JP2006262846A - Method for synthesizing and purifying 2-deoxy-scyllo-inosose with yeast and obtained 2-deoxy-scyllo-inosose - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵母による２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ； ２−ｄｅｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ）の合成方法、これに用いる形質転換体およびこの方法により合成された２−デオキシ−シロ−イノソースに関する。詳しくは、本発明は、酵母に、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する酵素遺伝子からなる遺伝子発現カセットを少なくとも１種類導入してなることを特徴とする形質転換体および前記形質転換体を用いて２−デオキシ−シロ−イノソースを合成する方法、この方法により合成された２−デオキシ−シロ−イノソースを培養液中から精製して回収する方法、およびこの方法により得られた２−デオキシ−シロ−イノソースに関する。 The present invention relates to a method for synthesizing 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) by yeast, a transformant used therefor, and 2-deoxy-siro-inosose synthesized by this method. Specifically, the present invention provides a transformant obtained by introducing at least one gene expression cassette comprising an enzyme gene involved in the synthesis of 2-deoxy-siro-inosose into yeast and the transformant A method for synthesizing 2-deoxy-siro-inosose using a method, a method for purifying and recovering 2-deoxy-siro-inosose synthesized by this method from a culture solution, and 2-deoxy obtained by this method -Relating to white-inosose.
炭素６員環化合物は従来石油化学の分野において、石油を原料として生産されてきた。 Carbon 6-membered ring compounds have been conventionally produced using petroleum as a raw material in the petrochemical field.
一方、ブチロシン生産菌バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）において、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）を基質として、炭素６員環化合物である２−デオキシ−シロ−イノソース（２−ｄｅｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ、以下、ＤＯＩ）を合成する反応を触媒する、ＤＯＩ合成酵素が見いだされた（特許文献２、図１）。
On the other hand, in a butyrosine-producing bacterium Bacillus circulans, glucose-6-phosphate (G-6-P) is used as a substrate, and a carbon 6-membered ring compound 2-deoxy-siro-inosose (2-deoxy) is used. A DOI synthase that catalyzes a reaction for synthesizing -syllo-inosose (hereinafter, DOI) has been found (
ＤＯＩ合成酵素は２−デオキシストレプタミンをアグリコンとして含有するアミノグリコシド抗生物質の生合成に関与する酵素であり、その生成物であるＤＯＩは、医薬原料や化学工業資源として有用な物質である。ＤＯＩを化学的に合成する方法は多段階の反応と有害又は高価な金属を使用するのに対し、ＤＯＩ合成酵素を用いれば、効率的に短行程でＤＯＩを生産することができる。これまでに、ＤＯＩ合成酵素を大腸菌に発現させることによって得られる組み換えＤＯＩ合成酵素を用いて、グルコース−６−リン酸から短工程でＤＯＩを生産する方法が確立されている（特許文献２）。 DOI synthase is an enzyme involved in the biosynthesis of aminoglycoside antibiotics containing 2-deoxystreptamine as an aglycone, and the product DOI is a substance useful as a pharmaceutical raw material or chemical industry resource. The method of chemically synthesizing DOI uses multistage reactions and harmful or expensive metals, whereas DOI synthetase can efficiently produce DOI in a short process. So far, a method for producing DOI from glucose-6-phosphate in a short process using recombinant DOI synthase obtained by expressing DOI synthase in E. coli has been established (Patent Document 2).
一方、酵母は増殖が速く、菌体生産性が高いことで知られていた。酵母菌体は従来単一細胞蛋白質（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）として注目され、ノルマルパラフィンを炭素源とした飼料用菌体生産が研究され、調味料としてその核酸成分が利用されてきた。更に、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であり、大規模での連続培養も比較的容易であった。 On the other hand, yeast was known for its rapid growth and high cell productivity. Yeast cells have hitherto been attracting attention as single cell proteins, and production of feed cells using normal paraffin as a carbon source has been studied, and their nucleic acid components have been used as seasonings. Furthermore, it was easier to separate the cells and the culture solution than bacteria, and continuous culture on a large scale was relatively easy.
酵素を用いてポリエステルを合成する方法が特許文献１に開示されている。また、精製したＤＯＩ合成酵素を用いて、グルコース−６−リン酸ＤＯＩを合成する方法が特許文献２に開示されている。この方法ではグルコース誘導体（リン酸塩）が出発原料として使用されている。
A method for synthesizing polyester using an enzyme is disclosed in
しかしながら、ＤＯＩ合成酵素を組み込んだ酵母を用いて、菌体内でＤ−グルコースからＤＯＩを合成する方法は課題として提起されていなかった。 However, a method for synthesizing DOI from D-glucose in a microbial cell using yeast incorporating DOI synthase has not been proposed as a problem.
さらに、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）は、グルコースに２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素とヘキソキナーゼを、またはグルコース−６−リン酸に２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素作用させることにより一段階の酵素反応で合成できることが知られている（特許文献３、非特許文献１）。また、酵素反応液を濃縮して酢酸溶液としヨウ化水素を作用させることにより、ＤＯＩを精製することなくカテコールに変換できることも報告されている（特許文献３）。
Furthermore, 2-deoxy-siro-inosose (DOI) is produced by allowing 2-deoxy-siro-inosose synthase and hexokinase to act on glucose or 2-deoxy-siro-inosose synthase on glucose-6-phosphate. It is known that it can be synthesized by a one-step enzymatic reaction (
現在までに、酵素反応によりＤＯＩを合成して、反応組成物のままのＤＯＩを変換することは報告されているが、ＤＯＩそのものを精製・単離する方法は未だ報告されていない。更に、酵素反応液中より多種多量の培地成分、炭素源であるグルコースの他、ペプトンなどに由来するアミノ酸類あるいは各種の金属イオン類が含まれている本発明の微生物培養液中からＤＯＩを精製することに関する情報は全く無い。すなわち、酵素反応液および微生物培養液からＤＯＩを精製する報告はなく、況や工業的に応用可能な精製方法については全く確立されていないのが現状である。 To date, it has been reported that DOI is synthesized by enzymatic reaction to convert DOI as a reaction composition, but a method for purifying and isolating DOI itself has not yet been reported. Furthermore, DOI is purified from the microorganism culture solution of the present invention containing a large amount of medium components, glucose as a carbon source, amino acids derived from peptone, etc. or various metal ions from the enzyme reaction solution. There is no information about what to do. That is, there is no report of purifying DOI from an enzyme reaction solution and a microorganism culture solution, and the present situation is that no purification method that can be applied industrially or industrially has been established.
培養液中からＤＯＩを精製するには、実験室的にはＨＰＬＣによる分取あるいは活性炭カラムクロマトグラフィーによる方法が知られている。しかし、ＨＰＬＣによる分取が工業的生産には適さないことはいうまでもない。また活性炭カラムによる方法では、培地中の有機化合物をいちど活性炭に吸着させた後、アルコールなどの有機溶媒の濃度を変化させながら、吸着力の差を利用して順次溶出させることになる。したがって大量のＤＯＩを生産する場合、培地中の大部分の有機化合物を吸着させるだけの量の活性炭が必要となり、この方法も大量精製には不向きである。そのようなことから、これまでは工業的方法でＤＯＩを精製する適切な方法は確立されていなかった。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、宿主としての酵母に、ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子からなる遺伝子発現カセットを少なくとも１種類導入した形質転換体を作製し、この形質転換体を用いてＤＯＩを合成すればよいことを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have produced a transformant in which at least one gene expression cassette comprising a gene encoding DOI synthase is introduced into yeast as a host. It has been found that DOI may be synthesized using a converter, and the present invention has been completed.
工業的方法でＤＯＩを精製するには、例えば培養液をカラムの上部から流すと、下部から精製されたＤＯＩが流出してくるような原理に基づく方法が好ましい。すなわち本発明の課題は、ＤＯＩ以外の物質を吸着して、且つＤＯＩは吸着されずに最初に流出してくるようなカラム基材を探索することである。 In order to purify DOI by an industrial method, for example, a method based on the principle that purified DOI flows out from the lower part when a culture solution is flowed from the upper part of the column is preferable. That is, an object of the present invention is to search for a column base material that adsorbs a substance other than DOI and that first flows out without adsorbing DOI.
従って、本発明は、ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子からなる遺伝子発現カセットである。 Accordingly, the present invention is a gene expression cassette comprising a gene encoding DOI synthase.
また、酵母に、ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子からなる遺伝子発現カセットを少なくとも１種類導入してなることを特徴とする形質転換体である。 The transformant is characterized in that at least one gene expression cassette comprising a gene encoding DOI synthase is introduced into yeast.
また、本発明は、酵母を用いて炭素源からＤＯＩを合成する方法において、上記の形質転換体を用いることを特徴とするＤＯＩの合成方法である。 In addition, the present invention is a method for synthesizing DOI, wherein the transformant is used in a method for synthesizing DOI from a carbon source using yeast.
さらにまた、本発明は、上記の方法により合成してなることを特徴とする２−デオキシ−シロ−イノソースである。 Furthermore, the present invention is a 2-deoxy-siro-inosose synthesized by the above method.
また本発明は、上記の合成方法により得られ、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソースを含有する培養液を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂からなる混合ベッド型カラムで処理することを特徴とする２−デオキシ−シロ−イノソースの精製法である。好ましくは前記有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂が酢酸イオン型である。また、本発明は精製された２−デオキシ−シロ−イノソースである。 The present invention also provides a culture solution obtained by the above synthesis method and containing 2-deoxy-siro-inosose from a hydrogen ion type strongly acidic cation exchange resin and an organic acid ion type basic anion exchange resin. This is a method for purifying 2-deoxy-siro-inosose, characterized in that it is treated with a mixed bed type column. Preferably, the organic acid ion type basic anion exchange resin is an acetate ion type. The present invention is also a purified 2-deoxy-shiro-inosose.
医薬品原料や化学工業原料として重要な炭素６員環化合物はこれまで、石油を原料とする石油化学によって製造されていた。しかしながら、本発明の技術を用いることにより、再生可能な植物資源（バイオマス）由来のＤ−グルコースを原料として炭素６員環化合物であるＤＯＩを酵母により合成することが可能となった。また、培養液を処理して、精製されたＤＯＩを回収することができる。 Until now, carbon 6-membered ring compounds that are important as raw materials for pharmaceuticals and chemical industry have been produced by petrochemistry using petroleum as a raw material. However, by using the technique of the present invention, it has become possible to synthesize DOI, which is a carbon 6-membered ring compound, from yeast using D-glucose derived from renewable plant resources (biomass) as a raw material. In addition, the culture solution can be treated to recover purified DOI.
