JP2006136284A - Mutanase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規のムタナーゼ、及びそれをコードする遺伝子に関する。 The present invention relates to a novel mutanase and a gene encoding the same.
歯科領域の疾患であるウ蝕は、日常生活と深い関わりをもつことが知られている。従って、この疾患を効果的に予防できる口腔衛生関連の商品を開発することはきわめて重要なことである。ウ蝕の原因は、歯垢中のストレプトコッカス ミュータンス等が乳酸を生成することであるとされる。ストレプトコッカス ミュータンスは食餌中のショ糖からグルコシルトランスフェラーゼにより、高分子のグルカンを合成し、それが歯垢形成の開始に関与すると言われている。合成されるグルカンには水溶性のα-1,6結合を主体とするデキストランと不溶性のα-1,3結合を主体とするムタンがあるが、歯垢形成の開始には粘着性で不溶性のムタンの関与が大きいとされている(非特許文献1、2)。このことから、ムタンを分解すれば歯垢形成を阻止できると共にウ蝕の誘発を抑えられることが充分考えられる。 Dental caries, a disease in the dental field, is known to have a deep connection with daily life. Therefore, it is extremely important to develop products related to oral hygiene that can effectively prevent this disease. The cause of caries is said to be the production of lactic acid by Streptococcus mutans in plaque. Streptococcus mutans is said to be involved in the initiation of plaque formation by synthesizing high molecular glucan from sucrose in the diet by glucosyltransferase. The synthesized glucan includes dextran mainly composed of water-soluble α-1,6 bond and mutan mainly composed of insoluble α-1,3 bond, but it is sticky and insoluble at the start of plaque formation. It is said that the involvement of mutan is large (Non Patent Literatures 1 and 2). From this, it can be considered that decomposition of mutan can prevent plaque formation and suppress the induction of caries.
従ってムタンを分解できるムタナーゼの開発は、非常に重要であり、従来からムタナーゼあるいはムタナーゼ生産菌についての報告がなされている(特許文献1−4)。しかし、安定性や分解力にまだ不足の部分もあり、実際に歯磨き剤に配合されたことはない。そこで、応用の可能性を広げるべく、新規なムタナーゼの開発が待たれていた。
本発明の目的は、口腔衛生用酵素として有用なムタナーゼを見出し、当該ムタナーゼを、単一且つ大量に生産する手段を提供することにある。 An object of the present invention is to find a mutanase useful as an enzyme for oral hygiene and to provide a means for producing the mutanase in a single and large amount.
本発明者らは、ムタンを分解できる酵素の生産菌を土壌中より見出し、新規なムタナーゼを見出した。さらに当該酵素をコードする遺伝子配列を見出した。 The present inventors have found an enzyme-producing bacterium capable of degrading mutan from the soil, and have found a novel mutanase. Furthermore, a gene sequence encoding the enzyme was found.
すなわち、本発明は、以下の(a)から(c)いずれかのタンパク質及びこれをコードする遺伝子を提供するものである。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
That is, the present invention provides any of the following proteins (a) to (c) and a gene encoding the same.
(A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and a mutanase activity (C) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a mutanase activity
また、本発明は、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
(a)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2で示される塩基配列からなるDNAとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2で示される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
The present invention also provides a gene comprising the polynucleotide according to any one of (a) to (c) below.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) a protein that hybridizes with the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has a mutanase activity Polynucleotide (c) a polynucleotide comprising a base sequence having 80% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having mutanase activity
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。 The present invention also provides a recombinant vector containing the gene and a transformant containing the recombinant vector.
また、本発明は、上記の形質転換体を培養し、ムタナーゼを採取するムタナーゼの生産方法を提供するものである。 The present invention also provides a method for producing a mutanase by culturing the above transformant and collecting the mutanase.
さらにまた、本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−19720として寄託された微生物(バチルス エスピー KSM−M35)を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a microorganism (Bacillus sp. KSM-M35) deposited as FERM P-19720 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
さらにまた、本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−19725として寄託された微生物(バチルス エスピー KSM−M426)を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a microorganism (Bacillus sp. KSM-M426) deposited as FERM P-19725 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
本発明で提供する微生物を用いれば、新規なムタナーゼを生産することができる。本発明のムタナ−ゼ遺伝子を用いれば、当該酵素を単一且つ大量に生産することができる。本発明の新規なムタナーゼは、歯垢形成を阻止するため、ウ蝕予防のために用いられる口腔衛生製品や、ガム、キャンディーなどの食品に有用である。 If the microorganism provided in the present invention is used, a novel mutanase can be produced. If the mutase gene of the present invention is used, the enzyme can be produced singly and in large quantities. The novel mutanase of the present invention is useful for oral hygiene products used for the prevention of dental caries and foods such as gums and candies because it prevents plaque formation.
