JP2006271388A - ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有するhcvns3タンパク質フラグメント - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HCV NS3蛋白質に由来するヘリカーゼ活性を有する特定のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたC型肝炎ウイルス(HCV)NS3ヘリカーゼフラグメント、あるいは1つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、この改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である。
【選択図】なし
Description
WO89/046699およびWO92/02642;欧州特許明細書第318,216−B号および欧州特許出願公開第388,232−A号および第398,748−A号(それぞれ本明細書中で参考として援用される)を参照。C型肝炎は、米国および日本を含む多くの国において輸血関連肝炎の主要な形態のようである。肝細胞癌の誘導にHCVが関与している証拠もある。従って、HCV感染を処置するための有効な方法(現在はない)についてのニーズが存在する。
S3タンパク質は、セリンタイププロテイナーゼの保存配列モチーフ、およびヌクレオシドトリホスファターゼ(NTPase)/RNAヘリカーゼの保存配列モチーフを有することが示されている。HCV NS3タンパク質のN’末端の1/3は、NS3−NS4A、NS4A−NS4B、NS4B−NS5AおよびNS5A−NS5B接合部を切断するトリプシン様セリンプロテイナーゼであることが示されている(Failaら、J.Virol.、68:3753−3760(1994))。NS3 C’末端フラグメントの2/3は、NTPase/RNAヘリカーゼ活性をコードすることが示されている(Chooら、PNAS、88:2451−2455(1991)、およびGorbalenyaら、Nucleic Acids Res.、17:4713−4729(1989))。Suzichらは、E.coliにおいて発現したHCV NS3のカルボキシ末端フラグメントの2/3が、ポリヌクレオチド刺激性NTPase活性を有することを示した(J.Virol、67:6152−6158(1993))。Gwackらは、「NTPase Activity of Hepatitis C Virus NS3
Protein Expressed in Insect Cells」Mol.Cells.、5(2):171−175(1995)において、2つのHCV NS3タンパク質p70およびp43がバキュロウイルス発現系で発現されることを示した。p70は、NS3モノクローナル抗体により阻害される特異的なNTPase活性を示した。Warrenerら(「Pestivirus NS3(p80)Protein Possesses RNA Helicase Activity」J.Virol.69:1720−1726(1995))は、バキュロウイルス発現系において発現されたウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)NS3タンパク質が、RNAヘリカーゼ活性を有することを示した。JP 06 319583Aは、バキュロウイルスの非必須領域へのHCVヘリカーゼ遺伝子の導入による、HCVによりコードされるヘリカーゼタンパク質の調製を記載している。ヘリカーゼアミノ酸配列は、HCVポリタンパク質の1200〜1500として報告されている。上記の全ての書類はその全体が本明細書中で参考として援用される。
配列番号2に示される配列と実質的に同じ配列を有するHCV NS3ヘリカーゼフラグメントを提供する工程;
このフラグメントを、RNAヘリカーゼ活性を阻害し得る化合物と接触させる工程;および
このC型肝炎ウイルスヘリカーゼの活性の阻害を測定する工程、
を包含する方法を提供する。
配列番号2に示す配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するHCV NS3ヘリカーゼフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
このフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連絡された、この宿主細胞中で機能する転写および翻訳調節配列;および
選択マーカー
を含むベクターを提供する。
A.定義
用語「C型肝炎ウイルス」および「HCV」は、BB−NANBHの主要な病因因子であるウイルス種をいう。そのプロトタイプの単離体は、PCT WO89/046699;欧州特許出願公開第318,216号、第388,232号、および第398,748号、ならびにPCT WO92/02642に同定されている。本明細書中で使用される「HCV」は、C型肝炎を引き起こし得る病原性株および弱毒化株またはそれ由来の欠損干渉粒子を含む。HCVゲノムはRNAから構成される。RNAを有するウイルスは比較的高率で自発的に変異し、その率は、取り込んだヌクレオチドあたり10−3から10−4のオーダーと報告されている(FieldsおよびKnipe、「Fundamental Virology」(1986、Raven Press、N.Y.))。遺伝子型の異種性および流動性は、RNAウイルスの固有の特徴であるので、HCV種には複数の株/単離体(毒性または無毒性であり得る)が存在する。
