JP2006254927A - 細胞のアポトーシス活性のモディファイヤーを同定するための迅速な方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する、単一ウェルのマイクロスケールの方法であって、該方法は、細胞の集団を覆うのために十分な容量の、アポトーシス特異的診断試薬および診断のアクセサリー試薬を含有する培地と、約1×105個の細胞の細胞の集団とを、約30分と4時間との間の時間接触させる工程、ならびにアポトーシス特異的診断試薬の活性を測定する工程を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、プログラムされた細胞死の生物学的プロセスに関する。そしてより詳細には、アポトーシス活性を測定する迅速な方法、およびアポトーシスを調節する化合物のスクリーニングする迅速な方法に関する。
(2)前記細胞集団が、約10,000個より多い細胞、より好ましくは約50,000個の細胞、そして好ましくは約100,000個の細胞をさらに含む、項目1に記載の方法。
(3)前記時間が、約30分と約4時間との間、より好ましくは約30と約2時間との間、そして好ましくは約1時間をさらに含む、項目1に記載の方法。
(4)前記容量が、約1μlと約200μlとの間、好ましくは約30μlと約200μlとの間、より好ましくは約100μlをさらに含む、項目1に記載の方法。
(5)前記アポトーシス特異的診断試薬が、カスパーゼ特異的基質またはアネキシンVをさらに含む、項目1に記載の方法。
(6)前記診断のアクセサリー試薬が、溶解試薬またはカルシウムである、項目5に記載の方法。
(7)前記アポトーシス特異的診断試薬が、検出可能な標識に結合されたカスパーゼ特異的基質を含む、項目1に記載の方法。
(8)前記アポトーシス特異的診断試薬が、ZEVD−AMC、YVAD−AMC、およびDEVD−AMCからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(9)マルチウェル形式をさらに含む、項目1に記載の方法。
(10)多数の異なるサンプルの同時の測定のための、多数の異なる単一ウェルをさらに含む、項目1に記載の方法。
(11)アポトーシスを誘導する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する細胞を提供する工程であって、該細胞生存性ポリペプチドは、アポトーシスの誘導を妨げるに十分なレベルで過剰発現されている、工程;
(b)細胞死の経路の直接的な刺激因子で、該細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する該細胞を処理する工程;
(c)アポトーシスを誘導する活性について試験される化合物を添加する工程;および
(d)細胞のアポトーシス活性を測定する工程であって、該活性の存在がアポトーシスのインデューサーである該化合物の指標である、工程、
を包含する、方法。
(12)前記細胞生存性ポリペプチドが、Bcl−2、BcL−xL、Mcl−1、およびE1B−19Kを含む、項目11に記載の方法。
(13)前記細胞生存性ポリペプチドが、細胞死の経路の直接的な刺激因子の誘導を妨げるためのレベルで過剰発現される、項目11に記載の方法。
(14)前記細胞生存性ポリペプチドが、Fasリガンド、抗Fas抗体、スタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される直接的な刺激因子によるアポトーシスの誘導を妨げるレベルで過剰発現される、項目13に記載の方法。
(15)前記細胞死の経路の直接的な刺激因子が、Fasリガンド、抗Fas抗体、スタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される、項目11に記載の方法。
(16)前記細胞生存性ポリペプチドが、外来性の核酸によってコードされる、項目11に記載の方法。
(17)前記外来性の核酸が、同種核酸または異種核酸のいずれかである、項目16に記載の方法。
(18)前記細胞生存性ポリペプチドが、内因性の核酸によってコードされる、項目11に記載の方法。
(19)前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞中のカスパーゼ活性を誘導する化合物をさらに含む、項目11に記載の方法。
(20)前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞生存性ポリペプチドの活性を阻害する化合物をさらに含む、項目11に記載の方法。
(21)前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞死ポリペプチドの活性を促進する化合物をさらに含む、項目11に記載の方法。
(22)前記工程(d)のアポトーシス活性の工程が、前記細胞を溶解させる工程、および該溶解物中のカスパーゼ活性を測定する工程をさらに包含する、項目11に記載の方法。
(23)前記工程(d)のアポトーシス活性の工程が、アネキシン5と前記細胞とを接触させる工程、および結合したアネキシン5の量を測定する工程をさらに包含する、項目11に記載の方法。
(24)アポトーシスを阻害する化合物を同定する迅速な方法であって、該方法が以下:
(a)多数の細胞の集団と、アポトーシス阻害活性について試験される異なる化合物とを別々に接触させる工程;
(b)約2分と3時間との間の時間、細胞死の経路の直接的な刺激因子とともに該細胞をインキュベートする工程;および