本発明の(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ムタンに作用し、そのα−1,3−グルコシド結合を分解する新規なムタナーゼである。本発明のタンパク質には、斯かる(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の他、当該タンパク質と等価のタンパク質が包含される。 The protein comprising the amino acid sequence shown in (a) SEQ ID NO: 1 of the present invention is a novel mutanase that acts on mutan and degrades its α-1,3-glucoside bond. The protein of the present invention includes (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a protein equivalent to the protein.
ここで、等価のタンパク質としては、(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 Here, examples of the equivalent protein include (b) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a mutanase activity. It is done.
ここで、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、1乃至10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、上記の付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。 Here, the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added. The above addition includes addition of one to several amino acids at both ends.
配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質について同一性を検索した結果、バチルス エスピー RM1株の生産するムタナーゼ(特開平10−201483号報)と47.6%、ストレプトコッカス コエリコラー A3(2)株の生産するputative secreted glycosyl hydrolase(GenBank AL939130.1 遺伝子 SCO7015)と58.5%、ストレプトコッカス リビダンスの生産するchitinase homolog(PIR T30261)と58.3%と極めて低い同一性を示すにすぎなかった。また、他の公知のタンパク質との同一性も極めて低かった。このことは、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が新規なムタナーゼであることを示唆するものであり、従って配列番号1に示したアミノ酸配列と最大80%以上の相同性を有するムタナーゼは本発明に含まれる。 As a result of searching for the identity of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, mutanase produced by the Bacillus sp. Putative secreted glycosyl hydrolase (GenBank AL939130.1 gene SCO7015) and 58.5%, and streptococcus lividans produced chitinase homolog (PIR T30261) and 58.3%, which is not very low identity. Also, the identity with other known proteins was extremely low. This suggests that the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a novel mutanase, and therefore, a mutanase having a maximum homology of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not present. Included in the invention.
即ち、本発明で提供するムタナーゼと等価なタンパク質は、配列番号1に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質を包含するものである。 That is, when the protein equivalent to the mutanase provided by the present invention is appropriately aligned with the corresponding sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (c) 80% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is more preferable. Includes an amino acid sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and includes a protein having a mutanase activity.
上記のアミノ酸配列の同一性とは、あるアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより計算されるものをいう。ここで用いるアルゴリズムとしては、特に限定されないが、公知のアルゴリズムが好ましく、Lipman−Pearson法(Science, 227,1435,1985参照)がより好ましい。また、上記の計算は、例えば、GENENTYX−WIN(ソフトウェア開発)のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて行うことができる。 The identity of the above amino acid sequences refers to those calculated by comparing amino acid sequences using a certain algorithm. Although it does not specifically limit as an algorithm used here, A well-known algorithm is preferable and Lipman-Pearson method (Science, 227,1435,1985) is more preferable. Moreover, said calculation can be performed using the search homology of GENTYTYX-WIN (software development) and a maximum matching program, for example.
ここで、ムタナーゼ活性を有するとは、ムタンに作用し、そのα−1,3−グルコシド結合を分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。 Here, having mutanase activity means the activity of acting on mutan and decomposing the α-1,3-glucoside bond, and the degree of the activity is represented by SEQ ID NO: 1 as long as it exhibits its function. It may be higher or lower than that of a protein having the same amino acid sequence.
また、上記のムタナーゼと等価なタンパク質は、ムタナーゼ活性を有していれば、さらに付加的な性質を有していてもよい。斯かる性質としては、例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び/又は高温においてのみ異なる性質を有する性質、最適pHが異なるという性質などが挙げられる。 In addition, a protein equivalent to the above mutanase may have additional properties as long as it has mutanase activity. Such properties include, for example, properties that are superior in stability compared to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, properties that have different properties only at low and / or high temperatures, and properties that differ in optimum pH. Etc.
また、本発明のムタナーゼは、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。ここで、融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが挙げられる。 The mutanase of the present invention may also be part of a larger protein, such as a fusion protein. Here, examples of the sequence added in the fusion protein include sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, and additional sequences that ensure stability during recombinant production.
本発明で提供するムタナーゼは、例えば、本発明で提供するムタナーゼを有する生物から取得することができる。本発明で提供するムタナーゼを有する生物としては、例えばバチルス エスピー KSM−M35株やバチルス エスピー KSM−M426株が挙げられる。 The mutanase provided by the present invention can be obtained, for example, from an organism having the mutanase provided by the present invention. Examples of the organism having the mutanase provided in the present invention include the Bacillus sp. KSM-M35 strain and the Bacillus sp. KSM-M426 strain.