/単離体を単離すること、およびこのような新規の株/単離体がHCVであるかどうかを同定することを可能にするに十分である。代表的には、異なる株(多くのヒト血清(および異なる地理的領域)から得られ得る)が、HCV1のゲノム配列からの情報を用いて単離される。
て、新規のHCV株または単離体は、ポリペプチドレベルで、少なくとも約40%相同であることが予想され、いくつかは約70%以上相同であると、およびいくつかはさらに約80%以上相同であると予想される:いくつかは約90%以上相同であり得る。アミノ酸配列の相同性を決定するための技法は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列が直接決定され、そして本明細書中に記載された配列と比較され得る。あるいは、推定HCVのゲノム物質のヌクレオチド配列が、(通常は、cDNA中間産物を介して)決定され得、そしてそれにコードされるアミノ酸配列が決定され得、そして対応する領域が比較され得る。
NS3フラグメントヘリカーゼ変異体を形成するための変更は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、そこでは、アミノ酸は類似の性質の別の天然に存在するアミノ酸と置き換えられる。例えば、次の置換が「保存的」と考えられる:
本発明の実施は、一般に、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来技法を使用する。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、J.Sambrookら、「Molecular Cloning:A
Laboratory Manual」(1989);「DNA Cloning」、第I巻および第II巻(D.N Glover編、1985年);「Oligonucl
eotide Synthesis」(M.J.Gait編、1984年);「Nucleic Acid Hybridizatin」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984年);「Transcription And Traslation」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984年);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編、1986年);「Immobilized Cells And Enzymes」(IRL Press、1986年);B.Perbal、「A Practical Guide To
Molecular Cloning」(1984年);シリーズ「Methods In Enzymology」(Academic Press,Inc.);「Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells」(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory);Meth Enzymol(1987)154および155(それぞれ、WuおよびGrossman編ならびにWu編);MayerおよびWalker編(1987年)、「Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology」(Academic Press,London);Scopes、「Protein Purification: Principles And Practice」、第二版(Springer−Verlag、N.Y.、1987年);および「Handbook Of
Experimental Immunology)」、第I巻〜第IV巻(WeirおよびBlackwell編、1986年)を参照。
)を、CEN3とARS1との組合せ、または、複製を確実にする他の手段(例えば、適切なフラグメントの宿主細胞ゲノムへの組み込みを生じる配列)を使用し得る。酵母ベクターのための制御配列は、当該分野で公知であり、3−ホスホグリセレートキナーゼ用のプロモーター(R.Hitzemanら、J Biol Chem(1980)255:2073)を含む、解糖酵素の合成用プロモーター(Hessら、J Adv Enzyme Reg(1968)7:149;Hollandら、Biochem(1978),17:4900)を包含する。ターミネーター(例えば、エノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター(Holland,J Biol Chem(1981)256:1385))もまた包含され得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)調節可能プロモーター、GAPDH由来のターミネーター、および分泌が所望であれば、酵母α−因子由来のリーダー配列を含む制御系である(本明細書に参考として援用される米国特許第4,870,008号を参照)。