(c)該細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する工程、
を包含する、方法。
(25)前記細胞死の経路の直接的な刺激因子が、Fasリガンド、抗Fas抗体、およびスタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される、項目24に記載の方法。
(26)前記工程(c)が、前記細胞を溶解させる工程、および該溶解物中のカスパーゼ活性を測定する工程をさらに包含する、項目24に記載の方法。
(27)前記化合物が、カスパーゼ阻害活性を示す、項目24に記載の方法。
(28)前記化合物が、細胞生存性ポリペプチドの活性を促進する、項目24に記載の方法。
(29)前記化合物が、細胞死ポリペプチド阻害活性を示す、項目24に記載の方法。
発明の要旨
本発明は、細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する、単一ウェルのマイクロスケール法を提供する。この方法は、細胞の集団を覆うために十分な容量の、アポトーシス特異的診断試薬および診断のアクセサリー試薬を含有する培地と、約1×105個の細胞の細胞の集団とを、約30分から4時間の間の時間接触させる工程、ならびにアポトーシス特異的診断試薬の活性を測定する工程を含む。本発明はまた、アポトーシスを誘導する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む:(a)アポトーシスの誘導を妨げるに十分なレベルで、細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する細胞を提供する工程;(b)細胞死の経路の直接的な刺激因子で細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する細胞を処理する工程;(c)アポトーシスを誘導する活性について試験される化合物を添加する工程;および(d)細胞のアポトーシス活性を測定する工程であって、その活性の存在がアポトーシスのインデューサーである化合物の指標である、工程。本発明はさらに、アポトーシスを阻害する化合物を同定する迅速な方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む:(a)多数の細胞の集団を、アポトーシス阻害活性について試験される種々の化合物と別々に接触させる工程;(b)約2分から3時間の間の時間、細胞死の経路の直接的な刺激因子とともに細胞をインキュベートする工程、および(c)細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する工程。
本発明は、アポトーシスの迅速なそして効率的な測定のための新規の方法に関する。この方法は、細胞死の他の形態からアポトーシスを区別する点、および単一の工程で、そして小スケールの分析において行われ得る点で有利である。さらに、この方法は、約30分から4時間の間の時間で行われ得る点で迅速である。これらの利点によって、特異性を有して、そして当該分野で公知の以前の方法を用いては以前には達成されなかった時間で、多数のサンプルの高スループットスクリーニングが可能である。システインアスパラギン酸プロテアーゼ、またはアポトーシスの他の特異的な指標の活性を測定するこの方法は、細胞死の他の形態からアポトーシスを区別する。従って、この方法は、Bcl-2の機能を阻害する化合物のような、アポトーシスのインデューサーの特異的な同定のために、有利に使用され得る。
特異的なアポトーシス活性の測定
この実施例は、特異的なアポトーシス活性の測定、およびアポトーシスのインデューサーについての化合物ライブラリーのスクリーニングのための、単一ウェル法の使用および特徴づけを記載する。
アポトーシスの誘導のための化合物のスクリーニング
この実施例は、アポトーシスインデューサーの検出のための化合物ライブラリーのスクリーニングの使用を記載する。
Claims (34)
- 細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する、単一ウェルのマイクロスケールの方法であって、該方法が、細胞集団を覆うために十分な容量のアポトーシス特異的診断試薬および診断のアクセサリー試薬を含有する培地と該細胞集団とを接触させる工程、ならびに該細胞集団のアポトーシス活性を測定する工程を包含する、方法。
- 前記細胞集団が、約10,000個より多い細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アポトーシス診断試薬が、約30分から約4時間の間の時間、前記細胞集団との接触を維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記容量が、約1μlから約200μlの間を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アポトーシス特異的診断試薬が、カスパーゼ特異的基質またはアネキシンVを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記診断のアクセサリー試薬が、溶解試薬またはカルシウムである、請求項5に記載の方法。
- 前記アポトーシス特異的診断試薬が、検出可能な標識に結合されたカスパーゼ特異的基質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アポトーシス特異的診断試薬が、ZEVD-AMC、YVAD-AMC、およびDEVD-AMCからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 複数の単一ウェルが、複数のサンプルの同時の測定のためのマルチウェル形式で配置されている、請求項1に記載の方法。
