JP2006132989A - ｐＨ測定装置及びｐＨ測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 気体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化と、液体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化とを、一つの複合センサにより、分離して同時に計測すること。
【解決手段】 複数のｐＨ電極と、ベースライン溶液の供給及び停止手段とを備えたｐＨ測定装置であって；ベースライン溶液の流路内にｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７が配置され、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７と液絡可能な位置に比較電極９が配置され、ｐＨ電極（Ａ）６と試料１１の間にはガス透過膜が配置され、ｐＨ電極（Ｂ）７と試料１１の間にはガス透過膜が配置されず、ベースライン溶液の供給を停止している間に、ｐＨ電極（Ａ）６ではガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来するベースライン溶液のｐＨ変化が、ｐＨ電極（Ｂ）７では全ての酸又はアルカリに由来するベースライン溶液のｐＨ変化が、それぞれ同時に測定されることを特徴とするｐＨ測定装置とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、複数のｐＨ電極を用いることによって、ガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来するｐＨ変化と、全ての酸又はアルカリに由来するｐＨ変化とが、同時に測定されるｐＨ測定装置に関する。また、それを用いたｐＨ測定方法に関する。本発明のｐＨ測定装置は、測定対象である生体試料などから分泌される酸又はアルカリの量を定量するのに適しており、医学、生理学、細胞生物学、さらには発酵、醸造、培養等のバイオ産業分野で好適に用いられる。

酸及びアルカリの中には、水に溶解した時、乳酸、リン酸、脂肪酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどのようにその蒸気圧がほとんどゼロである（以下、このことを「液体性の」ということがある）ものと、炭酸ガス、硫化水素、アンモニアなどのように蒸気圧を有する（以下、このことを「気体性の」ということがある）ものがある。一般的に気体性の酸及びアルカリは分子量が小さく、かつイオンへの解離が不十分である。一方、液体性の酸及びアルカリは分子量が大きいか、分子量が小さくても塩化水素のようにイオンへの解離が大きいものである。生体中には炭酸ガスや硫化水素、アンモニアのような気体性の酸又はアルカリと、乳酸、脂肪酸、塩酸、炭酸水素ナトリウムのような液体性の酸又はアルカリが混在することが多い。さらに酢酸やギ酸のように低い値ではあるけれどもある程度の蒸気圧を有するものもある。

これまでに気体性の酸又はアルカリの測定にはガス透過膜とｐＨ電極を組み合わせた、いわゆるSeveringhaus型のセンサが用いられてきた。これはガス透過性膜で覆われた室の中に測定対象ガスの溶解によってｐＨが変化するような内部溶液を満たし、その中にｐＨ電極と比較電極を収納したものである。この型のガスセンサでは一般的にガス濃度はその検体と平衡にある気相の分圧として表示される。このSeveringhaus型ガスセンサの原理を応用して、この内部溶液を間歇的に流通及び停止させることによって検体中の気体性の酸又はアルカリの分圧を測定するガスセンサが開示されている（特許文献１）。

特許文献１に記載されたガスセンサは、少なくとも測定対象ガスと共役なイオンを含むキャリヤ溶液を流通させるための入口と出口を備えかつガス透過膜で外部と隔離されたガス交換室を有するガス交換部と、前記ガス交換室の前記入口に接続されキャリヤ溶液を前記ガス交換室に導く往路部と、前記ガス交換室の前記出口に接続されキャリヤ溶液を前記ガス交換室から外部に導く復路部と、前記往路部の内部に設置された参照用ｐＨ電極と前記ガス交換室の内部及び前記復路部の内部のいずれかに設置された測定用ｐＨ電極とを備えたガスセンサである。これによって、ゼロ点校正の自動化が容易であり、かつｐＨ電極のベースラインドリフトや温度ドリフトも補償することができるとされている。

一方、測定対象試料が液体性と気体性の両方の酸やアルカリを含んでいる時、その両者を分離しないで、全体の酸分泌の速度を測定する方法と装置は公知である。そのようなケースの一例として細胞外酸性化の測定が挙げられる。細胞の活性の指標として細胞外酸性化の測定は重要である。細胞はグルコース、グルタミン酸、ピルビン酸、脂質等を代謝して、細胞の活動に必要なエネルギーの媒体であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を合成しているが、その結果として、乳酸や炭酸ガス等の酸性物質を細胞外に排出する。この過程をエネルギー代謝と呼んでいる。最も重要なグルコースの代謝においては、まずミトコンドリアの外の細胞質における解糖反応によりグルコースから乳酸への代謝が進み、さらにミトコンドリア内での呼吸反応により最終的に炭酸ガスと水に代謝される。この両方の過程でグルコース１分子から３８分子のＡＴＰが合成される。代謝産物である乳酸と炭酸ガスはいずれも酸性物質であるので、細胞外酸性化の速度を測定することによって、細胞のエネルギー代謝の活発さを知ることができる。