本発明では図１に示す反応式に従ってＤ−グルコースからＤＯＩが合成される。Ｄ−グルコースからグルコース−６−リン酸への変換は、菌体が保有するヘキソキナーゼによって触媒される。グルコース−６−リン酸からＤＯＩへの変換をもたらす多段階の反応は、菌体に導入したＤＯＩ合成酵素によって触媒される。 In the present invention, DOI is synthesized from D-glucose according to the reaction formula shown in FIG. The conversion from D-glucose to glucose-6-phosphate is catalyzed by hexokinase possessed by the cells. The multi-step reaction leading to the conversion of glucose-6-phosphate to DOI is catalyzed by DOI synthase introduced into the cells.
酵母はＤＯＩを合成するための宿主として最も好ましいと考えられる。その理由として、以下の２点が挙げられる。 Yeast is considered most preferred as a host for synthesizing DOI. The following two points can be cited as the reason.
（１）酵母と培養液との分離が容易である。 (1) It is easy to separate the yeast and the culture solution.
（２）酵母を用いた大規模の連続培養も比較的容易である。 (2) Large-scale continuous culture using yeast is relatively easy.
［宿主］
使用する酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されているアシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属）、アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属），アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属），アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属），アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属），ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属），ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属），ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属），ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属），ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属），ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属），キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属），クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属），クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属），シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属），デッカラ属（Ｄｅｋｋａｒａ属），ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属），ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属），エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属），エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属），エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属），エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属），エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属），フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属），ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属），ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属），ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属），ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属），ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属），ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属），ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属），ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属），イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属），クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属），クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属），クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属），コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属），クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属），クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属），ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属），ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属），マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属），メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属），ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属），マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属），ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属），ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属），ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属），オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属），オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属），ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属），ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属），ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属），ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属），サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属），サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属），サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属），サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属），シゾブラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属），シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属），スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属），スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属），スポロパキデミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属），ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属），ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属），ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属），シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属），トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属），トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属），ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属），ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属），ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属），ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属），ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属），ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属），ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属），ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属），ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属）又はザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属などの酵母を使用することができる。
[Host]
The yeast to be used is not particularly limited, and the genus Acycloconidium, the genus Ambrosiozyma (genus Ambrosiozyma), and the genus Arsuloascus (the genus Abrosiozyma), Arthroascus genus, Alxiozyma genus (Arxiozyma genus), Ashbia genus (Ashbya genus), Babjevia genus (Babjevia genus), Bensingtonia genus (Bentingtonia genus), Botryoascus genus (Bothrioascus genus) The genus Myces (genus Brettanomyces), the genus Burera (genus Bullera), the genus Bureromyces (genus Bulleromyces), the genus Candida (Cand genus da), Citeromyces genus (Citeromyces genus), Clavispora genus (Clavispora genus), Cryptococcus genus (Cryptococcus genus), Cystofilobasidium genus (genus Cystofilobasidium genus), Debaryomyces genus (Debaryomyk genus) Genus Dipodascopsis, genus Dipodascus (genus Dipodascus), genus Eniella (genus Eeniella), genus Endomycopsella (genus Endomascus), genus Eremoscus (genus Eremosci) Um (Erythrobasidium), Ferromyces (Fellom) ces), Philobasidium genus (Filobasidium genus), Galactomyces genus (Galactomyces genus), Geotrichum genus (Geotrichum genus), Guillermondella genus (Hansenia spora genus (Hansenia Spora genus) Genus), Hasegawaa genus (Hasegawaa genus), Holtermannia genus (Holtermannia genus), Holmoascus genus (Hormoascus genus), Hyphopicia genus (Hysophicchia genus), Isatchen genus (genus Issatchenkia genus), Chloequera genus (Kloeckeraspora genus), Kluyveromyces genus (Kluyvero) myces), Condo genus (Kondoa genus), Crysia genus (Kuraishia genus), Kurtsumanomyces genus (Kurtzmanomyces genus), Leukospodium (genus Leucosporidium genus), Lipomyces genus (genus Lipomyces genus), Roderomyces genus (Lodemydes genus) ), Malassezia (Malassezia genus), Methoschnia genus (Metschnikowia genus), Murakia genus (Mrakia genus), Mike Sozyma (genus Myxozyma genus), Nadosonia (Nadsonia genus), Nakazawa genus (Nakasawa genus (Nakasawa genus) Nematospora genus), Ogataea genus (Ogataea genus), Auspodium genus (Oosporidium genus), Pachisoren (Pachysolen spp.), Faticospora spp. (Phachytichosspora spp.), Phaffia spp. (Phaffia spp.), Pichia spp. (Pichia spp.), Rhodosporidium spp. (Rhodospora chlom genus), Rhodotorula spp. The genus Saccharomycodes (genus Saccharomycodes), the genus Saccharomycopsis (genus Saccharomycopsis), the genus Cytoela (genus Saitoella), the genus Sakaguchi (genus Sakaguchi), the genus Satanospora (or the genus Saturnospora), the genus Genus), Schizosaccharomyces (Schizosacchar) myces), Schwaniomyces genus (Schwanniomyces genus), Sporidioborus genus (Sporidiobolus genus), Sporoboromyces genus (Sporopydemidia genus) Sterigmatomyces spp. Genus (genus Torulaspora), Trichos polyela (Genus Trichosporiella), genus Trichosporon (genus Trichosporon), genus Trigonopsis (genus Trigonopsis), genus Tsuchiya (genus Tsuchiyaea), genus Udeniomyces (genus Udemimyces), genus Waltomyces Wickerhamiella spp., Williopsis spp. Zygozaima (It is possible to use the yeast, such as Zygozyma genus.
本発明の形質転換体において用いられる酵母として、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が例示され、特にキャンディダ・マルトーサが好ましい。 Examples of yeast used in the transformant of the present invention include Candida maltosa, Saccharomyces cerevisiae, and Pichia pastoris, with Candida maltosa being particularly preferred.
また、ＤＯＩ生産のための直接の基質となるグルコース−６−リン酸の菌による分解代謝を抑制し、ＤＯＩ生産能を高めるために、グルコース−６−リン酸の代謝に関わる酵素である、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をそれぞれ単独で破壊した株、またはその両者を同時に遺伝子破壊した株を用いることが望ましい。 In addition, in order to suppress degradation metabolism by bacteria of glucose-6-phosphate, which is a direct substrate for DOI production, and enhance DOI production ability, phospho, which is an enzyme involved in glucose-6-phosphate metabolism It is desirable to use a strain in which the genes encoding glucose isomerase and gluconate dehydrogenase are each disrupted alone, or a strain in which both are disrupted simultaneously.
［ＤＯＩ合成酵素遺伝子］
Ｄ−グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）からのＤＯＩの合成に関与する酵素の遺伝子としては特に限定されないが、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＤＯＩ合成酵素の４２ｋＤａサブユニットをコードする遺伝子（ｂｔｒＣ）を用いることができる。
[DOI synthase gene]
The gene of an enzyme involved in the synthesis of DOI from D-glucose is not particularly limited, but a gene (btrC) encoding a 42 kDa subunit of DOI synthase derived from Bacillus circulans is used. be able to.
（特許文献２：日本国特許第３１２２７６２号：特開２０００−２３６８８１号公報）
（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０６６２７６）
（非特許文献２：Ｋｕｄｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ｖｏｌ． ５２ ５５９−５７１ （１９９９））
ＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子であればバチルス・サーキュランス以外の生物に由来する遺伝子も利用できる。
(Patent Document 2: Japanese Patent No. 3127622: Japanese Patent Laid-Open No. 2000-236881)
(Genbank AB06276)
(Non-Patent Document 2: Kudo, F., et al. J. Antibiot., Vol. 52 559-571 (1999))
As long as the gene encodes an enzyme having DOI synthase activity, a gene derived from an organism other than Bacillus circulans can also be used.
上記宿主酵母の中には遺伝暗号の読みとりに異常を示す場合がある。例えばキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（Ｙ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１ １６４−１６６（１９８９））やキャンディダ・マルトーサ（Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｙｅａｓｔ １１ ４３−５２（１９９５））は、遺伝暗号ＣＴＧが、ロイシンではなくセリンに翻訳される特殊な酵母である。このような酵母では、異種生物由来の遺伝子を発現させる場合、遺伝暗号の読みとりに異常が生じることから、当該酵素のアミノ酸配列の異なった酵素が合成されることがある。その結果、当該酵素の機能が十分発揮できないことがある。 Some of the above host yeasts may show abnormal reading of the genetic code. For example, Candida cylindracea (Y. Kawaguchi et al, Nature 341 164-166 (1989)) and Candida maltosa (H. Sugiyama et al, Yeast 11 43-52 (1995)). CTG is a special yeast that is translated into serine rather than leucine. In such a yeast, when a gene derived from a different organism is expressed, an abnormality occurs in reading of the genetic code, and thus an enzyme having a different amino acid sequence may be synthesized. As a result, the function of the enzyme may not be fully exhibited.
このような現象は、予め遺伝子内に含まれる遺伝暗号ＣＴＧをロイシンに対応する他の遺伝暗号（ＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣ，ＣＴＡ）に改変した遺伝子を使用することによって避けることができる。 Such a phenomenon can be avoided by using a gene obtained by modifying the genetic code CTG contained in the gene in advance to another genetic code (TTA, TTG, CTT, CTC, CTA) corresponding to leucine.
また、酵母を含む生物の遺伝暗号解析の結果、遺伝暗号の使用頻度は生物によって大きく異なることが明らかになっている。すなわち、複数ある同一アミノ酸を指定する遺伝暗号のうち，使用される遺伝暗号は生物によって偏りが認められ、使用頻度の高い遺伝暗号から成る遺伝子の翻訳効率が高いことが指摘されている。例えば，ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子をキャンディダ・マルトーサにおいて効率よく発現させるためには、上記の遺伝暗号ＣＴＧを他のロイシン対応遺伝暗号に改変することに加えて、キャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高い遺伝暗号に改変した遺伝子を使用することが好ましい。 As a result of genetic code analysis of organisms including yeast, it has become clear that the frequency of use of the genetic code varies greatly depending on the organism. That is, among the genetic codes that specify a plurality of identical amino acids, it is pointed out that the genetic code used is biased depending on the organism and that the translation efficiency of the gene consisting of the frequently used genetic code is high. For example, in order to efficiently express a gene encoding DOI synthase in Candida maltosa, in addition to changing the above genetic code CTG to another leucine-compatible genetic code, the frequency of use in Candida maltosa It is preferable to use a gene modified into a high genetic code.
