JPH10206745A - Scanning optical microscope - Google Patents

Scanning optical microscope

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JPH10206745A
JPH10206745A JP952097A JP952097A JPH10206745A JP H10206745 A JPH10206745 A JP H10206745A JP 952097 A JP952097 A JP 952097A JP 952097 A JP952097 A JP 952097A JP H10206745 A JPH10206745 A JP H10206745A
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JP
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Application
Patent type
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excitation
scanning
wavelength
light
fluorescence
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Pending
Application number
JP952097A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Hiroshi Sasaki
浩 佐々木
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
オリンパス光学工業株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To remove a fluorescent stroke and to suppress the time delay of every observation due to plural excited wavelengths by switching the setting of excited wavelength and optical path for evey frame scanning or every line scanning or under the photodetection of one pixel synchronously with scanning. SOLUTION: Laser light oscillated by a krypton argon laser 1 is expanded into desired beam diameter by a beam expander 2 and made incident upon a turret 4 for selecting the wavelength of 488nm or 568nm by a reflection mirror 3. The turret 4 is composed of a rotary plate having exciting filters 4a and 4d, reflection mirror 4c and hole 4b. The exciting filter 4a transmits the light of 488nm and the filter 4d transmits the light of 568nm respectively. Synchronously with the scan of optical scanning system 7, the turret 4 is rotated at 90 deg. for every frame scanning, electric signals respectively detected by photodetectors 17 and 18 are successively fetched into a computer 100, pseudo color processing into green and red is respectively performed and these signals are displayed on a monitor 101 while being overlapped.

Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 【発明の属する技術分野】本発明は、多重染色された蛍光試料を複数の励起波長を用いて励起して各励起波長に対応して発生した複数の蛍光を観察する走査型光学顕微鏡に関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] [Technical Field of the Invention The present invention comprises a plurality of fluorescence generated in response to the excitation wavelength to excite by using a plurality of excitation wavelengths the fluorescent sample which has been multiple staining It relates to a scanning optical microscope for observing a. 【0002】 【従来の技術】異なる蛍光色素により多重染色された試料を複数の励起波長で励起して、発生した複数の蛍光を複数の検出器で検出する走査型光学顕微鏡があり、例えばUSP5,127,730に開示されている。 [0002] excites multiple stained specimen at a plurality of excitation wavelengths by BACKGROUND ART different fluorescent dye, there is scanning optical microscope for detecting a plurality of fluorescence generated at a plurality of detectors, for example USP5, It is disclosed in 127,730. 【0003】図18に、そのスキャンヘッド部の概略構成を示す。 [0003] Figure 18 shows a schematic configuration of the scan head. 488nm、568nm、647nm等の波長を同時発振するクリプトンアルゴンレーザ501から発した多波長レーザ光を励起フィルタブロック502に入射して特定の励起波長を抽出する。 488 nm, 568 nm, and extracts a specific excitation wavelength multiwavelength laser beam emitted from the Krypton Argon laser 501 which simultaneously oscillates the wavelength incident on the excitation filter block 502, such as 647 nm. 励起フィルタブロック502で3種類の励起フィルタ503a,503 In the excitation filter block 502 three excitation filter 503a, 503
b,503cを選択的に光路上に配置することにより励起波長を切り換える。 b, switching the excitation wavelength by selectively placed on the optical path of 503c. 【0004】503aは、488nmと568nmを透過させる励起フィルタで、図19(1)の上段(二帯域励起)553a,553bにその透過特性を示している。 [0004] 503a is a excitation filter which transmits 488nm and 568 nm, the upper (bi-band excitation) of FIG. 19 (1) 553a, which shows the transmission characteristic 553b. また503bは、488nmの波長のみを透過させる励起フィルタで、図19(1)の中段(488DF1 Further 503b is in an excitation filter that transmits only wavelengths of 488 nm, the middle of FIG. 19 (1) (488DF1
0)551にその透過特性を示す。 0) 551 to indicate the transmission characteristics. また、503cは5 In addition, 503c 5
68nmの波長のみを透過させる励起フィルタで図19 Figure excitation filter that transmits only the wavelength of 68 nm 19
(1)の下段(568DF10)552にその透過特性を示す。 It shows the transmission characteristics in the lower part of (1) (568DF10) 552. 【0005】励起フィルタブロック502の一つの励起フィルタで抽出した励起波長をフィルタブロック#1に入射して検体505側へ反射させる。 [0005] incident one excitation wavelength was extracted with excitation filter of the excitation filter blocks 502 in the filter block # 1 is reflected to the specimen 505 side. フィルタブロック#1の2色ダイクロイックミラー504で、488nm In two colors dichroic mirror 504 of the filter block # 1, 488 nm
及び568nmの励起光を反射させ、第1,第2の試薬で多重染色した検体505に照射する。 And reflects the excitation light of 568 nm, is irradiated to the first, the sample 505 obtained by multiplexing stained with the second reagent. 2色ダイクロイックミラー504は図19(2)の555に示す透過特性を有しており、488nmのラインにより励起される第1の試薬から発せられた蛍光の500〜540nmの波長範囲と、568nmのラインにより励起される第2 The two-color dichroic mirror 504 has a transmission characteristic shown in 555 of FIG. 19 (2), the fluorescence emitted from the first reagent which is excited by the 488nm line with a wavelength range of 500~540Nm, the 568nm the excited by line 2
の試薬から発せられた蛍光の585〜650nmの波長範囲とを透過させる。 And it transmits the wavelength range of 585~650nm of fluorescence emitted from the reagent. 【0006】フィルタブロック#1を透過した蛍光をフィルタブロック#2に入射し、ダイクロイックミラー5 [0006] incident fluorescence transmitted through the filter block # 1 filter block # 2, the dichroic mirror 5
21により500〜540nmの光を反射させ検出器5 The 21 reflects light of 500~540nm detector 5
06に入射し、585〜650nmの光を透過させ検出器507に入射し、488nmと568nmの反射光はバリアフィルタ522,523によりカットされる。 Incident on 06, and incident on the detector 507 by transmitting light 585~650Nm, light reflected 488nm and 568nm is cut by the barrier filter 522 and 523. フィルタブロック#2内のダイクロイックミラー521の特性を図19(3)の上段(561)に、バリアフィルタ522,523の特性を図19(3)の中段(56 The characteristics of the dichroic mirror 521 of the filter block # 2 to the upper (561) of FIG. 19 (3), the middle of FIG. 19 (3) the characteristics of the barrier filter 522 and 523 (56
2)、下段(563)に示す。 2), it is shown in the lower part (563). 【0007】以上の構成により、励起フィルタ503a [0007] According to the above configuration, the excitation filter 503a
が光路中にある時は、2色ダイクロイックミラー504 There when in the optical path, two-color dichroic mirror 504
を、488nm、568nmのレーザー波長が図中下方に反射され、標本505に照射される。 The, 488 nm, laser wavelength of 568nm is reflected downward in the figure, it is irradiated on the specimen 505. この波長により励起され、標本に染色されている第1の試薬から発せられた蛍光のうち500〜540nmの範囲及び第2の試薬から発せられた蛍光の585〜650nmの範囲が、 Is excited by this wavelength, range of 585~650nm of fluorescence emitted from the range and the second reagent 500~540nm of fluorescence emitted from a first reagent that is stained specimen,
2色ダイクロイックミラー504を透過する。 It passes through the two-color dichroic mirror 504. そして、 And,
フィルタブロック#2のダイクロイックミラー521により500〜540nmの光は反射して検出器506で検出され、585〜650nmの光は透過して検出器5 Light of 500~540nm by the dichroic mirror 521 of the filter block # 2 is detected by the detector 506 after being reflected, the detector 5 light 585~650nm is transmitted through
07で検出される。 It is detected at 07. 【0008】そして、図示しないガルバノミラーにより、検体505を2次元的に走査し、各走査位置での検出光を電気信号に変換し、図示しないモニタ上に2次元像として表示することになる。 [0008] Then, by the galvanometer mirror (not shown) to scan the sample 505 two-dimensionally, converts the detected light at each scan position to an electrical signal, it will be displayed as a two-dimensional image on a monitor (not shown). その時、それぞれの検出器506,507により検出された信号を色分けして一つのモニタに表示することにより、第1の試薬と第2の試薬のそれぞれから発せられた蛍光を識別することが可能となる。 Then, by displaying the single monitor color-coded signal detected by the respective detector 506 and 507, you can identify the fluorescence emitted from each of the first reagent and the second reagent Become. 【0009】 【発明が解決しようとする課題】このように、従来は第1の試薬の発する蛍光の波長の500〜540nmの範囲を検出しているが、フレオレスセインの発する蛍光波長の範囲は500〜600nm以上まで分布しているので、長波長側蛍光は第1の試薬の発する蛍光として検出されるだけでなく、第2の試薬の発する蛍光(585〜 [0009] [Problems that the Invention is to Solve Thus, conventionally, detects the range of 500~540nm wavelength of the fluorescence emitted from the first reagent, the range of the fluorescence wavelength emitted by Fureoresusein is since distributed to more than 500 to 600 nm, the long wavelength side fluorescence is not only detected as fluorescence emitted from the first reagent, fluorescence emitted from the second reagent (585~
650nm)を検出すべき検出器507に混入されてしまう不具合がある。 There is a problem that would be mixed into the detector 507 to be detected 650 nm). この現象を一般に蛍光クロストークといい、2重染色標本を観察する時に短波長側の蛍光が長波長側の蛍光にかぶることが知られている。 This phenomenon generally referred to as fluorescence cross-talk, and fluorescence on the short wavelength side when observing double stained sample is known to wear the fluorescence of the long wavelength side. 【0010】この蛍光クロストークを完全に除去するには、励起フィルタ503bを光路に入れ、488nmのレーザ波長のみを用いて第1の試薬の発する蛍光のみを検出器506で検出して観察し、次に励起フィルタ50 [0010] To completely remove the fluorescent crosstalk, the excitation filter 503b placed in the optical path, and observed by detecting only the fluorescence emitted from the first reagent by using only the laser wavelength of 488nm at the detector 506, then excitation filter 50
3cを光路に入れ568nmのレーザ波長のみを用いて第2の試薬の発する蛍光のみを検出器507で検出して観察することになる。 3c will be observed only fluorescence emitted from the second reagent by using only the laser wavelength of 568nm was placed in the light path is detected by the detector 507 a. 【0011】なお、488nmで観察する時は、検出器507側にも第1の試薬の蛍光が混入してくる(585 [0011] Incidentally, when viewed in 488nm, even detector 507 side fluorescence of the first reagent coming mixed (585
nm以上の長波長側)ので、検出器507側の検出機能を停止するか、フィルタブロック#2のダイクロイックミラー521を全反射ミラーに変更し、すべての蛍光を検出器506側に反射させる必要が生じる。 Or longer wavelength side) so nm, either stop detection function of the detector 507 side, and change the dichroic mirror 521 of the filter block # 2 to the total reflection mirror, need to be reflected to the detector 506 side all fluorescence occur. この場合、 in this case,
568nmの観察時は、フィルタブロック#2のダイクロイックミラー521を取り去り、空穴にしておかなければならない。 When 568nm observations deprived dichroic mirror 521 of the filter block # 2, it must be kept empty hole. 【0012】上記したように、488nmと568nm [0012] As described above, 488nm and 568nm
による観察を2回に分けて行うと、2つの観察の間に時間的遅れを生じる。 Performed separately observation by twice, it produces a time delay between the two observations. 標本に動き等がある場合、この遅れにより正確な観察ができなくなる。 If there is motion such as the specimen, it can not be accurately observed by this delay. また、走査型光学顕微鏡の特徴である共焦点効果(光軸方向に分解能を持つ)を利用して、一平面走査観察後、ステージを移動させる等して焦点面を標本の厚さ方向に所定量ずらし、さらに一平面走査観察を行い、再び焦点面を所定量動かして一平面走査観察を行うという工程を繰り返し、厚さのある標本の断層像の観察を行う方法がある。 Further, the scanning optical is characteristic of the microscope using a confocal effect (with a resolution in the optical axis direction), Tokoro after one plane scanning observation, the focal plane by such moving the stage in the thickness direction of the specimen shifting quantification, further subjected to a plane scanning observation, there is a method of repeating the steps, to observe a tomographic image of the specimen with a thickness of performing a predetermined amount to move in one plane scan observe the focal plane again. 通常、このような観察をXYZ観察といい、焦点面の移動と、走査の繰り返し作業は、1つのコンピュータにより制御され、移動量(1回のずらし量)と移動範囲(総移動量) Usually indicates such observation and XYZ observation, the movement of the focal plane, the iterative process of scanning is controlled by a single computer, the amount of movement (one shift amount) and the movement range (total amount of movement)
を入力することにより、一連の作業を人手をかけることなく、コンピュータで行う。 By entering, without applying the hand a series of operations performed by a computer. 従って、488nmと56 Therefore, 488nm and 56
8nmによる観察を2回に分けて観察する場合、488 If you want to observe separately the observation by 8nm to 2 times, 488
nmで一連の観察を行った後、568nmで一連の観察を行うことになり、焦点移動回数が増えるのに応じて時間的な遅れが大きくなってしまう。 After a series of observations in nm, it will be a series of observations at 568 nm, time delay in response to the focus movement times more increases. また、焦点面移動機能の位置再現性が悪いと、488nmと568nmで、 Further, when the poor position repeatability of the focal plane shift function, in 488nm and 568 nm,
別の平面を観察してしまうことになる。 So that would observe a different plane. 【0013】本発明は、以上のような実情に鑑みてなされたもので、蛍光クロストークを除去できるとともに、 [0013] The present invention has been made in view of the above circumstances, it is possible to remove the fluorescence crosstalk,
複数の励起波長による各々の観察の時間的な遅れを抑えることのできる走査型光学顕微鏡を提供することを目的とする。 And to provide a scanning optical microscope which can reduce the time delay of each of the observation by a plurality of excitation wavelengths. 【0014】 【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達成するために以下のような手段を講じた。 [0014] According to an aspect of the invention took measures as described below in order to achieve the above object. 本発明は、標本を光ビームで走査する走査型光学顕微鏡において、2 The present invention provides a scanning optical microscope for scanning a sample with a light beam, 2
