JP2006153591A - Mass production method for refined rare sugar - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、異性化反応により得られた希少糖混合溶液から目的希少糖を精製した形で分離する精製希少糖の大量生産方法、特に希少糖類の一つとしてその特性や機能性が注目される精製アロースの大量生産方法に関する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention focuses on a method for mass production of a purified rare sugar, in which the target rare sugar is separated from the rare sugar mixed solution obtained by the isomerization reaction in a purified form, and particularly its characteristics and functionality are one of the rare sugars. The present invention relates to a method for mass production of purified allose.
従来より、２成分以上を含有する原液中の特定成分を分離する方法として、擬似移動層式クロマト分離装置を用いた分離方法が知られている。この擬似移動層式クロマト分離装置は、代表的には原液中に含まれる２成分以上の成分中の特定成分に対して選択的吸着能力を有する吸着剤を充填した多数の充填塔を配管で直列に連結するとともに、最後部の充填塔と最前部の充填塔を配管で連結することによって、全体を無端に連結した充填塔群の系として形成した装置において、原液の供給、溶離液の供給、および非吸着液（つまり、吸着剤に対し吸着能力の低い非吸着物質を多く含む画分）の抜き出し、吸着液（つまり、吸着剤に対し吸着能力の高い吸着物質を多く含む画分）の抜き出しの各位置関係を一定に保ちながら、これらの位置を経時的に系内循環方向下流側に順次移行させることで、吸着剤の実際の移動を行わずに吸着剤が移動するのと同等の機能を発揮させ、移動層の処理操作を擬似的に実現する装置であることはよく知られている。このような擬似移動層式クロマト分離装置を用いて、糖類を含む原液からグルコースやフルクトースを含む画分を分離するようにした技術も知られている。この擬似移動層式のクロマト分離技術を用いて、プシコースとフルクトースを含む溶液からプシコースを高純度、高回収率で連続的に分離する方法が開発されている（特許文献１）。 Conventionally, a separation method using a simulated moving bed type chromatographic separation apparatus is known as a method for separating a specific component in a stock solution containing two or more components. This simulated moving bed type chromatographic separation apparatus typically has a large number of packed towers filled with an adsorbent having a selective adsorption ability for a specific component of two or more components contained in the stock solution in series by piping. In the apparatus formed as a system of a packed tower group in which the whole is connected endlessly by connecting the last packed tower and the front packed tower with pipes, supply of raw solution, supply of eluent, And extraction of non-adsorbing liquid (that is, a fraction containing a large amount of non-adsorbing substance having a low adsorption capacity with respect to the adsorbent) and extraction of an adsorbing liquid (that is, a fraction containing a large amount of adsorbing substance having high adsorption capacity with respect to the adsorbent) The function is equivalent to moving the adsorbent without actually moving the adsorbent by sequentially shifting these positions to the downstream side in the system circulation direction over time while keeping each positional relationship of the In the moving layer Operation is well known to be a pseudo realized that apparatus. A technique is also known in which a fraction containing glucose or fructose is separated from a stock solution containing saccharides using such a simulated moving bed type chromatographic separation apparatus. A method of continuously separating psicose with high purity and high recovery rate from a solution containing psicose and fructose using this simulated moving bed type chromatographic separation technique has been developed (Patent Document 1).
一方、新規な触媒機能を有する酵素、Pseudomonas stutzeri の生産するL-ラムノースイソメラーゼをコードする遺伝子配列を明らかとした（特許文献２）。希少糖戦略の中で、多種類の希少アルドースに作用し、多種類の希少ケトースを生産するために最も効率のよいイソメラーゼを得ることによって、多種類の希少糖を生産する反応系を確立した。これにより希少糖の生理活性探索に弾みがつき希少糖類の特性や機能性が次々と明らかにされて来ている。
しかし、希少糖類の一つとしてその特性や機能性が注目されるアロースをプシコースを原料として生産した場合、アロースおよびプシコースの混合物として得られるところ、希少糖類を生産対象糖類として、それを希少糖類同志の混合物から生産対象希少糖のみを大量に分離生産する技術は知られていない。
本発明は、生産することを目的とする希少糖を含む希少糖類同志の混合物からなる原液、あるいは、特定の酵素を用いて異性化した生産することを目的とする希少糖を含む原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離する精製希少糖の大量生産方法を提供することを目的とする。
より具体的には，本発明は、従来主として除去対象とされていた希少糖類のアロースの特性や機能性に着目し、アロースとプシコースを含む原液から、擬似移動層を用いて特定の条件で操作することにより、高純度かつ高回収率でプシコースを含む溶液を分離できる方法を提供することを目的とする。
However, when allose, whose characteristics and functionality are attracting attention as one of the rare saccharides, is produced using psicose as a raw material, it can be obtained as a mixture of allose and psicose. There is no known technique for separating and producing a large amount of only the rare sugar to be produced from this mixture.
The present invention mimics a stock solution composed of a mixture of rare saccharides including rare sugars intended to be produced, or a stock solution containing rare sugars intended to be isomerized using a specific enzyme. It is an object of the present invention to provide a method for mass production of a purified rare sugar that is chromatographically separated as a target rare sugar fraction continuously by a layer.
More specifically, the present invention focuses on the characteristics and functionality of allose, a rare sugar that has been mainly targeted for removal, and is operated from a stock solution containing allose and psicose using a simulated moving bed under specific conditions. It is an object of the present invention to provide a method capable of separating a solution containing psicose with high purity and high recovery rate.
本発明は、以下の（１）〜（１１）の精製希少糖の大量生産方法を要旨とする。
（１）異性化を触媒する酵素の作用で基質希少糖から目的希少糖へ変換し、得られる原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。
（２）基質希少糖Ｄ−プシコースから目的希少糖の精製Ｄ−アロースを製造する上記（１）の精製希少糖の大量生産方法。
（３）クロマト分離が、目的希少糖と基質希少糖を含む原液から、溶離液として水を用いて目的希少糖を多く含む目的希少糖画分と基質希少糖を多く含む基質希少糖画分とにクロマト分離する方法であって、基質希少糖と目的希少糖に対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム形の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、糖濃度が４０％以上、目的希少糖組成が２０％以上の原液、および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部から目的希少糖画分抜出部までの目的希少糖の脱着帯域、目的希少糖画分抜出部から原液供給部までの目的希少糖の濃縮帯域、原液供給部から基質希少糖画分抜出部までの基質希少糖の吸着帯域、基質希少糖画分抜出部から溶離液供給部までの基質希少糖の回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液を目的希少糖画分と基質希少糖画分とに連続的にクロマト分離する上記（１）または（２）の精製希少糖の大量生産方法。
（４）分離した基質希少糖画分を原液の製造工程に回収する上記（３）の精製希少糖の大量生産方法。
（５）下記配列番号(ａ)または (ｂ)に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる異性化を触媒する酵素の作用で基質糖から目的希少糖へ変換し、得られる原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、L-ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。
（６）上記酵素が、Pseudomonas stutzeri 由来のL-ラムノースイソメラーゼである上記（５）の精製希少糖の大量生産方法。
（７）目的希少糖がＤ−アロースまたはＤ−プシコースである上記（５）または（６）の精製希少糖の大量生産方法。
（８）クロマト分離が、目的希少糖と基質糖を含む原液から、溶離液として水を用いて目的希少糖を多く含む目的希少糖画分と基質糖を多く含む基質糖画分とにクロマト分離する方法であって、基質糖と目的希少糖に対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム形の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、糖濃度が４０％以上、目的希少糖組成が２０％以上の原液、および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部から目的希少糖画分抜出部までの目的希少糖の脱着帯域、目的希少糖画分抜出部から原液供給部までの目的希少糖の濃縮帯域、原液供給部から基質糖画分抜出部までの基質糖の吸着帯域、基質糖画分抜出部から溶離液供給部までの基質糖の回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液を目的希少糖画分と基質糖画分とに連続的にクロマト分離する上記（５）、（６）または（７）の精製希少糖の大量生産方法。
（９）分離した基質糖画分を原液の製造工程に回収する上記（８）の精製希少糖の大量生産方法。
（１０）上記（３）、（４）、（８）または（９）の方法を用いて、高純度かつ高回収率で目的希少糖を連続的に製造することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。
（１１）クロマト分離で得られた目的希少糖の溶液から目的希少糖を結晶として回収する上記（１）ないし（１０）のいずれかの精製希少糖の大量生産方法。
The gist of the present invention is the mass production method of the following purified rare sugars (1) to (11).
