JP2006079510A - 生体観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 生体内に３次元的に局在する自家発光体の深さ方向の分布を観察する。
【解決手段】 自家発光体Ｂを含んだ生体Ａに対向して配置され、自家発光体Ｂの中間像を結像する対物光学系３と、該対物光学系３による中間像位置近傍に配置される絞り部材１０と、該絞り部材１０を通過した自家発光体Ｂからの光を再結像させる結像光学系１１と、該結像光学系１１により再結像された自家発光体Ｂからの光を検出する光検出器１２と、対物光学系３の生体Ａ側の焦点位置を光軸方向に調節する焦点位置調節機構８とを備える生体観察装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、生体観察装置に関し、特に、生体内に投与した薬剤の反応により発光させた発光体を生体の外部から観察する生体観察装置に関するものである。

従来、この種の生体観察方法として、特許文献１に示される方法が知られている。
この観察方法は、哺乳類対象中に生物適合体と発光成分の複合体を投与し、その複合体がその対象中で局在を達成する期間の後に、その対象を光検出装置の検出フィールド内に固定し、対象中に局在する発光成分からの光子放射を、その光子放射の画像を構築することができるまで測定して画像を構築するものである。
また、この特許文献１には、哺乳類対象中における自家発光体の形成方法として、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応についても言及している。
特開２００３−１５９０８１号公報

しかしながら、特許文献１の観察方法は、哺乳類対象中の自家発光体のあらゆる深さ位置から発せられる光を生体の対象外部の一方向において検出するものであるため、対象全体の投影像における自家発光体の局在箇所については観察できるものの、その自家発光体が対象内のどのような深さ位置にどのように分布しているのかについては観察することができないという不都合があった。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体内に３次元的に局在する自家発光体の深さ方向の分布を観察することができる生体観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
自家発光体を含んだ生体に対向して配置され、自家発光体の中間像を結像する対物光学系と、該対物光学系による中間像位置近傍に配置される絞り部材と、該絞り部材を通過した自家発光体からの光を再結像させる結像光学系と、該結像光学系により再結像された自家発光体からの光を検出する光検出器と、前記対物光学系の試料側の焦点位置を光軸方向に調節する焦点位置調節機構とを備える生体観察装置を提供する。

本発明によれば、自家発光体から発せられた光が、生体に対向して配置されている対物光学系に入射されると、対物光学系は、入射された光を集光して自家発光体の中間像を結像する。中間像位置近傍には絞り部材が配置されているので、中間像を結像した光のみが絞り部材を通過させられ、それ以外の光は絞り部材によって遮断される。

すなわち、中間像位置と、対物レンズの生体側の焦点位置とは互いに共役な位置関係に配置されるので、対物レンズの生体側の焦点位置に配される発光体からの光のみが絞り部材を通過させられて結像光学系により再結像され、再結像位置に配置されている光検出器によって検出されることになる。したがって、焦点位置調節機構によって、対物レンズの焦点位置を固定することにより、生体内の特定の深さ位置に配される発光体からの光のみを検出できる。
また、焦点位置調節機構の作動によって、対物レンズの焦点位置を種々の位置に調節することにより、生体内における発光体の深さ方向の分布を観察することができる。

上記発明においては、前記絞り部材が、光軸に交差する方向に間隔をあけて２次元的に配列された複数のピンホールまたはスリットを備えることが好ましい。
２次元的に配列された複数のピンホールまたはスリットによって、生体内の所定の深さ位置に２次元的に分布する発光体からの光を検出し、発光体の２次元的な形態を明らかにすることができる。したがって、焦点位置調節機構の作動により、対物レンズの焦点位置を種々の位置に調節することにより、生体内における発光体の３次元的な形態を明らかにすることができる。

また、上記発明においては、前記絞り部材に、該絞り部材を前記ピンホールまたはスリットの間隔方向に移動させる絞り移動装置が備えられていることが好ましい。
絞り移動機構の作動により、絞り部材をピンホールまたはスリットの間隔方向に移動させることによって、ピンホールまたはスリットを通過可能な光を発する発光体の検出位置を光軸に交差する方向に移動させることができる。したがって、ピンホールまたはスリットの間隔寸法よりも短い距離だけ絞り部材を移動させることにより、発光体の検出間隔を狭めて検出位置を増やすことができ、得られる画像の解像度を高めることができる。