これまでに細胞外酸性化の計測に関しては多くの報告があるが、その大半は、Molecular Devices社の「Microphysiometer」を用いたものである。これはＬＡＰＳ（Light Addressable Potentiometric Sensor）と呼ばれる一種のｐＨ電極を検出器とし、培養細胞近傍の培養液のｐＨ変化を測定するものである（特許文献２、非特許文献１）。この方法における一例では、細胞が接着した基盤に対面してｐＨ電極が配置され、その間隙に弱いｐＨ緩衝能を有する培養液を流したり止めたりして、溶液の流通を止めた直後のｐＨ変化の速度から、細胞外酸性化の速度を求める。培養細胞からは気体性の酸である炭酸ガス、液体性の酸である乳酸、及び液体性のアルカリである炭酸水素イオン等が分泌される。この細胞外酸性化測定システムにおいては検出器として１本のｐＨ電極のみを使用しているために、気体性と液体性の酸及びアルカリの総和のみしか測定できない。

以上のように、従来の技術においても、気体性の酸又はアルカリの分泌速度のみを測定することは可能であった。また、気体性の酸又はアルカリと、液体性の酸又はアルカリの総和の分泌速度を計測することも可能であった。しかし、気体性の酸又はアルカリと、液体性の酸又はアルカリの分泌速度を分離して同時に測定することは不可能であった。

特開２００１−２８９８１１号公報 特許第２９９３９８２号公報 J. W. Parce外９名、「Detection of Cell-Affecting Agents with a Silicon Biosensor」、サイエンス、１９８９年１０月、第２４６巻、ｐ．２４３−２４７

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、気体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化と、液体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化とを、一つの複合センサにより、分離して同時に計測することを目的とするものである。

上記課題は、複数のｐＨ電極と、ベースライン溶液の供給及び停止手段とを備えたｐＨ測定装置であって；
前記ベースライン溶液の流路内にｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）が配置され、
ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）と液絡可能な位置に比較電極が配置され、
ｐＨ電極（Ａ）と測定対象の間にはガス透過膜が配置され、
ｐＨ電極（Ｂ）と測定対象の間にはガス透過膜が配置されず、
前記ベースライン溶液の供給を停止している間に、ｐＨ電極（Ａ）では前記ガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来する前記ベースライン溶液のｐＨ変化が、ｐＨ電極（Ｂ）では全ての酸又はアルカリに由来する前記ベースライン溶液のｐＨ変化が、それぞれ同時に測定されることを特徴とするｐＨ測定装置を提供することによって解決される。

前記ｐＨ測定装置において、ｐＨ電極（Ａ）がガス透過膜からなるチューブに覆われ、該チューブの内部をベースライン溶液が流通することが好適な実施態様である。ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）が内蔵された測定室を備え、該測定室がベースライン溶液の流入口及び流出口、並びに測定対象が接触する測定窓を有することも好適な実施態様であり、特に前記測定室が２つの測定窓を有し、一方の測定窓はガス透過膜で覆われてその内側にｐＨ電極（Ａ）が配置され、他方の測定窓はガス透過膜で覆われずにその内側にｐＨ電極（Ｂ）が配置されてなることが好適である。また、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）がいずれも一枚の半導体基板上に形成されてなることも好適な実施態様である。

前記ｐＨ測定装置において、ｐＨ電極（Ａ）からｐＨ電極（Ｂ）までの経路長が、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）までの距離の５倍以上であることが好適である。前記ベースライン溶液の流路内の、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）よりも上流の位置に比較電極が配置されてなることも好適である。前記比較電極が、参照用ｐＨ電極と擬似比較電極との組み合わせから構成されてなるものであることも好適である。また、前記ベースライン溶液のｐＨ緩衝能が１０〜５００μＭ／ｐＨであることも好適である。

また上記課題は、ベースライン溶液の流路内にｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）を配置し、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）と液絡可能な位置に比較電極を配置し、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）の周囲に同一組成のベースライン溶液を流通させて置換した後にベースライン溶液の流通を停止させ、ｐＨ電極（Ａ）では測定対象から生じたガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来するｐＨ変化を、ｐＨ電極（Ｂ）では測定対象から生じた全ての酸又はアルカリに由来するｐＨ変化を、それぞれ同時に測定することを特徴とするｐＨ測定方法を提供することによっても解決される。このようなｐＨ測定方法によって、生体組織から分泌される酸又はアルカリを定量する分泌物定量方法も、本発明の好適な実施態様であり、このとき炭酸ガス量と乳酸量とをそれぞれ定量することが特に好適である。

本発明のｐＨ測定装置によれば、気体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化と、液体性の酸又はアルカリに由来するｐＨ変化とを、一つの複合センサにより、分離して同時に計測することができる。これにより、例えば、生体から分泌される細胞の解糖活性と呼吸活性のそれぞれに対応する乳酸量と炭酸ガス量とをそれぞれ定量することも可能であり、細胞のエネルギー代謝に関するより詳細な情報を得ることができる。

以下、図面を使用して本発明をより具体的に説明する。図１は、測定室と測定窓を有する、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。図２は、比較電極が参照用ｐＨ電極と擬似比較電極との組み合わせから構成されてなる、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。図３は、測定室を有さない、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。図４は、測定室の全体が細長い環状体で形成されてなる、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。図１〜４はいずれも本発明のｐＨ測定装置の複合センサ部分のみを示しているものである。本発明のｐＨ測定装置は、前記複合センサ部分以外に、ベースライン溶液の供給及び停止手段、各電極に接続される電気配線、データ処理手段などを有しているが、ここでは図示を省略している。