(1) Purified rare, characterized by converting the substrate rare sugar to the target rare sugar by the action of an enzyme that catalyzes isomerization, and continuously chromatographically separating the resulting stock solution as a target rare sugar fraction using a simulated moving bed. A method for mass production of sugar.
(2) The method for mass production of the purified rare sugar of (1) above, wherein purified D-allose of the target rare sugar is produced from the substrate rare sugar D-psicose.
(3) Chromatographic separation of a target rare sugar fraction rich in the target rare sugar and a substrate rare sugar fraction rich in the substrate rare sugar using water as an eluent from the stock solution containing the target rare sugar and the substrate rare sugar. In this method, a plurality of packed towers packed with calcium-type cation exchange resins are connected in series and endlessly as an adsorbent having selective adsorption ability for a substrate rare sugar and a target rare sugar. A circulatory system in which the stock solution and the eluent can circulate is formed, and a stock solution having a sugar concentration of 40% or more and a target rare sugar composition of 20% or more is supplied to the circulatory system, and the circulatory system is eluted. The target rare sugar desorption zone from the liquid supply unit to the target rare sugar fraction extraction unit, the target rare sugar concentration zone from the target rare sugar fraction extraction unit to the stock solution supply unit, and the substrate rare sugar fraction from the stock solution supply unit Substrate rare sugar adsorption zone to substrate extraction, substrate rare Divided into 4 zones of substrate rare sugar recovery zone from sugar fraction extraction part to eluent supply part, and each supply part and each extraction part are sequentially moved downstream in the circulation direction while maintaining a predetermined positional relationship. A large amount of the purified rare sugar of (1) or (2) above, in which a simulated moving bed of the adsorbent is formed and the circulating liquid is continuously chromatographed into the target rare sugar fraction and the substrate rare sugar fraction. Production method.
(4) The method for mass production of the purified rare sugar according to (3) above, wherein the separated substrate rare sugar fraction is recovered in the production process of the stock solution.
(5) A substrate sugar is converted into a target rare sugar by the action of an enzyme that catalyzes isomerization consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: (a) or (b) below, and the resulting stock solution is transferred by a simulated moving bed. A method for mass production of purified rare sugar, characterized by continuously performing chromatographic separation as a target rare sugar fraction.
(a) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having L-rhamnose isomerase activity.
(6) The method for mass production of the purified rare sugar according to (5), wherein the enzyme is L-rhamnose isomerase derived from Pseudomonas stutzeri .
(7) The method for mass production of the purified rare sugar of (5) or (6) above, wherein the target rare sugar is D-allose or D-psicose.
(8) Chromatographic separation from a stock solution containing the target rare sugar and substrate sugar into a target rare sugar fraction rich in the target rare sugar and a substrate sugar fraction rich in the substrate sugar using water as an eluent A plurality of packed towers packed with calcium-type cation exchange resins as adsorbents having selective adsorption ability for substrate sugar and target rare sugar, and connected in series and endlessly to a stock solution and an eluent Form a circulatory system capable of being circulated, and supply to the circulatory system a stock solution having a sugar concentration of 40% or more and a target rare saccharide composition of 20% or more, and an eluent. Desorption zone of the target rare sugar to the target rare sugar fraction extraction section, concentration zone of the target rare sugar from the target rare sugar fraction extraction section to the stock solution supply section, from the stock solution supply section to the substrate sugar fraction extraction section Substrate sugar adsorption zone, eluent supply from substrate sugar fraction extraction part The substrate sugar recovery zone is divided into four zones, and the adsorbent pseudo-moving layer is formed by shifting each supply section and each extraction section sequentially downstream in the circulation direction while maintaining a predetermined positional relationship. The method for mass production of the purified rare sugar according to (5), (6) or (7) above, wherein the circulating liquid is continuously chromatographed into the target rare sugar fraction and the substrate sugar fraction.
(9) The method for mass production of the purified rare sugar as described in (8) above, wherein the separated substrate sugar fraction is recovered in the production process of the stock solution.
(10) A purified rare saccharide characterized in that the target rare saccharide is continuously produced with high purity and high recovery rate using the method of (3), (4), (8) or (9) above. Mass production method.
(11) The method for mass production of the purified rare sugar according to any one of (1) to (10) above, wherein the target rare sugar is recovered as crystals from a solution of the target rare sugar obtained by chromatographic separation.
本発明は、希少糖類を生産対象糖類として、それを希少糖類同志の混合物から生産対象希少糖のみを大量に分離生産する、あるいは特定のイソメラーゼを基質糖に作用させて異性化した生産対象希少糖を含む原液から生産対象希少糖のみを大量に分離生産する、精製希少糖の大量生産方法を提供することを目的とする。
特に希少糖類の一つとしてその特性や機能性が注目される精製アロースの大量生産方法によれば、次のような優れた効果が得られる。
（１）原液の品質を何ら損なうことなく原液より高純度のアロース溶液を得ることができる。
（２）原液の品質を何ら損なうことなく原液よりアロースを高回収率で分離、回収できる。
（３）試薬を用いることなく分離、回収ができ、安いランニングコストで実施することができる。
（４）連続的にまた工業的に実施することができる。
The present invention uses a rare saccharide as a production saccharide and separates and produces a large amount of only the production rare sugar from a mixture of the rare saccharides, or isomerizes a specific isomerase by acting on a substrate sugar. An object of the present invention is to provide a method for mass production of purified rare sugars, in which only the production rare sugars are separated and produced in large quantities from a stock solution containing.
In particular, according to the mass production method of purified allose, which is noted for its characteristics and functionality as one of rare saccharides, the following excellent effects can be obtained.
(1) An allose solution having a purity higher than that of the stock solution can be obtained without impairing the quality of the stock solution.
(2) Allose can be separated and recovered from the stock solution at a high recovery rate without any loss of the quality of the stock solution.
(3) Separation and recovery can be performed without using a reagent, and it can be carried out at a low running cost.
(4) It can be carried out continuously and industrially.
本発明者らは、二種類の希少糖を含む溶液、アロースとプシコースを含む溶液から生産を目的とする希少糖アロースを高純度の目的希少糖アロースの溶液として高回収率で分離する方法について検討した結果、原液糖濃度が４０％（全溶液中の重量％、以下同様）以上、目的希少糖アロース組成が２０％（全固形分中の重量％、以下同様）以上の溶液を擬似移動層により連続的にクロマト分離することにより工業的に有効な高純度、高回収率で目的希少糖アロース溶液を連続的に大量生産できることを見いだし、本発明に到達したものである。 The present inventors examined a method for separating a rare sugar allose for production from a solution containing two kinds of rare sugars, a solution containing allose and psicose as a solution of a high purity target rare sugar allose with a high recovery rate. As a result, a solution having a raw sugar concentration of 40% (weight% in the whole solution, the same applies hereinafter) or more and a target rare sugar allose composition of 20% (weight% in the total solids, the same applies hereinafter) or higher is obtained by the simulated moving bed. The inventors have found that the target rare sugar allose solution can be continuously mass-produced with high industrially effective high purity and high recovery rate by continuous chromatographic separation, and the present invention has been achieved.
すなわち、本発明の好ましい態様である精製アロースの大量生産方法は、アロースとプシコースを含む原液から、溶離液として水を用いてアロースを多く含むアロース画分とプシコースを多く含むプシコース画分とにクロマト分離する方法において、アロースとプシコースに対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウムイオンを有するカルシウム形の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、糖濃度が４０％以上、アロース組成が２０％以上の原液、および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部からアロース画分抜出部までのアロースの脱着帯域、アロース画分抜出部から原液供給部までのアロースの濃縮帯域、原液供給部からプシコース画分抜出部までのプシコースの吸着帯域、プシコース画分抜出部から溶離液供給部までのプシコースの回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液をアロース画分とプシコース画分とに連続的にクロマト分離することを特徴とする方法からなる。 That is, the mass production method of purified allose, which is a preferred embodiment of the present invention, chromatographed from a stock solution containing allose and psicose into an allose fraction rich in allose and a psicose fraction rich in psicose using water as an eluent. In a separation method, a plurality of packed towers packed with calcium-type cation exchange resins having calcium ions as adsorbents having selective adsorption ability for allose and psicose are connected in series and endlessly to provide a stock solution and an eluent. Form a circulatory system capable of being circulated, and supply to the circulatory system a stock solution having a sugar concentration of 40% or more and an allose composition of 20% or more, and an eluent. Allose desorption zone to the fraction extraction unit, allose concentration zone from the allose fraction extraction unit to the stock solution supply unit, and push from the stock solution supply unit The psicose adsorption zone to the source fraction extraction unit and the psicose recovery zone from the psicose fraction extraction unit to the eluent supply unit are divided into four zones. A method characterized by forming a simulated moving bed of adsorbent by sequentially moving to the downstream side in the circulation direction while maintaining the positional relationship, and continuously separating the circulating liquid into an allose fraction and a psicose fraction. Consists of.