本発明のＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝暗号に読みとり異常を示さない酵母の場合、上記の酵素遺伝子をそのまま利用可能であるが、アミノ酸配列を変更することなく当該酵母において使用頻度の高い遺伝暗号に改変した遺伝子を利用してもよい。また、遺伝暗号に読みとり異常を示す酵母の場合、上記の酵素遺伝子のＣＴＧコドンをＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣまたはＣＴＡに改変した遺伝子を利用してもよい。さらに、アミノ酸配列を変更することなく当該酵母において使用頻度の高い遺伝暗号に改変した遺伝子を利用してもよい。例えば、キャンディダ・マルトーサを宿主とした場合、本発明のＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子として配列番号１に示される遺伝子を利用することができる。上記遺伝子の塩基配列は、本発明のＤＯＩの合成酵素活性を有する酵素を合成する遺伝子であれば、その遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよい。 The gene encoding the DOI synthetase of the present invention can be used as it is in the case of yeast that does not show abnormalities in the genetic code, but it is frequently used in the yeast without changing the amino acid sequence. A gene modified into the genetic code may be used. Further, in the case of yeast that shows abnormal reading in the genetic code, a gene in which the CTG codon of the above enzyme gene is modified to TTA, TTG, CTT, CTC, or CTA may be used. Furthermore, a gene modified to a genetic code frequently used in the yeast may be used without changing the amino acid sequence. For example, when Candida maltosa is used as a host, the gene shown in SEQ ID NO: 1 can be used as a gene encoding the DOI synthase of the present invention. If the base sequence of the gene is a gene that synthesizes an enzyme having DOI synthetase activity of the present invention, the base sequence of the gene may have mutations such as deletion, substitution, and insertion.
［ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ユニットの構築］
酵母における遺伝子発現のためには、当該遺伝子の５’上流にプロモーター、ＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）等のＤＮＡ配列の連結、当該遺伝子の３’下流にポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ配列の連結が必要である。これらのＤＮＡ配列は酵母で機能する配列であればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものと誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターを用いてもよい。また、本発明の形質転換体においては、上記プロモーター、ターミネーターは、ＤＯＩの合成に使用する微生物種において機能するものである必要がある。
[Construction of DOI synthase gene expression unit]
For gene expression in yeast, a DNA sequence such as a promoter and UAS (Upstream Activation Sequence) is linked 5 ′ upstream of the gene, and a DNA sequence such as a poly A addition signal and a terminator is linked 3 ′ downstream of the gene. is required. Any DNA sequence can be used as long as it functions in yeast. There are promoters that constitutively express and promoters that inducibly express, but any promoter may be used. In the transformant of the present invention, the promoter and terminator must function in the microorganism species used for DOI synthesis.
以下、本発明の形質転換体に用いられる遺伝子発現カセット構築の例として、（Ａ）宿主としてキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａまたはＣ． ｍａｌｔｏｓａ）を使用する場合、（Ｂ）宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用する場合について具体的に説明する。 Hereinafter, as an example of constructing a gene expression cassette used in the transformant of the present invention, (A) when Candida maltosa (Candida maltosa) is used as the host, (B) Saccharomyces cerevisiae (B) as the host ( The case where Saccharomyces cerevisiae) is used will be specifically described.
（Ａ）宿主としてキャンディダ・マルトーサを使用する場合
宿主としてキャンディダ・マルトーサを使用する場合は、使用するブロモーター、ターミネーターはキャンディダ・マルトーサで機能するものでか、キャンディダ・マルトーサ由来のものであることがより好ましい。さらに好ましくは、キャンディダ・マルトーサＡＬＫ遺伝子のプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄ００４８１） （Ｍ． Ｔａｋａｇｉ， ｅｔ ａｌ． Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ， ｖｏｌ． ５， ２２１７−２２２６ （１９８９））（Ｍ． Ｏｈｋｕｍａ， ｅｔ ａｌ． ＤＮＡ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．１４ ｐ１６３−１７３， （１９９５））、またはそのプロモーターを改良したもの（後述）およびＡＬＫ遺伝子のターミネーター（配列番号６）を利用する。ＡＬＫ遺伝子はアルカンの末端酸化反応を触媒するＰ４５０をコードする遺伝子であり、アルカンや脂肪酸を炭素源とする培地において誘導的に高発現し（Ｍ． Ｏｈｋｕｍａ， ｅｔ ａｌ． ＤＮＡ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．１４ ｐ１６３−１７３， （１９９５））、そのプロモーターは、同様の条件下において異種遺伝子を高発現させるために利用することができる。（小暮高久、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａのｎ−アルカン誘導型チトクロームＰ４５０遺伝子群の転写誘導機構の解析、２００３年度、東京大学大学院博士論文）。プロモーターとしては、ＡＬＫ遺伝子の転写誘導に関わるプロモーター上の配列（シスエレメント）を多コピー連結し、より強カな誘導性をもたらすようにした改変型プロモーターを用いることができる。本発明においては、配列番号２に示すＡＬＫ１遺伝子のコアプロモーター領域（基本的な転写活性をもたらす領域）、または、配列番号３に示すＡＬＫ２遺伝子のコアプロモーター領域の直上流に、配列番号４に示すＡＬＫ１遺伝子プロモーター中に存在するアルカンや脂肪酸に応答した転写誘導に関与するシスエレメントを連結したもの、または、配列番号５に示すＡＬＫ２遺伝子プロモーター中に存在するアルカンや脂肪酸に応答した転写誘導に関与するシスエレメントを連結したものを用いるのが好ましい。尚、連結するシスエレメントの種類やコピー数は調節可能である（小暮高久、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａのｎ−アルカン誘導型チトクロームＰ４５０遺伝子群の転写誘導機構の解析、２００３年度、東京大学大学院博士論文）。この改変型プロモーターは、培地の炭素源の種類によらず、下流に連結した遺伝子の高発現をもたらすが、特にアルカンや脂肪酸に応答して特に強い発現をもたらす（図２）（小暮高久、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａのｎ−アルカン誘導型チトクロームＰ４５０遺伝子群の転写誘導機構の解析、２００３年度、東京大学大学院博士論文）。
(A) When using Candida maltosa as a host When using Candida maltosa as a host, the blower motor and terminator used may function in Candida maltosa or are derived from Candida maltosa It is more preferable that More preferably, the promoter of Candida maltosa ALK gene (Genbank D00481) (M. Takagi, et al. Agric. Biol. Chem., Vol. 5, 2217-2226 (1989)) (M. Ohkuma, et al. DNA.Cell.Biol., Vol.14 p163-173, (1995)), or an improved promoter thereof (described later) and an ALK gene terminator (SEQ ID NO: 6). The ALK gene is a gene encoding P450 that catalyzes the terminal oxidation reaction of alkane, and is inducibly highly expressed in a medium containing alkane or fatty acid as a carbon source (M. Ohkuma, et al. DNA. Cell. Biol.,). vol.14 p163-173, (1995)), and its promoter can be used for high expression of heterologous genes under similar conditions. (Takahisa Kogure, Analysis of transcription induction mechanism of n-alkane-inducible cytochrome P450 gene group of yeast Candida maltosa, 2003, The University of Tokyo Graduate School Doctoral Dissertation). As the promoter, a modified promoter in which multiple copies of a sequence (cis element) on the promoter involved in the induction of transcription of the ALK gene are linked so as to provide stronger inducibility can be used. In the present invention, the core promoter region of the ALK1 gene shown in SEQ ID NO: 2 (region that provides basic transcription activity) or the upstream of the core promoter region of the ALK2 gene shown in SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4. Concatenated cis elements involved in transcription induction in response to alkanes and fatty acids present in the ALK1 gene promoter, or involved in transcription induction in response to alkanes and fatty acids present in the ALK2 gene promoter shown in SEQ ID NO: 5. It is preferable to use one in which cis elements are linked. The type and copy number of the cis elements to be linked can be adjusted (Takahisa Kogure, analysis of the transcriptional induction mechanism of the n-alkane-inducible cytochrome P450 genes of the yeast Candida maltosa, 2003, the University of Tokyo Graduate School PhD thesis). This modified promoter provides high expression of downstream-linked genes regardless of the type of carbon source in the medium, but particularly high expression in response to alkanes and fatty acids (Fig. 2) (Takahisa Kogure, Yeast Analysis of transcriptional induction mechanism of n-alkane-inducible cytochrome P450 gene group of Candida maltosa, 2003, The University of Tokyo Graduate School Doctoral Dissertation).
プロモーターおよびターミネーターと構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を作製するためには、ＰＣＲ法が利用できる。なお、上記プロモーター及び／又はターミネーターのＤＮＡ配列は、キャンディダ・マルトーサで機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加されたＤＮＡ配列であってもよい。ＤＯＩ合成酵素遺伝子としては、上述したように、バチルス・サーキュランス由来のＤＯＩ合成酵素と同一のアミノ酸配列をコードし、キャンディダ・マルトーサのコドン利用率に適合するように合成した、配列番号１に示す遺伝子を用いることが好ましい。発現ベクターとして、自立増殖可能なｐＵＴＵ１（Ｍ． Ｏｈｋｕｍａ， ｅｔ ａｌ； Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８−３９５３（１９９８））やｐＢＴＨ２０Ａ （Ｈｉｋｉｊｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． １６， ２６１−２６６ （１９８９）、ｐＢＴＨ３０Ａ（ｐＢＴＨ２０ＡのＨＩＳ５遺伝子をＵＲＡ３遺伝子に置換したもの（（小林圭介 １９９６年東京大学大学院修士論文））などを用いることができる。また、キャンディダ・マルトーサ由来の自律複製配列（ＡＲＳ， ＣＥＮ）（Ｋａｗａｉ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ５１， １５８７−１５９１）、（Ｔａｋａｇｉ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖｏｌ． １６７， ５５１−５５５） 及びアミノ酸要求性を相補する選択マーカー遺伝子 （Ｈｉｋｉｊｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． １６， ２６１−２６６ （１９８９）（Ｋａｗａｉ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））、を大腸菌用のベクターに組み込んでも良い。また、遺伝子発現カセットを染色体上に組み込むこともできる。 In order to create a restriction enzyme site for linking the promoter and terminator to the structural gene, the PCR method can be used. The DNA sequence of the promoter and / or terminator may be a DNA sequence in which one or a plurality of bases are deleted, substituted, and / or added as long as it functions in Candida maltosa. . As described above, the DOI synthase gene encodes the same amino acid sequence as the DOI synthase derived from Bacillus circulans, and is synthesized so as to match the codon utilization of Candida maltosa. It is preferable to use the gene shown. As an expression vector, pUTU1 (M. Ohkuma, et al; J. Biol. Chem., Vol. 273, 3948-3953 (1998)) and pBTH20A (Hikiji et al. Curr. Genet., Vol. 16) capable of self-propagating. , 261-266 (1989), pBTH30A (in which the HIS5 gene of pBTH20A is replaced with the URA3 gene ((Kyosuke Kobayashi, 1996 Master's thesis, the University of Tokyo Graduate School)), etc. Replication sequence (ARS, CEN) (Kawai S., et al., Agric. Biol. Chem., Vol. 51, 1587-1591), (Takagi M., et al., J. Bacteriol., 167, 551-555) and a selectable marker gene that complements amino acid requirements (Hikiji et al. Curr. Genet., vol. 16, 261-266 (1989) (Kawai S., et al., Agric. Biol). Chem., Vol.55, 59-65 (1991)) may be incorporated into a vector for E. coli, and a gene expression cassette may be incorporated on the chromosome.