まず、図１を参照しながら、本発明のｐＨ測定装置の基本的な構成について説明する。図１は本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分を示したものである。センサボディ１は前室２と測定室３とからなり、ベースライン溶液の流入口４と流出口５を有している。測定室３の内部にはｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７が収納されており、ｐＨ電極（Ａ）６はガス透過膜からなるチューブ８によって取り囲まれている。さらに比較電極９がｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７と液絡可能な位置（この場合は前室２の内部）に設置されている。センサボディ１のｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７の両電極付近に測定窓１０が設けられ、ここに測定対象である試料１１が密着される。

流入口４から入ったベースライン溶液の一部は、ｐＨ電極（Ａ）６の周囲を置換しながらチューブ８の内部を流れ、流出口５から排出される。また、流入口４から入ったベースライン溶液の残余の部分は、ｐＨ電極（Ｂ）７の周囲を置換しながらチューブ８の外側を流れ、流出口５から排出される。ベースライン溶液の供給を停止している間に、試料１１から発生しガス透過膜を通過した酸又はアルカリが、拡散によってｐＨ電極（Ａ）６に到達する。またこのとき、試料１１から発生した全ての酸又はアルカリが、拡散によってｐＨ電極（Ｂ）７に到達する。

試料１１から液体性の酸ＬＨと気体性の酸ＧＨが分泌される場合を例として、図１に記載された複合センサにより、それぞれの酸によるベースライン溶液の酸性化Ａ_ＬとＡ_Ｇを求める方法について述べる。図１の複合センサの測定窓１０に試料１１を密着させて、ベースライン溶液を流通させる。センサボディ１の内部が新鮮なベースライン溶液で十分置換された時点で、ｐＨ電極（Ｂ）７及びｐＨ電極（Ａ）６の比較電極９に対する電位差を読みとり、それぞれＶ_Ｔ０（ｍＶ）及びＶ_Ｇ０（ｍＶ）とする。次にベースライン溶液の送液を止めて、所定時間ｔ後の両者の出力をＶ_Ｔｔ（ｍＶ）及びＶ_Ｇｔ（ｍＶ）とする。

簡単のために、両電極ともｐＨ感度は等しくＳ（ｍＶ／ｐＨ）であるとすると、ガス透過膜からなるチューブ８の外側の溶液のｐＨ変化ΔｐＨ_Ｔは、下記式（１）で示される。
ΔｐＨ_Ｔ＝（Ｖ_Ｔｔ−Ｖ_Ｔ０）／Ｓ （１）
また、チューブ８の内側の溶液のｐＨ変化ΔｐＨ_Ｇは、下記式（２）で示される。
ΔｐＨ_Ｇ＝（Ｖ_Ｇｔ−Ｖ_Ｇ０）／Ｓ （２）

チューブ８は気体性の酸ＧＨは透過させるが、液体性の酸ＬＨは透過させないので、ΔｐＨ_Ｇは気体性の酸ＧＨのみによるベースライン溶液の酸性化を示している。一方チューブ８の外側のベースライン溶液にはＧＨとＬＨの両者を合わせた全部の酸が溶解できるので、ΔｐＨ_Ｔは全部の酸による酸性化を表している。すなわち、下記式（３）及び（４）が成り立つ。
ΔｐＨ_Ｇ＝Ａ_Ｇ （３）
ΔｐＨ_Ｔ＝Ａ_Ｇ＋Ｌ （４）

ここで、Ａ_Ｇ＋ＬはＬＨとＧＨの両方による酸性化である。近似的にＡ_Ｇ＋ＬはＡ_ＧとＡ_Ｌの和に等しい、すなわち酸性化に加成性が成り立つとすると、式（４）は下記式（５）に書き直すことができる。
ΔｐＨ_Ｔ＝Ａ_Ｇ＋Ａ_Ｌ （５）

ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７は共通のベースライン溶液によって置換されているので、時間ｔにおいて、気体性の酸がガス透過性膜の内外で十分平衡状態に達していると仮定すれば、式（３）のＡ_Ｇと式（５）のＡ_Ｇは等しいとみなされる。このとき、式（３）と式（５）から液体性の酸による酸性化は下記式（６）で示される。
Ａ_Ｌ＝ΔｐＨ_Ｔ−ΔｐＨ_Ｇ （６）

以上のように、式（３）及び式（６）からＡ_ＧとＡ_Ｌをそれぞれ分離して求めることができる。なお、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７の周囲が異なるベースライン溶液で置換されている場合は、例え同一濃度の気体性の酸が溶解してもその酸性化の程度は異なるので、上記式（６）によって液体性の酸による酸性化を分離することはできない。このことから、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７の周囲を共通のベースライン溶液で置換するという本発明の工夫の重要性が理解できる。

次に、本発明のｐＨ測定装置における各構成要素について説明する。まずｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７としては、ガラス電極、金属酸化物／金属電極、ＩＳＦＥＴ（Ion Sensitive Field Effect Transistor：イオン感応性電界効果トランジスタ）、ＬＡＰＳ（Light Addressable Potentiometric Sensor）等、これまでに知られている各種のものが用いられる。中でも、ＩＳＦＥＴ、ＬＡＰＳなどの半導体センサは微小化が可能で、かつ応答速度が速いという特長を有しているので、本発明で使用するｐＨ電極として好適である。光の照射を要せず、装置が簡略化できる点も考慮すれば、ＩＳＦＥＴが特に好適に使用される。このとき、ｐＨ電極（Ａ）６とｐＨ電極（Ｂ）７とは、実質的に同じｐＨ感度、温度特性及びドリフト特性を有するものが使用されることが好ましい。それによって、ｐＨ電極（Ａ）６とｐＨ電極（Ｂ）７のそれぞれに対して、個別に校正パラメータ（ｐＨ感度、温度補正係数、ドリフト補正係数等）を設定する必要がなくなり、パラメータ設定操作を簡略化できる。