このアロースの分離方法においては、分離したプシコース画分を原液の製造工程に回収して再利用することも可能である。本発明に係るアロースの製造方法は、上記のようなアロースの分離方法を用いて、高純度かつ高回収率でアロースを連続的に製造することを特徴とする方法からなる。この方法により、高純度のアロースを工業的規模で大量生産することが可能になる。さらに、クロマト分離で得られたアロースの溶液からアロースを結晶として回収することができる。たとえば、アロースのアルコールに難溶性の性質を利用してアロースを結晶化させアロース結晶を分離することができる。 In this method of separating allose, the separated psicose fraction can be recovered and reused in the stock solution production process. The method for producing allose according to the present invention comprises a method characterized in that allose is continuously produced with a high purity and a high recovery rate by using the above-described method for separating allose. This method makes it possible to mass-produce high-purity allose on an industrial scale. Furthermore, allose can be recovered as crystals from a solution of allose obtained by chromatographic separation. For example, it is possible to separate allose crystals by crystallizing allose using the properties of allose that are hardly soluble in alcohol.
本発明で使用する異性化を触媒する酵素L-ラムノースイソメラーゼは、L-ラムノースからL-ラムニュロースへの異性化反応、ならびに、L-ラムニュロースからL-ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。L-ラムノースイソメラーゼの種類は限定されないが、本発明ではD−プシコースからD−アロースを生産することができる酵素Pseudomonas stutzeri由来の「L−ラムノースイソメラーゼ」を好ましいものとして例示される。L−ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」第85巻、539乃至541頁（1998年）で発表された公知酵素である。Pseudomonas stutzeri に属する菌株「Pseudomonas stutzeri LL172」は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に２００４年１月６日に国際寄託している（IPOD FERM BP-08593）が、それ由来のL-ラムノースイソメラーゼは配列番号１に記載されるアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列の中の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、欠失され、１個以上のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有し、以下の物理化学的性質を有する酵素である（WO
2004/063369）。
（イ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ロ）ｐＨ安定性
種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
（ハ）作用温度および至適温度
作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
（ニ）温度安定性
４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
（ホ）キレート剤の影響
キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
（ヘ）金属イオンの影響
１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
（ト）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
約４３，０００である。
The enzyme L-rhamnose isomerase that catalyzes the isomerization used in the present invention is an enzyme that catalyzes the isomerization reaction from L-rhamnose to L-rhamnulose and the isomerization from L-rhamnulose to L-rhamnose. The type of L-rhamnose isomerase is not limited. In the present invention, “L-rhamnose isomerase” derived from the enzyme Pseudomonas stutzeri that can produce D-allose from D-psicose is exemplified. L-rhamnose isomerase is a known enzyme published in "Journal of Fermentation and Bioengineering", Vol. 85, 539-541 (1998). The strain “ Pseudomonas stutzeri LL172” belonging to Pseudomonas stutzeri was founded on January 6, 2004 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1-1-1 Central, Tsukuba City, Ibaraki, Japan). Although it is deposited internationally (IPOD FERM BP-08593), the L-rhamnose isomerase derived from it has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids in the amino acid sequence substituted with another amino acid. Is an enzyme having an amino acid sequence to which one or more amino acids are added and having the following physicochemical properties (WO
2004/063369).
(B) Working pH and optimum pH
The working pH is 7.0-10.0 and the optimum pH is 9.0.
(B) pH stability When kept at 4 ° C. for 1 hour at various pHs, it is stable in the range of pH 6.0 to 11.0.
(C) Working temperature and optimum temperature Working temperature is 40-65 degreeC, and optimum temperature is 60 degreeC.
(D) Temperature stability It is stable at 40 ° C. for 10 minutes, and remains at 90% or more even at 50 ° C. for 10 minutes.
(E) Effect of chelating agent Even when EDTA and EGTA, which are chelating agents, are present together during activity measurement, the activity is hardly inhibited.
(F) Influence of metal ions About 30% is inhibited by 1 mM cobalt ions.
(G) Molecular weight of about 43,000 according to the SDS-PAGE method.
通常、得られた培養菌体からL−ラムノースイソメラーゼを抽出し、そのままで反応に用いることができるが、好ましくは固定化した形態で用いる。固定化の対象とするL−ラムノースイソメラーゼそのものは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記のL−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。 Usually, L-rhamnose isomerase can be extracted from the obtained cultured cells and used in the reaction as it is, but it is preferably used in an immobilized form. The L-rhamnose isomerase itself to be immobilized does not necessarily have to be purified with high purity depending on the purpose of use, and even a crude enzyme can be used. As a specific example of the crude enzyme, the above-mentioned microorganism having the ability to produce L-rhamnose isomerase itself, or its culture or partially purified culture can be used.
本発明により、異性化を触媒する酵素の作用で基質L-ラムノースまたはL-ラムニュロースから目的希少糖L-ラムニュロースまたはL-ラムノースへ変換し、得られる原液溶液を擬似移動層により連続的にクロマト分離することにより工業的に有効な高純度、高回収率で目的希少糖溶液を連続的に大量生産する。イズモリング（登録商標）を用いて異性化反応を整理した。Ｌ−ラムノースイソメラーゼの全ての異性化反応は、イズモリングの図１、図２、図３に示される。基質特異性は表１、表２、表３に示される。L-ラムノースおよびL-ラムニュロースを基質とする。のみならず、Ｌ−リキソースおよびＬ−キシルロース、Ｌ−マンノースおよびＬ−フラクトース、Ｄ−リボースおよびＤ−リブロース、Ｄ−アロースおよびＤ−プシコースを基質とする。図１、図２、図３よりＬ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。すなわち、活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は図１中太い黒線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。また、図２、図３に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。 According to the present invention, the substrate L-rhamnose or L-rhamnulose is converted from the target rare sugar L-rhamnulose or L-rhamnose by the action of an enzyme that catalyzes isomerization, and the resulting stock solution is continuously chromatographed by a simulated moving bed. By doing so, the target rare sugar solution is continuously mass-produced with industrially effective high purity and high recovery rate. The isomerization reaction was arranged using Izumoring (registered trademark). All isomerization reactions of L-rhamnose isomerase are shown in FIGS. 1, 2 and 3 of Izumoring. Substrate specificity is shown in Table 1, Table 2, and Table 3. L-rhamnose and L-rhamnulose are used as substrates. Not only L-lyxose and L-xylulose, L-mannose and L-fructose, D-ribose and D-ribulose, D-allose and D-psicose are used as substrates. 1, 2 and 3, it can be understood that L-rhamnose isomerase uses most of the monosaccharides as substrates. That is, the isomerization reaction confirmed to be catalyzed by L-rhamnose isomerase is shown by a thick black line in FIG. On the other hand, it can be understood at a glance that the isomerization reaction could not be confirmed are the four types shown by thick dotted lines. Moreover, as shown in FIG. 2 and FIG. 3, this also has total isomerization activity in pentose and tetrose, though the activity is large and small.
目的希少糖がD-アロースである場合について説明する。D-アロースは、希少糖研究の中で特に各種生理活性を有することが判明してきた希少糖である。希少糖とは、自然界に微量にしか存在しない単糖および糖アルコールと定義づけることができる。自然界に多量に存在する単糖は、D-グルコース、D-フラクトース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-リボース、D-キシロース、L-アラビノースの７種類あり、それ以外の単糖は全て希少糖である。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖と考えられる。
D-アロース（D-アロヘキソース）は、アルドース（アルドヘキソース）に分類されるアロースのD体であり、融点が178℃の六炭糖（C6H12O6）である。
The case where the target rare sugar is D-allose will be described. D-allose is a rare sugar that has been found to have various physiological activities in the research on rare sugars. Rare sugars can be defined as monosaccharides and sugar alcohols that exist only in trace amounts in nature. There are seven types of monosaccharides present in nature: D-glucose, D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, and all other monosaccharides are rare. It is sugar. Sugar alcohol can be obtained by reducing monosaccharides, but D-sorbitol is relatively large in nature, but the others are small in quantity, so these are also considered to be rare sugars.
D-allose (D-allohexose) is a D-form of allose classified as aldose (aldodohexose), and is a hexose (C 6 H 12 O 6 ) with a melting point of 178 ° C.