（Ｂ）宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを使用する場合
宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを使用する場合には、使用するプロモーター、ターミネーターはサッカロマイセス・セレビシエで機能するものであることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来であることがより好ましい。なお、上記プロモーター及び／又はターミネーターのＤＮＡ配列は、サッカロマイセス・セレビシエで機能する配列であれば、１つ若しくは複個の塩基が欠失、置換及び／又は、付加されたＤＮＡ配列であってもよい。サッカロマイセス・セレビシエにおいては、自律増殖可能な、ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＹＥｐｌａｃ１１２、ＹＥｐｌａｃ１９５、ＹＥｐｌａｃ１８１などのベクター（Ｇｉｅｔｚ， Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ７４ （１９８８） ５２７−５３４）を用いることができる。
(B) When Saccharomyces cerevisiae is used as a host When Saccharomyces cerevisiae is used as a host, the promoter and terminator used are preferably those that function in Saccharomyces cerevisiae, and are derived from Saccharomyces cerevisiae Is more preferable. The DNA sequence of the promoter and / or terminator may be a DNA sequence in which one or more bases are deleted, substituted, and / or added as long as it functions in Saccharomyces cerevisiae. . In Saccharomyces cerevisiae, vectors (Gietz, RD et al., Gene, 74 (1988) 527-534) that can autonomously proliferate, such as pYES2 (Invitrogen), YEplac112, YEplac195, and YEplac181, can be used. .
［酵母へのｂｔｒＣ発現コンストラクトの導入］
酵母にＤＯＩ合成に関与する遺伝子発現カセット組換えベクターを導入する際には、デルベルグ法（ｄｅｒｂｅｒｇ． Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１９，１０７２（１９７４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用いることができる。
[Introduction of btrC expression construct into yeast]
When introducing a gene expression cassette recombinant vector involved in DOI synthesis into yeast, the Delberg method (derberg. EM et al., J, Bacteriol, 119, 1072 (1974)) or electroporation method ( Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1.8.4, 1994) can be used.
宿主としては、例えば、キャンディダ・マルトーサＣＨＡＵ１株（Ｓ．Ｋａｗａｉ，ｅｔ ａｌ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））や、ＣＭＴ１０２株（Ｈ． Ｔａｋａｋｕ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂ． Ｃ． ， ｖｏｌ． ２７９， ２３０３０−２３０３７， ２００４）を用いることができる。本菌株に上記の形質転換法を用いてＤＯＩ合成酵素遺伝子発現カセットを形質転換することができる。 Examples of the host include Candida maltosa CHAU1 strain (S. Kawai, et al, Agric. Biol. Chem., Vol. 55, 59-65 (1991)) and CMT102 strain (H. Takaku, et al. J. B. C., vol. 279, 23030-23037, 2004) can be used. This strain can be transformed with a DOI synthase gene expression cassette using the transformation method described above.
また例えば宿主としてサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ株を用いることができる。本菌株に上記の形質転換法を用いてＤＯＩ合成酵素遺伝子発現カセットを形質転換することができる。 For example, the Saccharomyces cerevisiae W303-1A strain can be used as a host. This strain can be transformed with a DOI synthase gene expression cassette using the transformation method described above.
［ＤＯＩの合成方法（ｂｔｒＣ発現コンストラクトを導入した組み換え酵母の培養及びＤＯＩ生成量の定量）］
本発明のＤＯＩの製造方法は、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物から、ＤＯＩを採取する。
[DOI synthesis method (culture of recombinant yeast introduced with btrC expression construct and quantification of DOI production amount)]
In the method for producing DOI of the present invention, DOI is collected from a culture obtained by culturing the transformant of the present invention.
本発明の形質転換体を培養することによるＤＯＩの製造は、次のようにして行うことができる。 Production of DOI by culturing the transformant of the present invention can be carried out as follows.
培養に用いる炭素源としては、酵母が資化できるものであればどのようなものでもよく、単糖類もしくはオリゴ糖類またはでんぷんや米ぬかや廃糖蜜などの多糖類を含む原料に由来する単糖類が挙げられ、具体的にはＤ−グルコースが挙げられる。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を含む培地を使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であればよいが、２０乃至４０℃であり、３０℃付近がより好ましい。培養時間には特に制限はないが、１日から７日程度でよい。その後、得られた培養菌体又は培養上清液からＤＯＩを回収すればよい。 Any carbon source can be used as long as yeast can assimilate, and monosaccharides derived from raw materials containing monosaccharides or oligosaccharides or polysaccharides such as starch, rice bran, and molasses can be mentioned. Specific examples include D-glucose. In addition, when the expression of the promoter is inducible, an inducer may be added in a timely manner. As a nutrient source other than the carbon source, a medium containing a nitrogen source, inorganic salts, and other organic nutrient sources can be used. The culture temperature may be any temperature at which the bacteria can grow, but is 20 to 40 ° C, more preferably around 30 ° C. The culture time is not particularly limited, but may be about 1 to 7 days. Then, what is necessary is just to collect | recover DOI from the obtained cultured microbial cell or culture supernatant liquid.
炭素源としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース等の炭化水素や油脂類や脂肪酸類さらにはｎ−パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などがあげられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体などがあげられる。例えば、キャンディダ・マルトーサなどの培養において、炭素源として油脂を用いて培養することもできる。また、油脂を資化できないかまたは効率よく資化できない酵母では、培地中にリパーゼを添加することによって改善できる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。また、米ぬかのような混合炭素源を含むバイオマスを利用することもできる。Ｄ−グルコースにより遺伝子発現の抑制が起こる場合には、抑制の解除された株を用いる必要がある。 As the carbon source, hydrocarbons such as D-glucose, galactose, maltose, saccharose, and trehalose, fats and oils, fatty acids, and n-paraffin can be used. Examples of the fats and oils include rapeseed oil, coconut oil, palm oil, and palm kernel oil. Examples of fatty acids include saturated and unsaturated fatty acids such as hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, and myristic acid, and fatty acid derivatives such as esters and salts of these fatty acids. It is done. For example, in culturing Candida maltosa and the like, it is also possible to culture using fats and oils as a carbon source. Moreover, in the yeast which cannot assimilate fats and oils or cannot efficiently assimilate, it can improve by adding a lipase in a culture medium. Furthermore, the ability to assimilate fats and oils can be imparted by transforming the lipase gene. Biomass containing a mixed carbon source such as rice bran can also be used. When gene expression is suppressed by D-glucose, it is necessary to use a strain in which the suppression is released.
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。 Examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract, and the like. Examples of inorganic salts include sodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
その他の有機栄養源としては、アミノ酸類、例えば、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、トリプトファンなどが挙げられる。 Other organic nutrient sources include amino acids such as adenine, histidine, leucine, uracil, tryptophan and the like.
本発明において、ＤＯＩの培養液からの回収は，例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を除き、その濾液にイオン交換樹脂を添加し、蒸留水で溶出を行う。屈折率、ｐＨ、伝導率を測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除くことでＤＯＩを回収することができる。得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。 In the present invention, the DOI can be recovered from the culture solution by, for example, the following method. After completion of the culture, the cells are removed from the culture solution with a centrifuge or a filtration device to obtain a culture supernatant. The culture supernatant is further filtered to remove solids such as bacterial cells, and an ion exchange resin is added to the filtrate, followed by elution with distilled water. While measuring the refractive index, pH, and conductivity, the fraction containing no impurities is collected, and the DOI can be recovered by removing the solvent of the aqueous solution. The obtained DOI is analyzed by, for example, high performance liquid chromatography or nuclear magnetic resonance.
本発明のＤＯＩの製造方法は、上述のような構成からなるので、Ｄ−グルコースからヘキソキナーゼやＤＯＩ合成酵素を介してＤＯＩを効率良く製造できる。 Since the DOI production method of the present invention has the above-described configuration, DOI can be efficiently produced from D-glucose via hexokinase or DOI synthase.
また、上述したプラスミドｐＣｍ−ＤＯＩＳを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体、ｐＹＥＳ２−ＤＯＩＳを有するサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体等を作製し、培養する方法により、Ｄ−グルコースから、グルコース−６−リン酸を経て、更にＤＯＩ合成酵素が触媒する５ステツプの反応を経て、ＤＯＩを製造することができる。 Further, by preparing and culturing the above-mentioned Candida maltosa transformant having the plasmid pCm-DOIS, Saccharomyces cerevisiae transformant having pYES2-DOIS, and the like, glucose-6-phosphate is obtained from D-glucose. Then, DOI can be produced through a five-step reaction catalyzed by DOI synthase.
培養が終了した培養液中に含まれる除去すべき不純物としては、残存している炭素源としてのグルコース、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類がある。このうち培養条件の検討により、グルコースが完全に消費されるまで培養を続けることが可能になり、残る不純物は各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類となった。アミノ酸類の中には、リジンやヒスチジン、トリプトファンのようにアミノ基が複数個ある塩基性アミノ酸もあれば、グルタミン酸やアスパラギン酸のようにカルボキシル基を複数個持っている酸性アミノ酸も存在する。また、金属イオンは当然カチオンであるが、同時にそのカウンターイオンとしての塩素イオンや硫酸イオンなども培地中には存在している。したがって、そのような不純物をすべて吸着させて、かつ、ＤＯＩを吸着させない基材を探索すればよいことになる。 Impurities to be removed contained in the culture medium after culturing include glucose as a remaining carbon source, various amino acids or peptides, and various metal ions. By examining the culture conditions, it became possible to continue the culture until glucose was completely consumed, and the remaining impurities were various amino acids or peptides and various metal ions. Among amino acids, there are basic amino acids having a plurality of amino groups such as lysine, histidine and tryptophan, and acidic amino acids having a plurality of carboxyl groups such as glutamic acid and aspartic acid. In addition, the metal ions are naturally cations, but at the same time, chloride ions and sulfate ions as counter ions are also present in the medium. Therefore, it is only necessary to search for a substrate that adsorbs all such impurities and does not adsorb DOI.