さらに、上記発明においては、前記光検出器により得られた対物光学系の各焦点位置における画像を合成して３次元的な画像を構成する画像合成手段を備えることとしてもよい。
焦点位置調節機構を作動させて、対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させながら光検出器により検出された複数の２次元的な画像を、画像合成手段の作動によって３次元的な画像に合成することにより、生体内に局在化された発光体の３次元的な形態を観察することができる。

本発明によれば、生体内の所定の深さ位置における自家発光体の局在を明らかにすることができ、これによって、生体内に３次元的に局在する自家発光体の深さ方向の分布を観察することができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置１について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、実験小動物等の生体Ａを載置するステージ２と、ステージ２上の生体Ａに対向して配置される対物ユニット３と、対物ユニット３を固定した観察ヘッド４とを備えている。また、生体観察装置１および生体Ａは、暗箱５によって全体を覆われている。

観察ヘッド４は、ベース６から延びる支柱７に備えられた昇降機構８に固定され、昇降機構８を作動させることで観察ヘッド４を昇降させ、生体Ａに対する対物ユニット３の位置を調整することができるようになっている。なお、昇降機構８と観察ヘッド４との間に、任意の角度変更機構（図示略）を設け、生体Ａに対する対物ユニット３の角度を調節可能にしておいてもよい。

観察ヘッド４内には、対物ユニット３により結像された光を通過させるピンホール９を備えた絞り部材１０と、該絞り部材１０のピンホール９を通過した光を集光する結像レンズ１１と、該結像レンズ１１による再結像位置に検出面１２ａを配置した光検出器１２とが備えられている。

前記対物ユニット３は、１または複数の対物レンズ３ａを備えている。対物ユニット３は、生体Ａから入射された光を集光して、中間像を結像するようになっている。
前記絞り部材１０は、前記対物ユニット３により結像された中間像位置に配置されている。絞り部材１０は、図２に示されるように、等間隔を開けて格子配列された複数のピンホール９を備えている。

前記光検出器１２は、例えば、ピンホール９と同じ数の光電子増倍管(Photomultiplier Tube:PMT：以下、ＰＭＴ１２と言う。)を正方配列してなる多チャンネルＰＭＴであり、絞り部材１０の各ピンホール９を通過した光がそれぞれ別々のＰＭＴ１２の受光面１２ａに結像されるように配置されている。ＰＭＴ１２は、受光面１２ａに受光される光子数を計数し、その結果を図示しない画像処理装置に送るようになっている。画像処理装置は、全てのＰＭＴ１２から入力された所定時間内の光子数の分布に基づいて画像を形成するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る生体観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１により生体Ａ内の癌細胞等の特定の細胞を観察するには、例えば、生体Ａ内にルシフェラーゼを投与しておき、目的部位周辺にルシフェリンを注射する。細胞の代謝活動に関与するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）等の高エネルギ物質がルシフェリンと反応してアデニル酸ルシフェリンとなり、このアデニル酸ルシフェリンと酸素とがルシフェラーゼ等の酵素の存在下で酸化的脱炭酸反応により分解され、この分解反応の過程で得られるエネルギの一部が光子となって放出される。したがって、この方法によれば、代謝活動の活発な特定細胞が生体Ａ内に局在すると、その細胞の代謝活動によって周囲よりも多くの光子が放出されるので、生体Ａ外部においてその光子の分布を検出することにより、生体Ａ内に局在する特定細胞を自家発光体Ｂとして、外部から観察することができる。

このようにしてルシフェラーゼおよびルシフェリンを投与した実験小動物等の生体Ａをステージ２上に固定して、昇降機構８を作動させて観察ヘッド４を昇降させ、対物ユニット３の生体Ａに対する位置を調節する。このとき、対物ユニット３の焦点位置を、自家発光体Ｂの画像を取得したい生体Ａ内の深さ位置に設定する、その後に、生体観察装置１およびステージ２上の生体Ａを暗箱５内に収容する。

生体Ａからは、生体Ａ内に局在する自家発光体Ｂからの光が放射され、その一部が、対物ユニット３を介して観察ヘッド４内に入射される。観察ヘッド４内に入射された光は、対物ユニット３によって集光されることにより、絞り部材１０の位置に中間像を結像する。すなわち、対物ユニット３の焦点位置と絞り部材１０の位置とは互いに共役な位置関係となり、対物ユニット３の焦点位置に配される自家発光体Ｂから発せられた光のみが絞り部材１０のピンホール９を通過させられ、他の深さ位置から発せられた光は絞り部材１０によって遮断されることになる。