このD-アロースの製法としては、上記L-ラムノースイソメラーゼを用いてD-プシコースから合成する製法によれば、D-アロースを生成する場合には、未反応のD-プシコースと共に、新たに生成したD-アロースを含有している酵素反応液として得られる。本発明では、基質を含む溶液を原料にして酵素反応でD-アロースを含む溶液として得られるD-アロースの製造方法を利用して、D-アロースを分離回収することができ、また連続的に製造することができる。アロースとプシコースを含む溶液から高純度のプシコースを含む溶液を高回収率で分離する方法について検討した結果、原液糖濃度が４０％（全溶液中の重量％、以下同様）以上、アロース組成が２０％（全固形分中の重量％、以下同様）以上の溶液を擬似移動層により連続的にクロマト分離することにより工業的に有効な高純度、高回収率でプシコース溶液を連続的に大量生産できる。 As a method for producing this D-allose, according to the method for synthesizing from D-psicose using the above-mentioned L-rhamnose isomerase, when producing D-allose, it was newly produced together with unreacted D-psicose. Obtained as an enzyme reaction solution containing D-allose. In the present invention, D-allose can be separated and recovered using a method for producing D-allose obtained as a solution containing D-allose by an enzymatic reaction using a solution containing a substrate as a raw material, and continuously. Can be manufactured. As a result of examining a method for separating a solution containing high-purity psicose from a solution containing allose and psicose at a high recovery rate, the concentration of the raw sugar is 40% (weight% in the total solution, the same applies hereinafter) or more, and the allose composition is 20 % (% By weight in total solid content, the same applies hereinafter) continuously mass-produces psicose solution with industrially effective high purity and high recovery rate by continuous chromatographic separation with simulated moving bed .
本発明の連続法について、好ましい態様について説明する。
固定化酵素は、例えばL-ラムノースイソメラーゼを共有結合法によって固定化したものを用いる。これは、酵素を菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドにより架橋する。これは共有結合が起こり架橋されるもので、これにリジンを添加することでさらに強度が増すこととなる。この固定化法によって、これまで１週間ほどの安定性であったものが数ヶ月の安定性を持つ固定化酵素を得ることができる。L-ラムノースイソメラーゼを共有結合法によって固定化した固定化酵素および／または固定化微生物を使用するバイオリアクターに通液し例えば５０％エタノール溶液中でも安定な固定化酵素を用いたバイオリアクターを構築することができる。５０％エタノール溶液中でも安定な固定化酵素を用いたバイオリアクターを用いて、５０％エタノールを含むD-プシコース溶液を通液することで、反応時は４２℃、結晶化時は４℃と温度をコントロールすることによりD-アロースの結晶を連続的に製造する。結晶化後のろ液をエタノール除去、濃縮することなしにバイオリアクターに再添加する。
A preferred embodiment of the continuous method of the present invention will be described.
As the immobilized enzyme, for example, L-rhamnose isomerase immobilized by a covalent bond method is used. In the case of using an enzyme extracted from bacterial cells, the enzyme is precipitated and then crosslinked with glutaraldehyde when the bacterial cells themselves are used. This is a covalent bond that is cross-linked, and the addition of lysine increases the strength further. By this immobilization method, an immobilized enzyme having a stability of several months, which has been stable for about one week until now, can be obtained. Construction of a bioreactor using an immobilized enzyme that is stable even in a 50% ethanol solution by passing it through a bioreactor using an immobilized enzyme and / or an immobilized microorganism in which L-rhamnose isomerase is immobilized by a covalent bond method. Can do. A D-psicose solution containing 50% ethanol was passed through a bioreactor using a stable immobilized enzyme even in a 50% ethanol solution, and the temperature was 42 ° C during the reaction and 4 ° C during the crystallization. By controlling, crystals of D-allose are continuously produced. The filtrate after crystallization is re-added to the bioreactor without removing ethanol and concentrating.
本発明の分離回収の原理を説明する。目的希少糖がアロースである例について説明すると、アロースとプシコースを含む、糖濃度が４０％以上、アロース組成が２０％以上の原液から、溶離液として水を用いてアロース画分とプシコース画分とにクロマト分離される。まず、この本発明で用いるクロマト分離法の基本的な概念について説明する。 The principle of separation and recovery of the present invention will be described. An example in which the target rare sugar is allose will be described. From an undiluted solution containing allose and psicose and having a sugar concentration of 40% or more and an allose composition of 20% or more, using the water as an eluent, the allose fraction and the psicose fraction Chromatographically separated. First, the basic concept of the chromatographic separation method used in the present invention will be described.
図４に模式的に示すように、特定の吸着剤１、つまり本発明においてはカルシウム形の強酸性陽イオン交換樹脂が複数の充填層（本発明では充填塔２）に充填され、該複数の充填塔２が直列かつ無端に連結されて原液Ｆおよび溶離液Ｄが循環可能な循環系３が形成される。吸着剤としてのカルシウム形強酸性陽イオン交換樹脂１は、プシコースとアロースに対し選択的吸着能力を有し、プシコースに対しては高い吸着能力を発揮するが、アロースに対しては実質的に非吸着性である。この吸着能力の差に起因して生じる、循環系３内の溶液のプシコースの濃度分布およびアロースの濃度分布を利用し、アロースを多く含むアロース画分Ａとプシコースを多く含むプシコース画分Ｃとが、それぞれ特定の位置から抜き出される。このクロマト分離を連続的に行うには、循環系３内への液の供給位置および循環系３内の定常的な循環流に対して、吸着剤を反循環流方向に相対的に移動させる必要がある。この相対移動は、実際に吸着剤を移動させることでも達成できるが、そうすると各成分の濃度分布がくずれたり、吸着剤に物理的な力が作用して吸着剤の粉砕等の問題が生じるので、各液の供給位置および各画分の抜出位置を一定の関係に保ちながら、順次循環流下流側に間欠的に移行させることにより、吸着剤が移動されたのと同等の効果が得られるようにしたのが、擬似移動層式のクロマト分離である。 As schematically shown in FIG. 4, a specific adsorbent 1, that is, in the present invention, a calcium-type strongly acidic cation exchange resin is packed in a plurality of packed beds (packed tower 2 in the present invention), The packed tower 2 is connected in series and endlessly to form a circulation system 3 in which the stock solution F and the eluent D can be circulated. The calcium-type strongly acidic cation exchange resin 1 as an adsorbent has a selective adsorption capacity for psicose and allose, and exhibits a high adsorption capacity for psicose, but is substantially non-abundant for allose. Adsorbent. By utilizing the psicose concentration distribution and the allose concentration distribution of the solution in the circulation system 3 caused by this difference in adsorption capacity, an allose fraction A containing a large amount of allose and a psicose fraction C containing a large amount of psicose are obtained. , Each is extracted from a specific position. In order to perform this chromatographic separation continuously, it is necessary to move the adsorbent in the anti-circulation direction relative to the liquid supply position in the circulation system 3 and the steady circulation flow in the circulation system 3. There is. This relative movement can also be achieved by actually moving the adsorbent, but then the concentration distribution of each component is disrupted, and physical forces act on the adsorbent, causing problems such as pulverization of the adsorbent. While maintaining a constant relationship between the supply position of each liquid and the extraction position of each fraction, it is possible to obtain the same effect as when the adsorbent is moved by sequentially moving to the downstream side of the circulating flow. What is made is a pseudo moving bed type chromatographic separation.
このような擬似移動層式のクロマト分離においては、循環系３が、溶離液Ｄの供給部からプシコース画分Ｃの抜出部までのプシコースの脱着帯域４と、プシコース画分Ｃの抜出部から原液Ｆの供給部までのプシコースの濃縮帯域５と（図４におけるＣｎがプシコースの濃縮分布を示している。）、原液Ｆの供給部からアロース画分Ａの抜出部までのプシコースの吸着帯域６と（図４におけるＡｎがアロースの濃度分布を示している。）、アロース画分Ａの抜出部から溶離液Ｄの供給部までのアロースの回収帯域７との４つの帯域に区分される。これら４つの帯域が、各液の供給位置および各画分の抜出位置を図４に示したような位置関係に保ちながら、適切な時間間隔をもって順次下流側に移行されることにより、擬似的に吸着剤の移動層が形成され、擬似移動層式のクロマト分離が行われる。 In such a simulated moving bed type chromatographic separation, the circulation system 3 includes a psicose desorption zone 4 from the eluent D supply unit to the psicose fraction C extraction unit, and a psicose fraction C extraction unit. And the concentration zone 5 of psicose from the supply part to the stock solution F (Cn in FIG. 4 indicates the concentration distribution of psicose), and the adsorption of psicose from the supply part of the stock solution F to the extraction part of the allose fraction A Zone 6 is divided into four zones (An in FIG. 4 indicates the concentration distribution of allose) and allose recovery zone 7 from the allose fraction A extraction portion to the eluent D supply portion. The These four zones are moved to the downstream side sequentially at appropriate time intervals while maintaining the positional relationship as shown in FIG. 4 with the supply position of each liquid and the extraction position of each fraction. A moving bed of adsorbent is formed on the substrate, and simulated moving bed type chromatographic separation is performed.
