JP2006075154A - ハナビラタケの人工栽培方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 βグルカンを子実体乾燥重量100gあたり48.0g以上含むことを特徴とするハナビラタケであり、好ましくはハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−18(FERM P−19768)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−21(FERM P−19769)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−31(FERM P−19770)及びハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−33(FERM P−19771)であるハナビラタケ及び前記菌株を用いたハナビラタケの人工栽培方法。
【選択図】なし
Description
〔前処理〕
収穫したハナビラタケの子実体の凍結乾燥品0.25gを100ml三角フラスコに入れ、次に0.08Mリン酸緩衝液(pH6.0)を加えて全量25mlにする。熱耐性αアミラーゼ(シグマ社製)を1000Unit添加し、沸騰水中で、30分間インキュベートする。水酸化ナトリウムを用いて中和し、pH7.5とした。さら50mg/mlプロテアーゼ(シグマ社製)溶液を50μl添加し、さらに60℃、30分間インキュベートする。つぎに塩酸でpH4.3に調整し、アミログルコシダーゼ(シグマ社製)溶液を50μl加え、再び60℃、30分間インキュベートする。次に95%エタノールを4倍量添加し、室温で1時間以上静置する。生成した沈殿をガラス繊維ろ紙(Advantec社製、品番GA-100)を用い、ろ過し、回収する。80%エタノールで沈殿を洗浄し、さらにアセトンで洗浄する。
回収した沈殿を72%硫酸5mlで懸濁する。4時間静置する。水70ml添加し、沸騰水中で2時間、加水分解を行う。その後、氷水で冷却し中和する。ろ紙(Advantec社製、品番GA-100)によりろ過し、ろ液をサンプルとした。
以上の処理により得られたサンプルをグルコースCIIテストワコー(和光純薬工業社製)によりグルコース量を測定し、βグルカンが0.9gあたり、グルコース1gに変換されたものとしてハナビラタケのβグルカン量に換算した。
測定に供したハナビラタケを105℃で3時間絶乾して水分率を測定し、前記のグルコース量から求めたβグルカン量より絶乾での子実体100gあたりのβグルカン重量に補正して、本発明でいうβグルカン量とした。
〔ハナビラタケUT−18株〕
1)バレイショ・ブドウ糖寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は8mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は19mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
2)フェノールオキシダーゼ検定用培地〔0.1%没食子酸添加ポテト・グルコース寒天培地〕における生育状態
14日目でコロニー径は14mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は25mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
3)麦芽エキス寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は16mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は31mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
4)最適育成温度
各温度でそれぞれ培養したところ、最適生育温度は25℃付近であった。また、5℃ではほとんど育成せず、30℃付近ではまったく生育しなかった。
5)最適育成pH
生育培地を各pHに調整し、生育を調べたところ、最適pHは4〜5の間であった。また、本菌株の生育範囲は、pH4〜pH8の間であった。
1)バレイショ・ブドウ糖寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は13mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は24mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
2)フェノールオキシダーゼ検定用培地〔0.1%没食子酸添加ポテト・グルコース寒天培地〕における生育状態
14日目でコロニー径は13mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は22mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
3)麦芽エキス寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は17mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は32mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
4)最適育成温度
各温度でそれぞれ培養したところ、最適生育温度は25℃付近であった。また、5℃ではほとんど育成せず、30℃付近ではまったく生育しなかった。
5)最適育成pH
生育培地を各pHに調整し、生育を調べたところ、最適pHは4〜5の間であった。また、本菌株の生育範囲は、pH4〜pH8の間であった。
1)バレイショ・ブドウ糖寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は10mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は21mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