当該菌の菌学的性質並びに生理学的性質を以下に示す。
〔KSM−M35株の性質〕
A.形態学的性質
(a)細胞の形、大きさ:桿菌(0.53〜0.67x2〜4μm)
(b)細胞の多形性:無し
(c)運動性:有り
(d)胞子:有り、準端、膨潤有り(0.87〜1.3x0.67〜0.8μm)
(e)グラム染色:陽性
B.生理学的性質
(a)硝酸塩の還元:陰性
(b)カタラーゼ:陽性
(c)VPテスト:陽性
(d)インドールの生成:陰性
(e)澱粉の加水分解:陽性
(f)ジヒドロキシアセトンの生成:陽性
(g)オキシダーゼ:陽性
(h)グルコースからの酸産生:陽性
(i)アラビノースからの酸産生:陰性
(j)キシロースからの酸産生:陽性
(k)マンニットからの酸産生:陰性
(l)グルコースからのガス産生:陰性
(m)レシチナーゼ:陰性
(n)クエン酸の利用:陰性
(o)プロピオン酸の利用:陰性
(p)チロシンの分解:陰性
(q)フェニルアラニンの脱アミノ反応:陰性
(r)カゼインの分解:陰性
(s)ゼラチンの分解:陽性
(t)嫌気性下での生育:生育する
(u)食塩耐性:2%以下
(v)生育温度:10℃〜35℃
(w)YM寒天培地:弱い生育
(x)ニュートリエント寒天培地:生育する
The bacteriological and physiological properties of the bacterium are shown below.
[Properties of KSM-M35 strain]
A. Morphological properties (a) Shape and size of cells: Neisseria gonorrhoeae (0.53-0.67x2-4μm)
(B) Cell polymorphism: No (c) Motility: Yes (d) Spore: Yes, quasi-end, with swelling (0.87-1.3x0.67-0.8 μm)
(E) Gram staining: positive Physiological properties (a) nitrate reduction: negative (b) catalase: positive (c) VP test: positive (d) indole production: negative (e) starch hydrolysis: positive (f) dihydroxyacetone production: positive (G) Oxidase: Positive (h) Acid production from glucose: Positive (i) Acid production from arabinose: Negative (j) Acid production from xylose: Positive (k) Acid production from mannitol: Negative (l) Gas production from glucose: negative (m) lecithinase: negative (n) citrate utilization: negative (o) propionic acid utilization: negative (p) tyrosine degradation: negative (q) phenylalanine deamination: negative ( r) Casein degradation: negative (s) Gelatin degradation: positive (t) Anaerobic growth: grow (u) Salt tolerance: 2% or less (v) Growth temperature: 10 ° C to 35 ° C
(W) YM agar medium: weak growth (x) Nutrient agar medium: grows
〔KSM−M426株の性質〕
A.形態学的性質
(a)細胞の形、大きさ:桿菌(0.5〜0.67x1.2〜2.7μm)
(b)細胞の多形性:無し
(c)運動性:有り
(d)胞子:有り、準端、膨潤有り(0.6〜0.8x0.8〜1.4μm)
(e)グラム染色:陽性
B.生理学的性質
(a)硝酸塩の還元:陰性
(b)カタラーゼ:陽性
(c)VPテスト:陽性
(d)インドールの生成:陰性
(e)澱粉の加水分解:陽性
(f)ジヒドロキシアセトンの生成:陽性
(g)オキシダーゼ:陽性
(h)グルコースからの酸産生:陽性
(i)アラビノースからの酸産生:陰性
(j)キシロースからの酸産生:陰性
(k)マンニットからの酸産生:陰性
(l)グルコースからのガス産生:陰性
(m)レシチナーゼ:陰性
(n)クエン酸の利用:陰性
(o)プロピオン酸の利用:陰性
(p)チロシンの分解:陽性
(q)フェニルアラニンの脱アミノ反応:陰性
(r)カゼインの分解:陽性
(s)ゼラチンの分解:陽性
(t)嫌気性下での生育:生育する
(u)食塩耐性:2%以下
(v)生育温度:10℃〜35℃
(w)YM寒天培地:生育する
(x)ニュートリエント寒天培地:生育する
[Properties of KSM-M426 strain]
A. Morphological properties (a) Shape and size of cells: Neisseria gonorrhoeae (0.5-0.67 × 1.2-2.7 μm)
(B) Cell polymorphism: No (c) Motility: Yes (d) Spore: Yes, quasi-end, with swelling (0.6-0.8x0.8-1.4 μm)
(E) Gram staining: positive Physiological properties (a) nitrate reduction: negative (b) catalase: positive (c) VP test: positive (d) indole production: negative (e) starch hydrolysis: positive (f) dihydroxyacetone production: positive (G) Oxidase: Positive (h) Acid production from glucose: Positive (i) Acid production from arabinose: Negative (j) Acid production from xylose: Negative (k) Acid production from mannitol: Negative (l) Gas production from glucose: negative (m) lecithinase: negative (n) use of citrate: negative (o) use of propionic acid: negative (p) degradation of tyrosine: positive (q) deamination of phenylalanine: negative ( r) Casein degradation: positive (s) Gelatin degradation: positive (t) Anaerobic growth: grow (u) Salt tolerance: 2% or less (v) Growth temperature: 10 ° C to 35 ° C
(W) YM agar medium: grows (x) Nutrient agar medium: grows