このような擬似移動層式クロマト分離方法を実施するための、本発明に係る装置の構成例を図５および図６に示す。 A configuration example of an apparatus according to the present invention for carrying out such a simulated moving bed chromatographic separation method is shown in FIGS.
図５に示す擬似移動層式クロマト分離装置１１においては、８塔の充填塔１２が設けられ、各充填塔１２内には、原液中に含まれるアロースとプシコースに対し選択的吸着能力を有する吸着剤１３として、カルシウム形強酸性陽イオン交換樹脂が充填されている。各充填塔１２は、配管１４により、各充填塔１２の出口から隣接する充填塔１２の入口へと連結されて、全体として直列に連結されており、最後部の充填塔１２（たとえば、図２におけるＮｏ．８充填塔１２）の出口から最前部の充填塔１２（たとえば、図５におけるＮｏ．１充填塔１２）の入口へと配管１４で連結されることにより、全充填塔１２が無端に連結されている。したがって、この全充填塔１２が無端に連結された系は、流体が矢印方向に循環可能な循環系１５として形成されている。この循環系１５内のいずれか適当な部位に、循環ポンプＰＲが配設されている。また、循環系１５には、循環系１５内の圧力が予め設定した所定圧以上にはならないように、異常高圧逃がし用に安全弁１６（又はリリーフ弁）が設けられている。 In the simulated moving bed chromatographic separation apparatus 11 shown in FIG. 5, eight packed columns 12 are provided, and each packed column 12 has an adsorption capability for selectively adsorbing allose and psicose contained in the stock solution. As the agent 13, a calcium-type strongly acidic cation exchange resin is filled. Each packed column 12 is connected from the outlet of each packed column 12 to the inlet of the adjacent packed column 12 by piping 14, and is connected in series as a whole, and the last packed column 12 (for example, FIG. 2). No. 8 packed tower 12 in FIG. 5 is connected to the inlet of the foremost packed tower 12 (for example, No. 1 packed tower 12 in FIG. 5) by piping 14, so that all packed towers 12 are endless. It is connected. Therefore, the system in which all the packed towers 12 are connected endlessly is formed as a circulation system 15 in which the fluid can circulate in the arrow direction. A circulation pump PR is disposed at any appropriate site in the circulation system 15. The circulation system 15 is provided with a safety valve 16 (or a relief valve) for abnormally high pressure relief so that the pressure in the circulation system 15 does not exceed a predetermined pressure set in advance.
上記循環系１５に対し、原液タンク１７に収容されている、アロースとプシコースを含む原液１８が供給される。本実施態様では、原液１８は、原液供給ポンプＰＦにより原液供給ライン１９を介して供給され、供給圧が設定圧以上になるとリリーフ弁２０によってタンク１７に戻される。原液供給ライン１９は、各分岐供給ライン２１に分岐され、原液は各分岐供給ライン２１を介して各充填塔１２の入口側に供給可能となっている。各分岐供給ライン２１には、開閉可能な原液供給弁Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８が設けられており、開弁された原液供給弁のラインを介して対応する充填塔１２に原液が供給される。 A stock solution 18 containing allose and psicose stored in a stock solution tank 17 is supplied to the circulation system 15. In the present embodiment, the stock solution 18 is supplied via the stock solution supply line 19 by the stock solution supply pump PF, and is returned to the tank 17 by the relief valve 20 when the supply pressure exceeds the set pressure. The stock solution supply line 19 is branched to each branch supply line 21, and the stock solution can be supplied to the inlet side of each packed tower 12 via each branch supply line 21. Each branch supply line 21 is provided with open and close concentrate liquid supply valves F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, and F8, and the corresponding filling via the opened concentrate liquid supply valve line. The stock solution is supplied to the column 12.
溶離液タンク２２に収容されている溶離液２３（本発明では水）は、本実施態様では、溶離液供給ポンプＰＤにより、溶離液供給ライン２４を介して供給され、供給圧が設定圧以上になるとリリーフ弁２５によってタンク２２に戻される。溶離液供給ライン２４は、各分岐供給ライン２６に分岐され、溶離液は各分岐供給ライン２６を介して充填塔１２の入口側に供給可能となっている。各分岐供給ライン２６には、開閉可能な溶離液供給弁Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８が設けられており、開弁された溶離液供給弁のラインを介して対応する充填塔１２に溶離液が供給される。 In the present embodiment, the eluent 23 (water in the present invention) stored in the eluent tank 22 is supplied via the eluent supply line 24 by the eluent supply pump PD, and the supply pressure exceeds the set pressure. Then, it is returned to the tank 22 by the relief valve 25. The eluent supply line 24 is branched to each branch supply line 26, and the eluent can be supplied to the inlet side of the packed tower 12 via each branch supply line 26. Each branch supply line 26 is provided with an eluent supply valve D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8 that can be opened and closed, and can be handled via the opened eluent supply valve line. The eluent is supplied to the packed tower 12.
各充填塔１２と、その下流側に位置する充填塔１２との間の配管１４からは、アロース画分抜出ライン２７が分岐され、各抜出ライン２７には、各ラインを開閉可能なアロース画分抜出弁Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８が設けられている。各抜出ライン２７は、合流されて一つのアロース画分合流管２８にまとめられている。 From the piping 14 between each packed column 12 and the packed column 12 located downstream thereof, an allose fraction extraction line 27 is branched, and each extracted line 27 has an allose that can be opened and closed. Fraction extraction valves A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 are provided. Each extraction line 27 is merged and collected in one allose fraction merging pipe 28.
同様に、配管１４から、プシコース画分抜出ライン２９が分岐され、各抜出ライン２９には、各ラインを開閉可能なアロース画分抜出弁Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８が設けられている。各抜出ライン２９は、合流されて一つのプシコース画分合流管３０にまとめられており、ここからプシコース画分が抜き出される。抜き出されたプシコース画分はクロマト分離用原液の製造工程すなわちプシコースの一部をアロースにする反応工程用の原料プシコース溶液収容タンク（図示略）に回収することができる。 Similarly, a psicose fraction extraction line 29 is branched from the pipe 14, and each extraction line 29 has an allose fraction extraction valve C1, C2, C3, C4, C5, C6, which can open and close each line. C7 and C8 are provided. Each extraction line 29 is merged and collected in one psicose fraction merging pipe 30, from which the psicose fraction is extracted. The extracted psicose fraction can be collected in a raw material psicose solution storage tank (not shown) for the production process of the chromatographic separation stock solution, that is, the reaction process in which a part of psicose is allose.
このように構成された擬似移動層式クロマト分離装置１１を用いて、本発明に係るアロースの分離方法が実施され、循環系１５に糖濃度が４０％以上、アロース組成が２０％以上の原液と、水からなる溶離液とが供給される。そして、前述の図１に示したような基本的な分離処理操作が行われるように、各弁の開閉が制御されて、本発明に係るアロースの分離方法が実施される。各弁の開閉制御により、各液の供給位置および各画分の抜出位置が所定の位置関係に保たれながら、順次下流側に移行される。この移行が、循環系１５に対し一巡すると、分離処理の１サイクルが終了する。 Using the simulated moving bed type chromatographic separation apparatus 11 configured as described above, the method for separating allose according to the present invention is carried out, and the circulation system 15 is fed with a stock solution having a sugar concentration of 40% or more and an allose composition of 20% or more. And an eluent composed of water. Then, the opening and closing of each valve is controlled so that the basic separation processing operation as shown in FIG. 1 is performed, and the allose separation method according to the present invention is performed. By the opening / closing control of each valve, the supply position of each liquid and the extraction position of each fraction are sequentially shifted to the downstream side while maintaining a predetermined positional relationship. When this transition is completed for the circulation system 15, one cycle of the separation process is completed.
この１サイクルの動作例を表１に示す。表１には、各弁Ｆ１〜Ｆ８、Ｄ１〜Ｄ８、Ａ１〜Ａ８、Ｃ１〜Ｃ８の開閉制御状態が示されており、表中の数字は各弁の番号を示しており（たとえば、Ｆの項で「１」はＦ１の弁を示している）、その番号が記入されている弁が開弁されることを表している。また、循環ポンプＰＲの項では、丸印は作動オン状態を示しており、本実施態様では基本的に循環ポンプＰＲは分離処理中常時運転されている。 Table 1 shows an example of this one-cycle operation. Table 1 shows the open / close control states of the valves F1 to F8, D1 to D8, A1 to A8, and C1 to C8, and the numbers in the table indicate the numbers of the valves (for example, F In the term, “1” indicates the valve of F1), which indicates that the valve in which the number is written is opened. Further, in the section of the circulation pump PR, a circle indicates an operation-on state, and in this embodiment, the circulation pump PR is basically operated constantly during the separation process.