本発明者らは、そのような考えに基づいて基材の探索と溶出条件を検討した結果、汎用されるイオン交換樹脂、例えば、ナトリウムイオン型または水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂および塩素イオン型または水酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂を用いる方法ではＤＯＩを収率よく精製することはできなかった。すなわち、それぞれを連結した二床式カラム、または両者を混合した混合ベッド型のカラムを用いても、その目的を達成することはできない結果となった。アミノ酸は２種類のイオン交換樹脂のどちらかに結合する。また金属イオンは陽イオン交換樹脂に結合するのに対し、ＤＯＩはイオン性の官能基を持たないために、いずれのイオン交換樹脂にも結合しない特性を持っている。従って、アミノ酸類および金属塩類はイオン交換樹脂に結合し、ＤＯＩのみが吸着せずに溶離してくると推察されるが、結果は異なっていた。ＤＯＩの回収率は５０％以下となり、かつイオン交換樹脂の使用条件により大きく変動した。大量処理する工業的方法に適合するためには、回収率がより高く加えて安定した成績が必要とされる。 As a result of investigating the base material and elution conditions based on such an idea, the present inventors have found that ion exchange resins that are widely used, for example, sodium ion type or hydrogen ion type strongly acidic cation exchange resins and chloride ions DOI could not be purified in a high yield by the method using the basic or hydroxide ion type basic anion exchange resin. That is, even if a two-bed column connected to each other or a mixed bed type column in which both are mixed is used, the object cannot be achieved. Amino acids bind to either of two types of ion exchange resins. In addition, metal ions are bonded to the cation exchange resin, whereas DOI does not have an ionic functional group, so that it does not bond to any ion exchange resin. Therefore, it is presumed that amino acids and metal salts bind to the ion exchange resin and only DOI is eluted without being adsorbed, but the results are different. The DOI recovery was 50% or less, and varied greatly depending on the use conditions of the ion exchange resin. In order to be compatible with industrial methods for mass processing, higher recovery rates and stable results are required.
本発明者らは、基材と精製条件を更に拡大して鋭意検討した結果、陰イオン交換樹脂のカウンターイオンとして有機酸イオンを用いる方法、すなわち有機酸イオン型陰イオン交換樹脂と水素イオン型陽イオン交換樹脂を用いた混合ベッド型カラムを用いることにより、ＤＯＩを効率よく精製できることを見いだした。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸などが挙げられるが、中でも酢酸が好ましく使用できる。この発明はＤＯＩがｐＨ８以上のアルカリ性領域で極めて分解し易く、ｐＨ３〜５の弱酸性条件下でのみ安定であるという性質を発見して初めて完成することができたものである。すなわち、ＤＯＩが酸性とアルカリ性の両領域で完全に安定であれば、汎用されている陰イオン交換樹脂と陽イオン交換樹脂を別々のカラムに重点した二床式カラムに培養液を流すという方法でも上記の不純物を除くことができたであろう。また、両領域でフルクトースと同等の安定性を有していれば、混合ベッド型カラムで精製が可能となったであろう。ＤＯＩが二床式カラムはもちろん、混合ベッド型カラムを使用しても分解が起こるほどアルカリ領域で不安定であることを見いだしたのは本発明者らが初めてである。
As a result of further diligent investigation by further expanding the base material and purification conditions, the present inventors have used a method of using organic acid ions as counter ions of an anion exchange resin, that is, an organic acid ion type anion exchange resin and a hydrogen ion type cation. It has been found that DOI can be efficiently purified by using a mixed bed column using an ion exchange resin. Examples of the organic acid include acetic acid, propionic acid, oxalic acid, etc. Among them, acetic acid can be preferably used. This invention was completed only after discovering the property that DOI is very easily decomposed in an alkaline region of
この問題を解決するために、用いるイオン交換樹脂に結合するカウンターイオンの選択を検討した結果、本発明者らは陰イオン交換樹脂のカウンターイオンとして有機酸イオンを用いる方法を見いだした。これにより溶離液中には有機酸が残り、ＤＯＩの溶離画分にも混入するが、これは溶離液をｐＨ４前後に保つのに有効である。有機酸の中でも酢酸は濃縮により除去できる長所を有している。
In order to solve this problem, as a result of studying selection of counter ions to be bound to the ion exchange resin to be used, the present inventors have found a method using organic acid ions as counter ions of the anion exchange resin. As a result, the organic acid remains in the eluent and is also mixed in the elution fraction of DOI. This is effective for keeping the eluent at around
これにより、Ｈ＋型の陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型の陰イオン交換樹脂を混合して作成した混合ベッド型イオン交換カラムに、培養液を通過させることにより、ＤＯＩを精製できることが明らかになり、本発明が完成された。これは工業的大量生産にも十分叶う方法である。 This clearly shows that DOI can be purified by passing the culture solution through a mixed bed ion exchange column prepared by mixing H + type cation exchange resin and organic acid ion type anion exchange resin. Thus, the present invention has been completed. This is a method that can be applied to industrial mass production.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例により、その技術範囲が限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子
酵母キャンディダ・マルトーサは、普遍的にはロイシンに翻訳されるＣＴＧコドンをセリンに翻訳する。このため、キャンディダ・マルトーサを宿主とする場合、発現させようとする異種遺伝子にＣＴＧコドンが含まれるとき、その遺伝子産物の活性が失われる可能性が考えられた。また、バチルス・サーキュランスの糖質環化酵素遺伝子ｂｔｒＣには多数のＣＴＧコドンが含まれていた。そこで、キャンディダ・マルトーサを宿主としてｂｔｒＣ遺伝子を発現させるにあたっては、ＣＴＧコドンを、ロイシンをコードするコドンに置換した遺伝子を合成した。また、ｂｔｒＣ遺伝子のいくつかのアミノ酸に対応するコドンは、キャンディダ・マルトーサでは稀にしか使われないものであり、そのようなコドンをそのまま使用すると、発現レベルが低下する恐れが考えられた。そこで、そのようなアミノ酸に対応するコドンは、キャンディダ・マルトーサにおけるコドン利用率に適合するように選択した。
The gene encoding DOI synthase Yeast Candida maltosa translates the CTG codon that is universally translated into leucine into serine. For this reason, when Candida maltosa is used as a host, the activity of the gene product may be lost when a heterologous gene to be expressed contains a CTG codon. The Bacillus circulans sugar cyclase gene btrC contained many CTG codons. Therefore, in order to express the btrC gene using Candida maltosa as a host, a gene was synthesized in which the CTG codon was replaced with a codon encoding leucine. In addition, codons corresponding to some amino acids of the btrC gene are rarely used in Candida maltosa, and using such codons as they are may cause a decrease in expression level. Therefore, codons corresponding to such amino acids were selected to match the codon usage in Candida maltosa.
コドンの使用頻度はＫｌａｕｓ ＷｏＩｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）を参考にした。具体的には、以下のように設計した。アラニンをコードするコドンは、ＧＣＴが２０個、ＧＣＣが６個、ＧＣＡが４個、ＧＣＧが１個になるように設計した。グルタミンをコードするコドンは、ＣＡＡが９個、ＣＡＧが１個になるように設計した。グルタミン酸をコードするコドンは、ＧＡＡが２３個、ＧＡＧが１個になるように設計した。システインをコードするコドンは、ＴＧＴが４個になるように設計した。アルギニンをコードするコドンは、ＡＧＡが１２個、ＣＧＴが２個になるように設計した。グリシンをコードするコドンは、ＧＧＴが２３個、ＧＧＡが３個、ＧＧＧが２個、ＧＧＣが１個になるように設計した。ロイシンをコードするコドンは、ＴＴＧが１８個、ＴＴＡが１３個、ＣＴＴが４個になるように設計した。バリンをコードするコドンは、ＧＴＴが１６個、ＧＴＣが５個、ＧＴＧが２個、ＧＴＡが１個になるように設計した。セリンをコードするコドンは、ＴＣＴが８個、ＴＣＣが４個、ＡＧＴが４個、ＴＣＡが３個、ＴＣＧが１個、ＡＧＣが１個になるように設計した。プロリンをコードするコドンは、ＣＣＡが１１個、ＣＣＴが３個になるように設計した。スレオニンをコードするコドンは、ＡＣＴが１１個、ＡＣＣが５個、ＡＣＡが２個になるように設計した。また、リジン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシンをコードするコドンは、バチルス・サーキュランスのｂｔｒＣ遺伝子のコドン配列をそのまま用いた。 The frequency of codon usage was determined by referring to Nonconventional Yeast in Biotechnology by Klaus WoIf (published by Springer). Specifically, it designed as follows. Codons encoding alanine were designed so that there were 20 GCTs, 6 GCCs, 4 GCAs, and 1 GCG. The codons encoding glutamine were designed to have 9 CAAs and 1 CAG. The codons encoding glutamic acid were designed so that there were 23 GAAs and 1 GAG. The codon encoding cysteine was designed to have 4 TGTs. The codons encoding arginine were designed to have 12 AGAs and 2 CGTs. The codons encoding glycine were designed so that there were 23 GGTs, 3 GGAs, 2 GGGs, and 1 GGC. The codons encoding leucine were designed to have 18 TTGs, 13 TTAs, and 4 CTTs. The codons encoding valine were designed to have 16 GTTs, 5 GTCs, 2 GTGs and 1 GTA. The codons encoding serine were designed to be 8 TCTs, 4 TCCs, 4 AGTs, 3 TCAs, 1 TCGs and 1 AGCs. The codon encoding proline was designed to have 11 CCA and 3 CCT. The codons encoding threonine were designed to have 11 ACT, 5 ACC, and 2 ACA. Further, the codon encoding lysine, aspartic acid, phenylalanine, tyrosine, histidine, asparagine, methionine, tryptophan, and isoleucine was the same as that of the btrC gene of Bacillus circulans.
このようにして糖質環化酵素ｂｔｒＣ遺伝子全長の塩基配列を設計した。その配列を、配列番号１に示す。その配列をもとに、合成オリゴＤＮＡとＰＣＲ法を用いてキャンディダ・マルトーサを宿主として発現させるためのｂｔｒＣ遺伝子の全合成を行った。合成した遺伝子の塩基配列にエラーが入っていないことは、シーケンスを読んで確認できた。 In this way, the nucleotide sequence of the full length of the carbohydrate cyclization enzyme btrC gene was designed. The sequence is shown in SEQ ID NO: 1. Based on the sequence, total synthesis of the btrC gene for expressing Candida maltosa as a host was performed using a synthetic oligo DNA and PCR method. It was confirmed by reading the sequence that there were no errors in the base sequence of the synthesized gene.
サッカロマイセス・セレビシエはキャンディダ・マルトーサのような遺伝暗号の読みとり異常を示さず、コドン利用率についても、それほど大きな偏りがみられない。従って、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを使用する場合には、バチルス・サーキュランスの糖質環化酵素の４２ｋＤａサブユニットをコードする遺伝子（ｂｔｒＣ）
（特開２０００−２３６８８１号公報）
（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０６６２７６）
（非特許文献２：Ｋｕｄｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ｖｏｌ． ５２ ５５９−５７１ （１９９９））
をそのまま使用した。
Saccharomyces cerevisiae does not show abnormal reading of the genetic code like Candida maltosa, and the codon usage is not so biased. Therefore, when Saccharomyces cerevisiae is used as a host, a gene (btrC) encoding the 42 kDa subunit of the carbohydrate cyclizing enzyme of Bacillus circulans
(Japanese Patent Laid-Open No. 2000-236881)
(Genbank AB06276)
(Non-Patent Document 2: Kudo, F., et al. J. Antibiot., Vol. 52 559-571 (1999))
Was used as is.