上記のKSM−M35株及びKSM−M426株の菌学的性質並びに生理学的性質についてBergey’s Mannual of Systematic Bacteriology (Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ検討した結果、バチルス属細菌に属することは明白であったが、種については公知のバチルス属細菌とは完全に一致するものではなかった。そこで新規な微生物として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス エスピー KSM−M35(FERM P−19720)及びバチルス エスピー KSM−M426(FERM P−19725)として寄託した。 As a result of examination according to the description of Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology (Williams & Wilkins, 1984), the bacteriological properties and physiological properties of the KSM-M35 strain and the KSM-M426 strain described above Obviously, the species was not completely consistent with known Bacillus bacteria. Therefore, new microorganisms were deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Bacillus SP KSM-M35 (FERM P-19720) and Bacillus SP KSM-M426 (FERM P-19725).
上記の微生物を用いて本発明のムタナーゼを取得するには、培地に微生物を接種し、常法に従って培養すればよい。ここで、培地としては、0.005%〜10%(w/v)のムタンを添加した培地が好ましい。斯くして得られた培養物中から目的のムタナーゼを採取することができる。この培養上清液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、精製するのが好ましい。培養液からのムタナーゼの精製は、常法に従って行うことができる。即ち、培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清から硫安添加により酵素を沈殿させたり、あるいは限外ろ過膜などを用いて濃縮することができる。さらに噴霧乾燥、凍結乾燥、結晶化などにより様々な形態として調製することができる。 In order to obtain the mutanase of the present invention using the above-mentioned microorganism, the medium may be inoculated with the microorganism and cultured according to a conventional method. Here, as the medium, a medium to which 0.005% to 10% (w / v) mutan is added is preferable. The target mutanase can be collected from the culture thus obtained. The culture supernatant can be used as it is, but is preferably purified as necessary. Purification of mutanase from the culture can be performed according to a conventional method. That is, after centrifuging the culture solution and removing the cells, the enzyme can be precipitated from the supernatant by adding ammonium sulfate, or concentrated using an ultrafiltration membrane or the like. Furthermore, it can be prepared in various forms by spray drying, freeze drying, crystallization and the like.
斯くして得られる本発明のムタナーゼの分子量は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による定量で約130kDaであると測定される。 The molecular weight of the mutanase of the present invention thus obtained is measured to be about 130 kDa as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
本発明の遺伝子は、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであり、好適には、(a)配列番号2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子、及びこれと等価な遺伝子が挙げられる。ここで、等価な遺伝子には、(b)配列番号2で示される塩基配列からなるDNAとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2で示される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。 The gene of the present invention encodes a protein consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and preferably (a) a gene consisting of a polynucleotide consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 2, and an equivalent thereof Gene. Here, the equivalent gene includes (b) a polynucleotide that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and encodes a protein having mutanase activity, and (c And a polynucleotide encoding a protein consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a mutanase activity.
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular cloning −a laboratory manual, 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。即ち、6XSSC(1XSSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5Xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。 Here, the stringent conditions, for example, Molecular cloning -a laboratory manual, 2 nd edition (Sambrook et al., 1989), and the conditions described. That is, 6XSSC (1XSSC composition: 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5X Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. Examples include conditions of constant temperature for 8 to 16 hours and hybridization.