ルス(RSV)、アデノウイルス(ADV)、およびウシパピローマウイルス(BPV)由来のプロモーター)を包含する。哺乳動物細胞はまた、ターミネーター配列およびポリA付加配列を必要とし得る。発現を増大させるエンハンサー配列もまた包含され得、遺伝子増幅を促進する配列(例えば、メトトレキセート耐性遺伝子)もまた望ましくあり得る。これらの配列は当該分野で公知である。
ある。(SummerおよびSmith、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555:Smithら、Mol Cell Biol(1983)3:2156−2165;ならびにLuckowおよびSummers、Virol(1989)17:31を参照)。例えば、異種DNAは、相同組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子へ挿入され得るか、または、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位に挿入され得る。この挿入される配列は、ポリタンパク質の全部または種々のセグメントをコードする配列、またはウイルスポリペプチドをコードする他のorfであり得る。例えば、インサートは、ポリタンパク質に由来する以下の番号のアミノ酸セグメントをコードし得る:アミノ酸1〜1078;アミノ酸332〜662;アミノ酸406〜662;アミノ酸156〜328、およびアミノ酸199〜328。
Eb、Viol(1978)52:546のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の公知の変法を使用して実施され得る。細胞(特に哺乳動物細胞)に、組換えポリヌクレオチドを導入する他の方法には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、およびポリヌクレオチドの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
使用され得、任意の一本鎖DNA部分の加水分解を生じる。
Acad Sci USA(1975)73:3961の手順を使用して、プローブされ得る。簡潔に述べれば、この手順において、プローブされるDNAは、ニトロセルロースフィルター上に固定され、変性され、そして0〜50%ホルムアミド、0.75M NaCl、75mM クエン酸Na、各々0.02%(wt/v)のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、およびFicoll(登録商標)、50mMNaH2PO4(pH6.5)、0.1% SDS、ならびに100mg/mLキャリア変性DNAを含有する緩衝液でプレハイブリダイズされる。緩衝液中のホルムアミドの割合、ならびにプレハイブリダイゼーションおよび続くハイブリダイゼーション工程の時間および温度条件は、必要なストリンジェンシーに依存する。より低いストリンジェンシー条件が必要なオリゴマープローブは、一般に、低い割合のホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。30または40ヌクレオチド以上を含むプローブ(例えば、cDNAまたはゲノム配列由来のプローブ)は、一般に、より高い温度(例えば約40〜42℃)、および高い割合のホルムアミド(例えば50%)を用いる。プレハイブリダイゼーション後、5’−32P標識オリゴヌクレオチドプローブは緩衝液に添加され、フィルターは、ハイブリダイゼーション条件下で、この混合物中でインキュベートされる。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに供し、ハイブリダイ
ズしたプローブの位置を示す;元の寒天プレート上の対応する位置のDNAが、所望のDNAの供給源として使用される。
NS3の対応するモチーフを示す。HCV NS3タンパク質は、DEXHタンパク質サブファミリー中にその分類を生じるDECHの配列モチーフを有する。
から精製されたRNAヘリカーゼAは、そのコファクターとしてMg2+のみを必要とし、Mn2+はMg2+の代用にはならない(本明細書に参考として援用される、Leeら、J.Biol.267:4398−4407(1992)を参照)。ペスチウイルスNS3およびワクシニアウイルスRNAヘリカーゼは、両カチオンを使用することが示されている。同様に、本明細書に開示されるHCV NS3タンパク質ヘリカーゼフラグメントは、両金属イオンを利用し得る。
ルトース結合タンパク質ドメインを、これとHCV NS3タンパク質とを含有する融合タンパク質から分離するのは困難である。さらに、pET21bベクターを利用して、HCV NS3タンパク質ドメイン(アミノ酸1027〜1657)を発現させた。このタンパク質の発現レベルは非常に低く、ほんの少量のタンパク質のみが単離された。
1)pMALまたはpGEXベクターのプロモーターと比較した場合、より良好なT7プロモーター系;
2)ヘリカーゼ活性を有する発現NS3タンパク質フラグメントの溶解性の増大;
3)融合タンパク質から非HCV NS3タンパク質フラグメントを除去する必要性の排除;および
4)ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いる簡便な精製工程。