種以上の励起波長の中から1種づつ選択する波長選択手段及び前記2種以上の各々の励起波長により励起される各々の蛍光を、それぞれ所望の光検出器へ導く光路選択手段を設け、各々の励起波長及びその励起波長により励起される各々の蛍光をそれぞれ対応する光検出器へ導く励起波長及び光路の設定を走査に同期して1フレーム走査毎に、1ライン走査毎に又は1画素受光中に切り換えて各々の蛍光を対応する光検出器で検出する。 Each of the fluorescence excited by the wavelength selection means and the excitation wavelength of the two or more each for selecting one by one from a species or more excitation wavelengths, respectively provided an optical path selection means for guiding to a desired optical detectors, respectively the setting of the excitation wavelength and excitation wavelength and the optical path thereof leads to each of the fluorescence excited by the excitation wavelength to the corresponding optical detector in synchronization with each frame scan the scan, or one pixel receiving each line scan each of the fluorescence detected by the corresponding light detector is switched in. 【0015】本発明によれば、各々の励起波長とその励起波長により励起される各々の蛍光をそれぞれ対応する光検出器へ導くための励起波長及び光路の設定を走査に同期して1フレーム走査毎又は1ライン走査毎又は1画素受光中に切り換えて、2つ以上の蛍光色素により染色された標本の各々の蛍光を、個々に対応する光検出器で検出しているので、蛍光クロストークを完全に除去できるとともに、各励起波長による観察の時間的な遅れを極力少なく、またはなくすことができる。 According to the present invention, each of the excitation wavelength synchronization with one frame scanning fluorescence of each excited by the excitation wavelength corresponding set of excitation wavelength and the optical path for guiding to the photodetector to a scanning is switched in each or one line scan or every pixel receiving, each of the fluorescence of the stained sample by two or more fluorescent dyes, since the detection by the photodetector corresponding to each, the fluorescence crosstalk together can be completely removed, the time delay of the observation with the excitation wavelength can be minimized or eliminated. 【0016】波長選択手段及び光路選択手段を回転板の単体で構成する。 [0016] constituting the wavelength selection means and the optical path selection means alone of the rotating plate. 光源から標本に至る光路と標本から発した蛍光の通過する蛍光光路とを同時に遮る回転板を配置し、当該回転板において光源から標本に至る光路が遮られる部分を含む同一円上に各々波長帯域の異なる励起波長が通過する励起フィルターを設け、回転板において蛍光光路が遮られる部分を含む同一円上であって各励起フィルターが光路上に配置されたときに蛍光光路を遮る各々の位置にそのとき光路上に配置された励起フィルターに対応した検出器へ蛍光を導く反射ミラー又は空穴を設ける。 The rotary plate that blocks the fluorescent light path simultaneously passing the fluorescent light emitted from the light path and the sample reaching the specimen from a light source is provided, each wavelength band on the same circle that includes a portion where the light path to the sample from a light source in the rotating plate is blocked the excitation filter to different excitation wavelengths to pass through a provided that the position of each block the fluorescence light path when the excitation filter be on the same circle including the portion fluorescence light path is blocked is arranged on the optical path in a rotating plate when providing the reflecting mirror or an empty hole guides the fluorescence to the detector that corresponds to the excitation filter positioned on the optical path. 【0017】この発明によれば、回転板を回転させることにより励起波長選択と光路選択とが機械的に連動するので高速切換えが可能になる。 According to the present invention, the excitation wavelength selection and an optical path selected by rotating the rotation plate to allow fast switching because mechanically interlocked. 波長選択手段及び光路選択手段をガルバノミラー、音響光学偏向素子等の偏向素子を用いて構成する。 Galvanomirror wavelength selection means and the optical path selection means, constructed using deflector element such as acousto-optic deflector. 波長選択手段は、各々波長帯域の異なる励起波長が通過する複数の励起フィルターと、光源側から入射する光ビームを偏向させていずれかの励起フィルターへ入射する偏向素子とを含んだ構成とし、光路選択手段は、標本から入射する蛍光をその励起波長に対応した検出器へ導くように偏向させる偏向素子を含んだ構成とする。 Wavelength selection means, respectively and a plurality of excitation filters having different excitation wavelengths wavelength band passes, a light source including a deflecting element that is incident on either of the excitation filter to deflect the light beam incident from the side structure, the optical path selecting means configured including a deflecting element for deflecting to direct to the detector that corresponds to the fluorescence incident from the sample to the excitation wavelength. 【0018】 【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態について説明する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Hereinafter, will be described embodiments of the present invention. (第1の実施の形態)図1(a)に実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成を示している。 Shows an overall configuration of a scanning optical microscope according to the First Embodiment Embodiment in Figure 1 (a). 【0019】この走査型光学顕微鏡は、クリプトンアルゴンレーザ1で488nm、568nm等の波長を発振し、クリプトンアルゴンレーザ1の発振したレーザ光をビームエクスパンダ2で所望のビーム径に拡大して反射ミラー3によって488nm又は568nmの波長を選択するターレット4に入射している。 [0019] The scanning optical microscope, 488 nm krypton argon laser 1 oscillates a wavelength such as 568 nm, reflecting the enlarged laser light oscillated krypton argon laser 1 at beam expander 2 into a desired beam diameter mirror It is incident on turret 4 to select a wavelength of 488nm or 568nm by 3. 【0020】図1(b)にターレット4を同図(a)に示す矢印5方向から見た平面図を示している。 [0020] The turret 4 in FIG. 1 (b) shows a plan view seen from the arrow 5 direction shown in the diagram (a). ターレット4は、2つの励起フィルタ4a,4d及び反射ミラー4c、空穴4bを持つ回転板で構成されており、モータ102により回転制御される。 Turret 4, two excitation filters 4a, 4d and the reflecting mirror 4c, is constituted by the rotating plate with an empty hole 4b, controlled to rotate by a motor 102. 励起フィルタ4aは48 Excitation filter 4a 48
8nm、励起フィルタ4dは568nmをそれぞれ透過させる特性を持つ。 8 nm, excitation filter 4d has the property of each transmit 568 nm. 【0021】励起フィルタ4aと反射ミラー4cとは回転軸を挟んで対称位置に配置され、励起フィルタ4dと空穴4bとは回転軸を挟んで対称位置に配置され、さらに励起フィルタ4aと励起フィルタ4dとは90度の角度でずれている。 [0021] The excitation filter 4a and the reflection mirror 4c disposed at symmetrical positions across the rotation axis, the excitation filter 4d and Soraana 4b disposed at symmetrical positions across the rotation axis, further the excitation filter 4a excitation filter It is displaced at an angle of 90 degrees and 4d. 【0022】ターレット4の励起フィルタで抽出した励起波長を励起ダイクロイックミラー6で反射させて走査光学系7に導いている。 [0022] The excitation wavelength was extracted with excitation filter of the turret 4 is reflected by the excitation dichroic mirror 6 are guided to the scanning optical system 7. なお、励起ダイクロイックミラー6は図19(2)に示す特性を持ち、488nmと5 Incidentally, the excitation dichroic mirror 6 has the characteristics shown in FIG. 19 (2), 488 nm and 5
68nmを反射し、フレオレスセインより発する蛍光(500〜540nm)とTEXAS RED TMより発する蛍光(585nm以上)を透過する特性を持つ。 It reflects 68 nm, with the property of transmitting the fluorescence emitted from Fureoresusein (500~540Nm) and TEXAS RED emit fluorescence (or 585 nm) than TM. 【0023】走査光学系7はX,Yの2次元に光ビームを走査する偏向光学素子として1組のガルバノメータスキャナミラーで構成されており、これらのスキャナミラーは瞳投影レンズ9、結像レンズ10により対物レンズ11の瞳と共役関係になっている。 The scanning optical system 7 is X, is composed of a pair of galvanometer scanner mirror as the optical deflector for scanning the light beam in the two-dimensional Y, these scanners mirrors pupil projection lens 9, the imaging lens 10 It has become a pupil conjugate with the objective lens 11 by. 走査光学系7でX, X in the scanning optical system 7,
Y方向に偏向させた光ビームをミラー8を介して瞳投影レンズ9に入射する。 The light beam is deflected in the Y direction through the mirror 8 is incident on the pupil projection lens 9. 12は標本、13はステージを示している。 12 specimens, 13 shows the stage. 【0024】また、励起ダイクロイックミラー6の走査光学系7側からみて透過側には結像レンズ14を配置している。 [0024] are disposed an imaging lens 14 to the permeate side as viewed from the scanning optical system 7 side of the excitation dichroic mirror 6. 結像レンズ14でミラー15を介して焦点ピンホール16上にビームを結像させる。 Focusing the beam onto the focal pinhole 16 via the mirror 15 by the imaging lens 14. 17,18は光検出器を示し、488nm及び568nmの不要な反射光をカットするバリアフィルタ19,20がそれぞれ前面に配置される。 17 and 18 represents a photodetector, a barrier filter 19 and 20 to cut the unnecessary reflected light of 488nm and 568nm are arranged on the front surface, respectively. 【0025】コンピュータ100は、ターレット4のモータ102と走査光学系7のミラー駆動部とを設定に基づいて制御する。 [0025] Computer 100 is controlled based on the setting of the motor 102 of the turret 4 and the mirror drive unit of the scanning optical system 7. 例えば、走査光学系7で1フレーム毎にターレット4を90度回転させる。 For example, the turret 4 is rotated 90 degrees for every one frame scanning optical system 7. このような走査光学系7とターレット4との連動関係をコンピュータ10 Such scanning optical system 7 and the computer 10 the interlocking relationship between the turret 4
0によって管理している。 It is managed by 0. また、コンピュータ100は光検出器17,18から出力される信号をカラー処理してモニタ101にカラー表示させる機能を備える。 The computer 100 has a function to be color displayed on the monitor 101 by a signal output from the photodetector 17 and color processing. 【0026】次に、以上のように構成された走査型光学顕微鏡の動作について説明する。 Next, the operation of the configured scanning optical microscope as described above. 図1に励起波長488 Excitation wavelength in Figure 1 488
nmによりフレオレスセインを励起し、その蛍光を検出している状態を示し、図2に568nmによりTEXA nm by exciting the Fureoresusein, shows a state of detecting the fluorescence, TEXA by 568nm 2
S RED TMを励起し、その蛍光を検出している状態を示している。 Exciting the S RED TM, shows a state of detecting the fluorescence. 【0027】図1に示すように、ターレット4は488 As shown in FIG. 1, the turret 4 is 488
nmに透過特性を持つ励起フィルタ4aが反射ミラー3 Excitation filter 4a is a reflecting mirror having a nm in transmission characteristic 3
と励起ダイクロイックミラー6との間の光路上に配置され、反射ミラー4cが焦点ピンホール16を通過した光の進行路上に配置されている。 Excitation dichroic disposed on the optical path between the dichroic mirror 6, the reflecting mirror 4c is disposed in the traveling path of the light passing through the focal pinhole 16 and. 図1においては、クリプトンアルゴンレーザ1を発振したレーザ光はビームエクスパンダ2により所望の径に拡大され、ミラー3で下方に反射される。 In Figure 1, the laser light oscillated krypton argon laser 1 is expanded to a desired diameter by a beam expander 2 and is reflected downward by the mirror 3. そして、ターレット4上の励起フィルタ4aにより488nmの波長が選択される。 The wavelength of 488nm is selected by the excitation filter 4a on the turret 4. そして、励起ダイクロイックミラー6で反射して走査光学系7を通ってからミラー8で反射して瞳投影レンズ9から結像レンズ10を通り、対物レンズ11により標本12上にビームスポットとして結像する。 Then, the excitation dichroic from through the scanning optical system 7 and is reflected by dichroic mirror 6 is reflected by the mirror 8 passes through the imaging lens 10 from the pupil projection lens 9 and focused as a beam spot on the specimen 12 by the objective lens 11 . 【0028】そして、標本12上のフレオレスセインにより発せられた蛍光が、前記光路を逆にたどり励起ダイクロイックミラー6を透過する。 [0028] Then, the fluorescence emitted by Fureoresusein on the specimen 12 is transmitted through the excitation dichroic mirror 6 follows the light path in reverse. 励起ダイクロイックミラー6を透過した蛍光が結像レンズ14、ミラー15を介して共焦点ピンホール16を通過する。 Fluorescence transmitted through the excitation dichroic mirror 6 passes through the imaging lens 14, a confocal pinhole 16 through the mirror 15. このとき、この蛍光の進行路上にはターレット4上のミラー4cが配置されているので、ミラー4cで反射されバリアフィルタ19で488nmの反射光をカットされた後、光検出器17で検出される。 At this time, since the mirror 4c on the turret 4 is in the traveling path of the fluorescence is placed, after being cut reflected light 488nm barrier filter 19 is reflected by a mirror 4c, is detected by the photodetector 17 . 【0029】走査光学系7を構成するガルバノメータスキャナミラーを振ることにより、光ビームを標本12上で2次元方向に走査することになり、各走査位置においての光検出器17により検出される光量を電気信号に変換する。 [0029] By shaking the galvanometer scanner mirrors constituting the scanning optical system 7, will be scanned in two-dimensional directions of the light beam on the specimen 12, the amount of light detected by the light detector 17 for each scanning position and converts it into an electrical signal. 【0030】以上のように、図1の状態でXY方向に1 [0030] As described above, in the XY direction in a state of FIG. 1 1