絞り部材１０には複数のピンホール９が設けられているので、生体Ａの表面下、所定の深さ位置に広がる対物ユニット３の焦点平面Ｃ上の各位置に配される自家発光体Ｂからの光が、各ピンホール９を通過させられる。絞り部材１０の各ピンホール９を通過した光は、結像レンズ１１によって再結像される。各ピンホール９を通過した光の再結像位置には、それぞれ対応するＰＭＴ１２が配置されているので、所定の時間にわたって検出を行うことによって、各ＰＭＴ１２において計数される光子数の分布に基づいて、一焦点面Ｃにおける生体Ａ内の自家発光体Ｂの画像が取得されることになる。

また、昇降機構８を作動させて観察ヘッド４を昇降させ、対物ユニット３の焦点面Ｃを生体Ａの深さ方向にずらすことにより、異なる深さ位置における自家発光体Ｂの画像を取得することが可能となる。
すなわち、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、生体Ａ内に３次元的に局在する自家発光体Ｂの各深さ位置における２次元的な分布を観察することができる。

また、昇降機構８を作動させて観察ヘッド４を昇降させ、対物ユニット３の焦点面Ｃを生体Ａの深さ方向にずらしながら、異なる深さ位置において取得した自家発光体Ｂの複数の画像Ｄ１〜Ｄ５を記憶しておき、図示しない画像処理装置によって、図３に示されるように、これらの２次元的な複数の画像Ｄ１〜Ｄ５を合成して３次元的な画像Ｄを構築することにしてもよい。
このようにすることで、生体Ａ内に３次元的に局在する自家発光体Ｂの３次元的な分布を観察することができる。

なお、本実施形態においては、昇降機構８によって観察ヘッド４を、ステージ２上の生体Ａに対して昇降させることで、対物ユニット３の焦点位置を生体Ａに対して深さ方向に移動させるよう調節することとしたが、これに代えて、観察ヘッド４を固定し、ステージ２に搭載した生体Ａを昇降させることとしてもよい。

また、観察ヘッド４を昇降させることに代えて、図４に示されるように、対物ユニット３を構成する対物レンズ３ａの１つを光軸方向に移動させることにしてもよい。このように構成することで、可動部の軽量化を図ることができ、焦点位置の移動を高速化することができる。符号１５は、モータ１３およびボールネジ１４からなる対物レンズ移動機構である。モータ１３を作動させることにより、ボールネジ１４をその軸線回りに回転させ、該ボールネジ１４に取り付けられた対物レンズ３ａを光軸方向に移動させることができる。

また、図４に示されるように、絞り部材１０を光軸に直交する２次元方向に移動させることにしてもよい。本実施形態に係る生体観察装置１は、絞り部材１０を固定した場合には、絞り部材１０に形成されているピンホール９の数によってその解像度が決定される。そこで、絞り部材１０を光軸に直交する方向に移動させて、ピンホール９の位置を、絞り部材１０におけるピンホール９の間隔よりも短いピッチで変更することにより、ピンホール９の数を擬似的に増大させて、画像の解像度を向上することができる。
図中、符号１６は、モータ１７およびボールネジ１８からなる２軸の絞り移動機構である。モータ１７を作動させることにより、ボールネジ１８をその軸線回りに回転させ、該ボールネジ１８に取り付けられた絞り部材１０を、光軸に直交する方向に移動させることができる。

また、これに代えて、図５に示されるように、対物ユニット３を光軸に直交する２次元方向に移動させることとしても、絞り部材１０を移動させた場合と同様に、画像の解像度を向上することができる。
図中、符号１９は、モータ２０およびボールネジ２１からなる対物ユニット移動機構である。モータ２０を作動させることにより、ボールネジ２１をその軸線回りに回転させ、該ボールネジ２１に取り付けられた対物ユニット３を、光軸に直交する方向に移動させることができる。

また、本実施形態に係る生体観察装置１においては、絞り部材１０として、複数のピンホール９を有するものを採用したが、これに代えて、図６に示されるように、複数のスリット２２を有する絞り部材１０′を採用することにしてもよい。この場合、例えば、モータ２３とボールネジ２４とからなる絞り移動機構２５の作動により、スリット２２の配列方向に絞り部材１０′を移動させるように構成することで、上記と同様に、解像度を向上することができるという効果が得られる。

また、光検出器１２としては、多チャンネルＰＭＴ、ラインＰＭＴ、２次元ＰＭＴおよびＰＭＴアレイのようなＰＭＴに加えて、クールドＣＣＤ等の光検出器１２を採用することができる。
また、図１に示されるように、ステージ２上の生体Ａに励起光を照射するための蛍光観察用の照明装置２６を配置してもよい。

