, and it is possible to emit an ultrashort pulse laser beam having high pointing stability.
上記発明においては、前記パルスレーザ光源が、複数の異なる波長の極短パルスレーザ光を出射可能であり、該パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度と出射角度を調節する制御装置を備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記制御装置が、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長と、音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
In the above invention, the pulse laser light source can emit a plurality of ultrashort pulse laser beams having different wavelengths, and the acoustooptic modulation is performed according to the wavelength of the ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source. It is good also as providing the control apparatus which adjusts the intensity | strength and emission angle of the ultra-short pulse laser beam radiate | emitted from a filter.
In the above invention, the control device stores the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source and the frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acoustooptic modulation filter in association with each other. It is good also as providing.
また、上記発明においては、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度が、指定された強度となるように前記音響光学変調フィルタを制御する制御装置を備えることとしてもよい。
上記発明においては、前記制御装置が、極短パルスレーザ光の強度と、音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
In the above invention, a control device may be provided that controls the acousto-optic modulation filter so that the intensity of the ultrashort pulse laser beam emitted from the acousto-optic modulation filter becomes a specified intensity.
In the above invention, the control device may include a storage unit that stores the intensity of the ultrashort pulse laser beam and the frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acoustooptic modulation filter in association with each other.
また、上記発明においては、前記制御装置が、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度を検出する検出器を備え、該検出器により検出された強度に基づいて、該強度が指定された強度となるように、前記音響光学変調フィルタに供給する駆動信号の周波数および振幅を調節することとしてもよい。 Moreover, in the said invention, the said control apparatus is equipped with the detector which detects the intensity | strength of the ultrashort pulse laser beam radiate | emitted from the said acousto-optic modulation filter, and this intensity | strength is based on the intensity | strength detected by this detector. The frequency and amplitude of the drive signal supplied to the acousto-optic modulation filter may be adjusted so that becomes the specified intensity.
また、上記発明においては、可視レーザ光を出射する可視レーザ光源と、該可視レーザ光源から発せられた可視レーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記音響光学変調フィルタが、温度調節装置またはヒートシンクのような内部温度安定化手段を備えることとしてもよい。
Moreover, in the said invention, it is good also as providing the visible laser light source which radiate | emits visible laser light, and the acousto-optic modulation filter which modulates the visible laser light emitted from this visible laser light source.
Moreover, in the said invention, the said acousto-optic modulation filter is good also as providing an internal temperature stabilization means like a temperature control apparatus or a heat sink.
本発明によれば、音響光学変調フィルタの使用によって、より簡易な構成で、観察装置本体に入射させる極短パルスレーザ光のポインティングスタビリティを向上し、多光子励起効果を効率的に発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができるという効果を奏する。 According to the present invention, by using an acousto-optic modulation filter, it is possible to improve the pointing stability of the ultrashort pulse laser light incident on the observation apparatus main body with a simpler configuration, efficiently generate a multiphoton excitation effect, There is an effect that a clear multiphoton fluorescence image can be obtained.