回走査し、フレオレスセインより発した蛍光を、光検出器17で検出した直後にコンピュータ100からの指示でモータ102によりターレット4を90度回転させ、 Scan times, the fluorescence emitted from Fureoresusein, the turret 4 is rotated 90 degrees by the motor 102 by an instruction from the computer 100 immediately after detected by the photodetector 17,
568nmを選択する励起フィルタ4dと空穴4bを各光路上に配置させる。 The excitation filter 4d and Soraana 4b for selecting the 568nm is placed in each optical path. 【0031】図2はターレット4を図1の状態から90 [0031] Figure 2 is a turret 4 from the state shown in FIG. 1 90
度回転させた状態を示している。 It shows a state obtained by degrees rotation. このような状態でクリプトンアルゴンレーザ1を発振した波長のうち568n 568n of wavelengths oscillated krypton argon laser 1 in this state
mの波長が励起フィルタ4dにより選択され励起ダイクロイックミラー6を反射し標本12上にビームスポットとして結像する。 Wavelength of m is imaged as a beam spot on the reflecting sampled 12 selected the excitation dichroic mirror 6 by the excitation filter 4d. そして、標本12上のTEXASRE Then, TEXASRE on the specimen 12
TMにより発せられた蛍光が励起ダイクロイックミラー6を透過し、結像レンズ14、ミラー15を介して共焦点ピンホール16を通過する。 Fluorescence emitted by D TM is transmitted through the excitation dichroic mirror 6, passes through the confocal pinhole 16 through the imaging lens 14, a mirror 15. このとき、蛍光の光路上にはターレット4上の空穴4bが配置されているので、 At this time, since the turret 4 empty hole 4b is disposed on the optical path of the fluorescence,
ターレット4上の空穴4bを透過し、バリアフィルタ2 It passes through the turret 4 empty holes 4b, the barrier filter 2
0で568nmの反射光をカットされ光検出器18で検出される。 0 is cut reflected light 568nm in and detected by the photodetector 18. 【0032】ここでも、走査光学系7のガルバノメータスキャナミラーを振ることで、光ビームを標本12上で2次元に走査し、各走査位置において光検出器18により検出される光量を電気信号に変換してコンピュータ1 [0032] Again, by shaking the galvanometer scanner mirror of the scanning optical system 7, and two-dimensionally scanned light beam on the specimen 12, converts the amount of light detected by the photodetector 18 into an electric signal at each scanning position and computer 1
00に入力する。 00 to enter into. 【0033】図1、図2に示した2つの工程を走査光学系7の走査に同期して、1フレーム走査毎にターレット4を90度回転させることにより行い、光検出器17, [0033] Figure 1, in synchronism with two steps shown in FIG. 2 in the scanning of the scanning optical system 7, carried out by rotating the turret 4 90 degrees every frame scan, the photodetector 17,
18で検出した電気信号をコンピュータ100に順次取り込む。 Sequentially captures the electrical signal detected at 18 to the computer 100. そして、たとえば、光検出器17によるものを緑色に光検出器18によるものを赤色に疑似カラー処理してモニタ101上に重ねて表示する。 Then, for example, as by the photodetector 17 to green as by the photodetector 18 and the pseudo-color processing on the red display superimposed on the monitor 101. 【0034】このような実施の形態によれば、走査光学系7で1フレーム走査を行い、フレオレスセインの発した蛍光を光検出器17で取得した直後に励起フィルタ4 According to this embodiment performs a one-frame scanning by the scanning optical system 7, excitation filter immediately after obtaining the emitted fluorescence of Fureoresusein the photodetector 17 4
a,4dと光検出器17,18への光路の設定を切り換えて、もう一度、1フレーム走査を行い、TEXAS a, change the setting of the optical path to 4d and the light detector 17 and 18, again, for 1 frame scan, TEXAS
RED TMの発した蛍光を光検出器18で取得しているので、フレオレスセインの発した蛍光は光検出器18側にかぶる(混入する)ことなく光検出器17で検出され、 Since the fluorescent light emitted for RED TM are acquired by the photodetector 18, the fluorescence emitted in Fureoresusein is wear to the photodetector 18 side (mixing) is detected by the photodetector 17 without,
またTEXAS RED TMの発した蛍光もすべて光検出器18で検出されるので、蛍光クロストークを完全に除去できる。 Since all even fluorescence emitted of TEXAS RED TM is detected by the photodetector 18, it can be completely removed fluorescence crosstalk. また、ターレット4を回転させるだけで使用する励起波長と検出器を簡単に切換えることができるので、フレオレスセインとTEXAS RED TMの観察の時間差を極力少なくできる。 Further, it is possible to switch only the excitation wavelengths used and the detector simply by rotating the turret 4 can minimize the time difference observations Fureoresusein and TEXAS RED TM. 【0035】(第2の実施の形態)標本を光軸方向の複数のスライス面でスライスしたスライス画像を取得する共焦点走査型レーザ顕微鏡において、各スライス面で1 [0035] In confocal laser scanning microscope (the second embodiment) samples to obtain the sliced ​​slice images in a plurality of slice plane in the optical axis direction, each slice plane 1
フレーム走査毎に第1の実施の形態と同様の2波長切り換え観察を行う。 It performs the same two wavelengths switching observation in the first embodiment for each frame scan. 【0036】この実施の形態は、さらにステージ13を光軸方向に一平面の観察毎に移動させる観察方法(XY [0036] In this embodiment, the observation method (XY for further moving the stage 13 in each of the one plane observed in the optical axis direction
Z観察)を実現するXYZ観察プログラムをコンピュータ100に登録しておく。 It registers the XYZ observation program for realizing the Z observation) to the computer 100. 【0037】図3(a)は標本12の上部を観察するときの状態を示しており、21がその観察面となっている。 [0037] FIG. 3 (a) shows a state when viewing the top of the specimen 12, 21 has become the observation plane. 観察面21に焦点を合わせた状態で、ターレット4 In the viewing surface 21 focused state, the turret 4
を回転させて図1に示す状態にする。 The rotated to the state shown in FIG. そして、励起フィルタ4aで抽出した488nmの励起光を標本12に照射して蛍光を発生させると共に、走査光学系7で観察面21を1フレーム分走査する。 Then, by irradiating the excitation light 488nm extracted with excitation filter 4a to the sample 12 with generating a fluorescence is one frame scanning the observation surface 21 in the scanning optical system 7. 標本12上のTEXAS TEXAS on the specimen 12
RED TMにより発せられた蛍光は、ダイクロイックミラー27を透過し、ミラー15、4cを介して光検出器17で検出される。 Fluorescence emitted by RED TM is transmitted through the dichroic mirror 27, it is detected by the photodetector 17 through the mirror 15,4C. 1フレーム走査が終了したら、即座にターレット4を90度回転させて励起フィルタ4dで抽出した568nmの励起波長を標本12に照射して蛍光を発生させると共に、走査光学系7で同一観察面21 When one frame scanning is completed, immediately causes the turret 4 generate fluorescence by irradiation with excitation wavelength of 568nm which was extracted with excitation filter 4d is rotated 90 degrees to the sample 12, the same observation plane in the scanning optical system 7 21
を1フレーム走査する。 The one frame scanning. 標本12上のTEXAS RE TEXAS RE on the specimen 12
TMにより発せられた蛍光は、ダイクロイックミラー2 Fluorescence emitted by D TM is a dichroic mirror 2
7を透過し、ミラー15、空孔4bを介して光検出器1 7 is transmitted through the mirror 15, the photodetector 1 through the holes 4b
8で検出される。 It is detected at 8. この結果、コンピュータ100に観察面21を2波長で走査した2つの画像が取得されたことになる。 As a result, the observation plane 21 to the computer 100 two images scanned at 2 wavelengths are acquired. 【0038】次にステージ13を上方へ移動し、図3 [0038] Then moving the stage 13 upward, FIG. 3
(b)の状態とする。 The state of (b). この状態では標本12の中心部2 Central portion 2 of the specimen 12 in this state
2が観察面となっている。 2 is in the observation plane. 観察面22に焦点を合わせた状態で、励起フィルタ4aで抽出した488nmの励起光を標本12に照射し、走査光学系7で観察面22を1 In the viewing surface 22 focused state, irradiated with excitation light of 488nm which was extracted with excitation filter 4a to the specimen 12, the viewing surface 22 by the scanning optical system 7 1
フレーム分走査したら、即座にターレット4を90度回転させて励起フィルタ4dで抽出した568nmの励起波長を標本12に照射して同一観察面22を1フレーム走査することにより、上記と同様に488nmの励起光による標本12からの蛍光は光検出器17で検出され、 After scanning frames immediately by the turret 4 to 1 frame scan the same observation plane 22 is irradiated with an excitation wavelength of 568nm which was extracted with excitation filter 4d is rotated 90 degrees to the sample 12, of 488nm in the same manner as described above fluorescence from the specimen 12 by the excitation light is detected by a photodetector 17,
568nmの励起光による標本12からの蛍光は検出器18で検出される。 Fluorescence from the specimen 12 by the excitation light of 568nm is detected by the detector 18. この結果、コンピュータ100に観察面22を2波長で走査した2つの画像が取得されたことになる。 This results in the observation plane 22 to the computer 100 two images scanned at 2 wavelengths are acquired. 【0039】さらにステージ13を上方へ移動し、図3 The further moving the stage 13 upward, FIG. 3
(c)の状態とする。 The state of (c). この状態では標本12の下部23 Lower 23 specimens 12 in this state
が観察面となる。 But the observation plane. 観察面23に焦点を合わせた状態でも、上記同様に走査光学系7の走査とターレット4の回転動作とを連動させて2波長観察して観察面23の2つの画像を取得する。 At the viewing surface 23 focused state, it acquires two images of the same scanning optical system 7 scan and in conjunction with the rotation of the turret 4 2 wavelengths observed by viewing surface 23. 【0040】以上の一連の動作をコンピュータ制御で行うことにより、蛍光クロストークを完全に除去でき、かつ2種の蛍光取得の時間的な遅れを極力、少なくした2 [0040] By performing a series of operations of the computer control, the fluorescence crosstalk can be completely removed, and the two fluorescent obtain the time delay as much as possible, and less 2
種染色標本のXYZ観察が可能となる。 It is possible to XYZ observation of species stained sample. 標本のXYZ観察方法としては、ステージ移動方式の他に、対物レンズをZ方向に移動させながらステージをXY方向に移動させることもできる。 The XYZ observation method of the specimen, in addition to the stage moving system, it is also possible to move the stage while moving the objective lens in the Z direction in the XY direction. またフォーカルな光学系の光路中に焦点距離を補正する厚さの異なる複数の光路長補正板を選択挿入できるようにすることもできる。 It is also possible to be able to select insert multiple optical path length correction plate having different thicknesses for correcting the focal length in the optical path of the focal optics. 【0041】(第3の実施の形態)所定の時間間隔毎に一平面の観察画像を取り込んで標本の時間的な変化を追うXYZ観察に、第1の実施の形態で示した工程を適用する。 [0041] (Third Embodiment) captures one surface of the observed image at predetermined time intervals follow a temporal change of a sample XYZ observation applies the process shown in the first embodiment . 【0042】この実施の形態は、走査型光学顕微鏡を第1の実施の形態と同様に構成し、XYZ観察を実現する観察プログラムをコンピュータ100に登録する。 [0042] In this embodiment, the scanning optical microscope configured similarly to the first embodiment, registers the observing program for realizing the XYZ observed computer 100. 今、 now,
コンピュータ100により入力されたインターバル(時間間隔)をt分とする。 The input interval (time interval) and t minutes by the computer 100. まず、第1の実施の形態と同様にして、ターレット4の回転と走査光学系7の動作とを連動させて1フレーム走査毎に励起波長を切り換えて、 First, as in the first embodiment, by switching the excitation wavelength for each frame scan in conjunction with the operation of rotating a scanning optical system 7 of the turret 4,
フレオレスセインの発した蛍光と、TEXAS RED And the fluorescent light emitted from the Fureoresusein, TEXAS RED
TMの発した蛍光とを順次取得し、1回の画像取得工程を終了する。 Sequentially acquires the fluorescence emitted in the TM, completed one of the image acquisition process. 【0043】次に、前回の画像取得完了からt分経過後に、再び上記同様の手法によりフレオレスセイン、TE Next, after t minutes elapsed from the previous image acquisition completion, again by the same method Fureoresusein, TE