図６は、本発明の方法に適用可能な別の実施態様に係る擬似移動層式クロマト分離装置を示している。本実施態様では、装置全体の簡素化、小型化がはかられつつ、アロースの高純度、高回収率での分離が可能となっている。 FIG. 6 shows a simulated moving bed chromatographic separation apparatus according to another embodiment applicable to the method of the present invention. In this embodiment, it is possible to separate allose with high purity and high recovery rate while simplifying and downsizing the entire apparatus.
本実施態様に係るクロマト分離装置４１では、充填塔の数が４塔とされており、このクロマト分離装置４１で原液タンク４２からの原液４３の分離処理を行う。クロマト分離装置４１は、４つの充填塔４４（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４充填塔）を備えており、各充填塔４４内には、原液４３中に含まれる特定成分としてのアロースとプシコースに対し選択的吸着能力を有するカルシウム形陽イオン交換樹脂からなる吸着剤４５が充填されている。各充填塔４４は、配管４６により、各充填塔４４の出口から隣接する充填塔４４の入口へと連結されて、全体として直列に連結されており、最後部の単位充填塔４４（たとえば、図６におけるＮｏ．４充填塔４４）の出口から最前部の単位充填塔４４（たとえば、図６におけるＮｏ．１充填塔４４）の入口へと配管４６で連結されることにより、全充填塔４４が無端に連結されている。したがって、この全充填塔４４が無端に連結された系は、流体が矢印方向に循環可能な循環系４７として形成されている。 In the chromatographic separation apparatus 41 according to this embodiment, the number of packed towers is four, and the chromatographic separation apparatus 41 performs the separation process of the stock solution 43 from the stock solution tank 42. The chromatographic separation device 41 includes four packed columns 44 (No. 1 to No. 4 packed columns), and in each packed column 44, allose and psicose as specific components contained in the stock solution 43 are provided. An adsorbent 45 made of a calcium-type cation exchange resin having a selective adsorption capacity is filled. Each packed column 44 is connected from the outlet of each packed column 44 to the inlet of the adjacent packed column 44 by piping 46, and is connected in series as a whole, and the last unit packed column 44 (for example, FIG. 6 is connected to the inlet of the front-most unit packed column 44 (for example, No. 1 packed column 44 in FIG. 6) by a pipe 46, so that all packed columns 44 are Endlessly connected. Therefore, the system in which all the packed towers 44 are connected endlessly is formed as a circulation system 47 in which the fluid can circulate in the direction of the arrow.
上記循環系４７内のいずれか適当な部位に、循環ポンプＰＲが配設されている。また、循環系４７内の各隣接充填塔４４間の部位には、それよりも循環方向下流側の充填塔４４に対し循環系４７を遮断可能な遮断弁Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が設けられている。各遮断弁Ｒ１〜Ｒ４と、その上流側に位置する各充填塔４４の出口との間には、吸着剤４５に対し吸着能力の低いアロースを多く含むアロース画分の抜き出しライン４８がそれぞれ分岐され、各抜き出しライン４８には、各ラインを開閉可能なアロース画分抜出弁Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４が設けられている。各抜き出しライン４８は、合流されて一つのアロース画分合流管４９にまとめられている。また、同様に、吸着剤４５に対し吸着能力の高いプシコースを多く含むプシコース画分の抜き出しライン５０がそれぞれ分岐され、各抜き出しライン５０には、各ラインを開閉可能なプシコース画分抜出弁Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４が設けられている。各抜き出しライン５０は、合流されて一つのアロース画分合流管５１にまとめられている。 A circulation pump PR is disposed at any appropriate site in the circulation system 47. Further, shut-off valves R1, R2, R3, and R4 that can shut off the circulation system 47 with respect to the packed tower 44 on the downstream side in the circulation direction are provided at a portion between the adjacent packed towers 44 in the circulation system 47. ing. Between each shutoff valve R1 to R4 and the outlet of each packed tower 44 located on the upstream side, an extraction line 48 for an allose fraction containing a large amount of allose having a low adsorption capacity with respect to the adsorbent 45 is branched. Each extraction line 48 is provided with allose fraction extraction valves A1, A2, A3, and A4 capable of opening and closing each line. Each extraction line 48 is merged and combined into one allose fraction merging pipe 49. Similarly, a psicose fraction extraction line 50 containing a large amount of psicose having a high adsorption capacity with respect to the adsorbent 45 is branched, and each extraction line 50 has a psicose fraction extraction valve C1 that can open and close each line. , C2, C3, and C4 are provided. Each extraction line 50 is merged and combined into one allose fraction merging pipe 51.
循環系４７には、循環系４７内の圧力が予め設定した所定圧以上にはならないように、異常高圧逃がし用に安全弁５２（又はリリーフ弁）が設けられている。また、各充填塔４４間には、逆流防止用の逆止弁５３が設けられている。 The circulation system 47 is provided with a safety valve 52 (or a relief valve) for releasing an abnormally high pressure so that the pressure in the circulation system 47 does not exceed a predetermined pressure set in advance. Further, a check valve 53 for preventing a backflow is provided between the packed towers 44.
循環系４７内には、原液４３と、溶離液タンク５４に収容された溶離液５５が供給可能となっている。原液４３は、本実施態様では、供給流量の制御が可能な原液供給ポンプＰＦにより、原液供給ライン５６を介して供給され、供給圧が設定圧以上になるとリリーフ弁５７によって原液タンク４２に戻される。原液供給ライン５６は、各分岐供給ライン５８に分岐され、原液は各分岐供給ライン５８を介して各充填塔４４の入口側に供給可能となっている。各分岐供給ライン５８には、開閉可能な原液供給弁Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４が設けられており、開弁された原液供給弁のラインを介して対応する充填塔に原液が供給される。 In the circulation system 47, the stock solution 43 and the eluent 55 stored in the eluent tank 54 can be supplied. In this embodiment, the stock solution 43 is supplied via a stock solution supply line 56 by a stock solution supply pump PF capable of controlling the supply flow rate, and is returned to the stock solution tank 42 by a relief valve 57 when the supply pressure becomes a set pressure or higher. . The stock solution supply line 56 is branched to each branch supply line 58, and the stock solution can be supplied to the inlet side of each packed tower 44 via each branch supply line 58. Each branch supply line 58 is provided with open and close stock solution supply valves F1, F2, F3, and F4, and the stock solution is supplied to the corresponding packed tower through the opened stock solution supply valve line.
溶離液５５は、本実施態様では、供給流量の制御が可能な溶離液供給ポンプＰＤにより、溶離液供給ライン５９を介して供給され、供給圧が設定圧以上になるとリリーフ弁６０によって溶離液タンク５４に戻される。溶離液供給ライン５９は、各分岐供給ライン６１に分岐され、溶離液は各分岐供給ライン６１を介して各充填塔４４の入口側に供給可能となっている。各分岐供給ライン６１には、開閉可能な溶離液供給弁Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４が設けられており、開弁された溶離液供給弁のラインを介して対応する充填塔４４に溶離液が供給される。 In this embodiment, the eluent 55 is supplied via an eluent supply line 59 by an eluent supply pump PD capable of controlling the supply flow rate. When the supply pressure becomes a set pressure or higher, the relief valve 60 causes the eluent tank to flow. Return to 54. The eluent supply line 59 is branched to each branch supply line 61, and the eluent can be supplied to the inlet side of each packed tower 44 via each branch supply line 61. Each branch supply line 61 is provided with an eluent supply valve D1, D2, D3, D4 that can be opened and closed, and the eluent is supplied to the corresponding packed tower 44 via the opened eluent supply valve line. Supplied.
このように構成されたクロマト分離装置４１において、分離処理は次のように行われる。すなわち、このクロマト分離装置４１では、５つの工程の運転が可能となっており、そのうち少なくとも第３の工程と、第２または第５の工程を含むように運転される。 In the chromatographic separation apparatus 41 configured as described above, the separation process is performed as follows. That is, the chromatographic separation apparatus 41 can be operated in five steps, and is operated to include at least the third step and the second or fifth step.