比較電極９としては、従来の飽和かんこう電極、銀／塩化銀電極等を内部電極とする液絡式の比較電極などが用いられる。このとき、液絡部を有する容器に一定濃度の塩素イオンを含有する内部溶液が充填された従来タイプの液絡式比較電極を使用することもできるが、ベースライン溶液が常に一定濃度の塩素イオンを含有するものである場合は、裸の銀／塩化銀電極をベースライン溶液の流路内に直接配置したものを使用することもでき、これによって装置を簡略化することができる。比較電極９の配置場所は、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７と液絡可能な位置であればどこでもかまわない。しかしながら、ベースライン溶液の流路内の、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７よりも上流の位置に比較電極９が配置されることが好ましい。これによって、比較電極９の周囲が常に新鮮なベースラインによって満たされ、試料による液絡部の汚染等が避けられるからである。図１の例では、常に新鮮なベースラインによって満たされる前室２の中が、比較電極９を設置する場所として好適である。

さらに、比較電極が、参照用ｐＨ電極と擬似比較電極との組み合わせから構成されてなるものであることも好適である。この場合のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分を示したものが図２である。図２の例においては、前室２の内部に、図１における比較電極９の変わりに、参照用ｐＨ電極１２と擬似比較電極１３とが配置されている。この場合、ｐＨ電極（Ａ）６と擬似比較電極１３との電位差（Ｖａ）、ｐＨ電極（Ｂ）７と擬似比較電極１３との電位差（Ｖｂ）、参照用ｐＨ電極１２と擬似比較電極１３との電位差（Ｖｒ）をそれぞれ測定する。このとき、Ｖａ−Ｖｒが、図１の例の場合のｐＨ電極（Ａ）６と比較電極９との電位差に相当し、Ｖｂ−Ｖｒが、図１の例の場合のｐＨ電極（Ｂ）７と比較電極９との電位差に相当するので、前述の要領でベースライン溶液の酸性化などを算出することができる。このように、参照用ｐＨ電極１２とｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７との差動出力を読むことによって、ベースライン溶液の酸性化以外のノイズ、例えば、誘導ノイズ、温度ノイズ、流動ノイズなどを相殺し、より精度の高い測定を行うことが可能である。このような差動型ｐＨ測定の方法は、特開２００１−２８９８１１号公報（特許文献１）に詳細に開示されている。

特に、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７としてＩＳＦＥＴを用いる場合は、比較電極９の代わりに参照用ｐＨ電極１２であるＩＳＦＥＴと疑似比較電極１３とを使用することが好ましい。この場合、参照用ｐＨ電極１２用のＩＳＦＥＴとしてはｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７として使用されるＩＳＦＥＴと実質的に同じｐＨ感度、温度特性、ドリフト特性を有するものを用いることが望ましい。また、疑似比較電極１３としては白金、銀、金等の貴金属電極や炭素電極等を用いることができる。

ガス透過膜としては、シリコーンゴム等のガス透過性に優れた均質膜、もしくはポリテトラフロロエチレンやポリプロピレン等の疎水性樹脂の多孔質膜が好適である。図１においてはガス透過膜としてチューブ８が例示されているが、その形態は特に限定されない。ｐＨ電極（Ａ）６と測定対象の間にガス透過膜が配置され、ｐＨ電極（Ｂ）７と測定対象の間にガス透過膜が配置されず、測定対象から発生した酸又はアルカリのうち、気体性の酸又はアルカリのみが選択的にｐＨ電極（Ａ）６に到達するような配置にすればよい。例えば、図１において、ｐＨ電極（Ａ）６を囲むチューブ８を配置する代わりに、ｐＨ電極（Ａ）６とｐＨ電極（Ｂ）７の間を平膜状のガス透過膜で仕切っても良い。また、ｐＨ電極（Ａ）６を収納する流路を設け、その上に平膜状のガス透過膜を貼り付けてもよい。

ｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの経路長が、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）６までの距離よりも十分大きいことが望ましい。そうすることによって、ベースライン溶液の停止時間内において、気体性の酸又はアルカリがガス透過膜を通ってｐＨ電極（Ａ）６に到達するまでの間に、液体性の酸又はアルカリがｐＨ電極（Ｂ）７にのみ到達してその影響がｐＨ電極（Ａ）６に及ばないようにすることができる。このことが、気体性の酸又はアルカリと、液体性の酸又はアルカリとを分離して定量するためには重要である。具体的には、ｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの経路長が、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）６までの距離の５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることがより好ましく、１５倍以上であることがさらに好ましい。図１の例では、前記経路長は、ｐＨ電極（Ｂ）７からチューブ８の上端１４を経てｐＨ電極（Ａ）６に到達するまでの距離と、ｐＨ電極（Ｂ）７からチューブ８の下端１５を経てｐＨ電極（Ａ）６に到達するまでの距離との内で、短いほうの距離ということになる。またこのとき、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）６までの距離は、チューブ８の内径の半分程度ということになる。