XAS RED TMの発した蛍光を順次取得する。 Sequentially acquires fluorescence emitted in XAS RED TM. このような処理をコンピュータ100の管理下でt分毎に実行し、予めコンピュータ100に指定された回数だけ繰り返す。 Such processing was executed every t minutes under the control of the computer 100 is repeated the number of times specified in advance in the computer 100. これにより、蛍光クロストークがなく、かつ2種の蛍光取得の時間的な遅れを極力、少なくした2重染色標本のXYZ観察が可能となる。 This eliminates the fluorescence crosstalk, and two fluorescent obtain the time delay as much as possible, it is possible to XYZ observation of double staining specimens less. 【0044】(第4の実施の形態)光源に488nmを発振するアルゴンレーザと700nmの赤外光をパルス状に発振するレーザを用いることで、赤外のパルスレーザを走査型光学顕微鏡に適用し、赤外のパルスレーザを集光させることで2光子励起を発生させるものである。 [0044] By using a laser that oscillates infrared light an argon laser and 700nm for oscillating a 488nm (Fourth Embodiment) light source in a pulsed manner, by applying the pulsed laser outside red scanning optical microscope it is intended to generate a two-photon excitation by focusing the pulsed laser infrared. 【0045】UV光により励起され450nm近辺の蛍光を発する色素DAPIに700nmの赤外パルスレーザを照射して励起すると、450nm近辺の蛍光を発することができる。 [0045] When excited by irradiating a fluorescent 700nm infrared pulse laser of the dye DAPI that emits in the vicinity of 450nm is excited by the UV light, it can emit fluorescence in the vicinity of 450nm. このような赤外のパルスレーザを集光させる2光子励起では赤外光で集光しているので厚みのある標本内の屈折による結像性能の劣化が起きにくいというメリットがある。 Such a infrared photon excitation for focusing a pulsed laser is advantageous in that deterioration of the imaging performance due to refraction of the specimen with a thickness hardly occurs because the condensed infrared light. 【0046】図4は、本実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図であり、図1及び図2に示したものと同じ機能の部位には同一符号を付けている。 [0046] Figure 4 is a diagram showing a configuration of a scanning optical microscope according to the present embodiment, they are given the same reference numerals to portions having the same functions as those shown in FIGS. この実施の形態は、488nmを発振するアルゴンレーザ24からのレーザ光と700nmのパルスを発振するパルスレーザ25からのレーザ光とを、488nmを反射し70 This embodiment reflects the laser beam, a 488nm from the pulse laser 25 that oscillates a pulse of laser light and 700nm from an argon laser 24 for oscillating 488nm 70
0nmを透過させる特性を持つダイクロイックミラー2 A dichroic mirror 2 having a property of transmitting 0nm
6により一つの光路上に導いている。 It has led to one of the optical path by 6. 【0047】また、ターレット4上に700nmのパルスレーザを選択する励起フィルタ4eが備えられている。 Further, the excitation filter 4e are provided for selecting a pulse laser of 700nm on turret 4. 励起ダイクロイックミラー27の特性は、図6に示すように488nmと700nmを反射し、それ以外の波長を透過するようになっている。 Characteristics of the excitation dichroic mirror 27 is adapted to reflect 488nm and 700nm as shown in FIG. 6, it transmits other wavelengths. 【0048】また、光検出器18の前面に568nmの反射光をカットするバリアフィルタ20に代えて、70 [0048] In place of the barrier filter 20 for cutting the reflection light 568nm in front of the optical detector 18, 70
0nmの反射光をカットするバリアフィルタ28を備えている。 And a barrier filter 28 for cutting the reflection light of 0 nm. 標本29はDAPI及びフレオレスセインで2 Specimen 29 is 2 with DAPI and Fureoresusein
重染色されている。 It is heavy staining. 【0049】次に、この実施の形態の動作について説明する。 Next, the operation of this embodiment. まず、図4の状態にターレット4を位置させることにより、光路上に488nmの励起フィルタ4aとミラー4cを配置し、アルゴンレーザ24より発振した4 First, by positioning the turret 4 to the state of FIG. 4, the excitation filter 4a and the mirror 4c of 488nm was disposed on the optical path, and oscillated from the argon laser 24 4
88nmのレーザ光を用いて、フレオレスセインの発する蛍光を光検出器17側で検出する。 Using a laser beam of 88 nm, detecting the fluorescence emitted from the Fureoresusein the photodetector 17 side. 【0050】そして、1フレーム走査後にターレット4 [0050] Then, the turret 4 after one frame scanning
をモータ102により90°回転させ、光路上に励起フィルタ4e及び空穴4bを配置させる。 The the motor 102 rotate 90 °, to arrange the excitation filter 4e and Soraana 4b on the optical path. これにより、赤外パルスレーザ25の発振した700nmのパルスレーザを標本29に導く。 Thus, directing a pulsed laser having the 700nm infrared pulse laser 25 to the specimen 29. DAPIより発した蛍光は、励起ダイクロイックミラー27を透過して、ターレット4の空穴4bを通り、光検出器18で検出される。 Fluorescent light emitted from DAPI is transmitted through the excitation dichroic mirror 27, passes through the air hole 4b of the turret 4, is detected by the photodetector 18. 【0051】ここで、通常、対物レンズ11は、700 [0051] In this case, usually, the objective lens 11, 700
nmの赤外領域までは収差補正されていない。 nm is up to the infrared region are not aberration correction. したがって、700nmのパルスレーザを用いた場合と488n Therefore, when a pulse laser of 700nm and 488n
mのアルゴンレーザを用いた場合とでは、対物レンズ1 In the case of using an argon laser of m, the objective lens 1
1の焦点面がずれる現象が生じる。 Phenomenon that the focal plane of 1 is shifted occurs. 図5に焦点面がずれる状況を拡大して示している。 Shows an enlarged conditions deviate the focal plane in FIG. 【0052】コンピュータ100は、488nmの観察から700nmの観察に切りかえる時(ターレット4を90°回転させた時)に、ステージ13を移動させて4 [0052] Computer 100 is, when switched to 700nm observations from 488nm observation (when the turret 4 is rotated 90 °), by moving the stage 13 4
88nmの観察面と700nmの観察面のズレδを補正する。 To correct the deviation δ of the observation plane and 700nm of the observation plane of 88 nm. 【0053】このようにして得られた画像をフレオレスセインの発する蛍光を緑、DAPIの発する蛍光を水色のように色分けし、重ねてモニタ101に表示することにより、蛍光クロストークがなく、また2種の蛍光の観察の時間的遅れを、極力少なくでき、かつ赤外レーザとアルゴンレーザの対物レンズの収差による焦点面のズレが生じない観察ができる。 [0053] green fluorescence emitted image obtained in this manner of Fureoresusein, the fluorescence emitted by DAPI color-coded as blue, superimposed by displaying on the monitor 101, no fluorescence crosstalk, also the time delay of the two fluorescent observation, as much as possible can be reduced, and displacement of the focal plane due to the aberration of the infrared laser and argon laser of the objective lens can observe not occur. 【0054】なお、ステージ13の制御で焦点面のずれを補正するのではなく、光路に対して光路長補正板を挿入することによっても同様の効果を奏することができる。 [0054] Incidentally, instead of correcting the deviation of the focal plane in the control of the stage 13, it is possible to achieve the same effect by inserting the optical path length correction plate relative to the optical path. 例えば、瞳投影レンズ9から結像レンズ10の間のフォーカル光学系中(集光点を除く)に焦点面のずれ量を補正可能な厚さを有する光路長補正板を挿脱自在に設け、レーザ切換えに連動して挿脱させる。 For example, it provided the optical path length correction plate having a focal optical system in the deviation amount correctable thickness of the focal plane (excluding the converging point) between the imaging lens 10 to be freely inserted and removed from the pupil projection lens 9, to be inserted and removed in conjunction with the laser switching. 【0055】(第5の実施の形態)複数の励起フィルターとそれら励起フィルターに対応した反射ミラー及び空穴とをそれぞれ異なる円周上に配置したターレットを使用して励起波長及び光路の切換えを行う。 [0055] for switching the excitation wavelength and the optical path using the Fifth Embodiment plurality of excitation filters and turret reflecting mirror and the air holes are arranged in different circumferentially respectively corresponding to their excitation filter . 【0056】図7,図8に実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成(結像レンズ9からステージ13までは省略してあるが第1の実施の形態と同一構成をなす) [0056] Figure 7, (forming the same configuration as it is omitted the first embodiment from the imaging lens 9 to stage 13) overall configuration of a scanning optical microscope according to the embodiment in FIG. 8
を示している。 The shows. 図1、図2に示す顕微鏡と同じ機能を有する部位には同一符号を付している。 1 are denoted by the same reference numerals to portions having the same functions as the microscope shown in FIG. 第1の実施の形態と同様に、488nmと568nmの波長を発振するクリプトンアルゴンレーザ1により、フレオレスセインとTEXSA RED Like the first embodiment, the krypton argon laser 1 oscillates a wavelength of 488nm and 568 nm, Fureoresusein and TEXSA RED
TMで2重染色標本を観察するもので、励起ダイクロイ But to observe the double staining specimens TM, excitation Daikuroi
ックミラー6、バリアフィルタ19,20は第1の実施 Kkumira 6, the barrier filter 19, 20 first embodiment
の形態と同じものを用いている。 It is used the same as those of the embodiment. 【0057】本実施の形態では、ターレット31上に図 [0057] In the present embodiment, FIG on the turret 31
7(b)に示すように45°間隔で4コづつ交互に48 7 48 4 U increments alternately at 45 ° intervals as shown in (b)
8nm選択の励起フィルタ31a(☆印)と、568n And 8nm selection of excitation filter 31a (☆ mark), 568n
m選択の励起フィルタ31b(*印)を同心円上に配置 m selection of excitation filter 31b (* mark) arranged concentrically the
し、その外側に488nmにより励起されフレオレスセ And, Fureoresuse excited by 488nm on the outside
インより発した蛍光を光検出器17へ導くミラー31c Mirror 31c for guiding the fluorescent light emitted from the Inn to the photodetector 17
(+印4ケ所)と、568nmにより励起されTEXA And (+ mark 4 places), it is excited by the 568nm TEXA
S RED TMより発した蛍光を光検出器18へ導く空穴31d(△印4ケ所)とを同じ45度間隔で交互に同じ同心円状に配置している。 They are arranged in S RED directing fluorescent light emitted from the TM to the photodetector 18 Soraana 31d (△ mark X4) and the same concentrically alternately at the same intervals of 45 degrees. 【0058】図7には励起光照明光路上に488nmを選択する励起フィルタ31aが配置され、光検出器17 [0058] FIG. 7 is arranged excitation filter 31a for selecting the 488nm excitation light illumination light path is, the photodetector 17
へ蛍光を導くミラー31cが光路上に配置され、フレオレスセインの発する蛍光を光検出器17で検出する状態を示している。 Mirror 31c for guiding the fluorescence is disposed on the optical path, and shows a state of detecting the fluorescence emitted from the Fureoresusein by the photodetector 17 to. 【0059】また図8には、励起光照明光路上に568 [0059] Figure 8 is also in the excitation light illumination optical path 568
nmを選択する励起フィルタ31bが配置され、光検出器18へ蛍光を導く空穴31dが光路上に配置されて、 Excitation filter 31b for selecting nm is disposed Soraana 31d for guiding the fluorescence to the light detector 18 is disposed on the optical path,
TEXAS RED TMの発する蛍光を光検出器18で検出する状態を示している。 The fluorescence emitted from the TEXAS RED TM shows a state to be detected by the light detector 18. 【0060】ターレット31を連続的に回転させることにより高速で図7と図8の状態(フレオレスセイン又はTEXAS RED TMの観察)を切りかえることができる。 [0060] the state of FIG. 7 and FIG. 8 at a high speed by continuously rotating the turret 31 (Fureoresusein or TEXAS RED TM observation) can be switched to. 走査光学系7は、Xガルバノミラー7aを高速で画面水平方向に走査し、Yガルバノミラー7bをXガルバノミラー7aが水平方向1ライン走査する毎にY方向1 Scanning optical system 7, X galvanometer mirror 7a is scanned in the horizontal direction of the screen at a high speed, Y direction 1 Y galvanometer mirror 7b for each of X galvanometer mirror 7a is horizontal line scan
ピクセル(画素)分動かす。 Moving pixels (pixels). また、モニター101の解像度に合わせてX,Yガルバノミラー7a,bの走査と光検出器17,18の検出タイミングを決めている。 Also determines the detection timing of in accordance with the resolution of the monitor 101 X, Y galvanometer mirror 7a, b of the scanning and the optical detector 17. 本実施の形態では、Xガルバノミラー7aが1ライン走査を終えるごとに、ターレット31を45°回転させるように走査光学系7の走査と、回転ターレット31の回転を同期させることにより、図9に示すように水平方向1 In this embodiment, each time the X galvanometer mirror 7a completes one line scanning, the scanning of the scanning optical system 7 so as to rotate the turret 31 45 °, by synchronizing the rotation of the rotary turret 31, in FIG. 9 horizontal 1 as shown
ライン毎にフレオレスセインによる蛍光とTEXAS Fluorescence due to Fureoresusein on a line-by-line basis and TEXAS