以下、本発明の一実施形態に係る多光子励起型観察装置について図1〜図6を参照して説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置1は、多光子励起型顕微鏡であって、図1に示されるように、光源装置(多光子励起型観察用光源装置)2と、該光源装置2の後段に配置される蛍光顕微鏡本体(観察装置本体)3とを備えている。
Hereinafter, a multiphoton excitation observation apparatus according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
The multiphoton excitation
前記光源装置2は、極短パルスレーザ光Lを出射するパルスレーザ光源4と、該パルスレーザ光源4から出射された極短パルスレーザ光Lのオンオフあるいは強度変調を行う音響光学変調フィルタ(以下、AOTFと略す。)5と、変調された極短パルスレーザ光Lの群速度分散を補償する分散補償光学系6と、分散補償され前記蛍光顕微鏡本体3に入射される極短パルスレーザ光Lを調節する視準光学系7とを備えている。
The
前記分散補償光学系6は、例えば、図2に示されるように、一対のプリズム8,9とミラー10とから構成されている。プリズム8,9どうしの間隔を調節することで、分散補償量を調節して、パルスレーザ光源4から蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aに至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。
The dispersion compensation
この際に、光路長の調節により、光軸がシフトし、波長の変化によって光軸の角度が変動するので、プリズム8,9およびミラー10の位置および角度を矢印に示すように調節することにより、出射される極短パルスレーザ光Lの光軸の位置および角度が調節されるようになっている。
図中、符号11は、パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lを反射して分散補償光学系6に指向させる一方、分散補償光学系6から出力された極短パルスレーザ光Lの光軸から外れた位置に配置されているミラーである。
At this time, the optical axis shifts by adjusting the optical path length, and the angle of the optical axis fluctuates due to the change in wavelength. Therefore, by adjusting the positions and angles of the
In the figure,
また、視準光学系7は、例えば、図3に示されるように、両凸レンズ12と平凹レンズ13とを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダと、両凸レンズ12および平凹レンズ13をそれぞれ光軸方向に移動可能に支持するレンズ移動機構14,15とにより構成されている。視準光学系7は、極短パルスレーザ光Lが、蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aの瞳位置に瞳径と略同等の光束径で入射されるように、出射される極短パルスレーザ光Lの光束径およびビームダイバージェンスを調節することができるようになっている。
Further, for example, as shown in FIG. 3, the collimating
前記AOTF5は、図4〜図6に示されるように、2酸化テルルからなる結晶16と、該結晶16を固定するケース17と、結晶16に接着された圧電素子からなるトランスデューサ18と、該トランスデューサ18に入力する電気信号Eを伝達する音響波発生用電気回路19と、前記結晶16に接着されたヒートシンク20とを備えている。結晶16とケース17との間および結晶16とヒートシンク20との間には、例えば、シリコーングリースのようなサーマルコンパウンドあるいはインジウム箔からなる界面材21が介在させられている。また、図中、符号22は、トランスデューサ18から発せられ結晶16内を伝播した音響波を吸収する吸音材である。
As shown in FIGS. 4 to 6, the
結晶16を挟んで対向するケース17の一対の側壁にはそれぞれ開口部23が設けられており、一の開口部23から極短パルスレーザ光Lを入射させ、結晶16を透過した極短パルスレーザ光Lを他の開口部23から出射させるようになっている。
ヒートシンク20は例えば、アルミニウムあるいはアルミニウム合金のような熱伝導率の高い材質からなり、図5に示されるように平行間隔をあけて配置される複数の平板状のフィン20aを備えている。
An
The
前記蛍光顕微鏡本体3の内部には、極短パルスレーザ光Lを2次元的に走査する(例えば、近接ガルバノミラーのような)ガルバノミラー301、走査された極短パルスレーザ光Lを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ302、中間像を結像した極短パルスレーザ光Lを集光して略平行光にする結像レンズ303、略平行光にされた極短パルスレーザ光Lを集光して試料Aに結像させる対物レンズ3a、試料Aにおいて発せられ対物レンズ3aにより集光された多光子蛍光Fを極短パルスレーザ光Lから分岐するダイクロイックミラー304、分岐された多光子蛍光Fを集光する集光レンズ305、集光された多光子蛍光Fを検出する光電子増倍管(PMT)306とを備えている。符号307はミラーである。
Inside the fluorescent microscope
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置1の作用について、以下に説明する。
パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lは、AOTF5を通過させられることにより、オンオフあるいは所定の強度に変調された状態で、分散補償光学系6に入射され、多光子励起型観察装置1の光学系全体の群速度分散量が補償される。その後、極短パルスレーザ光Lは、視準光学系7を通過させられることによって、その光束径およびビームダイバージェンスが、蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aの瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正される。これにより、パルスレーザ光源4から発せられた極短パルスレーザ光Lを最も無駄なく効率的に試料Aに集光させ、試料A内に形成されるビームウエスト位置における光子密度を向上させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。
The operation of the thus configured multiphoton
The ultrashort pulsed laser light L emitted from the pulsed
AOTF5においては、音響波発生用電気回路19の作動により、所定周波数の電気信号Eがトランスデューサ18に入力され、トランスデューサ18において発生させられた音響波によって、結晶16内における極短パルスレーザ光Lの音響光学効果が発生する。また、トランスデューサ18により発生する音響波の振幅を変更することにより、結晶16内における極短パルスレーザ光Lの回折強度を変化させ、AOTF5から出射される極短パルスレーザ光Lの強度を、音響波の振幅に応じた所定の割合で変調する。
In the
これにより、入射された極短パルスレーザ光Lが結晶16を通過してケース17の開口部23から、所定の強度に変調された状態で出射されることになる。
この場合において、AOTF5においては従来のAOMと異なり、入射の有効範囲である開口部23が比較的大きく確保されているので、前段においてビーム径を調節したり、アライメントを精密に調節したりしなくても、極短パルスレーザ光Lが結晶16の有効範囲内に漏れなく入射される。したがって。結晶16に入射されない極短パルスレーザ光Lや結晶16の側面によって乱反射等される極短パルスレーザ光Lが存在せず、これらの極短パルスレーザ光Lが迷光となって、正常に結晶16を通過する極短パルスレーザ光Lに混入することがない。
As a result, the incident ultrashort pulse laser beam L passes through the
In this case, unlike the conventional AOM, the
その結果、結晶16から出射される極短パルスレーザ光Lにおける波面の乱れの発生が抑制され、試料Aの集光位置におけるPSFの悪化が抑制される。すなわち、対物レンズ3aの前方に形成される試料Aにおける集光位置において、光子密度の低下が防止され、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。
As a result, the occurrence of wavefront disturbance in the ultrashort pulse laser beam L emitted from the
そして、本実施形態に係る多光子励起型観察装置1によれば、極短パルスレーザ光LがAOTF5により変調されるので、光源装置2の構成を簡易化することができる。すなわち、AOMとは異なり、入射の有効範囲(開口部23)が広いので、AOTF5への入射に先立って極短パルスレーザ光Lの光束径を絞ったり、精密なアライメント調整を行ったりするための縮小ビームエキスパンダやアライメント調整装置を省略できる。したがって、装置全体の構成の簡易化、小型化および低コスト化を図ることができるという利点がある。
And according to the multiphoton
また、本実施形態に係る多光子励起型観察装置1によれば、極短パルスレーザ光LがAOTF5により変調されるので、蛍光顕微鏡本体3に入射される極短パルスレーザ光Lのポインティングスタビリティを安定化させることができる。すなわち、AOMとは異なり、結晶16の局所的な過熱が少ない。したがって、AOTF5の後段に、不安定なポインティングスタビリティを補償するためのアライメント調整手段を必要とせず、この点においても、装置の簡易化、小型化および低コスト化を図ることができるという利点がある。
In addition, according to the multiphoton
また、トランスデューサ18により結晶16に入力する音響波をオンオフすることにより、極短パルスレーザ光Lの出射と遮断とを切り替えてオンオフすることができる。例えば、蛍光顕微鏡本体3のガルバノミラー301による極短パルスレーザ光Lの2次元的な走査と同期させて極短パルスレーザ光Lをオンオフすることにより、試料Aに対して所定の走査範囲のみに極短パルスレーザ光Lを照射することが可能となる。
In addition, by turning on and off the acoustic wave input to the
また、極短パルスレーザ光LはAOTF5の結晶16内を通過させられる際に音響光学効果によって回折させられる。このとき、結晶16にはトランスデューサ18から音響波が入力されるので、そのエネルギによって結晶16が局所的に発熱する。AOTF5の結晶16における発熱はAOMの結晶における発熱より十分に小さい。
The ultrashort pulse laser beam L is diffracted by the acoustooptic effect when it passes through the