図１の例に示されているように、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７が内蔵された測定室３を備えていることが好ましい。測定室３の中に測定対象である試料を浮遊させたり懸濁させたりして測定することも可能であるので、生体組織片や微生物など、様々な試料に対応することができる。また、測定室３が、測定対象である試料が接触する測定窓１０を有することも好ましい。この場合、測定窓１０に試料１１を接触させるだけで測定することが可能なので、身体の一部を接触させてそこからの分泌物を測定することも可能である。生体組織からの分泌物の量は、通常微量であるために、微量の酸又はアルカリによって十分にｐＨが変動することが好ましく、応答速度を早くして測定時間を短縮するためには、測定室３の容量は小さいほうが好ましい。具体的には容量は１０００μＬ以下であることが好ましく、１００μＬ以下であることがより好ましい。一方、複数の電極を一枚の半導体基板上に形成するような場合には、測定室３の容量の下限値を０．１μＬ程度にすることもできるが、ベースライン溶液の流通性などを考慮すれば、通常１μＬ以上である。また、測定窓１０の面積が広い方が、測定時間を短縮できて好ましい。図１の例に示されているように、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７が内蔵された測定室３の上流側に前室２が設けられていることが好ましく、そこに比較電極９を配置することが好適である。

図３に示した実施態様は、測定室３を有さず、ガス透過膜からなるチューブ８によって取り囲まれているｐＨ電極（Ａ）６と、チューブ８の外側に配置されているｐＨ電極（Ｂ）７とを筒状の試料１１で囲んで測定する装置である。これは、切り出し血管のように管状体である試料を用いる場合のみならず、管状体の内壁に細胞を接着培養したような試料を用いる場合に好適である。

図４に示した実施態様では、測定室３は全体が細長い環状体からなるセンサボディ１の内側に形成されており、長手方向に同じ向きに２つの測定窓１６，１７が設けられている。測定窓１６の付近においてガス透過膜からなるゴム製のチューブ８がセンサボディ１を覆っていて、測定窓１６のみがガス透過膜で覆われた状態になっている。測定窓１６の内側にはｐＨ電極（Ａ）６が配置されていて、測定窓１７の内側にはｐＨ電極（Ｂ）７が配置されていて、測定対象である試料１１が両方の測定窓１６，１７に接触する形で測定が行われる。ベースライン溶液は、流入口４から導入され流出口５から排出される。比較電極９は、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７よりも上流側に配置されることが好適であるが、ｐＨ電極（Ａ）６とｐＨ電極（Ｂ）７との位置関係は、いずれが上流側に配置されても構わない。このとき、前述のようにｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの経路長が、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）６までの距離よりも十分大きければ、両電極の間にガス透過膜がなくても気体性の酸又はアルカリと、液体性の酸又はアルカリとを分離して定量することができる。図４に示した実施態様では、測定室内の容量を小さくすることも容易であり、この点からも好適である。特に、身体の一部を接触させてそこからの分泌物を測定するような場合に、短時間での測定が容易であり好ましい実施態様である。

また、ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７がいずれもＩＳＦＥＴ、ＬＡＰＳなどの半導体センサからなる場合には、これらが一枚の半導体基板上に形成されてなることも好適である。こうすることによって、非常に小型のｐＨ測定装置を生産性良く製造することが可能である。このとき、比較電極９、参照用ｐＨ電極１２、あるいは疑似比較電極１３についても同様に一枚の半導体基板上に形成されることが好適である。これらの各種電極を１枚の半導体基板上に形成して配線を施すことは、通常の半導体製造プロセスを採用することによって可能である。これらの電極がベースライン溶液の流路内に配置されるように流路を形成する。流路の形成方法としては、例えば、流路パターンをエッチングしたガラスを半導体基板に重ねて接着する方法などが採用される。ｐＨ電極（Ａ）６と測定対象との間に、ガス透過膜を配置する方法としては、ｐＨ電極（Ａ）６をガス透過膜で覆う方法や、ｐＨ電極（Ａ）６付近に配置された測定窓をガス透過膜で覆う方法など、前述の各種方法が採用できる。

本発明のｐＨ測定装置に用いられるベースライン溶液には、送液中には、電極の周辺をベースライン溶液のｐＨに保ち、ベースライン溶液の送液を停止した後は、試料から放出される酸やアルカリによってできる限り大きくｐＨが変化することが求められる。そのためにはベースライン溶液のｐＨ緩衝能が強すぎても弱すぎても不都合であり、１０〜５００μＭ／ｐＨの緩衝能であることが好ましい。ｐＨ緩衝能が強すぎる場合には、測定感度が鈍くなるおそれがあり、好適には５００μＭ／ｐＨ以下であり、より好適には２５０μＭ／ｐＨ以下である。特に感度を重視する場合には１００μＭ／ｐＨ以下であることがさらに好ましい。市販の緩衝液は１０００μＭ／ｐＨを超えるものがほとんどであり、それに比べて弱い緩衝能を有するベースライン溶液とすることが好ましい。本発明のｐＨ測定装置では、微量の酸やアルカリを定量する場合が多いために、感度が重要視されるからである。一方、ｐＨ緩衝能が弱すぎる場合には、測定される電位のベースラインがふらつくおそれがあり、好適には１０μＭ／ｐＨ以上であり、より好適には１３μＭ／ｐＨ以上である。