第１の工程では、いずれかの遮断弁Ｒが閉じられた状態で、いずれかの原液供給弁Ｆが開かれて溶離液が対応する充填塔４４の入口側から循環系４７内に供給され、そのときのアロース画分の抜き出し位置に相当するアロース画分抜出弁Ａが開かれ、そのアロース画分抜き出しライン４８を通してアロース画分の全量が抜き出される。 In the first step, in a state where any one of the shutoff valves R is closed, any one of the stock solution supply valves F is opened, and the eluent is supplied into the circulation system 47 from the inlet side of the corresponding packed column 44, The allose fraction extraction valve A corresponding to the extraction position of the allose fraction at that time is opened, and the entire amount of the allose fraction is extracted through the allose fraction extraction line 48.
第２の工程では、いずれかの遮断弁Ｒが閉じられた状態で、いずれかの溶離液供給弁Ｄが開かれて、溶離液がそれぞれ対応する充填塔４４の入口側から循環系４７内に供給され、そのときのプシコース画分の抜き出し位置に相当するプシコース画分抜出弁Ｃが開かれ、そのプシコース画分抜き出しライン５０を通してプシコース画分の全量が抜き出される。 In the second step, with one of the shutoff valves R closed, one of the eluent supply valves D is opened, and the eluent enters the circulation system 47 from the inlet side of the corresponding packed tower 44. The psicose fraction extraction valve C corresponding to the extraction position of the psicose fraction at that time is opened, and the whole amount of the psicose fraction is extracted through the psicose fraction extraction line 50.
第３の工程では、いずれかの遮断弁Ｒが閉じられた状態で、いずれかの溶離液供給弁Ｄが開かれて溶離液が対応する充填塔４４の入口側から循環系４７内に供給され、そのときのアロース画分の抜き出し位置に相当するアロース画分抜出弁Ａが開かれ、そのアロース画分抜き出しライン４８を通してアロース画分の全量が抜き出される。 In the third step, with one of the shut-off valves R closed, one of the eluent supply valves D is opened, and the eluent is supplied into the circulation system 47 from the inlet side of the corresponding packed tower 44. The allose fraction extraction valve A corresponding to the extraction position of the allose fraction at that time is opened, and the entire amount of the allose fraction is extracted through the allose fraction extraction line 48.
第４の工程では、一切の供給、抜き出し、遮断は行われず、原液と溶離液の混合液が循環系４７内を循環ポンプＰＲにより循環移動され、循環系４７内の液のプシコース画分とアロース画分への分離が促進される。 In the fourth step, no supply, withdrawal, or shut-off is performed, and the mixed solution of the stock solution and the eluent is circulated through the circulation system 47 by the circulation pump PR, and the psicose fraction of the solution in the circulation system 47 and allose Separation into fractions is facilitated.
この擬似移動層式クロマト分離装置４１の運転の一例を、表２に示す。表２には、各弁Ｆ、Ｄ、Ａ、Ｃの開閉制御状態が示されており、表中の数字は各弁の番号を示しており（たとえば、Ｆの項で１はＦ１の弁を示している）、その番号が記入されている弁が開弁されることを表している。空欄の場合には、閉弁の状態を示している。また、遮断弁Ｒの項では、遮断する弁（つまり、閉じる弁）の番号を示している。空欄の場合には全遮断弁Ｒは開かれている。さらに、循環ポンプＰＲの項では、丸印は作動オン状態を示しており、空欄の場合には、作動がオフとされ、循環系４７内での必要な液の移動は循環ポンプＰＲ内のクリアランスを介して行われ、そのときの液の抜き出しは、溶離液供給ポンプＰＤまたは／および原液供給ポンプＰＦの吐出圧を利用して行われる。 An example of the operation of the simulated moving bed chromatographic separation apparatus 41 is shown in Table 2. Table 2 shows the open / close control states of the valves F, D, A, and C, and the numbers in the table indicate the numbers of the valves (for example, 1 in the F term indicates that the valve of F1 is Indicates that the valve with that number is opened. When the column is blank, the valve is closed. In the section of the shutoff valve R, the number of the shutoff valve (that is, the valve to be closed) is shown. In the case of a blank, all shutoff valves R are open. Further, in the section of the circulation pump PR, the circle indicates the operation on state, and when it is blank, the operation is turned off, and the necessary liquid movement in the circulation system 47 is the clearance in the circulation pump PR. The extraction of the liquid at that time is performed using the discharge pressure of the eluent supply pump PD and / or the stock solution supply pump PF.
表２において、工程Ｎｏ．１−１〜１−４から工程Ｎｏ．４−１〜４−４までが、本クロマト分離装置４１における分離処理の１サイクルを示している。 In Table 2, the process No. 1-1 to 1-4, the process no. 4-1 to 4-4 show one cycle of the separation process in the present chromatographic separation apparatus 41.
工程Ｎｏ．１−１〜１−４についてみるに、工程１−１では、遮断弁Ｒ２が閉じられ、原液供給弁Ｆ１が開かれて原液が循環系４７内に供給されるとともに、アロース画分抜出弁Ａ１が開かれて、そこからアロース画分の全量が抜き出される。したがって、この工程１−１は前述の第１の工程に相当している。 Step No. As for 1-1 to 1-4, in step 1-1, the shut-off valve R2 is closed, the stock solution supply valve F1 is opened, and the stock solution is supplied into the circulation system 47, and the allose fraction extraction valve. A1 is opened, from which the whole amount of the allose fraction is extracted. Therefore, this process 1-1 corresponds to the first process described above.
工程１−２では、遮断弁Ｒ２が閉じられ、溶離液供給弁Ｄ３が開かれて溶離液が循環系４７内に供給されるとともに、プシコース画分抜出弁Ｃ３が開かれて、そこからプシコース画分の全量が抜き出される。したがって、この工程１−２は前述の第２の工程に相当している。 In step 1-2, the shutoff valve R2 is closed, the eluent supply valve D3 is opened and the eluent is supplied into the circulation system 47, and the psicose fraction extraction valve C3 is opened, from which psicose The entire fraction is extracted. Therefore, this process 1-2 corresponds to the second process described above.
工程１−３では、弁Ｄ３が開かれ遮断弁Ｒ２が閉じられて、循環系４７内に溶離液が供給されるとともに、アロース画分抜出弁Ａ１が開かれて、そこからアロース画分の全量が抜き出される。したがって、この工程１−３は前述の第３の工程に相当している。 In step 1-3, the valve D3 is opened, the shutoff valve R2 is closed, the eluent is supplied into the circulation system 47, and the allose fraction extraction valve A1 is opened from which the allose fraction is opened. The whole amount is extracted. Therefore, Step 1-3 corresponds to the third step described above.
工程１−４では、弁Ｆ、Ｄ、Ａ、Ｃは全て閉じられるとともに、遮断弁Ｒは全て開かれ、循環ポンプＰＲが作動されて、循環系４７内の液が循環移動されてプシコース画分、アロース画分への分離が促進される。したがって、この工程１−４は前述の第４の工程に相当している。 In step 1-4, all the valves F, D, A, and C are closed, all the shut-off valves R are opened, the circulation pump PR is operated, and the liquid in the circulation system 47 is circulated and moved to the psicose fraction. , Separation into allose fraction is promoted. Therefore, this process 1-4 corresponds to the above-mentioned fourth process.
以上の一連の工程１−１〜１−４は、原液、溶離液の供給位置、プシコース画分、アロース画分の抜き出し位置、および循環系４７の遮断位置が、ある特定の位置関係をもって実行され、これら一連の工程１−１〜１−４が終了すると、その特定の位置関係を維持しつつ、各制御対象弁の位置が下流側に一つ移行され、次の一連の工程２−１〜２−４が実行される。この移行を順次行うことにより、擬似移動層式クロマト分離装置としての作動が成立する。 The series of steps 1-1 to 1-4 described above are performed with a specific positional relationship between the stock solution, the eluent supply position, the psicose fraction, the allose fraction extraction position, and the circulation system 47 blocking position. When these series of steps 1-1 to 1-4 are completed, the position of each control target valve is shifted to the downstream side while maintaining the specific positional relationship, and the next series of steps 2-1 to 2-1 are performed. 2-4 are executed. By performing this transition sequentially, the operation as a simulated moving bed type chromatographic separation apparatus is established.
工程２−１〜２−４、工程３−１〜３−４、工程４−１〜４−４では、上記の如く各弁の位置が一つずつ移行された状態にて、上記工程１−１〜１−４と同様の運転が実行される。工程１−１〜４−４までが実行されると、分離処理の１サイクルが終了する。 In Steps 2-1 to 2-4, Steps 3-1 to 3-4, and Steps 4-1 to 4-4, the position of each valve is shifted one by one as described above. The same operation as 1 to 1-4 is performed. When steps 1-1 to 4-4 are executed, one cycle of the separation process is completed.