本実施形態に係る多光子励起型観察装置1によれば、結晶16自体の熱容量が小さいが、該結晶16に熱容量の大きなヒートシンク20が接着されているので、結晶16において発生した熱はヒートシンク20によって吸収される。また、ヒートシンク20には複数のフィン20aが設けられているので、結晶16から吸収した熱は、これらのフィン20aを介して外気に効率的に放散される。これにより、結晶16の局所的な温度上昇が抑制され、結晶16内の屈折率の変動が大幅に抑制されることになる。
According to the multiphoton
結晶16の屈折率が変動すると、結晶16内における極短パルスレーザ光Lの回折が変化するため、AOTF5からの出射方向が変化する。したがって、何ら対策を施さない場合には、トランスデューサ18から入力される音響波によって、結晶16の温度が経時的に変化し、それによって結晶16からの出射方向がずれて適正な位置に出射されなくなってしまうことになる。
When the refractive index of the
また、結晶16に入力する音響波の振幅は、その強度変調の程度やオンオフの頻度等の使用状態によって相違するため、使用状態ごとに極短パルスレーザ光Lの出射方向が変化する。
Further, since the amplitude of the acoustic wave input to the
本実施形態によれば、熱容量の大きなヒートシンク20によって結晶16の温度変化が抑制されるので、音響波を発生させるためにトランスデューサ18に入力する駆動電力が高くても、結晶16における局所的な加熱状態が防止され、極短パルスレーザ光Lの出射方向を一定に維持することができる。その結果、結晶の経時的な温度変化を検出したり、検出された結晶16の温度に基づいてアライメント調節装置をその都度調節したりする必要がなく、簡易な構成で、観察開始時に設定されたアライメント状態のままで、試料Aの適正な照射範囲に極短パルスレーザ光Lを照射して、蛍光観察を行うことができる。
According to the present embodiment, since the temperature change of the
なお、本実施形態においては、ヒートシンク20の形態として、平板状のフィン20aを備えるものを例示したが、これに代えて、他の任意の形態のヒートシンクを採用することができる。また、図7に示されるように、ヒートシンク20に代えて、ペルチェ素子やヒータ等の冷却器、加熱器および熱電対等の温度計測器を備えた温度調節装置24を配置することにしてもよい。
In the present embodiment, the
なお、図8に示されるように、AOTF5の後段にビームポインティング調整光学系25を配置することにしてもよい。ビームポインティング調整光学系25は、例えば、図9に示されるように、2枚のミラー26a,26bとこれらミラー26a,26bをそれぞれ移動させる2つのミラー移動機構27,28とを備えている。第1のミラー26aは、第1の方向Z1から矢印のように入射されてきた極短パルスレーザ光Lを、該第1の方向Z1に略直交する第2の方向Z2に偏向させるようになっている。また、第2のミラー26bは、第2の方向Z2に入射される極短パルスレーザ光Lを、第1の方向Z1および第2の方向Z2に略直交する第3の方向Z3に偏向させて出射するようになっている。
As shown in FIG. 8, the beam pointing adjustment
第1のミラー移動機構27は、前記第1の方向Z1に沿って第1のミラー26aを並進移動させる第1の並進機構27aと、前記第3の方向Z3に平行な軸線回りに第1のミラー26aを揺動させる第1の揺動機構27bとを備えている。第2のミラー移動機構28は、前記第3の方向に沿って第2のミラー26bを並進移動させる第2の並進機構28aと、前記第1の方向Z1に平行な軸線回りに第2のミラー26bを揺動させる第2の揺動機構28bとを備えている。第1、第2の並進機構27a,28aは、例えば、モータ27c,28cおよびボールネジ27d,28dにより駆動され、第1、第2の揺動機構27b,28bは、例えば、モータ27e,28eにより構成されている。
The first
これにより、極短パルスレーザ光Lの光軸の角度が、第1の方向Z1に対して、第1の方向Z1および第2の方向Z2を含む平面内においてずれている場合には、第1の揺動機構27bを作動させてその角度を調節し、第1の方向Z1に対して第2の方向Z2および第3の方向Z3を含む平面内においてずれている場合には、第2の揺動機構28bを作動させてその角度を調節することができるようになっている。また、ビームポインティング調整光学系25から出射される極短パルスレーザ光Lの光軸の位置が第1の方向Z1にずれている場合には、第1の並進機構27aを作動させ、第2の方向Z2にずれている場合には第2の並進機構28aを作動させて、その位置ずれを調節することができるようになっている。
これにより、パルスレーザ光源4や分散補償光学系6に起因するアライメントのズレを補償することが必要な場合に効果的である。
Thus, if the angle of the optical axis of the ultrashort pulsed laser light L with respect to the first direction Z 1, are shifted in the plane including the first direction Z 1 and a second direction Z 2 is actuates a first
This is effective when it is necessary to compensate for misalignment caused by the pulse