ベースライン溶液に、測定対象の気体性の酸やアルカリに対する共役イオンを含有させておいてもかまわない。例えば、測定対象に炭酸ガスが含まれている場合は炭酸水素イオンを、アンモニアが含まれている場合はアンモニウムイオンを含有させておいてもかまわない。こうすることにより、気体性の酸やアルカリに対する感度を向上させることができる（Severinghaus型ガスセンサの原理）場合がある。しかしながら、この場合には測定可能な下限濃度が上昇する場合が多いので、測定対象から発生する酸やアルカリの量が少ない場合などには、好ましくない場合がある。また試料が細胞や切り出し臓器、あるいは生体表面のように栄養や酸素を必要とするものである場合は、ベースライン溶液にグルコース等の栄養分と酸素を含有させておくことが好ましい。

ベースライン溶液を供給する手段は特に限定されず、各種のポンプなどを使用することができる。ベースライン溶液を停止させるには、流路のバルブを閉じたり、ポンプの運転を停止したりする手法が採用される。所定の時間、ベースライン溶液を供給して電極の周辺をベースライン溶液で置換してから、送液を停止し、ｐＨ変化の測定を開始する。検出される電位の安定性を考慮すると、ベースライン溶液で置換する時間は１秒以上であることが好ましく、１０秒以上であることがより好ましい。一方、全測定に要する時間を短縮するためには、置換する時間は１０分以下であることが好ましく、３分以下であることがより好ましい。また、送液を停止してからｐＨの変化を測定する時間は、測定対象や測定装置によっても相違するが、ｐＨ電極（Ａ）の周囲のベースライン溶液中に、ガス透過膜を通過した酸又はアルカリが到達できるまでの時間とする必要がある。測定精度を向上させるためには、最終的な平衡濃度が推定可能になる濃度に到達するまで測定することが好ましい。測定時間は好適には１秒以上であることが好ましく、１０秒以上であることがより好ましい。一方、測定時間が長すぎると、特に身体の一部を接触させて測定するような場合には、測定対象者の負担が大きくなり好ましくない。したがって、好適には２０分以下であり、より好適には５分以下である。本発明のｐＨ測定装置は、比較的短時間での測定が可能である。ベースライン溶液の供給及び停止のタイミング、電極からの取得データの処理などは、コンピュータを用いて自動的に行うことも可能である。

本発明のｐＨ測定装置で測定対象とされる酸又はアルカリとしては、水に溶解可能な酸又はアルカリであれば特に限定されない。ガス透過膜の透過性によって、ｐＨ電極（Ｂ）のみで検出されるものと、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）の両方で検出されるものとに分けられる。ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）の両方で検出される酸及びアルカリとしては、分子量が低く、かつイオンへの解離が不十分なものである。具体的には、分子量が７０以下であり、かつ２５℃における酸解離定数（Ｋａ）又は塩基解離定数（Ｋｂ）が１０^−６以下であるような化合物である。代表的には、二酸化炭素、アンモニア、硫化水素などである。また、メチルアミン、メチルメルカプタン、ギ酸、酢酸なども装置の構成や測定条件によっては対象となる。一方、ｐＨ電極（Ｂ）のみで検出される酸及びアルカリとしては、分子量が高いか、あるいはイオンへの解離が十分なものである。具体的には、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、乳酸、ピルビン酸、炭素数が３以上の脂肪酸などである。なかでも、細胞のエネルギー代謝の状況を調べるために、代謝産物である乳酸と炭酸ガスとをそれぞれ定量することが特に好ましい。

本発明の装置の測定対象となる試料としては、気体性の酸又はアルカリと、液体性の酸又はアルカリの両方を溶出あるいは分泌するものがあげられる。生きている生物の生体組織から分泌される酸又はアルカリを直接定量しても良いし、生物から採取した生体組織から分泌される酸又はアルカリを定量しても良い。具体的な試料の形態としては、例えば、細胞、微生物、生体組織、切りだし臓器等があげられる。試料が細胞や微生物の場合は、それらを測定室の中に懸濁させておいてもよいし、平板表面に接着培養してそれを測定窓に密着させて試料としてもよい。測定対象が生体組織、例えば人の表皮の場合は、試料のところに表皮をもってきて、それを測定窓に密着させる方法が適切である。

測定の目的は特に限定されないが、生体試料などから分泌される酸又はアルカリの量を定量するのに適しており、医学、生理学、細胞生物学、さらには発酵、醸造、培養等のバイオ産業分野で好適に用いられる。人の皮膚から分泌される酸又はアルカリを定量することは、本発明の好適な実施態様である。この場合、身体を傷つけることなく表皮細胞のエネルギー代謝の状況を調べることが簡単にできる。代謝異常などの皮膚の疾患を診断するための装置としてのみならず、美容のために皮膚の状況を判断する装置としても好適に使用される。特に、美容目的の場合には、短時間で簡易に測定できることが極めて重要なので、本発明の装置が好適に使用される。