さらに、ヘリカーゼ活性を有する可溶性NS3タンパク質フラグメントは、不溶性の完全長タンパク質に対していくつかの利点を有する。第一に、可溶性タンパク質フラグメントは、精製および酵素アッセイにおける使用のために、変性および再折り畳みの必要がない。不溶性タンパク質またはフラグメントは、精製のために、尿素またはグアニジン−HClによって変性される必要があり、次いで、タンパク質フラグメントの再折り畳みおよびその酵素活性の回収の前に、尿素またはグアニジン−HClを除去するため、濃度段階勾配に対して透析されなければならない。第二に、発現系からの可溶性NS3タンパク質フラグメントの収率は、不溶性NS3タンパク質フラグメントの収率より高い。変性−再折り畳みプロセスの間に、不溶性タンパク質フラグメントは、大部分の細胞抽出物中で損失される。第三に、不溶性NS3タンパク質の酵素活性は、再折り畳み後には観察され得ない。
下記の実施例は、当業者へのさらなるガイドとして提供され、いかなる方法においても
本発明の限定として解釈されるべきではない。
実施例1
HCV NS3タンパク質の発現および精製
HCV NS3タンパク質のカルボキシ側2/3を発現させるために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、HCV−1 cDNA由来のアミノ酸1193〜1657を含む1.4Kb DNAフラグメントを増幅した。使用したセンスプライマーは、JCK−1 5’−GGGGATCCGGTGGACTTTATCCCT−3’(配列番号4)であり、そしてアンチセンスプライマーはJCK−7 5’−GGAAGCTTGCTGACGACCTCG−3’(配列番号5)であった。PCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpET21b(Novagen,WIから購入した)1のBamHIおよびHindIII部位に挿入した。組換えプラスミドをpET21b−NS3HCVと呼び、E.coli BL21(DE3)へ形質転換し、そして挿入された領域を配列決定によって確認した。pET21b−NS3HCVは、HCV NS3のカルボキシ末端の466アミノ酸残基からなり、そしてより容易な精製のために、C末端にHisタグ(6つのヒスチジン)およびpET発現ベクター由来のさらなる19残基を含有した。HCV NS3 Hisタグ融合タンパク質の約54kDa(481アミノ酸残基)を、組換えプラスミドを有するE.coli BL21(DE3)から1mM IPTGによって誘導して、10mg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で細胞を指数的に増殖させた(図5レーン1および2を参照)2。200mlの培養物から純度約95%のタンパク質400mgを得た。37℃にて3時間培養後、細胞を回収し破砕した。細胞抽出物の可溶性部分を、金属結合カラムに負荷した。樹脂結合タンパク質を、1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−Cl pH7.9を用いて溶出した。溶出画分をSDS−PAGEに供し、タンパク質含有画分をプールし、50mM Tris−Cl pH7.9に対して4時間透析した。ポリエチレンイミンセルロースTLC(J.T.Baker)上でのNTPaseアッセイを、Suzichらに以前に記載されたように実施して、最終的な精製タンパク質が活性コンホメーションを有することを確認した。精製タンパク質はNTPase活性を示した(データは示さず)。1 ネガティブコントロールとして、インサートを含まないpET21bプラスミドを、E.coli BL21(DE3)に形質転換し、1mM IPTGで誘導した。ネガティイブコントロール細胞培養物を、pET21b−NS3HCVと同じ精製工程でプロセシングした。ネガティブコントロールは酵素活性を示さなかった(図6レーン1を参照)。2 約50kDaの1つ以上のタンパク質バンドが、IPTG誘導によって出現したが、54kDa NS3−His融合タンパク質のみを、金属結合アフィニティーカラムから精製した(図5レーン3を参照)。
実施例2
RNAヘリカーゼに対する基質の調製
図4は、RNAヘリカーゼの基質として使用された二本鎖RNAの構造を示す。長鎖を、PvuIIで切断されたpGEM1のインビトロ転写によって調製し、そして短鎖をBamHI消化pSP65から転写した。両鎖を、SP6 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて、製造者のマニュアルに従って転写した。転写反応後、各アリコートをRNase free DNase(Promega)で処理し、フェノール:クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。各RNA鎖を、25mlのハイブリダイゼーション緩衝液(20mM HEPES−KOH pH7.6、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1%SDS)を用いて再懸濁し、そして混合した。この混合物を100℃に5分間加熱し、65℃で30分間インキュベートし、そして25℃で一晩インキュベートした。長鎖RNAを、[α−32P]−CTPで標識し、そして標識基質の比活性は、1〜1.5×105cpm/pmol ds RNA基質であった3。二本鎖RNAを、6%未変性ポリアクリルアミドゲル(30:0.8)上で電気泳動し、ds RNAの位置をオートラジオグラフィーにより同定した。RNA基質を回収するために、切り出したゲルフラグメントを、400μlの溶出緩衝液(0.