また、図７に示されるように、ステージ２の上下に２つの観察ヘッド４′を有する生体観察装置１′を採用することにしてもよい。図中、対物レンズ３ａは、図示しないレンズ移動機構によって光軸方向に移動可能に設けられている。
この場合、生体Ａを搭載するステージ２は、ガラス等の透明な材質により構成されている必要がある。これにより、生体Ａ内の自家発光体Ｂから発せられる光を効率的に回収して、より精度の高い観察を行うことができる。なお、観察ヘッド４′は２つに限定されるものではなく、生体Ａの周囲に複数配置することにしてもよい。

また、図７に示すように、観察ヘッド４′を固定したアーム２７をモータ２８によって回転可能に設けておくことにより、生体Ａを複数の角度から観察することができる。これにより、自家発光体Ｂからの光をより多く回収することができ、より精度の高い観察を行うことが可能となる。

また、図８に示されるように、対物レンズ３ａから光検出器１２側の集光レンズ３ｂに向かう平行光路上にハーフミラー２９を配置しておき、あるいは、ミラーを挿脱可能に設けておくとともに、ハーフミラー２９あるいはミラーによって反射された光を撮像するＣＣＤ３０を設けておくことにしてもよい。この場合に、ＣＣＤ３０は、対物ユニット３の焦点位置に対して予め定められた位置関係に配置されている必要がある。図中、符号３１は集光レンズである。

生体Ａ内の自家発光体Ｂから生体Ａ外に放出されてくる光は微弱であるため、ＣＣＤ３０によって撮像した生体Ａ外面の画像に基づいて、対物ユニット３の位置調整を行うことにより、対物ユニット３の焦点位置を生体Ａ内の所望の深さ位置に精度よく合わせることができる。
これにより、生体Ａ内における自家発光体Ｂの位置を正確に把握することができる。

また、対物レンズ３ａ、対物ユニット３および絞り部材１０を移動させる移動機構１５，１６，１９，２５として、モータ１３，１７，２０，２３とボールネジ１４，１８，２１，２４とからなるアクチュエータを採用したが、これに代えて、ピエゾ素子等任意のアクチュエータを採用してもよい。

本発明の一実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。 図１の生体観察装置の観察ヘッド内の構成部品を模式的に示す斜視図である。 図１の生体観察装置により得られた画像を合成して３次元的な画像を作成する様子を説明する図である。 図１の生体観察装置の観察ヘッド内の構成部品の変形例を模式的に示す斜視図である。 図１の生体観察装置の観察ヘッド内の構成部品の他の変形例を模式的に示す斜視図である。 絞り部材の変形例を含む観察ヘッド内の構成部品を模式的に示す斜視図である。 図１の生体観察装置の変形例であって、ステージの上下に観察ヘッドを有する生体観察装置を示す全体構成図である。 図１の生体観察装置の他の変形例であって、焦点位置調節時に使用するＣＣＤを有する生体観察装置を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 生体
Ｂ 自家発光体
１ 生体観察装置
３ 対物ユニット（対物光学系）
８ 昇降機構（焦点位置調節機構）
９ ピンホール
１０，１０′ 絞り部材
１１ 結像レンズ（結像光学系）
１２ ＰＭＴ（光検出器）
１５ 対物レンズ移動機構（焦点位置調節機構）
２２ スリット
２５ 絞り移動装置

Claims (4)

1. 自家発光体を含んだ生体に対向して配置され、自家発光体の中間像を結像する対物光学系と、
   該対物光学系による中間像位置近傍に配置される絞り部材と、
   該絞り部材を通過した自家発光体からの光を再結像させる結像光学系と、
   該結像光学系により再結像された自家発光体からの光を検出する光検出器と、
   前記対物光学系の生体側の焦点位置を光軸方向に調節する焦点位置調節機構とを備える生体観察装置。
2. 前記絞り部材が、光軸に交差する方向に間隔をあけて２次元的に配列された複数のピンホールまたはスリットを備える請求項１に記載の生体観察装置。
3. 前記絞り部材に、該絞り部材を前記ピンホールまたはスリットの間隔方向に移動させる絞り移動装置が備えられている請求項２に記載の生体観察装置。
4. 前記光検出器により得られた対物光学系の各焦点位置における画像を合成して３次元的な画像を構成する画像合成手段を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体観察装置。

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