実施例１
図３に記載されているｐＨ測定装置を用いて試験を行った。ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７は、いずれも幅０．４５ｍｍ、厚み０．２ｍｍ、露出部の長さ１．５ｍｍのＩＳＦＥＴである。比較電極９は直径０．５ｍｍ、長さ３ｍｍの銀線の表面を塩化銀でコーティングしたもの（銀／塩化銀線）である。チューブ８は内径０．５ｍｍ、外径０．５４ｍｍ、長さ１５ｍｍのシリコーンチューブである。ｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの経路長は１５ｍｍであり、シリコーンチューブの内壁からｐＨ電極（Ａ）６までの距離は０．２ｍｍ程度である。

試料１１として、内径３ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス管の内壁にヒト臍帯動脈の内皮細胞を接着培養したものを用いた。ベースライン溶液としては、溶液１Ｌ中にＤ−グルコース２．７ｇ、食塩８．１８ｇ、塩化カリウム０．３８ｇ、塩化マグネシウム６水和物０．１８６ｇ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン）−Ｎ’−（２−エタンスルフォン酸）０．０２４ｇを溶かした後、微量の炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．４に調整した溶液を用いた。このベースライン溶液の緩衝能βは２００μＭ／ｐＨであった。すなわちこのベースライン溶液に塩酸を２００μＭになるように加えるとｐＨが６．４になった。このガラス管の中をベースライン溶液で十分置換した後、ベースライン溶液の送液を停止した。図５に送液停止後１０分間におけるΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの変化を示した。送液停止後１０分でのΔｐＨ_Ｔは−０．３７６、ΔｐＨ_Ｇは−０．２２５であった。

これより、気体性の酸（炭酸ガス）による酸性化Ａ_Ｇと液体性の酸（主として乳酸）による酸性化Ａ_Ｌは、
Ａ_Ｇ＝ΔｐＨ_Ｇ＝−０．２２５
Ａ_Ｌ＝ΔｐＨ_Ｔ−ΔｐＨ_Ｇ＝−０．３７６−（−０．２２５）＝−０．１５１
となる。これから気体性の酸と液体性の酸の分泌濃度Ｃ_ＧとＣ_Ｌは、
Ｃ_Ｇ＝β｜Ａ_Ｇ｜＝４５μＭ
Ｃ_Ｌ＝β｜Ａ_Ｌ｜＝３０μＭ
であった。すなわちこの細胞では１０分間での気体性の酸（炭酸ガス）の分泌濃度は塩酸換算で４５μＭ、液体性の酸のそれは３０μＭであった。なお、ここで算出された分泌濃度はあくまでも塩酸換算値である。塩酸換算値４５μＭの炭酸ガスとは「ｐＨの変動に関して４５μＭの塩酸と同一の効果を有する炭酸ガスの濃度」という意味である。炭酸ガスは塩酸に比べて格段に弱酸であるから、４５μＭの塩酸と同一の効果を有する炭酸ガスの濃度は４５μＭより相当高い濃度となる。

実施例２
図１に記載されているｐＨ測定装置を用いて試験を行った。測定室３の内容積は約５０μＬである。ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７は、いずれも幅０．４５ｍｍ、厚み０．２ｍｍ、露出部の長さ１．５ｍｍのＩＳＦＥＴである。比較電極９は直径０．５ｍｍ、長さ３ｍｍの銀線の表面を塩化銀でコーティングしたものである。チューブ８は内径０．５ｍｍ、外径０．５４ｍｍ、長さ１５ｍｍのシリコーンチューブである。ｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの経路長は１５ｍｍであり、シリコーンチューブの内壁からｐＨ電極（Ａ）６までの距離は０．２ｍｍ程度である。

健常人の外腕部表皮に図１のセンサの窓を密着させ、実施例１と同一のベースライン溶液を３ｍＬ／分の流速で１分間流通させた後、送液を停止した、図６に送液停止後１０分間のΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの経時変化を示した。送液停止後１０分でのΔｐＨ_Ｔ，ΔｐＨ_Ｇはそれぞれ−１．５１９及び−０．７２０であった。これより実施例１と同様にして、Ｃ_ＧとＣ_Ｌを求めると、次のようになった。
Ｃ_Ｇ＝１４４μＭ
Ｃ_Ｌ＝１６０μＭ
すなわち、当該表皮からの気体性の酸（炭酸ガス）の１０分間での分泌濃度は、塩酸換算で１４４μＭ、液体性の酸（主として乳酸）のそれは１６０μＭであった。

実施例３
図４に記載されている細径管タイプのｐＨ測定装置を用いて試験を行った。測定室３は、内径１．５ｍｍ、長さ５０ｍｍのポリテトラフロロエチレン管であり、その内容積は約５０μＬである。ｐＨ電極（Ａ）６及びｐＨ電極（Ｂ）７は、いずれも幅０．４５ｍｍ、厚み０．２ｍｍ、露出部の長さ１．５ｍｍのＩＳＦＥＴである。比較電極９は直径０．５ｍｍ、長さ３ｍｍの銀線の表面を塩化銀でコーティングしたものである。チューブ８は内径０．５ｍｍ、外径０．５４ｍｍ、長さ１５ｍｍのシリコーンチューブである。ｐＨ電極（Ａ）６からｐＨ電極（Ｂ）７までの距離は１５ｍｍであり、シリコーンチューブの内壁からｐＨ電極（Ａ）６までの距離は０．１ｍｍ程度である。