また、上記の塩基配列の同一性とは、あるアルゴリズムを用いて塩基配列を比較することにより計算されるものをいう。ここで用いるアルゴリズムとしては、特に限定されないが、公知のアルゴリズムが好ましく、Lipman−Pearson法(Science, 227,1435,1985参照)がより好ましい。また、上記の計算は、例えば、GENENTYX−WIN(ソフトウェア開発)のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて行うことができる。 Further, the identity of the above base sequences means that calculated by comparing the base sequences using a certain algorithm. Although it does not specifically limit as an algorithm used here, A well-known algorithm is preferable and Lipman-Pearson method (Science, 227,1435,1985) is more preferable. Moreover, said calculation can be performed using the search homology of GENTYTYX-WIN (software development) and a maximum matching program, for example.
また、上記(a)で示される遺伝子と等価な遺伝子は、(a)で示される遺伝子に比べて、mRNAの発現量が多い、そのmRNAの安定性が高い、または翻訳されるタンパク質の安定性が優れているなどの性質を有していてもよい。 In addition, the gene equivalent to the gene shown in (a) has a higher expression level of mRNA, higher stability of the mRNA, or stability of the translated protein than the gene shown in (a). May have properties such as excellent.
本発明のムタナーゼ遺伝子は、例えばバチルス エスピー KSM−M35株等からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、PCR法を用いて行う方法が挙げられる。 The mutanase gene of the present invention can be cloned from, for example, the Bacillus sp. KSM-M35 strain and the like, and examples of the cloning method include methods performed using known means such as the shotgun method and the PCR method.
また、本発明で提供する遺伝子は、例えば、計画的なもしくはランダムな変異導入法などの方法により、配列番号2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子を改変し、必要に応じて適当な選択をすることにより作製することもできる。 In addition, the gene provided by the present invention can be obtained by modifying a gene consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 by a method such as planned or random mutagenesis, It can also be made by selection.
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。ここで特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、PCR法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラバイオ)等を用いて行う方法が挙げられる。また、リコンビナントPCR(polymerase chain reaction)法(PCR protocols, Academic press, New York, 1990)を用いることもできる。 Here, the design of the mutation when introducing the mutation systematically can be performed, for example, by taking into account the characteristic sequence on the gene sequence. Here, reference to a characteristic sequence can be performed, for example, by taking into account the three-dimensional structure prediction of the protein and homology with known proteins. Examples of the method for randomly introducing mutations include a PCR method and a mutagen treatment method. As a method of introducing mutation systematically, site-directed mutagenesis can be mentioned. More specifically, for example, a method using Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit (Takara Bio) etc. Is mentioned. Further, a recombinant PCR (polymerase chain reaction) method (PCR protocols, Academic press, New York, 1990) can also be used.
また、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子の一部又は全部を含む又はからなるポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより取得することもできる。この適当な原理には、例えば、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うPCR法、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が含まれる。 The gene of the present invention can also be obtained by obtaining a sequence that hybridizes to a polynucleotide containing or consisting of a part or all of the gene of the present invention using an appropriate principle. The appropriate principle includes, for example, a PCR method using a polynucleotide containing a part of the gene of the present invention as a primer, and a method using a polynucleotide containing a part of the gene of the present invention as a probe. included.
なお、配列番号2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子の有さない性質を有する遺伝子の取得を試みる場合、遺伝子の性質を利用した選択を併せて行うのが好ましい。このような選択は、公知の方法により容易に行うことができる。 In addition, when attempting to obtain a gene having a property that does not have a gene composed of a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, it is preferable to perform selection using the property of the gene. Such selection can be easily performed by a known method.
本発明で提供する遺伝子を用いれば、本発明で提供するタンパク質を大量に生産することができ有用である。 If the gene provided by the present invention is used, the protein provided by the present invention can be produced in large quantities and is useful.
本発明遺伝子を用いてムタナ−ゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記ムタナ−ゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からムタナ−ゼを採取すればよい。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。 In order to produce mutase using the gene of the present invention, the above mutase gene is incorporated into any vector suitable for expressing the gene in the target host, and the recombinant vector is used as a host. The obtained transformant may be cultured, and mutanas may be collected from the culture solution. The culture may be carried out by inoculating a medium containing a carbon source, a nitrogen source and other essential nutrients that can assimilate microorganisms, and following a conventional method.
本発明ムタナ−ゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにムタナ−ゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、pUC18、pBR322、pHY300PLK等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、pUB110、pHSP64(Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175, 1995)あるいはpHY300PLK等が挙げられる。 In order to produce a recombinant vector containing the mutase gene of the present invention, it is possible to maintain replication in a host cell, to stably express the enzyme, and to a vector that can stably retain the gene. It is sufficient to incorporate the gene. Examples of such vectors include pUC18, pBR322, pHY300PLK and the like when Escherichia coli is used as a host, and pUB110, pHSP64 (Sumitomo et al., Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175, 1995) when Bacillus subtilis is used as a host. ) Or pHY300PLK.