- アポトーシスを誘導する化合物を同定する方法であって、該方法が以下の工程:
(a)細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する細胞を提供する工程であって、該細胞生存性ポリペプチドが、アポトーシスの誘導を妨げるに十分なレベルで過剰発現される、工程;
(b)該細胞生存性ポリペプチドを過剰発現する該細胞を、細胞死の経路の直接的な刺激因子で処理する工程;
(c)アポトーシス誘導活性について試験される化合物を添加する工程;および
(d)細胞のアポトーシス活性を測定する工程であって、ここで、該アポトーシス活性の存在がアポトーシスのインデューサーである該化合物の指標である、工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞生存性ポリペプチドが、Bcl-2、BcL-xL、Mcl-1、およびE1B-19Kを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞生存性ポリペプチドが、細胞死の経路の直接的な刺激因子の誘導を妨げるためのレベルで過剰発現される、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞生存性ポリペプチドが、Fasリガンド、抗Fas抗体、スタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される直接的な刺激因子によるアポトーシスの誘導を妨げるためのレベルで過剰発現される、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞死の経路の直接的な刺激因子が、Fasリガンド、抗Fas抗体、スタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞生存性ポリペプチドが、外来性の核酸によってコードされる、請求項10に記載の方法。
- 前記外来性の核酸が、同種核酸または異種核酸のいずれかである、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞生存性ポリペプチドが、内因性の核酸によってコードされる、請求項10に記載の方法。
- 前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞中のカスパーゼ活性を誘導する化合物をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞生存性ポリペプチドの活性を阻害する化合物をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記アポトーシス誘導活性について試験される化合物が、細胞死ポリペプチドの活性を促進する化合物をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記工程(d)のアポトーシス活性の工程が、前記細胞を溶解させる工程、および該溶解物中のカスパーゼ活性を測定する工程をさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- 前記工程(d)のアポトーシス活性の工程が、アネキシン5と前記細胞とを接触させる工程、および結合したアネキシン5の量を測定する工程をさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- アポトーシスを阻害する化合物を同定する迅速な方法であって、該方法が以下の工程:
(a)多数の細胞の集団を、アポトーシス阻害活性について試験される異なる化合物と別々に接触させる工程;
(b)約2分から3時間の間の時間、細胞死の経路の直接的な刺激因子とともに該細胞をインキュベートする工程;および
(c)該細胞の特異的なアポトーシス活性を測定する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞死の経路の直接的な刺激因子が、Fasリガンド、抗Fas抗体、およびスタウロスポリン、UV照射およびγ線照射からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記工程(c)が、前記細胞を溶解させる工程、および該溶解物中のカスパーゼ活性を測定する工程をさらに包含する、請求項23に記載の方法。
- 前記化合物が、カスパーゼ阻害活性を示す、請求項23に記載の方法。
- 前記化合物が、細胞生存性ポリペプチドの活性を促進する、請求項23に記載の方法。
- 前記化合物が、細胞死ポリペプチド阻害活性を示す、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞集団が、約50,000個より多い細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団が、約100,000個の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記時間が、約30分から約2時間の間である、請求項3に記載の方法。
- 前記時間が約1時間である、請求項3に記載の方法。
- 前記容量が、約30μlから約125μlの間である、請求項4に記載の方法。
- 前記容量が約100μlである、請求項4に記載の方法。
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