図４に示した細径管タイプのセンサを健常人の手のひらに密着させ、生理食塩液（緩衝能βは２０μＭ／ｐＨ）を０．５ｍＬ／分の流速で１分間流通させた後、送液を停止した。図７に送液停止後５分間のΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの経時変化を示した。送液停止後５分でのΔｐＨ_Ｔ及びΔｐＨ_Ｇはそれぞれ−１．４５１及び−０．７１４であった。これより実施例１と同様にして、Ｃ_ＧとＣ_Ｌを求めると、次のようになった。
Ｃ_Ｇ＝１４μＭ
Ｃ_Ｌ＝１５μＭ
すなわち、当該表皮からの気体性の酸（炭酸ガス）の１０分間での分泌濃度は、塩酸換算で１４μＭ、液体性の酸（主として乳酸）のそれは１５μＭであった。

実施例１〜３のいずれにおいてもＣ_ＧとＣ_Ｌは同じオーダーであり、分泌酸は液体性と気体性の両方から構成されていることが明瞭である。

測定室と測定窓を有する、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。 比較電極が参照用ｐＨ電極と擬似比較電極との組み合わせから構成されてなる、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。 測定室を有さない、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。 測定室の全体が細長い環状体で形成されてなる、本発明のｐＨ測定装置の一例の複合センサ部分の模式図である。 実施例１において、送液停止後１０分間のΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの変化を示したグラフである。 実施例２において、送液停止後１０分間のΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの変化を示したグラフである。 実施例３において、送液停止後５分間のΔｐＨ_ＴとΔｐＨ_Ｇの変化を示したグラフである。

符号の説明

１ センサボディ
２ 前室
３ 測定室
４ ベースライン溶液の流入口
５ ベースライン溶液の流出口
６ ｐＨ電極（Ａ）
７ ｐＨ電極（Ｂ）
８ チューブ
９ 比較電極
１０，１６，１７ 測定窓
１１ 試料
１２ 参照用ｐＨ電極
１３ 擬似比較電極
１４ チューブの上端
１５ チューブの下端

Claims (12)

1. 複数のｐＨ電極と、ベースライン溶液の供給及び停止手段とを備えたｐＨ測定装置であって；
   前記ベースライン溶液の流路内にｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）が配置され、
   ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）と液絡可能な位置に比較電極が配置され、
   ｐＨ電極（Ａ）と測定対象の間にはガス透過膜が配置され、
   ｐＨ電極（Ｂ）と測定対象の間にはガス透過膜が配置されず、
   前記ベースライン溶液の供給を停止している間に、ｐＨ電極（Ａ）では前記ガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来する前記ベースライン溶液のｐＨ変化が、ｐＨ電極（Ｂ）では全ての酸又はアルカリに由来する前記ベースライン溶液のｐＨ変化が、それぞれ同時に測定されることを特徴とするｐＨ測定装置。
2. ｐＨ電極（Ａ）がガス透過膜からなるチューブに覆われ、該チューブの内部をベースライン溶液が流通する請求項１記載のｐＨ測定装置。
3. ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）が内蔵された測定室を備え、該測定室がベースライン溶液の流入口及び流出口、並びに測定対象が接触する測定窓を有する請求項１又は２記載のｐＨ測定装置。
4. 前記測定室が２つの測定窓を有し、一方の測定窓はガス透過膜で覆われてその内側にｐＨ電極（Ａ）が配置され、他方の測定窓はガス透過膜で覆われずにその内側にｐＨ電極（Ｂ）が配置されてなる請求項３記載のｐＨ測定装置。
5. ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）がいずれも一枚の半導体基板上に形成されてなる請求項１記載のｐＨ測定装置。
6. ｐＨ電極（Ａ）からｐＨ電極（Ｂ）までの経路長が、ガス透過膜からｐＨ電極（Ａ）までの距離の５倍以上である請求項１〜５のいずれか記載のｐＨ測定装置。
7. 前記ベースライン溶液の流路内の、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）よりも上流の位置に比較電極が配置されてなる請求項１記載のｐＨ測定装置。
8. 前記比較電極が、参照用ｐＨ電極と擬似比較電極との組み合わせから構成されてなるものである請求項７記載のｐＨ測定装置。
9. 前記ベースライン溶液のｐＨ緩衝能が１０〜５００μＭ／ｐＨである請求項１〜８のいずれか記載のｐＨ測定装置。
10. ベースライン溶液の流路内にｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）を配置し、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）と液絡可能な位置に比較電極を配置し、ｐＨ電極（Ａ）及びｐＨ電極（Ｂ）の周囲に同一組成のベースライン溶液を流通させて置換した後にベースライン溶液の流通を停止させ、ｐＨ電極（Ａ）では測定対象から生じたガス透過膜を通過する酸又はアルカリに由来するｐＨ変化を、ｐＨ電極（Ｂ）では測定対象から生じた全ての酸又はアルカリに由来するｐＨ変化を、それぞれ同時に測定することを特徴とするｐＨ測定方法。
11. 請求項１０記載のｐＨ測定方法によって、生体組織から分泌される酸又はアルカリを定量する分泌物定量方法。
12. 炭酸ガス量と乳酸量とをそれぞれ定量する請求項１１記載の分泌物定量方法。

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