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されず、あらゆるものを用いることができ、例えば、動物、動物由来の細胞、植物、植物由来の細胞、微生物などを用いることができるが、微生物が好ましく、微生物としては、Bacillus属(枯草菌)等のグラム陽性菌、Escherichia coli(大腸菌)等のグラム陰性菌、Streptomyces属(放線菌)、Saccharomyces属(酵母)、Aspergillus属(カビ)等の真菌などが好ましく、枯草菌がより好ましく、枯草菌ISW1214株がより好ましい。動物由来の細胞、植物由来の細胞としては、培養細胞として確立しているものが好ましい。また、宿主株としては、アルカリプロテアーゼが欠損している株が好ましい。 Transformation of a host bacterium using the recombinant vector thus obtained can be performed using a protoplast method, a competent cell method, an electroporation method, or the like. The host bacterium is not particularly limited, and any one can be used. For example, animals, animal-derived cells, plants, plant-derived cells, microorganisms and the like can be used, but microorganisms are preferable, and microorganisms include Gram-positive bacteria such as Bacillus genus (Bacillus subtilis), Gram-negative bacteria such as Escherichia coli (Escherichia coli), fungi such as Streptomyces genus (actinomycetes), Saccharomyces genus (yeast), Aspergillus genus (mold) are preferred, Bacillus subtilis Is more preferable, and Bacillus subtilis ISW1214 strain is more preferable. As animal-derived cells and plant-derived cells, those established as cultured cells are preferred. Further, as the host strain, a strain lacking alkaline protease is preferable.
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。 The obtained transformant may be cultured under suitable conditions using a medium containing an assimilating carbon source, nitrogen source, metal salt, vitamin and the like. From the culture solution thus obtained, the enzyme can be collected and purified by a general method, and the necessary enzyme form can be obtained by freeze-drying, spray-drying, and crystallization.
かくして得られた培養物中からのムタナ−ゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。 Collection and purification of mutanase from the culture thus obtained can be performed according to a general method. That is, the cells can be removed from the culture by centrifugation or filtration, and the target enzyme can be concentrated from the obtained culture supernatant by conventional means. The enzyme solution or dry powder thus obtained can be used as it is, but can be further crystallized and granulated by a known method.
実施例1 ムタナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌サンプル0.5gを生理食塩水(5mL)に懸濁し、80℃で20分間処理を行った。その後、以下の表1の組成からなる液体培地(4mL)に0.1mLの熱処理上清液を添加し、30℃で7日間振盪培養を行った。菌が生育した培養液は、新たな同組成の培地へ0.1mL接種し、さらに7日間振盪培養を行った。この操作をさらに1回繰り返した後、菌液をトリプティケースソイ寒天培地へ塗抹し、30℃で3日間、静置培養を行った。生育した菌を選抜し、純化した後に液体培地へ接種し、30℃で3日間、振盪培養を行い、上清液中のムタナーゼ活性を測定した。ムタナーゼ生産量の高い菌株の中からバチルス エスピー KSM−M35株あるいはバチルス エスピー KSM−M426株を選抜した。
実施例2 ムタナーゼの生産並びに精製
バチルス エスピー KSM−M35株を0.1%(w/v)リン酸1カリウム、0.2%リン酸2カリウム、0.5%酵母エキス(ディフコ)、0.75%魚肉エキス(和光)、0.3%バクトソイトン(ディフコ)、0.01%硫酸マグネシウム7水塩、0.001%硫酸マンガン、0.1%ムタンからなる75mLの液体培地に接種し、30℃、3日間振盪培養を行った(培養液中のムタナーゼの生産量:0.066U/mL)。培養液を遠心分離(8,000xg、10分間、4℃)し、得られた上清液1Lに対し、硫安を70%飽和になるように徐々に加え遠心分離(8,000xg、15分間、4℃)し、沈殿を集め、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に対し1昼夜透析を行った。透析内液を予め50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)にて平衡化しておいたSuperQ Toyopearlカラム(東ソー)へ添着させた。ムタナーゼ活性は非吸着画分に得られ、次いで予め0.8M硫安を含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化しておいたPhenyl Toyopearlカラム(東ソー)へ添着させた後、0.8M〜0M硫安の直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。ムタナーゼ活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮脱塩を行った。濃縮液のSDS電気泳動を行ったところ、分子量130kDa付近に均一のタンパク質バンドが確認され、このバンドのアミノ末端配列を解析した。その結果、Gly−Asn−Leu−Ala−Gln−Gly−Lys−Ser−Ile−Thr−Ser−X−X−Phe−Gly−Asp−Val−Tyr−Val−Ala−Thr(X:不明)の19アミノ酸配列が決定された。