RED TMによる蛍光とを取得する。 And it acquires the fluorescence by the RED TM. 【0061】さらに、ターレット31を45°回転させるタイミングとして、Xガルバノミラー7aの1ピクセル停止期間中(1ピクセル受光中)に切り換えを行うことにすれば、全てのピクセル(画素)にフレオレスセインによる蛍光の情報とTEXAS RED TMによる蛍光の情報とを光検出器17,18で検出することが可能となる。 [0061] Furthermore, as a timing for rotating the turret 31 45 °, if it to switch in one pixel stop period of X galvanometer mirror 7a (in one pixel receiving), Fureoresusein to all pixels (pixels) it is possible to detect by the photodetector 17 and fluorescence information and TEXAS RED TM by the fluorescence information by. 【0062】このような実施の形態によれば、第1の実施の形態に記した効果を確保できる上に、フレオレスセインによる蛍光とTEXAS RED TMによる蛍光を検出する時間的な遅れを完全になくすことができる。 [0062] According to this embodiment, on which can be secured effects noted in the first embodiment, completely the time delay for detecting the fluorescence of fluorescent and TEXAS RED TM by Fureoresusein it can be eliminated. 【0063】(第6の実施の形態)図10〜図13を参照して第6の実施の形態について説明する。 [0063] For see (Sixth Embodiment) FIGS. 10-13 sixth embodiment will be described. この実施の形態は、クリプトンアルゴンレーザ35の発振する48 This embodiment oscillates krypton argon laser 35 48
8nm、568nm、647nmの3波長を用いてフレオレスセイン、TEXAS RED TM 、シアニン5により発する3種の蛍光を3つの光検出器36,37,38 8 nm, 568 nm, using a 3-wavelength of 647nm Fureoresusein, TEXAS RED TM, the three three fluorescence emitted by cyanine 5 photodetectors 36, 37, 38
でそれぞれ検出する。 In the detection, respectively. 【0064】図10、図11、図12は図示しないモータに接続された回転ターレット39を回転して切換えた3段階の状態を示している。 [0064] Figure 10, Figure 11, Figure 12 shows a 3-stage of the conditions of switching by rotating the rotary turret 39 which is connected to a motor (not shown). 回転ターレット39は光源側の大円部と標本側の小円部とを光軸方向に所定距離離間させて一体化した2重円板構造になっている。 Rotary turret 39 is in a double disc structure which integrates the predetermined distance is separated in the optical axis direction and a small circle portion of the large circle portion and the specimen side of the light source side. 【0065】図10(b)に示すように、回転ターレット39の小円部は488nmを透過する励起フィルタ3 [0065] Figure 10 (b), the small circle portion of the rotary turret 39 excitation filter 3 which transmits 488nm
9a、568nmを透過する励起フィルタ39b、64 9a, excitation filter 39b which transmits 568 nm, 64
7nmを透過する励起フィルタ39cが同一円上に隣接して配置され、その同一円上で中心を挟んで488nm Excitation filter 39c which transmits 7nm is disposed adjacent to the same circle, 488 nm across the center on the same circle
励起フィルタ39aと対称位置にミラー39eが配置され、さらにその同一円上で中心を挟んで568nm励起フィルタ39b、647nm励起フィルタ39cの対称位置にそれぞれ空穴39g,39mが配置されている。 Excitation filter 39a and the mirror 39e to the symmetrical positions are arranged, and further across the center on the same circle 568nm excitation filter 39 b, 647 nm excitation filter 39c respectively-hole 39g at symmetrical positions of arrangement 39m. 【0066】また、図10(c)に示すように、回転ターレット39の大円部は、488nm励起フィルタ39 [0066] Further, as shown in FIG. 10 (c), a great circle of the rotating turret 39, 488 nm excitation filter 39
a等の配置された円と同一径の円上に空穴39d,39 Soraana on a circle of the same diameter and arranged circle a like 39d, 39
f,39jが488nm励起フィルタ39a,39b, f, 39j is 488nm excitation filter 39a, 39b,
39cと同一ピッチで配置されている。 It is arranged at 39c the same pitch. さらに、空穴3 In addition, empty hole 3
9d等が配置された円よりも大きい円周上であって空穴39f,39jとそれぞれ回転中心を挟んで対称位置にミラー39h、空穴39nが配置されている。 9d or the like is a big circumferentially than the circle which is arranged-hole 39f, a mirror 39h at symmetrical positions across the respective center of rotation and 39j, empty hole 39n is arranged. 【0067】図13は励起ダイクロイックミラー40の透過特性を示している。 [0067] Figure 13 shows the transmission characteristic of the excitation dichroic mirror 40. この励起ダイクロイックミラー40は、励起波長の488nmと568nmと647n The excitation dichroic mirror 40, a 488nm and 568nm excitation wavelength 647n
mを反射し、フレオレスセイン、TEXAS RE It reflects m, Fureoresusein, TEXAS RE
TM 、シアニン5の発する蛍光を透過する透過特性を持つ。 D TM, having a transmission characteristic of transmitting the fluorescence emitted from the cyanine 5. 【0068】以上のように構成した実施の形態での動作について説明する。 [0068] The operation in the embodiment constructed as described above will be described. 図10は、488nmの波長を励起フィルタ39aで選択し、フレオレスセインの発生した蛍光を光検出器36で検出している状態を示している。 Figure 10 shows a state of selecting the wavelength of 488nm with excitation filter 39a, detects the generated fluorescence Fureoresusein the photodetector 36.
このような図10に示す状態で標本を1フレーム走査する。 Sample one frame scanning in the state shown in this Figure 10. 【0069】図10に示す状態では、クリプトンアルゴンレーザ35を発した488nm、568nm、647 [0069] In the state shown in FIG. 10, issued krypton argon laser 35 488 nm, 568 nm, 647
nmの各波長の多波長レーザ光は、ターレット39の空穴39dを通過し、励起フィルタ39aにより488n Multi-wavelength laser light of each wavelength nm passes through the empty hole 39d of the turret 39, 488N by excitation filter 39a
mの波長が選択される。 Wavelength of m is selected. そして、励起ダイクロイックミラー40を反射し、走査光学系7のガルバノメータスキャナミラーで反射された後、ミラー8を反射し図示しない標本上にビームスポットを形成する。 Then, reflected by the excitation dichroic mirror 40 after being reflected by the galvanometer scanner mirror of the scanning optical system 7, to form a beam spot of the mirror 8 onto the specimen without reflected shown. 【0070】標本のフレオレスセインより発した蛍光が逆の光路をたどって励起ダイクロイックミラー40を透過する。 [0070] The fluorescence emitted from Fureoresusein the specimen by following the reverse optical path transmitted through the excitation dichroic mirror 40. この励起ダイクロイックミラー40を透過した蛍光は結像レンズ14、ミラー15、共焦点ピンホール16を通り、ターレット39に配置されたミラー39e The excitation dichroic fluorescence transmitted through the mirror 40 is an imaging lens 14, a mirror 15, passes through the confocal pinhole 16, a mirror disposed in the turret 39 39e
により反射される。 It is reflected by. ミラー39eで反射した蛍光はさらにバリアフィルタ19により488nmの反射光をカットされてから光検出器36でフレオレスセインの発する蛍光として検出される。 It is detected as fluorescence emitted from the cut reflected light 488nm of Fureoresusein by the photodetector 36 by fluorescence further barrier filter 19 that is reflected by the mirror 39e. 図10に示すターレット39の位置で、走査光学系7のガルバノメータスキャナミラーを走査駆動して1フレーム走査を行って、フレオレスセインによる画像を1枚取得する。 In the position of the turret 39 shown in FIG. 10, by performing a 1-frame scanning galvanometer scanner mirror of the scanning optical system 7 scan drive to, acquires one image by Fureoresusein. 【0071】このように、488nmの励起波長で励起したフレオレスセインからの蛍光を1フレームだけ走査したら、図10(b)(c)に示す矢印41方向にターレット39を60°だけ図示しないモータ等により回転させる。 [0071] Motor Thus, when scanning the fluorescence from Fureoresusein excited at an excitation wavelength of 488nm by one frame, not shown in the arrow 41 direction shown in FIG. 10 (b) (c) the turret 39 by 60 ° rotated by like. その結果、図11に示す状態に変化する。 Consequently, changes to the state shown in FIG. 11. 【0072】図11は568nmの波長を励起フィルタ39bで選択し、TEXAS RED TMの発した蛍光を光検出器37で検出する状態を示している。 [0072] Figure 11 shows a state of selecting the wavelength of 568nm with excitation filter 39 b, detecting fluorescence emitted of TEXAS RED TM by the photodetector 37. 図11に示す状態で再び標本を1フレーム走査する。 Again one frame scanning specimens in the state shown in FIG. 11. 【0073】図11に示す状態では、クリプトンアルゴンレーザ35から発振した488nm、568nm、6 [0073] In the state shown in FIG. 11, 488 nm oscillated from Krypton Argon laser 35, 568 nm, 6
47nmは、ターレット39上の空穴39fを通過し、 47nm passes through the turret 39 empty hole 39f,
励起フィルタ39bにより568nmの波長が選択される。 Wavelength of 568nm is selected by the excitation filter 39 b. 568nmのレーザ光が励起ダイクロイックミラー40で反射され、図10と同じ経路をたどり、標本上にビームスポットを形成する。 Laser light of 568nm is reflected by the excitation dichroic mirror 40, it follows the same path as in FIG. 10 to form a beam spot on the specimen. 【0074】そして、TEXAS RED TMより発した蛍光が、図10と同様に逆方向に光路を進み、励起ダイクロイックミラー40を透過する。 [0074] Then, the fluorescence emitted from TEXAS RED TM is, take the light path in the opposite direction as in FIG 10, it is transmitted through the excitation dichroic mirror 40. 励起ダイクロイックミラー40を透過した蛍光は、結像レンズ14、ミラー15、共焦点ピンホール16を通り、ターレット39上に形成した空穴39gを通過して同ターレット39のミラー39hにより反射され、さらにバリアフィルタ20 Fluorescence transmitted through the excitation dichroic mirror 40, an imaging lens 14, a mirror 15, passes through the confocal pinhole 16, and is reflected through the empty hole 39g formed on the turret 39 by a mirror 39h of the turret 39, further barrier filter 20
により568nmの反射光をカットされてから光検出器37でTEXAS RED TMの発する蛍光として検出される。 It is detected as fluorescence emitted by the light detector 37 of TEXAS RED TM after being cut reflected light 568nm by. したがって、図11に示すターレット39位置で走査光学系7を駆動して1フレーム走査を行うことにより、TEXAS RED TMによる画像が1枚取得される。 Therefore, by performing the drive to one frame scanning scanning optical system 7 in the turret 39 position shown in FIG. 11, the image by TEXAS RED TM is acquired one. 【0075】1フレーム走査が完了したら、ターレット39を図11(b)(c)に示す矢印42の方向に60 [0075] When one frame scanning is completed, the turret 39 in the direction of arrow 42 shown in FIG. 11 (b) (c) 60
°だけモータで回転して図12に示す状態にする。 ° just rotated by a motor to the state shown in FIG. 12. 図1 Figure 1
2では647nmの波長を励起フィルタ39cで選択し、シアニン5の発した蛍光を光検出器38で検出している。 In 2 the wavelength of 647nm was selected by the excitation filter 39c, and detects the fluorescent light emitted cyanine 5 by the photodetector 38. 図12に示す状態で再び標本を1フレーム走査する。 Again one frame scanning specimens in the state shown in FIG. 12. 【0076】図12に示す状態では、クリプトンアルゴンレーザ35から発振した、488nm、568nm、 [0076] In the state shown in FIG. 12, it oscillated from Krypton Argon laser 35, 488 nm, 568 nm,
647nmは、ターレット39上の空穴39gを通過し、励起フィルタ39cにより647nmの波長が選択される。 647nm passes through the turret 39 empty hole 39g, the wavelength of 647nm is selected by the excitation filter 39c. この励起波長は励起ダイクロックミラー40により反射され、図10,11と同様に図示しない標本上にビームスポットを形成する。 The excitation wavelength is reflected by the excitation dichroic mirror 40, to form a beam spot on the specimen (not shown) as in FIG. 10 and 11. 【0077】647nmの励起波長で励起したシアニン5により発した蛍光は、図10、11と同様に逆方向に光路を進み、励起ダイクロイックミラー40を透過する。 [0077] Fluorescence emitted by cyanine 5 excited at the excitation wavelength of 647nm proceeds the optical path in the opposite direction as in FIG. 10 and 11, transmitted through the excitation dichroic mirror 40. そして、結像レンズ14、ミラー15、共焦点ピンホール16を通り、ターレット39上に形成した空穴3 Then, an imaging lens 14, a mirror 15, passes through the confocal pinhole 16, air holes 3 formed on the turret 39
9m,39nを通過し、バリアフィルタ43により64 9m, passes through 39n, the barrier filter 43 64
7nmの反射光をカットしてから光検出器38でシアニン5の発する蛍光として検出される。 It is detected as fluorescence emitted from the cyanine 5 to cut reflected light of 7nm by the photodetector 38. したがって、図1 Thus, FIG. 1
2に示すターレット39の位置で1フレーム走査を行うことにより、シアニン5による画像が1枚取得される。 By performing one frame scanned at positions of the turret 39 shown in 2, the image by the cyanine 5 is acquired one. 【0078】以上のようにして、図10、図11、図1 [0078] As described above, FIG. 10, FIG. 11, FIG. 1
2に示す状態でそれぞれ取得したフレオレスセインによる画像、TEXAS RED TMによる画像、シアニン5 Image by Fureoresusein obtained respectively in the state shown in 2, the image by TEXAS RED TM, Cyanine 5
による画像をそれぞれ色分けしてモニターに重ねて表示する。 Color-coded each image displayed superimposed on the monitor by. 【0079】このような実施の形態によれば、3重染色標本の各蛍光色素より発する蛍光の取り込みをガルバノメータスキャナミラーの走査とターレットの回転を同期させて1フレーム走査毎にターレットを切り換えて各蛍光色素毎に行っているので、蛍光クロストークがなく、 [0079] According to this embodiment, the switches the turret for each frame scanning in synchronization with rotation of the scanning and turret galvanometer scanner mirror fluorescence uptake emanating from each fluorescent dye triple stained sample since going to each fluorescent dye, no fluorescence cross-talk,