次に、本発明の第2の実施形態に係る多光子励起型観察装置30について、図10を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第1の実施形態に係る多光子励起型観察装置1と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
Next, a multiphoton
In the description of the present embodiment, the same reference numerals are assigned to portions having the same configuration as the multiphoton
本実施形態に係る多光子励起型観察装置30は、複数の波長の極短パルスレーザ光Lを出射可能なパルスレーザ光源31と、AOTF5から出射された極短パルスレーザ光Lを分岐してその強度を検出する検出器32と、検出された極短パルスレーザ光Lの強度が最大となるように、AOTF5の結晶16に供給する音響波(駆動信号)の周波数および振幅を調節する制御装置33とを備えている。制御装置33には、極短パルスレーザ光Lの強度と音響波の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶装置(図示略)が備えられていてもよい。
The multiphoton
検出器32は、AOTF5から出射された極短パルスレーザ光Lを分岐するビームサンプラ34と、分岐された極短パルスレーザ光Lの強度、ビーム形状およびアライメントを調節するビーム整形光学系35と、調節された極短パルスレーザ光Lを検出するパワーモニタ36とを備えている。
ビーム整形光学系35は、例えば、NDフィルタ、スリットあるいは集光レンズとスリットとの組合せにより構成されている。パワーモニタ36は、例えば、カロリーメータ、フォトダイオード、CMOSまたはCCDにより構成されている。
The
The beam shaping
AOTF5の結晶16に供給する音響波が固定されている場合に、パルスレーザ光源4から発せられる極短パルスレーザ光Lの波長が変動すると、AOTF5から出射される極短パルスレーザ光Lの強度と出射方向が変動する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置30によれば、パルスレーザ光源31から発せられる極短パルスレーザ光Lの波長が変化したときに、検出器32により検出される極短パルスレーザ光Lの強度が最大となるようにAOTF5の結晶16への音響波の周波数および振幅を調節するので、極短パルスレーザ光Lの波長にかかわらず、AOTF5からの出射角度を一定に、かつ、適正な出射強度を維持することができる。
When the acoustic wave supplied to the
According to the multiphoton
次に、本発明の第3の実施形態に係る多光子励起型観察装置40について、図11を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、上述した第1、第2の実施形態に係る多光子励起型観察装置1,30と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
Next, a multiphoton
Also in the description of the present embodiment, the same reference numerals are given to portions having the same configurations as those of the multiphoton
本実施形態に係る多光子励起型観察装置40は、パルスレーザ光源31から出射させる極短パルスレーザ光Lの波長を入力するキーボード等の入力装置41と、該入力装置41からの入力信号に基づいて、パルスレーザ光源31に対し、出射すべき極短パルスレーザ光Lの波長を指示する制御装置42とを備えている。
制御装置42は、パルスレーザ光源31に対して出力する波長指令信号と、当該波長の極短パルスレーザ光LがAOTF5に入射された際に、AOTF5からの出射角度を一定に維持し、かつ、適正な出射強度を得るための音響波の周波数および振幅とを対応づけて記憶する記憶装置43を備えている。
The multiphoton
The
本実施形態に係る多光子励起型観察装置40によれば、パルスレーザ光源31から出射させる極短パルスレーザ光Lの波長情報が入力装置41から入力されると、入力された波長情報が制御装置42に送られ、制御装置42において、送られてきた波長情報に基づいて記憶装置43内が検索され、波長に対応づけて記憶されている音響波の周波数および振幅情報が取得される。取得された音響波の周波数および振幅信号は、制御装置42からAOTF5に供給される。これにより、AOTF5においては、出射される極短パルスレーザ光Lの波長に合わせて出射強度と出射角度とが調節される。
According to the multiphoton
すなわち、本実施形態に係る多光子励起型観察装置40によれば、パルスレーザ光源31の波長の変化にかかわらず、簡易かつ精度よく一定の出射角度で、かつ、適正な出射強度で極短パルスレーザ光Lを出射させることができる。
That is, according to the multiphoton
このように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置40によれば、パルスレーザ光源31から出射される極短パルスレーザ光Lの波長が変更されても、制御装置42が、その波長情報に基づいてAOTF5を制御する。したがって、極短パルスレーザ光Lの波長が変更されても、蛍光顕微鏡本体3の対物レンズ3aの瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有する極短パルスレーザ光Lを入射させることができ、試料Aにおける多光子励起効果を効率的に発生させて鮮明な多光子励起画像を得ることができるという効果を奏する。