糖質環化酵素遺伝子発現コンストラクトの作製
（Ａ）キャンディダ・マルトーサを宿主とする発現コンストラクトの作製
全合成したｂｔｒＣ遺伝子全長をリン酸化後、ｐＵＣ１１９ベクターのマルチクローニングサイトのＨｉｎｃＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＣｍｂｔｒＣを構築した。次に配列番号３に示す、ＡＬＫ２遺伝子のコアプロモーター領域（−１８９ｂｐから−１ｂｐ、翻訳開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）を、キャンディダ・マルトーサ・ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡ２Ｃ−Ｆｗ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＴＡＣ−３'）、及び、プライマーＡ２Ｃ−Ｒｖ（５'−ＴＧＴＧＡＧＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＡＣ−３'）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９４℃×３０秒、５２℃×３０秒、６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル行った。以下、ＰＣＲ反応は同様の条件で行った。また、ｂｔｒＣ遺伝子の５’側領域を、ｐＵＣ−ＣｍｂｔｒＣを鋳型とし、プライマーＣｍｂｔｒＣ−Ｆｗ （５'−ＡＴＧＡＣＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧ−３'）、及び、ＣｍｂｔｒＣ−Ｒｖ２ （５'−ＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧ−３'）を用いて増幅した。増幅したコアプロモーター及びＣｍｂｔｒＣの５'側領域のＤＮＡ断片をリン酸化後、ライゲーション反応を行った。その反応液を鋳型として、プライマーＡ２Ｃ−Ｆｗ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＴＡＣ−３'）及びプライマーＣｍｂｔｒＣ−Ｒｖ２（５'−ＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧ−３'）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＬＫ２遺伝子のコアプロモーターの下流側（３’側）にｂｔｒＣ遺伝子の５’側領域が連結された断片を増幅した。そのＤＮＡ断片をＸｂａＩとＳｐｅＩで消化し、ｐＵＣ−ｂｔｒＣをＸｂａＩとＳｐｅＩで切断して生じるベクター側断片とライゲーション反応を行って連結し、ｐＵＣ−Ａ２Ｃ−ＣｍｂｔｒＣを構築した。また、キャンディダ・マルトーサのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＴＭＮ−Ｆｗ（５'−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＧ−３'）及びＴＭＮ−Ｒｖ（５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣ−３'）を用いてＡＬＫ１ターミネーターをＰＣＲ増幅し、プライマー部分に付加したＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトで切断したものを、ｐＵＣ−Ａ２Ｃ−ＣｍｂｔｒＣのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＵＣ−Ａ２Ｃ−ＣｍｂｔｒＣ−ＴＭＮを構築した。
Production of carbohydrate cyclase gene expression construct (A) Production of expression construct using Candida maltosa as a host After phosphorylating the entire synthesized btrC gene, it was inserted into the HincII site of the multi-cloning site of pUC119 vector and pUC -CmbtrC was constructed. Next, the core promoter region of the ALK2 gene shown in SEQ ID NO: 3 (-189 bp to -1 bp, A of translation initiation codon ATG is set to +1), Candida maltosa genomic DNA as a template, primer A2C-Fw ( 5′-GCTCTAGAGTTTTTTTTTTCCGCAATAC-3 ′) and primer A2C-Rv (5′-TGTGAGTTTAAAATGAATAATAAC-3 ′). For PCR amplification, KOD DNA polymerase (TOYOBO) was used as a heat-resistant DNA polymerase, and 30 cycles were performed with 94 ° C. × 30 seconds, 52 ° C. × 30 seconds, and 68 ° C. × 1 minute as one cycle. Hereinafter, the PCR reaction was performed under the same conditions. In addition, the 5 ′ region of the btrC gene was amplified using pUC-CmbtrC as a template and using the primers CmbtrC-Fw (5′-ATGAACTACTAAACAAATTTG-3 ′) and CmbtrC-Rv2 (5′-GACCAAGTTTTACTACACTAG-3 ′) did. A ligation reaction was performed after phosphorylating the amplified core promoter and the DNA fragment in the 5 ′ region of CmbtrC. Using the reaction solution as a template, PCR was performed using primer A2C-Fw (5′-GCTCTAGAGTTTTTTTTATTCCGCCAATAC-3 ′) and primer CmbtrC-Rv2 (5′-GACCAAGTTTTACTACACTAG-3 ′), and downstream of the core promoter of the ALK2 gene A fragment in which the 5 'region of the btrC gene was linked to (3' side) was amplified. The DNA fragment was digested with XbaI and SpeI, and pUC-btrC was cleaved with XbaI and SpeI and ligated with a vector side fragment to construct pUC-A2C-CmbtrC. In addition, using Candida maltosa genomic DNA as a template, using primers TMN-Fw (5′-AAAAACTGCAGAGATAGATGATTTTTCTTTTTATG-3 ′) and TMN-Rv (5′-CCCAAGCTTATGCATCTTTGAGATTGATC-3 ′), the ALK1 terminator, What was cleaved at the PstI and HindIII sites added to the portion was inserted into the PstI-HindIII site of the multicloning site of pUC-A2C-CmbtrC to construct pUC-A2C-CmbtrC-TMN.
シスエレメントを多コピー連結したＤＮＡ断片は、以下のようにして作製した。ｐＵＣ１１９のマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位をＢｇｌ ＩＩサイトに置換したプラスミドｐＵＣ１１９ＰＢ のＨｉｎｃ ＩＩサイトに特定のシスエレメントに相当するＤＮＡ断片を挿入し、塩基配列を確認後、そのプラスミドをＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢａｍＨＩで切断して目的のＤＮＡ断片を含む断片をそれぞれ切り出し、それらの断片とｐＵＣ１１９ＰＢをＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断した断片によるライゲーション反応を行うことで、目的の配列が直列に２コピー連結された状態で挿入されたプラスミドを得た。そのプラスミドに対して同様の操作を繰り返すことで、目的の断片のコピー数を２倍ずつ増幅することことが可能である。 A DNA fragment in which multiple copies of cis elements were ligated was prepared as follows. A DNA fragment corresponding to a specific cis element was inserted into the Hinc II site of the plasmid pUC119PB in which the PstI site of the multicloning site of pUC119 was replaced with the Bgl II site. After confirming the nucleotide sequence, the plasmid was cleaved with EcoRI + BglII or HindIII + BamHI. Then, each fragment containing the target DNA fragment was excised, and a ligation reaction was performed with these fragments and a fragment obtained by cleaving pUC119PB with EcoRI + HindIII to obtain a plasmid inserted with two copies of the target sequence connected in series. It was. By repeating the same operation on the plasmid, it is possible to amplify the copy number of the target fragment by 2 times.
ＡＲＲ１−２（配列番号４）が１６コピー直列に連結された断片をｐＵＣ−ＡＲＲ１−２×１６（小暮高久、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａのｎ−アルカン誘導型チトクロームＰ４５０遺伝子群の転写誘導機構の解析、２００４年度、東京大学大学院博士論文）からＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ処理により切り出し、平滑化処理後、ｐＵＣ−Ａ２Ｃ−ｂｔｒＣ−ＴＭＮのマルチクローニングサイトのＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＡＲＲ１ｍｕｌｔｉ−ＣｍｂｔｒＣを構築した。 PUC-ARR1-2 × 16 (Takahisa Kogure, analysis of transcription induction mechanism of n-alkane-inducible cytochrome P450 gene group of yeast Candida maltosa, ARC1-2 (SEQ ID NO: 4) linked in 16 copies in series, 2004 In the year, the doctoral dissertation of the University of Tokyo was cut out by EcoRI and BglII treatment, smoothed, and inserted into the SmaI site of the multicloning site of pUC-A2C-btrC-TMN to construct pUC-ARR1multi-CmbtrC.
同様に、ＡＣＲＲ２−２（配列番号５）が８コピー連結された断片をｐＵＣ−ＡＣＲＲ２−２×８（小暮高久、ｎ−アルカン誘導型チトクロームＰ４５０遺伝子群の転写誘導機構の解析、２００４年度、東京大学大学院博士論文）からＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ処理により切り出し、平滑化処理後、ｐＵＣ−Ａ２Ｃ−ＣｍｂｔｒＣ−ＴＭＮのマルチクローニングサイトのＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＡＣＲＲ２ｍｕｌｔｉ−ＣｍｂｔｒＣを構築した。 Similarly, a fragment in which 8 copies of ACRR2-2 (SEQ ID NO: 5) were ligated was designated as pUC-ACRR2-2 × 8 (Takahisa Kogure, Analysis of transcription induction mechanism of n-alkane-inducible cytochrome P450 genes, 2004, Tokyo, Japan. From the doctoral dissertation of the University Graduate School), it was cut out by EcoRI and BglII treatment, smoothed, and then inserted into the SmaI site of the multicloning site of pUC-A2C-CmbtrC-TMN to construct pUC-ACRR2multi-CmbtrC.
キャンディダ・マルトーサ内での自律複製配列（ＡＲＳ）とウラシル要求性を相補するマーカー遺伝子ＵＲＡ３を、ｐＢＴＨ３０Ａ（ｐＢＴＨ２０Ａ（Ｈｉｋｉｊｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． １６， ２６１−２６６ （１９８９） のＨＩＳ５遺伝子をＵＲＡ３遺伝子に置換したもの（小林圭介 １９９６年東京大学大学院修士論文））を鋳型とし、プライマーＵＲＡ／５'（５'−ＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＣＧ−３'）とプライマーＡＲＳ／３'（５'−ＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＧＡＴＴＡＴＣ−３'）を用いてＰＣＲ増幅した。そのＤＮＡ断片をＰＣＲプライマーに付加したＳａｃＩサイトで切断後、ｐＵＣ−ＡＲＲ１ｍｕｌｔｉ−ＣｍｂｔｒＣのＳａｃＩサイト、または、ｐＵＣ−ＡＣＲＲ２ｍｕｌｔｉ−ＣｍｂｔｒＣのＳａｃＩサイトに挿入し、キャンディダ・マルトーサを宿主とするｂｔｒＣ発現プラスミド、ｐＣＭＡ１−ｂｔｒＣ（図４）及びｐＣＭＡ２−ｂｔｒＣ（図５）をそれぞれ構築した。 The marker gene URA3, which complements the autonomously replicating sequence (ARS) in Candida maltosa and uracil requirement, was designated as pBTH30A (pBTH20A (Hikiji et al. Curr. Genet., Vol. 16, 261-266 (1989) HIS5). Using URA3 gene as a template (Kyosuke Kobayashi 1996 Master's thesis, Graduate School of Tokyo University) as a template, primer URA / 5 '(5'-AAAAGTACACTTACTTTTTTTTTTGTTTTCGCG-3') and primer ARS / 3 '(5'-AAAAGTACTACATCATATCATATCATATCATAT The DNA fragment was cleaved at the SacI site added to the PCR primer, and then pUC-ARR1multi- Inserted into the SacI site of mbtrC or the SacI site of pUC-ACRR2multi-CmbtrC, and constructed btrC expression plasmids pCMA1-btrC (FIG. 4) and pCMA2-btrC (FIG. 5) using Candida maltosa as hosts. .