5M酢酸アンモニウム、0.1%SDS、10mM EDTA)中で粉砕し、4℃で2時間激しく振盪した。上清をクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させて、RNAペレットをD.W.中に溶解させた。3 鎖置換を、放射標識した長鎖のバンドシフトによって観察した。
実施例3
RNAヘリカーゼアッセイ
RNAヘリカーゼアッセイを20μlの次の反応混合物中で実施した:1pmol NS3 HCVタンパク質フラグメント、0.5pmol ds RNA基質、25mM MOPS−KOH(pH6.5)、5mMATP、3mM MnCl2、2mM DTT、100μg/ml BSA、および2.5U RNasin(Promega)。この反応混合物を37℃で30分間インキュベートした。反応を、5μlの5×終止緩衝液(0.1M Tris−Cl(pH7.4)、20mM EDTA、0.5%SDS、0.1%NP−40、0.1%ブロモフェノールブルー、0.1%キシレンシアノール、および50%グリセロール)を添加することによって停止させた。各アリコートを6%未変性ポリアクリルアミドゲル(30:0.8)に負荷し、80Vで3時間電気泳動した。ds
RNA基質および巻き戻しRNA鎖をオートラジオグラフィーにより可視化した。NS3タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性に対するATPおよび二価金属イオンの効果を、1mMまたは5mM ATPの存在下で、1、2、3、4、および6mMのMn2+またはMg2+を用いて同じ反応を実施して調べた。鎖分離効率を、PhosphoImager(Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA)を用いて、バンドの放射活性をカウントすることによって計算した。種々の濃度のATPおよび二価カチオンでの、HCV NS3タンパク質フラグメントの活性変化については、図7を参照。HCV NS3 RNAヘリカーゼフラグメントは、Mg2+およびMn2+のような二価イオンを必要とした(図6レーン2〜5を参照)。Mg2+またはMn2+イオンが存在する場合のみ、鎖置換が観察された(図6レーン2および4を参照)。これら二価カチオンまたはATPのいずれかを欠く場合、ds RNAは巻き戻されなかった(図6レーン3、5、および7を参照)。一価カリウムイオンは、これらの条件下で、HCV NS3タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性を活性化しなかった(図6レーン6を参照)。1mM ATPでは、ヘリカーゼ活性は、5mMのときより低かった(図6レーン8を参照)。NS3の酵素活性は、HCV NS3タンパク質フラグメントのモノクローナル抗体によって阻害され(図6レーン9を参照)、そして2つの異なる濃度の非特異抗体によってはブロックされなかった(図6レーン10および11を参照)。
実施例4
短縮型HCV NS3フラグメントのヘリカーゼ活性についての試験
種々のサイズのHCV NS3フラグメントを、上記のように発現および精製した。次いで、そのフラグメントを、上記のようにヘリカーゼ活性について、そして、当該分野で公知のようにNTPase活性について試験した。図9は、試験したフラグメントおよびそのフラグメントがヘリカーゼ/NTPase活性を示したどうかを示す。以下のフラグメントを試験した:番号1、完全長ヘリカーゼフラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1193〜アミノ酸1657)、ATCC寄託番号97306;番号2、HCV NS3ヘリカーゼドメインのC末端から10アミノ酸を欠失させたHCV
NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1193〜アミノ酸1648)、ATCC寄託番号97307;番号3、HCV NS3ヘリカーゼドメインのC末端から30アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV
NS3ドメインのアミノ酸1193〜アミノ酸1638)、ATCC寄託番号97308;番号4、HCV NS3ヘリカーゼドメインのC末端から50アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1193〜アミノ酸1608)、ATCC寄託番号97309;番号5、HCV NS3ヘリカーゼドメインのC末端から97アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1193〜アミノ酸1651)、ATCC寄託番号97310;番号6、HCV NS3ヘリカーゼドメインのC末端から135アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1209〜アミノ酸1657)、ATCC寄託番号97311;番号7、HCV NS3ヘリカーゼドメインのN末端から16アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1209〜アミノ酸1657)、ATCC寄託番号97312;および番号8、HCV NS3ヘリカーゼドメインのN末端から32アミノ酸を欠失させたHCV NS3フラグメント(すなわち、HCV NS3ドメインのアミノ酸1225〜アミノ酸1657)、ATCC寄託番号97313。
実施例5
HCV NS3フラグメントの溶解性測定
pET21b−HCVNS3ベクターからの発現タンパク質の溶解性を、以下の方法によって測定した:ITPG誘導細胞を5分間6000Gにて回収した。次いで、細胞を、1×結合緩衝液(5mMイミダゾール、500mM NaCl、20mM Tris−Cl pH7.9)を用いて再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞を、ドライアイス−エタノールバス中で凍結させ、氷上で解凍して、2分間超音波処理した。細胞抽出物を27000Gで30分間遠心分離した。細胞抽出物の可溶性部分(上清)および細胞抽出物の不溶性部分(ペレット)をSDS−PAGEに供した。ウエスタンブロットを、HCV NS3タンパク質フラグメントに対するモノクローナル抗体を用いて、SDS−PAGEについて実施した場合、発現タンパク質は、細胞抽出物の可溶性部分中にのみ観察された。
Claims (1)
- 配列番号2のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたC型肝炎ウイルス(HCV)NS3ヘリカーゼフラグメント、あるいは、1つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、該改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である、フラグメント。
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