Example 2 Production and Purification of Mutanase Bacillus sp. KSM-M35 strain was prepared by using 0.1% (w / v) 1 potassium phosphate, 0.2% dipotassium phosphate, 0.5% yeast extract (Difco), 0. Inoculate 75 mL of liquid medium consisting of 75% fish meat extract (Wako), 0.3% Bacto Soyton (Difco), 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.001% manganese sulfate, 0.1% mutan, 30 The shaking culture was carried out at 3 ° C. for 3 days (production amount of mutanase in the culture solution: 0.066 U / mL). The culture solution was centrifuged (8,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), and ammonium sulfate was gradually added to 70% saturation to 1 L of the obtained supernatant solution, followed by centrifugation (8,000 × g, 15 minutes, 4 ° C.), and the precipitate was collected and dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) for one day. The dialyzed internal solution was applied to a SuperQ Toyopearl column (Tosoh) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). The mutanase activity was obtained in the non-adsorbed fraction, and then added to a Phenyl Toyopearl column (Tosoh) equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.8 M ammonium sulfate. The adsorbed protein was eluted by a linear concentration gradient method of ˜0M ammonium sulfate. The fraction with mutanase activity was collected and concentrated and desalted by ultrafiltration. When the concentrated solution was subjected to SDS electrophoresis, a uniform protein band was confirmed around a molecular weight of 130 kDa, and the amino terminal sequence of this band was analyzed. As a result, Gly-Asn-Leu-Ala-Gln-Gly-Lys-Ser-Ile-Thr-Ser-X-X-Phe-Gly-Asp-Val-Tyr-Val-Ala-Thr (X: unknown) A 19 amino acid sequence was determined.
また、バチルス エスピー KSM−M426株も同様に培養した。その培養液中のムタナーゼの生産量は、0.05U/mLであった。培養液からムタナーゼを上記と同様の方法で精製すると分子量130kDa付近に均一のタンパク質バンドが確認された。 Bacillus sp. KSM-M426 strain was also cultured in the same manner. The amount of mutanase produced in the culture was 0.05 U / mL. When mutanase was purified from the culture medium in the same manner as described above, a uniform protein band was confirmed in the vicinity of a molecular weight of 130 kDa.
実施例3 ムタナーゼ遺伝子のクローニング
実施例2で得られた19アミノ酸配列を基にプライマー1(配列番号3)、プライマー2(配列番号4)をデザインした。
バチルス エスピー KSM−M35株を1.0%(w/v) バクトトリプトン(ディフコ)、0.5%酵母エキス(ディフコ)、1.0%NaClから成る10mLの液体培地に接種し、30℃、1日間振盪培養を行った後、Genとるくん(酵母用)(タカラバイオ)を用いて菌体から染色体を抽出した。LA PCR in vitro Cloning キット(タカラバイオ)に従い、得られた染色体5μgをHindIII及びPstI制限酵素処理した後、カセット(キット添付)と結合させ、プライマー1とプライマーC1(キット添付)を用いたPCRを行った。得られた増幅断片を鋳型とし、さらにプライマー2とプライマーC2(キット添付)を用いたPCRを行い、約1.8kb及び約2.2kbのPCR増幅断片を取得した。増幅したDNA断片のシーケンスをプライマー2とプライマーC2を用いて行い、ムタナーゼ遺伝子の部分配列を解析した。得られた塩基配列を基にプライマーを構築し、LA PCR in vitro Cloning キットによりムタナーゼをコードする遺伝子を含む5091bpの塩基配列を決定した。
Example 3 Cloning of Mutanase Gene Primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4) were designed based on the 19 amino acid sequence obtained in Example 2.
Bacillus sp. KSM-M35 strain was inoculated into 10 mL of liquid medium consisting of 1.0% (w / v) bactotripton (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 1.0% NaCl, and 30 ° C. After shaking culture for 1 day, chromosomes were extracted from the cells using Gen Toru-kun (for yeast) (Takara Bio). According LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Bio), and the obtained chromosomal 5μg was Hin dIII and Pst I restriction enzyme treatment, is combined with the cassette (attached to the kit), using primers 1 and primer C1 (the kit) PCR was performed. Using the obtained amplified fragment as a template, PCR was further performed using Primer 2 and Primer C2 (attached to the kit) to obtain PCR amplified fragments of about 1.8 kb and about 2.2 kb. The amplified DNA fragment was sequenced using Primer 2 and Primer C2, and the partial sequence of the mutanase gene was analyzed. Primers were constructed based on the obtained base sequence, and the base sequence of 5091 bp containing the gene encoding mutanase was determined by the LA PCR in vitro Cloning kit.