ｐＣＭＡ１−ｂｔｒＣまたはｐＣＭＡ２−ｂｔｒＣをキャンディダ・マルトーサＣＭＴ１０２株に、上記した形質転換法を用いて導入し、選択培地上で形質転換体を選別することにより、ｐＣＭＡ１−ＣｍｂｔｒＣまたはｐＣＭＡ２−ＣｍｂｔｒＣを保有するキャンディダ・マルトーサＣＭＴ１０２株を作製した。 pCMA1-CmbtrC or pCMA2-CmbtrC is retained by introducing pCMA1-btrC or pCMA2-btrC into the Candida maltosa CMT102 strain using the transformation method described above and selecting the transformant on a selective medium. Candida maltosa CMT102 strain was prepared.
（Ｂ）宿主としてサッカロマイセス・セレビシエを用いる場合
また、ｐＤＳ４ （Ｋｕｄｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ｖｏｌ． ５２ ５５９−５７１ （１９９９））を鋳型とし、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したプライマーｂｔｒＣ／Ｆｗ（５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧ−３'）及び、ＸｂａＩサイトを付加したプライマーｂｔｒＣ／Ｒｖ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣ−３'）を用いてＰＣＲを行い、Ｎ末端にヒスチジンタグを付加したｂｔｒＣ遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をプライマー上にデザインしたＨｉｎｄＩＩＩ、及びＸｂａＩで消化後、ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトに挿入することによって、ｐＹＥＳ２−ｂｔｒＣを構築した（図６）。
(B) When Saccharomyces cerevisiae is used as a host. Furthermore, pDS4 (Kudo, F., et al. J. Antibiot., Vol. 52 559-571 (1999)) is used as a template, and a primer btrC / PCR was performed using Fw (5′-CCCAAGCTTATGAGAGGATCTCCATCATCATCATCATCATCATATGACGACTAAAACAAATTTG-3 ′) and the primer btrC / Rv (5′-GCTCTAGTAGTACCCCCTCTCCGGATCAC-3 ′) added with the XbaI site to the end using PCR. . The amplified DNA fragment was digested with HindIII and XbaI designed on the primer, and then inserted into the HindIII-XbaI site of the multicloning site of vector pYES2 (Invitrogen) to construct pYES2-btrC (FIG. 6).
また、Ｄ−グルコースを炭素源とする培地で強い発現をもたらす、ＰＧＫ１プロモーターを用いたｂｔｒＣの発現カセットを以下のようにして作製した。 In addition, a btrC expression cassette using the PGK1 promoter, which produces strong expression in a medium containing D-glucose as a carbon source, was prepared as follows.
プロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＧＫ１ Ｆｗプライマー（５'−ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＣＡＣＡＡＴＡＧＡＡＧＣ−３'）とＰＧＫ１ Ｒｖプライマー（５'−ＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧ−３'）を設計し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、反応は、９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で２０秒間、４８℃で３０秒間、６８℃で１．５分間を３５サイクル、さらに６８℃で３分間を１サイクル、行った。ＰＣＲ産物を５’−リン酸化した。次に、ＤＯＩ合成酵素ｂｔｒＣは、ｂｔｒＣ−Ｆｗプライマー（５'−ＡＴＧＡＣＧＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧ−３'）と、ｂｔｒＣ−Ｒｖプライマー（５'−ＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＡＴＣ−３'）を設計し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、反応は、９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で１．２分間を３５サイクル、さらに６８℃で３分間を１サイクル行った。ＰＣＲ産物を５’−リン酸化した。リン酸化したＰＧＫ１とｂｔｒＣでライゲーション反応を行った。この反応液を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で２．４５分間を３５サイクル、さらに６８℃で５分間を１サイクル、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を５’−リン酸化し、ＹＥｐｌａｃ１１２ベクターに挿入してＹＥｐ−ＰＧＫ１−ｂｔｒＣを得た（図７）。 As a promoter, Saccharomyces cerevisiae genomic DNA was used as a template, and a PGK1 Fw primer (5′-GGAATTCACTTAAGCCACAAATAGAGC-3 ′) and a PGK1 Rv primer (5′-TGTTTTATTATTTGTTGTAAAAAG-3 ′) were designed and PCR-amplified. PCR uses KOD plus polymerase (TOYOBO) and the reaction consists of 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 48 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1.5 minutes, One cycle was performed at 68 ° C. for 3 minutes. The PCR product was 5'-phosphorylated. Next, the DOI synthase btrC was designed by PCR with the btrC-Fw primer (5′-ATGACGACTAAACAAATTTG-3 ′) and the btrC-Rv primer (5′-TTACAGCCCTTCCCGAGATC-3 ′). PCR uses KOD plus polymerase (TOYOBO) and the reaction consists of 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1.2 minutes, One cycle was performed at 68 ° C. for 3 minutes. The PCR product was 5'-phosphorylated. A ligation reaction was performed with phosphorylated PGK1 and btrC. PCR was performed using this reaction solution as a template. PCR is 94 ° C. for 2 minutes for 1 cycle, followed by 94 ° C. for 20 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2.45 minutes for 35 cycles, 68 ° C. for 5 minutes for 1 cycle, KOD plus polymerase (TOYOBO) was used. The PCR product was 5'-phosphorylated and inserted into the YEplac112 vector to obtain YEp-PGK1-btrC (Fig. 7).
ｐＹＥＳ２−ｂｔｒＣをサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ株に上記形質転換法により導入し、選択培地上で形質転換体を選別することにより、ｐＹＥＳ２−ｂｔｒＣを保有するＷ３０３−１Ａ株を作製した。ＹＥｐ−ＰＧＫ１−ｂｔｒＣをサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ株に上記形質転換法により導入し、選択培地上で形質転換体を選別することにより、ＹＥｐ−ＰＧＫ１−ｂｔｒＣを保有するＷ３０３−１Ａ株を作製した。 pYES2-btrC was introduced into the Saccharomyces cerevisiae W303-1A strain by the above-described transformation method, and a transformant was selected on a selective medium to prepare a W303-1A strain carrying pYES2-btrC. YEp-PGK1-btrC was introduced into the Saccharomyces cerevisiae strain W303-1A by the above-described transformation method, and a transformant was selected on a selective medium to produce a W303-1A strain carrying YEp-PGK1-btrC. .
キャンディダ・マルトーサ形質転換体におけるＤＯＩ合成酵素の発現の確認（図８）
ｐＣＭＡ１−ｂｔｒＣを導入したキャンディダ・マルトーサ形質転換体を８ ｍｌのグルコース培地またはアルカン培地で、３０℃で、２日間培養を行った。菌体を遠心により回収し、フレンチプレスにより細胞を破砕した。菌体抽出液を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動させ、クマシー染色によりバンドを検出した。また、抗ｂｔｒＣ抗体を用いたウェスタン解析により、キャンディダ・マルトーサ形質転換体におけるｂｔｒＣの発現を確認した（図８）。その結果、ｐＣＭＡ１−ｂｔｒＣを導入したキャンディダ・マルトーサ形質転換体に特異的にｂｔｒＣが発現していることが確認された（図８）。
Confirmation of DOI synthase expression in Candida maltosa transformants (FIG. 8)
The Candida maltosa transformant introduced with pCMA1-btrC was cultured at 30 ° C. for 2 days in 8 ml of glucose medium or alkane medium. The cells were collected by centrifugation, and the cells were crushed with a French press. The bacterial cell extract was subjected to 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and a band was detected by Coomassie staining. In addition, the expression of btrC in the Candida maltosa transformant was confirmed by Western analysis using an anti-btrC antibody (FIG. 8). As a result, it was confirmed that btrC was specifically expressed in the Candida maltosa transformant introduced with pCMA1-btrC (FIG. 8).
キャンディダ・マルトーサ形質転換体を用いるＤＯＩの合成−１
プラスミドｐＣＭＡ１−ＤＯＩＳを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を５ｍｌのアルカン培地（２％ドデカン、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）入り試験管に接種して、これを培養温度３０℃で、３日間培養した。続いて、菌体を遠心分離により回収し、グルコース培地（１％Ｄ−グルコース、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）に菌体を移してさらに３０℃で２４時間培養を行った。培養上清液をｐＨ３に調整した調整上清液４００μｌとＨＰＬＣ用メタノール４００μｌを混合し、さらに１０ｍｇ／ｍｌ Ｏ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＣＲＯＳ社）ピリジン溶液を８０μｌ添加して、温度６０℃で１時間のオキシム化反応を行った。
Synthesis of DOI using Candida maltosa transformant-1
Candida maltosa transformant carrying plasmid pCMA1-DOIS is inoculated into a test tube containing 5 ml of alkane medium (2% dodecane, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate), and this is cultured at a culture temperature of 30. The cells were cultured at 3 ° C. for 3 days. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, transferred to a glucose medium (1% D-glucose, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate), and further cultured at 30 ° C. for 24 hours. It was. 400 μl of the adjusted supernatant liquid adjusted to
この反応液を、Ｓｐｅｅｐ Ｖａｃ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社ＩＳＳ１１０）を用いて乾燥させた後、再度ＨＰＬＣ用メタノール５０μｌを加え、超音波によって溶解させた。この溶液を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。 After drying this reaction solution using a Speed Vac System (Thermo ISS110), 50 μl of methanol for HPLC was added again and dissolved by ultrasonic waves. This solution was analyzed by high performance liquid chromatography.
高速液体クロマトグラフィーではＳＨＩＭＡＤＺＵ社ＬＣ−１０ＡＴ、カラムとしてはＰｈｒｎｏｍｅｎｅｘ社Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（カラム長１５０ｍｍ、カラム内径４．６ｍｍ）を用い、溶離液として２０％メタノールを用い、２６２ｎｍにおける紫外線吸収を測定した。ＤＯＩのＯ−（４−ニトロベンジル）オキシム誘導体の量を、標準曲線法により定量した。
In high performance liquid chromatography, SHIMADZU LC-10AT was used, Phranomenex Luna 5u C18 (
得られたチャートを図９に示す。化学的に合成したＤＯＩオキシム体の標品のチャートと比較した結果、ＤＯＩのオキシム体に相当するピークが形質転換体の培養上清から検出されたことから、酵母キャンディダ・マルトーサの形質転換体を用いて、Ｄ−グルコースからＤＯＩを合成できることが判明した。 The obtained chart is shown in FIG. As a result of comparison with a chart of a chemically synthesized DOI oxime preparation, a peak corresponding to the DOI oxime form was detected from the culture supernatant of the transformant, so that the transformant of yeast Candida maltosa Was found to be able to synthesize DOI from D-glucose.