また各蛍光色素により発する蛍光の取り込みの時間的遅れを、極力少なくできる。 The temporal delay of the fluorescence uptake emitting by the fluorescent dye, can be minimized. 【0080】(第7の実施の形態)励起波長の選択及び光検出器へ導く光路の切換えのために前述した各実施の形態で採用しているターレット方式ではなく励起波長選択用及び光路切換え用のガルバノミラーを使用する。 [0080] (Seventh Embodiment) for excitation wavelength selection and an optical path switching rather than turret method is adopted in the above-described embodiments for switching the optical path for guiding the selection and photodetector excitation wavelength to use of the galvanometer mirror. 【0081】図14、図15に第7の実施の形態となる走査型光学顕微鏡の光学系の構成を示している。 [0081] Figure 14 shows a configuration of a seventh optical system of a scanning optical microscope comprising a embodiment of Figure 15. この実施の形態は、第1の実施の形態と同様に488nmと5 This embodiment, like the first embodiment 488nm and 5
68nmを発振するクリプトンアルゴンレーザによりフレオレスセインとTEXASRED TMで2重染色された標本を観察するもので、第1の実施の形態と同じ機能を持つ部位には同じ符号を付している。 The krypton argon laser that emits a 68nm intended to observe the double stained specimens Fureoresusein and TexasRed TM, are denoted by the same reference numerals to portions having the same functions as the first embodiment. 【0082】ビームエキスパンダ2で所定ビーム径に調整したレーザ光を第1ガルバノミラー51に入射し、第1ガルバノミラー51を振ることでレーザ光の進行する光路を2つの光路53と光路54とから選択する。 [0082] The laser beam which is adjusted to a predetermined beam diameter by the beam expander 2 is incident on the first galvanometer mirror 51, the optical path of the two optical paths 53 and the optical path 54 of propagation of the laser beam by swinging the first galvano mirror 51 to choose from. 一方の光路53には488nmの励起フィルタ55が配置され、もう一方の光路54には568nmの励起フィルタ56が配置されている。 The one light path 53 is disposed excitation filter 55 of 488 nm, on the other optical path 54 are arranged excitation filter 56 of 568 nm. すなわち、光路53と54とからいずれかの光路を選択することが励起波長を選択することになる。 That is, the selecting the one of the optical path from the optical path 53 and 54 to select the excitation wavelength. 2つの光路はミックス用ダイクロイックミラー57によって励起ダイクロイックミラー6の配置された一つの光路に導かれる。 Two optical paths are guided to one optical path arranged in the excitation dichroic mirror 6 by mixing dichroic mirror 57. 【0083】また、共焦点ピンホール16を通過した蛍光を第2ガルバノミラー52に入射し、第2ガルバノミラー52を振ることで蛍光を光検出器17,18に導く2つの光路59,60から選択する。 [0083] Moreover, incident fluorescence passing through the confocal pinhole 16 in the second galvanometer mirror 52, the two optical paths 59 and 60 leading to the photodetectors 17 and 18 the fluorescence by shaking the second galvanometer mirror 52 select. 【0084】ガルバノミラー51の傾きを制御してレーザ光を光路53又は54に切換える。 [0084] to control inclination of the galvanometer mirror 51 switches the laser light to the optical path 53 or 54. 図14に示すように、光路53へレーザ光が導かれるように制御した場合、光路53には488nmを選択する励起フィルタ5 As shown in FIG. 14, the case of controlling so that the laser light is guided to the optical path 53, excitation filter into the optical path 53 selects the 488 nm 5
5が配置されているので、ミックス用ダイクロイックミラー57に入射するレーザ波長は488nmとなる。 Because 5 is disposed, the laser wavelength incident to the mix dichroic mirror 57 becomes 488 nm. 【0085】一方、図15に示すようにガルバノミラー51の傾きを制御してレーザ光を光路54に導いた場合は、光路中に568nmを選択する励起フィルタ56が配置されているので、ミックス用ダイクロイックミラー57に入射するレーザ波長は568nmとなる。 [0085] On the other hand, if the led in the optical path 54 of the laser beam by controlling the tilt of the galvanometer mirror 51 as shown in FIG. 15, since the excitation filter 56 to select a 568nm in the optical path is arranged, mixes laser wavelength incident on the dichroic mirror 57 becomes 568 nm. 【0086】ミックス用ダイクロイックミラー57は、 [0086] mix dichroic mirror 57,
488nmを反射し、568nmを透過する透過特性を持つ。 It reflects 488 nm, with a transmission characteristic which transmits 568 nm. したがって、図14に示すように光路53を進む488nmのレーザ光はミラー58、ミックス用ダイクロイックミラー57を反射して励起ダイクロイックミラー6に入射し、励起ダイクロイックミラー6を反射して走査光学系7、ミラー8を通り、図示しない標本上にビームスポットを結ぶ。 Thus, 488 nm laser light mirror 58 traveling optical path 53 as shown in FIG. 14, and enters the excitation dichroic mirror 6 reflects the mix dichroic mirror 57, the excitation dichroic mirror 6 reflected by the scanning optical system 7, through the mirror 8, connecting the beam spot on the specimen (not shown). また、図15に示すように光路5 Further, the optical path 5 as shown in FIG. 15
4を進む568nmのレーザ光はミックス用ダイクロイックミラー57を透過し、励起ダイクロイックミラー6 Laser light of 568nm traveling 4 is transmitted through the mix dichroic mirror 57, the excitation dichroic mirror 6
を反射して走査光学系7、ミラー8を通り、図示しない標本上にビームスポットを形成する。 Reflected by the scanning optical system 7, through the mirror 8 to form a beam spot on the specimen (not shown). 【0087】488nmの励起レーザ光で励起されてフレオレスセインにより発した蛍光、568nmの励起レーザ光で励起されてTEXAS RED TMにより発した蛍光は、逆方向に光路を進み励起ダイクロイックミラー6を透過する。 [0087] The fluorescence emitted by excited by Fureoresusein excitation laser light 488 nm, the fluorescence emitted by excited by the excitation laser beam of 568nm by TEXAS RED TM, transmits the excitation dichroic mirror 6 proceeds backward in the optical path to. その後、結像レンズ14、ミラー15、 Thereafter, an imaging lens 14, a mirror 15,
共焦点ピンホール16を透過して第2ガルバノミラー5 The second galvano-mirror 5 is transmitted through the confocal pinhole 16
2へ入射する。 Incident to 2. 【0088】ここで、第1ガルバノミラー51による励起波長選択と第2ガルバノミラー52による光路の切換えとが連動するように、図示していないコンピュータによりミラー駆動制御し、しかも第1,第2ガルバノミラー51と走査光学系7の走査とが同期するように3者の動作を制御する。 [0088] Here, as the excitation wavelength selection by the first galvanometer mirror 51 and the switching of optical path by the second galvanometer mirror 52 is interlocked, and the mirror drive control by a computer (not shown), yet the first, second galvano a mirror 51 and scanning of the scanning optical system 7 controls the 3's operation to synchronize. 【0089】今、図14のように第1ガルバノミラー5 [0089] Now, the first galvanometer mirror 5 as shown in FIG. 14
1により488nmが励起波長として選択されていれば、ピンホール16を通過したフレオレスセインの発した蛍光は、第2ガルバノミラー52により光路59の方へ進みバリアフィルタ19で488nmの反射光をカットして、フレオレスセインの発した蛍光として光検出器17で検出される。 If 488nm by 1 has been selected as the excitation wavelength, the fluorescence emitted in Fureoresusein that has passed through the pinhole 16, cuts the reflected light 488nm barrier filter 19 proceeds toward the optical path 59 by the second galvanometer mirror 52 and, it is detected by the photodetector 17 as a fluorescent light emitted in Fureoresusein. 【0090】また、図15のように第1ガルバノミラー51により568nmが励起波長として選択されていれば、共焦点ピンホール16を通過したTEXAS RE [0090] Further, if 568nm is the first galvanometer mirror 51 as shown in FIG. 15 is selected as an excitation wavelength, TEXAS RE passing through the confocal pinhole 16
TMの発した蛍光は、第2ガルバノミラー52により光路60の方へ進み、バリアフィルタ20で568nmの反射光をカットして、TEXAS RED TMの発した蛍光として光検出器18で検出される。 Fluorescent light emitted in D TM proceeds toward the optical path 60 by the second galvanometer mirror 52, to cut reflected light 568nm barrier filter 20 and is detected by the photodetector 18 as a fluorescent light emitted of TEXAS RED TM . 【0091】図14に示す状態に制御してフレオレスセインの発する蛍光を取り込む状態と図15に示す状態に制御してTEXAS RED TMの発する蛍光を取り込む状態との切り換えを走査光学系7の走査に同期して行う。 [0091] Switching the scanning of the scanning optical system 7 with a state by controlling the state shown in FIG. 14 is controlled to the state shown in state and 15 to capture the fluorescence emitted from the Fureoresusein capturing fluorescence emitted by TEXAS RED TM by carried out in synchronization with. 具体的には、第1の実施の形態のように1フレーム走査毎の光路切り換えや、第5の実施の形態のように走査光学系7のXガルバノミラー7aの1ライン走査毎の光路切り換えを行うことができる。 Specifically, and an optical path switching for each frame scanning, as in the first embodiment, the optical path switching for each line scan of the X galvanometer mirror 7a of the scanning optical system 7 as in the fifth embodiment It can be carried out. 【0092】このような実施の形態によれば、2重染色標本の各蛍光色素より発する蛍光の取り込みを、1フレーム走査毎、1ライン走査毎に切換えて各蛍光色素毎に行っているので、蛍光クロストークがなく、また各蛍光色素により発する蛍光の取り込みの時間的な遅れを極力少なくできる。 [0092] According to this embodiment, the respective fluorescent dyes emit from fluorescent uptake double stained specimen, each frame scan, since doing switched every line scan for each fluorescent dye, there is no fluorescence cross-talk, also a temporal delay of the fluorescence of incorporation that emits by each of the fluorescent dye can be reduced as much as possible. また、励起波長の選択、光検出器への光路切り換えをガルバノメータスキャナで行っているので、標本上のビーム走査を行うガルバノメータスキャナミラーとの同期が取りやすく、1ライン走査毎の切り換え等の高速切り換えを簡単に実現できる。 The selection of the excitation wavelength, because the optical path switching to the optical detector is performed by a galvanometer scanner, synchronization tends to take the galvanometer scanner mirror that performs beam scanning on the specimen, fast switching such as switching of each line scan the can be easily realized. 【0093】(第8の実施の形態)励起波長の選択及び光検出器へ導く光路の切換えのために前述したガルバノミラー51,52ではなく励起波長選択用及び光路切換え用の音響光学偏向素子(AOD)を使用する。 [0093] (Eighth Embodiment) Selection of excitation and acousto-optic deflector for excitation wavelength selection rather than the galvanometer mirror 51 and 52 described above and for the optical path switching for switching the optical path leading to the photodetector ( to use the AOD). 【0094】図16、図17に第8の実施の形態となる走査型光学顕微鏡の光学系の構成を示している。 [0094] Figure 16 shows the structure of the eighth optical system of a scanning optical microscope comprising a embodiment of Figure 17. この実施の形態は、ガルバノミラー51,52を音響光学偏向素子61,62に代えたこと以外は前述の第7の実施の形態とほぼ同じ構成になっている。 This embodiment, except that instead of the galvanometer mirror 51 to acousto-optic deflector 61, 62 are substantially the same configuration as the seventh embodiment described above. 【0095】第1音響光学偏向素子61はビームエキクスパンダ2からのレーザ光を光路53又は54へ導くように偏向させる機能を持ち、第2音響光学偏向素子62 [0095] The first acousto-optic deflector 61 has the function of deflecting to direct the optical path 53 or 54 the laser beam from the beam equi box expander 2, a second acousto-optic deflector 62
は共焦点ピンホール16を通過した蛍光を光路59又は60へ導くように偏向させる機能を持つ。 Has a function of deflecting to direct fluorescence passing through the confocal pinhole 16 to the optical path 59 or 60. 【0096】これら第1,第2の音響光学偏向素子6 [0096] These first, second acousto-optic deflecting element 6
1,62の偏向作用を図示していないコンピュータからの制御で第7の実施の形態と同様に連動させることができるので、走査光学系7の走査に同期して第1音響光学偏向素子61により励起波長を選択すると共に、第2音響光学偏向素子62により蛍光を入射する光路を選択することができる。 It is possible to control from 1,62 computer (not shown) the deflection action of interlocked like the seventh embodiment, the first acousto-optic deflector 61 in synchronization with the scanning of the scanning optical system 7 with selecting the excitation wavelength, the second acousto-optic deflector 62 can select an optical path incident fluorescence. 本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々変形実施可能である。 The present invention is not limited to the above embodiments, and various modifications may be practiced within the scope of the gist of the present invention. 【0097】 【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、蛍光クロストークを除去できるとともに、複数の励起波長による各々の観察の時間的な遅れを抑えることのできる走査型光学顕微鏡を提供できる。 [0097] According to the present invention as Shoki according to the present invention above, it is possible to remove the fluorescence crosstalk, scanning optical microscope that can suppress the time delay of each of the observation by a plurality of excitation wavelengths It can provide.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】第1の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 1 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to the first embodiment.