バチルス エスピー KSM−M35株の染色体DNAを鋳型とし、決定した塩基配列を基にデザインしたプライマー3(配列番号5)及びプライマー4(配列番号6)を用いてPCRを行った。PCRはLA Taq(タカラバイオ)を用い、94℃で1分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、56℃で30秒間、72℃で3分間を1サイクルとして30サイクル行い、更に72℃で2分間保温した。増幅した4.3kbDNA断片を制限酵素SalIおよびBglIIにて処理し、同様にSalIおよびBglIIにて処理したプラスミドpHY300PLK(タカラバイオ)と結合反応を行い、反応液を用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ)を形質転換した。形質転換体から抽出したムタナーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて、アルカリプロテアーゼを欠損させた枯草菌ISW1214株(ヤクルト本社)を形質転換した。 PCR was performed using primer 3 (SEQ ID NO: 5) and primer 4 (SEQ ID NO: 6) designed on the basis of the determined nucleotide sequence using the chromosomal DNA of Bacillus sp. KSM-M35 as a template. PCR was performed using LA Taq (Takara Bio), denaturing the template DNA at 94 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes, Incubated at 72 ° C. for 2 minutes. The amplified 4.3kbDNA fragment was treated with restriction enzymes Sal I and Bgl II, subjected to coupling reaction in the same manner as in Sal I and the plasmid was treated with Bgl II pHY300PLK (Takara Bio), Escherichia coli JM109 strain using the reaction solution (Takara Bio) was transformed. A plasmid containing the mutanase gene extracted from the transformant was used to transform Bacillus subtilis ISW1214 strain (Yakult Honsha) lacking alkaline protease.
実施例4 組換えムタナーゼの生産
実施例3で得られた形質転換株を8%(w/v)ポリペプトンS、1%魚肉エキス、0.5%酵母エキス、0.2%リン酸カリウム、0.04%硫酸マグネシウムからなる培地(50mL)に接種し30℃、3日間振盪培養を行った。そのときのムタナーゼの生産量は、2.3U/mLであった。
Example 4 Production of recombinant mutanase 8% (w / v) polypeptone S, 1% fish meat extract, 0.5% yeast extract, 0.2% potassium phosphate, 0% A medium (50 mL) composed of 0.04% magnesium sulfate was inoculated and cultured at 30 ° C. for 3 days with shaking. The production amount of mutanase at that time was 2.3 U / mL.
参考例 ムタナーゼ活性測定法
50mM MOPS緩衝液(pH6.5)、0.5mM 塩化マンガン、0.2%ムタンからなる反応液に適当に希釈した酵素液を添加し、40℃で1時間恒温した(全量1mL)。1mLのDNS試薬[0.5%(w/v)ジニトロサリチル酸、0.4N 水酸化ナトリウム、30%酒石酸ナトリウム・カリウム]を添加した後、100℃で5分間恒温し、生成された還元糖を定量した。本実施例におけるムタナーゼ1単位(ユニット)は、特に記載のない限り、上記反応条件下で1分間に1μmoLのグルコースに相当する還元糖を生成する量とした。
Reference Example Method for Measuring Mutanase Activity An enzyme solution appropriately diluted was added to a reaction solution consisting of 50 mM MOPS buffer (pH 6.5), 0.5 mM manganese chloride and 0.2% mutan, and incubated at 40 ° C. for 1 hour ( Total volume 1 mL). After adding 1 mL of DNS reagent [0.5% (w / v) dinitrosalicylic acid, 0.4N sodium hydroxide, 30% sodium / potassium tartrate], the mixture was incubated at 100 ° C. for 5 minutes. Quantified. Unless otherwise specified, one unit of mutanase in this example was the amount that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under the above reaction conditions.
Claims (9)
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質 Any of the following proteins (a) to (c):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having a mutanase activity (C) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a mutanase activity
(a)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2で示される塩基配列からなるDNAとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2で示される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド A gene comprising the polynucleotide according to any one of (a) to (c) below.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) a protein that hybridizes with the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has a mutanase activity Polynucleotide (c) a polynucleotide comprising a base sequence having 80% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having mutanase activity
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