キャンディダ・マルトーサ形質転換体を用いるＤＯＩの合成−２
米ぬか培地の作製は以下のようにして行った。重量にして２０％の米ぬかをオートクレーブで処理した後、耐熱性α−アミラーゼ（アミラーゼＡＤ「アマノ」１）を０．３％濃度加え、７０℃で一晩反応させた。その後、ｐＨ５に調整し、耐熱性グルコアミラーゼ（グルクザイムＡＦ６）を０．１％加え、５８℃で一晩放置した。反応液を遠心分離し、上清を米ぬか培地として使用した。
Synthesis of DOI using Candida maltosa transformant-2
The rice bran medium was prepared as follows. After treating rice bran of 20% by weight with an autoclave, 0.3% concentration of thermostable α-amylase (amylase AD “Amano” 1) was added and reacted at 70 ° C. overnight. Thereafter, the pH was adjusted to 5 and 0.1% of thermostable glucoamylase (Gluczyme AF6) was added and left at 58 ° C. overnight. The reaction solution was centrifuged, and the supernatant was used as a rice bran medium.
プラスミドｐＣＭＡ１−ＤＯＩＳを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を米ぬか培地に植菌し、３０℃で２日間培養した。その培養上清を実施例４に記述した方法と同様に処理し、ＨＰＬＣによる分析を行った。その結果、図９に示すチャートと同様のチャートが得られ、ＤＯＩのオキシム体に相当するピークが検出されたことから、ＤＯＩが生成していることが示された。 Candida maltosa transformant having plasmid pCMA1-DOIS was inoculated into rice bran medium and cultured at 30 ° C. for 2 days. The culture supernatant was treated in the same manner as described in Example 4 and analyzed by HPLC. As a result, a chart similar to the chart shown in FIG. 9 was obtained, and a peak corresponding to the oxime body of DOI was detected, indicating that DOI was generated.
サッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を用いるＤＯＩの合成
プラスミドｐＹＥＳ２−ＤＯＩＳを有するサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ株を次のように培養した。前培養にはグルコース培地（１％Ｄ−グルコース、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）を使用した。また、誘導培地としてはガラクトース培地（２％ガラクトース、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）を使用した。ＤＯＩ合成培地としては、ＳＤ培地（２％Ｄ−グルコース、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）を使用した。
Synthesis of DOI using Saccharomyces cerevisiae transformant Saccharomyces cerevisiae W303-1A strain having plasmid pYES2-DOIS was cultured as follows. A glucose medium (1% D-glucose, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate) was used for the preculture. Further, a galactose medium (2% galactose, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate) was used as the induction medium. As the DOI synthetic medium, SD medium (2% D-glucose, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate) was used.
形質転換株はグルコース寒天培地ストックから菌体を３ｍｌのグルコース培地が入った試験管に接種して、これを培養温度３０℃で、１昼夜前培養した。前培養菌体を１％濃度で、ガラクトース培地に植菌し、２４時間、３０℃で培養を行った。その菌体を遠心分離により回収し、続いてＤＯＩ合成培地に移して、さらに２４時間、３０℃で培養を行った。 The transformed strain was inoculated with a bacterial cell from a glucose agar medium stock into a test tube containing 3 ml of glucose medium, and cultured at 30 ° C. for one day and night. The precultured cells were inoculated in a galactose medium at a concentration of 1% and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The cells were collected by centrifugation, transferred to a DOI synthesis medium, and further cultured at 30 ° C. for 24 hours.
培養上清液をｐＨ３に調整した調整上清液４００μｌとＨＰＬＣ用メタノール４００μｌを混合し、さらに１０ｍｇ／ｍｌ 塩酸Ｏ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（ＡＣＲＯＳ社）のピリジン溶液を８０μｌ添加して、反応温度６０℃で１時間のオキシム化反応を行った。ＤＯＩのオキシム体の構造を図に示す。この反応液を、Ｓｐｅｅｐ Ｖａｃ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社ＩＳＳ１１０）を用いて乾燥させた後、再度ＨＰＬＣ用メタノール５０μｌを加え、超音波によって溶解させた。
400 μl of the adjusted supernatant liquid adjusted to
この溶液を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。高速液体クロマトグラフィーではＳＨＩＭＡＤＺＵ社ＬＣ−１０ＡＴ、カラムとしてはＰｈｒｎｏｍｅｎｅｘ社Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（カラム長１５０ｍｍ、カラム内径４．６ｍｍ）を用いた。
This solution was analyzed by high performance liquid chromatography. In high performance liquid chromatography, SHIMADZU LC-10AT was used, and as the column, Phrnomenex Luna 5u C18 (
得られたチャートを図１０に示す。ＤＯＩのオキシム体に相当するピークが検出されたことから、酵母サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体を用いて、Ｄ−グルコースからＤＯＩを合成できることが判明した。 The obtained chart is shown in FIG. Since a peak corresponding to the oxime form of DOI was detected, it was found that DOI can be synthesized from D-glucose using a transformant of yeast Saccharomyces cerevisiae.
キャンディダ・マルトーサ形質転換体を用いるＤＯＩの合成−１
実施例４と同様にして、プラスミドｐＣＭＡ１−ＤＯＩＳを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を５ｍｌのアルカン培地（２％ドデカン、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）入り試験管に接種して、これを培養温度３０℃で、３日間培養した。続いて、菌体を遠心分離により回収し、グルコース培地（１％Ｄ−グルコース、０．１７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム）に菌体を移してさらに３０℃で２４時間培養を行った。
Synthesis of DOI using Candida maltosa transformant-1
In the same manner as in Example 4, Candida maltosa transformant having plasmid pCMA1-DOIS was inoculated into a test tube containing 5 ml of alkane medium (2% dodecane, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate). This was cultured at a culture temperature of 30 ° C. for 3 days. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, transferred to a glucose medium (1% D-glucose, 0.17% Yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate), and further cultured at 30 ° C. for 24 hours. It was.
アンバーライトＩＲ１２０とアンバーライトＩＲＡ４１０の混合ベッド型樹脂を用いる方法
Ｈ＋型のアンバーライトＩＲ１２０と酢酸型のアンバーライトＩＲＡ４１０を各２００ｍｌずつ混合した後、カラム（φ５ｃｍ×２５ｃｍ）に充填した。これにｐＨ２.９６に調整した、上記の培養液１００ｍｌ（１.４ｇのＤＯＩを含む）を添加した後、蒸留水を流速２ｍｌ／ｍｉｎで流すことにより溶離を行った。６ｍｌずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて１本おきにｐＨおよび伝導度を測定した。また、３本おきにＤＯＩの定量も行った。ＤＯＩの定量は、Ｏ−（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｉｍｅに誘導した後、ＨＰＬＣで面積を測定した後、検量線より計算した。このときの結果を図１１に示す。また、フラクションを４つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のＤＯＩの純度および量を測定した。結果を表１に示す。得られた精製ＤＯＩのＣ−１３ＮＭＲスペクトルを図１２に示す。Ｃ−１３ＮＭＲスペクトルは、重水に溶解した試料をＢｒｕｋｅｒ社のＤＰＸ−２５０ＮＭＲ装置（Ｃ−１３核は６７.５ＭＨｚで共鳴）を用いて測定した。
Method using a mixed bed type resin of Amberlite IR120 and Amberlite IRA410 After mixing 200 ml each of H + type Amberlite IR120 and acetic acid type Amberlite IRA410, the column (φ5 cm × 25 cm) was packed. After adding 100 ml of the above culture solution (containing 1.4 g of DOI) adjusted to pH 2.96, elution was performed by flowing distilled water at a flow rate of 2 ml / min. Six ml fractions were collected and the pH and conductivity of every other fraction were measured. In addition, DOI was also quantified every third. The quantification of DOI was calculated from the calibration curve after measuring the area by HPLC after inducing O- (4-nitrobenzoyl) oxime. The result at this time is shown in FIG. In addition, the fractions were collected in 4 blocks and freeze-dried, and then the purity and amount of DOI in each block were measured. The results are shown in Table 1. The C-13 NMR spectrum of the obtained purified DOI is shown in FIG. The C-13 NMR spectrum was measured on a sample dissolved in heavy water using a Bruker DPX-250 NMR apparatus (the C-13 nucleus resonates at 67.5 MHz).
アンバーライトＩＲ２００とアンバーライトＩＲＡ４１０の混合ベッド型樹脂を用いる方法
Ｈ＋型のアンバーライトＩＲ２００と酢酸型のアンバーライトＩＲＡ４１０を各２００ｍｌずつ混合した後、カラム（φ５ｃｍ×２５ｃｍ）に充填した。これにｐＨ２.９７に調整した、実施例７の培養液５０ｍｌ（５６２ｍｇのＤＯＩを含む）を添加した後、蒸留水を流速２ｍｌ／ｍｉｎで流すことにより溶出を行った。６ｍｌずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて１本おきにｐＨおよび伝導度を測定した。また、３本おきにＤＯＩの定量も行った。このときの結果を図１３に示す。また、フラクションを４つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のＤＯＩの純度および量を測定した。結果を表２に示す。得られた精製ＤＯＩのＣ−１３ＮＭＲスペクトルを図１４に示す。ＤＯＩの定量方法およびＣ−１３ＮＭＲスペクトルの測定方法は実施例８と同様にして行った。
Method using a mixed bed type resin of Amberlite IR200 and
［微生物の受領番号］
本発明において使用される微生物の受領番号として以下のように付与されている。
受領機関名 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
受領日 平成１７年３月１８日
受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６３
[Microbe receipt number]
The receipt number of the microorganism used in the present invention is given as follows.
Name of recipient organization National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center Date of receipt March 18, 2005 Receipt number FERM AP-20463
本発明により、従来の石油由来の化学物質に代わり、再生可能な資源である、でんぷんなどのバイオマス由来の原料を用いて、発酵法により、様々な炭素６員環化合物の製造のための出発原料となる高純度ＤＯＩを製造することが可能となった。 According to the present invention, instead of conventional petroleum-derived chemical substances, starting materials for the production of various carbon 6-membered ring compounds by fermentation using raw materials derived from biomass, such as starch, which are renewable resources It became possible to produce high-purity DOI.
Claims (12)
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