As described above, according to the multiphoton
また、制御装置42は、記憶装置43に波長と対応づけて記憶されているAOTF5の結晶16に供給する音響波の周波数および振幅を記憶装置43から取得してAOTF5を制御する。したがって、波長が変更されても、簡易かつ迅速に、試料Aにおいて多光子励起効果を効率的に発生させるように極短パルスレーザ光Lを調節することができる。
In addition, the
次に、本発明の第4の実施形態に係る多光子励起型観察装置50について、図12を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、上述した第1〜第3の実施形態に係る多光子励起型観察装置1,30,40と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
Next, a multiphoton
Also in the description of the present embodiment, the same reference numerals are given to portions having the same configuration as the multiphoton
本実施形態に係る多光子励起型観察装置50は、図12に示されるように、パルスレーザ光源31に加えて、可視レーザ光源51および紫外レーザ光源52と、これらの光源51,52から出射されるレーザ光L1,L2をそれぞれ変調するAOTF53,54と、可視レーザ光L1および紫外レーザ光L2を伝播するシングルモードファイバのような光ファイバ55,56と、これらのレーザ光L1,L2および極短パルスレーザ光Lを同一の光路に合流させて蛍光顕微鏡本体3に供給する合波光学系57とを備えている。
As shown in FIG. 12, the multiphoton
制御装置42は、入力装置41から入力された波長指令に応じて、各レーザ光源31,51,52に対し、出射すべきレーザ光L.L1.L2の波長を指示するようになっている。また、記憶装置43には、各レーザ光源31,51,52から出射されるレーザ光L.L1.L2の波長情報と、そのときのAOTF5,53,54の各結晶16に供給する音響波の周波数および振幅情報とが対応づけて記憶されている。
In response to the wavelength command input from the
前記合波光学系57は、光ファイバ55,56により伝播されてきた可視レーザ光L1および紫外レーザ光L2をそれぞれ略平行光にするコリメートレンズ58,59および光路を合流させるためのダイクロイックミラー60,61を備えている。図中、符号62はミラーである。
各レーザ光源31,51,52は、複数の波長のレーザ光L.L1.L2を出射可能な連続あるいはパルスレーザ光源である。複数の単波長式のレーザ光を切り替える方式であっても、可変波長式であってもよい。
The multiplexing
Each of the
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置50によれば、第3の実施形態に係る多光子励起型観察装置40と同様にして、パルスレーザ光源31、可視レーザ光源51および紫外レーザ光源52から出射させるレーザ光L,L1,L2の波長情報が入力装置41から入力されると、入力された波長情報が制御装置42に送られ、制御装置42において、送られてきた波長情報に基づいて記憶装置43内が検索され、波長情報に対応づけて記憶されている音響波の周波数および振幅情報が取得される。取得された音響波の周波数および振幅情報は、制御装置42からAOTF5,53,54に供給される。
According to the multiphoton
これにより、AOTF5,53,54においては、出射されるレーザ光L,L1,L2の波長に合わせて出射強度と出射角度とが調節される。
すなわち、本実施形態に係る多光子励起型観察装置50によれば、各レーザ光源31,51,52の波長の変化にかかわらず、簡易かつ精度よく一定の出射角度、かつ、適正な出射強度でレーザ光L,L1,L2を出射させることができる。
Thereby, in the
That is, according to the multiphoton
この場合において、本実施形態に係る多光子励起型観察装置50によれば、複数のレーザ光源31,51,52をそれぞれAOTF5,53,54により変調するので、制御信号をほぼ同レベルとすることができ、AOTF5,53,54のタイミング制御を行い易いという利点がある。
In this case, according to the multiphoton
L 極短パルスレーザ光
L1 可視レーザ光
L2 紫外レーザ光
1,30,40,50 多光子励起型観察装置
2 多光子励起型観察用光源装置
3 蛍光顕微鏡本体(観察装置本体)
4,31 パルスレーザ光源
5,53,54 AOTF(音響光学変調フィルタ)
20 ヒートシンク(内部温度安定化手段)
24 温度調節装置(内部温度安定化手段)
32 検出器
33,42 制御装置
43 記憶装置(記憶部)
L Ultrashort pulse laser beam L 1 Visible laser beam L 2
4,31 Pulsed
20 Heat sink (internal temperature stabilization means)
24 Temperature control device (internal temperature stabilization means)
32
Claims (16)
該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備える多光子励起型観察装置。 A pulse laser light source that emits ultrashort pulse laser light;