上記分離処理においては、原液供給ポンプＰＦおよび溶離液供給ポンプＰＤは、定流量供給制御としてもよいし、流量制御を行ってもよい。流量制御を行う場合には、たとえば溶離液のみの供給から、溶離液と原液の両液の供給に移行する場合、トータルの供給量を一定にするような制御を行うこともでき、より高精度の分離が可能となる。 In the separation process, the stock solution supply pump PF and the eluent supply pump PD may perform constant flow rate supply control or flow rate control. When performing flow rate control, for example, when shifting from supplying only the eluent to supplying both the eluent and the stock solution, it is also possible to perform control so that the total supply amount is constant, resulting in higher accuracy. Can be separated.
さらに、第３の工程が必須とされることで、溶離液が循環系４７内を循環されて、少ない充填塔数でありながら、プシコース画分、アロース画分への十分に高い分離効率が容易に達成される。 Furthermore, since the third step is indispensable, the eluent is circulated in the circulation system 47, and the separation efficiency is sufficiently high for the psicose fraction and the allose fraction while the number of packed columns is small. To be achieved.
［L-ラムノースイソメラーゼの調製］
D-プシコースからD-アロースの生産は、Pseudomonas stutzeri LL172の生産するL-ラムノースイソメラーゼをグルタルアルデヒドを用いた架橋法で固定化酵素を作成した。Pseudomonas stutzeri LL172は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に２００４年１月６日に国際寄託している（IPOD FERM BP-08593）。上記段落番号００１０参照。
[Preparation of L-rhamnose isomerase]
For production of D-allose from D-psicose, L-rhamnose isomerase produced by Pseudomonas stutzeri LL172 was prepared by a cross-linking method using glutaraldehyde. Pseudomonas stutzeri LL172 was deposited internationally on January 6, 2004 at the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-6, Tsukuba, Higashi 1-1, Japan) (IPOD) FERM BP-08593). See paragraph 0010 above.
［アロースの製造］
５０％Ｄ−プシコースを含有する溶液（１mM MnCl2を含むグリシン緩衝液pH９に溶解したもの）100mlに上記の固定化L-ラムノースイソメラーゼ（約20000単位の固定化酵素）を作用させて、Ｄ−アロースとＤ−プシコースを生成せしめ、酵素反応液を得る。この反応液はD-アロース３０．２４０％、D-プシコース６８．４４３％、その他反応時の副産物、１．３１６％よりなる全糖濃度５０％のD-アロース原液として得られる。
[Manufacture of allose]
The above-mentioned immobilized L-rhamnose isomerase (approximately 20000 units of immobilized enzyme) was allowed to act on 100 ml of a solution containing 50% D-psicose (dissolved in glycine buffer pH 9 containing 1 mM MnCl 2 ), and D- Allose and D-psicose are produced to obtain an enzyme reaction solution. This reaction solution is obtained as a D-allose stock solution having a total sugar concentration of 50% consisting of D-allose of 30.240%, D-psicose of 68.443%, other by-products during the reaction, and 1.316%.
［アロースの分離］
図３に示した擬似移動層式クロマト分離装置４１を用いて、D-アロース３０．２４０％、D-プシコース６８．４４３％、その他反応時の副産物、１．３１６％よりなる全糖濃度５０％のD-アロース原液を分離した。No.１〜No.４の各充填塔４４は内径２８ｍｍ、高さ１．０ｍの円筒形とし、各充填塔４４にはカルシウム形の強酸性陽イオン交換樹脂”アンバーライト”CR１３１０（ロースアンドハース社製）を２．４６L充填した。充填塔４４内は約６０℃に保持した。この擬似移動層においてD-アロース原液および遊離液としての水の供給量を（１サイクル当たりの供給量）をそれぞれ以下の条件で運転した。
[Separation of allose]
Using the simulated moving bed type chromatographic separation apparatus 41 shown in FIG. 3, the total sugar concentration is 50% consisting of D-allose 30.240%, D-psicose 68.443%, other by-products during the reaction, 1.316%. The D-allose stock solution was isolated. Each packed tower 44 of No. 1 to No. 4 has a cylindrical shape with an inner diameter of 28 mm and a height of 1.0 m, and each packed tower 44 has a calcium-type strongly acidic cation exchange resin “Amberlite” CR1310 (Rose and Hearth). Of 2.46 L). The inside of the packed tower 44 was kept at about 60 ° C. In this simulated moving bed, the supply amount of D-allose stock solution and water as the free solution (supply amount per cycle) was operated under the following conditions, respectively.
D-アロース原液 ：３６０ｍｌ
水供給量 ：１９８０ｍｌ
D-アロース画分抜出液 ：５４０ｍｌ
D-フラクトース画分抜出液 ：１８００ｍｌ
循環量 ：１５４８ｍｌ
１サイクル当たりの時間 ：３．８６７ｈ
D-allose stock solution: 360 ml
Water supply: 1980 ml
D-allose fraction extract: 540 ml
D-fructose fraction extract: 1800 ml
Circulation amount: 1548 ml
Time per cycle: 3.867h
定常状態において抜き出されたD-アロース画分およびD-プシコース画分の糖組成は上記表に示した。D-アロース画分中のD-アロースの回収率は８３．７％であった。 The sugar composition of the D-allose fraction and D-psicose fraction extracted in the steady state is shown in the above table. The recovery rate of D-allose in the D-allose fraction was 83.7%.
１ 吸着剤
２ 充填塔（充填層）
３ 循環系
４ プシコースの脱着帯域
５ プシコースの濃縮帯域
６ プシコースの吸着帯域
７ アロースの回収帯域
Ａ アロース画分
Ｃ プシコース画分
Ｄ 溶離液
Ｆ 原液
１１、４１ クロマト分離装置
１２、４４ 充填塔
１３、４５ 吸着剤
１４、４６ 配管
１５、４７ 循環系
１７、４２ 原液タンク
１８、４３ 原液
１９、５６ 原液供給ライン
２１、５８ 原液分岐供給ライン
２２、５４ 溶離液タンク
２３、５５ 溶離液
２４、５９ 溶離液供給ライン
２６、６１ 溶離液分岐供給ライン
２７、４８ アロース画分抜出ライン
２８、４９ アロース画分合流管
２９、５０ プシコース画分抜出ライン
３０、５１ プシコース画分合流管
ＰＲ 循環ポンプ
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８ アロースの画分抜出弁
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８ プシコースの画分抜出弁
ＰＦ 原液供給ポンプ
ＰＤ 溶離液供給ポンプ
Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８ 原液供給弁
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８ 溶離液供給弁
Ｒ１、Ｒ２、３、Ｒ４ 遮断弁
1 Adsorbent 2 Packing tower (packed bed)
3 Circulation system 4 Desorption zone for psicose 5 Concentration zone for psicose 6 Adsorption zone for psicose 7 Recovery zone for allose A Allose fraction C Psicose fraction D Eluent F Stock solution 11, 41 Chromatographic separation device 12, 44 Packed tower 13, 45 Adsorbents 14 and 46 Piping 15 and 47 Circulation systems 17 and 42 Stock solution tanks 18 and 43 Stock solutions 19 and 56 Stock solution supply lines 21 and 58 Stock solution branch supply lines 22 and 54 Eluent tanks 23 and 55 Elution solutions 24 and 59 Eluent supply Lines 26, 61 Eluent branch supply line 27, 48 Allose fraction extraction line 28, 49 Allose fraction confluence tube 29, 50 Psicose fraction extraction line 30, 51 Psicose fraction confluence tube PR Circulation pumps A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 Allose fraction extraction valves C1, C2, C3, C4, C5, C6, C 7, C8 Psicose fraction extraction valve PF Stock solution supply pump PD Eluent supply pump F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 Stock solution supply valves D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7 , D8 Eluent supply valve R1, R2, 3, R4 shut-off valve
Claims (11)
(ｂ)に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる異性化を触媒する酵素の作用で基質糖から目的希少糖へ変換し、得られる原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、L-ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。 SEQ ID NO: (a) or
The substrate sugar is converted to the target rare sugar by the action of an enzyme that catalyzes isomerization consisting of a protein having the amino acid sequence shown in (b), and the resulting stock solution is continuously chromatographed as a target rare sugar fraction by a simulated moving bed. A method for mass production of a purified rare sugar characterized by separating.
(a) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having L-rhamnose isomerase activity.
The method for mass production of a purified rare sugar according to any one of claims 1 to 10, wherein the target rare sugar is recovered as crystals from a solution of the target rare sugar obtained by chromatographic separation.
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