【図2】第1の実施の形態の全体構成図であり図1とは異なる状態を示す図である。 Is a diagram showing a state different from the Figure 2 there Figure 1 in overall configuration diagram of a first embodiment.

【図3】第2の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の動作説明図である。 3 is an operation explanatory diagram of the scanning optical microscope according to the second embodiment.

【図4】第4の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 4 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to the fourth embodiment.

【図5】第4の実施の形態における焦点ずれ補正原理を説明するための図である。 5 is a diagram for explaining a defocus correcting principle in the fourth embodiment.

【図6】励起ダイクロイックミラーの透過特性を示す図である。 6 is a graph showing the transmission characteristics of the excitation dichroic mirror.

【図7】第5の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 7 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to the fifth embodiment.

【図8】図7とは異なる状態での第5の実施の形態の全体構成図である。 The [8] 7 is an overall configuration diagram of a fifth embodiment in different states.

【図9】第5の実施の形態における取得画像情報の並びを示す図である。 9 is a diagram showing the arrangement of the acquired image information in the fifth embodiment.

【図10】第6の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 Figure 10 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to a sixth embodiment.

【図11】図10とは異なる状態での第6の実施の形態の全体構成図である。 The [11] FIG 10 is an overall configuration diagram of a sixth embodiment of the in different states.

【図12】図10,図11とは異なる状態での第6の実施の形態の全体構成図である。 [12] FIG. 10, the 11 is an overall configuration diagram of a sixth embodiment of the in different states.

【図13】励起ダイクロイックミラーの透過特性を示す図である。 13 is a graph showing the transmission characteristics of the excitation dichroic mirror.

【図14】第7の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 14 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to the seventh embodiment.

【図15】図14とは異なる状態での第7の実施の形態の全体構成図である。 The [15] FIG 14 is an overall configuration diagram of a seventh embodiment of the in different states.

【図16】第8の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の全体構成図である。 16 is an overall configuration diagram of a scanning optical microscope according to the eighth embodiment.

【図17】図16とは異なる状態での第8の実施の形態の全体構成図である。 The [17] FIG 16 is an overall configuration diagram of an eighth embodiment of the in different states.

【図18】従来の走査型光学顕微鏡のスキャンヘッド部の構成図である。 18 is a configuration diagram of a scanning head portion of a conventional scanning optical microscope.

【図19】各フィルタブロックの特性図である。 19 is a characteristic diagram of the filter block.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1…クリプトンアルゴンレーザ 2…ビームエキスパンダ 3…ミラー 4…励起フィルタユニット 4a,4d…励起フィルタ 4b…空穴 4c…反射ミラー 6…励起ダイクロイックミラー 7…走査光学系 8…ミラー 11…対物レンズ 12…標本 16…共焦点ピンホール 17、18…光検出器 100…コンピュータ 101…モニタ 102…モータ 1 ... Krypton Argon laser 2 ... beam expander 3 ... mirror 4 ... excitation filter unit 4a, 4d ... excitation filter 4b ... air holes 4c ... reflecting mirror 6 ... excitation dichroic mirror 7 ... scanning optical system 8 ... mirror 11 ... objective lens 12 ... sample 16 ... confocal pinhole 17, 18 ... photodetector 100 ... computer 101 ... monitor 102 ... motor

Claims (3)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 光源からの光ビームを標本に照射し走査機構によって前記標本を前記光ビームで走査する走査型光学顕微鏡において、 前記光源から前記標本に至る光路の途中で2種以上の励起波長の中から1種づつ波長を選択する波長選択手段と、 前記2種以上の励起波長で夫々励起される各蛍光を個別に検出すべく設けられた複数の検出器と、 前記標本から発した蛍光をその励起波長に対応した検出器へ導くように前記波長選択手段の波長選択動作に連動して光路を選択する光路選択手段と、 前記走査機構による走査に同期して1フレーム走査、1 1. A scanning optical microscope for scanning the specimen by the light beam irradiates the specimen scanning mechanism from a light source by the light beam, the way in more than one excitation wavelength of the optical path leading to the sample from the light source fluorescence emitted a plurality of detectors arranged to detect each of them individually fluorescence from the specimen are respectively excited by the wavelength selection means for selecting one by one wavelength, the two or more excitation wavelengths from among an optical path selecting means for selecting light path in conjunction with the wavelength selection operation of the wavelength selection means so as to guide to the detector corresponding to the excitation wavelength, in synchronization with one frame scanning in scanning by the scanning mechanism, 1
    ライン走査又は1画素受光中に前記波長選択手段による選択励起波長及び前記光路選択手段による選択光路を切換える手段とを具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡。 Scanning optical microscope, characterized by comprising a means for switching the selected optical path by selecting the excitation wavelength and the optical path selection means by the wavelength selection means during the line scan or one pixel receiving.
  2. 【請求項2】 請求項1記載の走査型光学顕微鏡において、 前記波長選択手段及び前記光路選択手段は、前記光源から前記標本に至る光路と前記標本から発した蛍光の通過する蛍光光路とを同時に遮る回転板を配置し、当該回転板において光源から標本に至る光路が遮られる部分を含む同一円上に各々波長帯域の異なる励起波長が通過する励起フィルターを設け、前記回転板において前記蛍光光路が遮られる部分を含む同一円上であって前記各励起フィルターが光路上に配置されたときに蛍光光路を遮る各々の位置にそのとき光路上に配置された励起フィルターに対応した検出器へ蛍光を導く反射ミラー又は空穴を設けてなることを特徴とする走査型光学顕微鏡。 2. A scanning optical microscope of claim 1, wherein said wavelength selection means and the optical path selection means, and a fluorescence light path passing from said light source of fluorescent light emitted from the light path and the sample leading to the specimen at the same time the rotating plate to shield disposed, the excitation filter, each excitation wavelength of the wavelength band different to the rotation same onto circle including a portion where the light path to the sample from a light source is blocked in plate passes provided, the fluorescent light path in the rotary plate fluorescence the detector where the respective excitation filter even on the same circle is corresponding to the excitation filter at that time is disposed on the optical path to each of the positions blocking the fluorescence light path when placed on the optical path including the portion intercepted scanning optical microscope, characterized by comprising a reflective mirror or empty hole leads.
  3. 【請求項3】 請求項1記載の走査型光学顕微鏡において、 前記波長選択手段は、各々波長帯域の異なる励起波長が通過する複数の励起フィルターと、前記光源側から入射する光ビームを偏向させていずれかの励起フィルターへ入射する偏向素子とを含んでなり、 前記光路選択手段は、前記標本から入射する蛍光をその励起波長に対応した検出器へ導くように偏向させる偏向素子を含むことを特徴とする走査型光学顕微鏡。 3. A scanning optical microscope of claim 1, wherein said wavelength selection means is each a plurality of excitation filters having different excitation wavelengths wavelength band passes, to deflect the laser beam from the light source side comprises a deflection element that is incident on one of the excitation filter, the optical path selection means, characterized in that it comprises a deflecting element for deflecting to direct fluorescence incident from the specimen to the detector corresponding to the excitation wavelength scanning optical microscope to.
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