An observation apparatus main body for irradiating the sample with an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source and observing fluorescence emitted from the sample;
A multi-photon excitation observation device that is disposed between the pulse laser light source and the observation device main body and includes an acousto-optic modulation filter that modulates ultrashort pulse laser light emitted from the pulse laser light source.
該パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度と出射角度を調節する制御装置を備える請求項1に記載の多光子励起型観察装置。 The pulse laser light source can emit a plurality of ultrashort pulse laser beams having different wavelengths,
The control apparatus which adjusts the intensity | strength and the emission angle of the ultrashort pulse laser beam radiate | emitted from the acousto-optic modulation filter according to the wavelength of the ultrashort pulse laser beam radiate | emitted from this pulse laser light source. Multiphoton excitation observation device.
該可視レーザ光源と前記観察装置本体との間に配置され、可視レーザ光源から発せられ観察装置本体に入射される可視レーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備える請求項1から請求項6のいずれかに記載の多光子励起型観察装置。 A visible laser light source that emits visible laser light;
The acousto-optic modulation filter which is arrange | positioned between this visible laser light source and the said observation apparatus main body, and modulates the visible laser beam emitted from the visible laser light source and injected into the observation apparatus main body. The multiphoton excitation observation apparatus according to any one of the above.
該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を変調する音響光学変調フィルタとを備える多光子励起型観察用光源装置。 A pulse laser light source that emits ultrashort pulse laser light;
A multiphoton excitation observation light source device comprising an acousto-optic modulation filter for modulating an ultrashort pulse laser beam emitted from the pulse laser light source.
該パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記音響光学変調フィルタから出射される極短パルスレーザ光の強度と出射角度を調節する制御装置を備える請求項9に記載の多光子励起型観察用光源装置。 The pulse laser light source can emit a plurality of ultrashort pulse laser beams having different wavelengths,
The control apparatus which adjusts the intensity | strength and emission angle of the ultra-short pulse laser beam radiate | emitted from the acousto-optic modulation filter according to the wavelength of the ultra-short pulse laser beam radiate | emitted from this pulse laser light source. Multiphoton excitation type observation light source device.
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