2)フェノールオキシダーゼ検定用培地〔0.1%没食子酸添加ポテト・グルコース寒天培地〕における生育状態
14日目でコロニー径は9mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は18mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
3)麦芽エキス寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は15mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は29mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
4)最適育成温度
各温度でそれぞれ培養したところ、最適生育温度は25℃付近であった。また、5℃ではほとんど育成せず、30℃付近ではまったく生育しなかった。
5)最適育成pH
生育培地を各pHに調整し、生育を調べたところ、最適pHは4〜5の間であった。また、本菌株の生育範囲は、pH4〜pH8の間であった。
1)バレイショ・ブドウ糖寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は12mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は24mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
2)フェノールオキシダーゼ検定用培地〔0.1%没食子酸添加ポテト・グルコース寒天培地〕における生育状態
14日目でコロニー径は13mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は23mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
3)麦芽エキス寒天培地における生育状態
14日目でコロニー径は19mm、白色で密な菌糸、気菌糸を多量に生じる。22日目でコロニー径は35mmとなり、菌糸は白色で密、直線状に伸びる。気菌糸が多い。裏面は一様で変色は無い。
4)最適育成温度
各温度でそれぞれ培養したところ、最適生育温度は25℃付近であった。また、5℃ではほとんど育成せず、30℃付近ではまったく生育しなかった。
5)最適育成pH
生育培地を各pHに調整し、生育を調べたところ、最適pHは4〜5の間であった。また、本菌株の生育範囲は、pH4〜pH8の間であった。
〔染色体DNAの調製〕
ハナビラタケUT−18、同UT−21、同UT−31及び同UT−33についてのハナビラタケから以下のようにして染色体DNAを抽出、調製した。ハナビラタケ子実体および菌糸体100 mgを液体窒素を入れた乳鉢中で磨細したのち、組織重量と等量の溶液(100 mM Na2HPO4, 50 mMクエン酸, pH6.0, 10 mM EDTA, 2% N-ラウロイルサルコシンナトリウム)中に懸濁し、65℃で30分間放置した。次に冷却遠心分離機によって7000 rpmで10分間遠心し、上清を回収した。フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(=75:24:1)溶液を等量加えて処理し(2回)、冷却遠心分離機によって13000 rpmで15分間遠心し、上層を回収した。1/10容量の3M NaOAcを加えた後、2.5倍量のエタノールを加えた後、−80℃で20分間放置した。13000 rpmで20分間遠心を行い、DNAを沈殿した。得られたDNAをTES-buffer(組成 30 mM Tris-HCl, pH8.0, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl)に加えてよく溶かした後、RNaseを終濃度100 μg/mlとなるように加えてRNAを分解した。等量のフェノール:クロロホルム液を加えて攪拌した後、微量冷却遠心分離機によって13000 rpmで15分間遠心し、水層(DNAを含む)を回収した。1/10容量の3M NaOAcを加えた後、2.5倍量のエタノールを加えた後、−80℃で20分間放置した。13000 rpmで20分間遠心を行い、DNAを沈殿した。DNAをTE-buffer(組成 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA)に加えてよく溶かした後、得られたDNA量を定量した。その結果ハナビラタケの染色体DNAが約30〜100 μg得られた。
上記のようにして得られたハナビラタケの染色体DNA 5 ngをテンプレートとしてPCRを行った。プライマーには12塩基のプライマーを各種用いた。PCRの条件は変性温度94℃を30秒、アニーリング温度42℃で2分、伸長反応温度72℃3分間を45サイクル行った。TaqポリメラーゼはTaKaRa EX Taq Hot Start Version(宝酒造社)を用いた。
PCR増幅産物のバンドパターンの確認を、TAEバッファーに1%の濃度で作成したアガロースゲルにPCR産物を5μlをローディングし、100V、27分間電気泳動により行った。DNAマーカーは200bp ladder (宝酒造社)を用いた。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネータ上でバンドの確認を行った。
まず、PCRのプライマーとして配列ggcatggcctttを用いた。その結果RAPD解析から得られたバンドパターンを図1に示す。図1よりハナビラタケUT−33はプライマーとして配列ggcatggcctttを用いた場合に他の菌株には現れない2300±200 bpのバンドを示すこと、ハナビラタケUT−21はプライマーとして配列ggcatggcctttを用いた場合に他の菌株には現れない2500±200 bpのバンドを示すことが明らかになった。
ハナビラタケUT−18(FERM P−19768)の種菌を、栽培用のオガクズ培地に接種した。オガクズ培地の培地基材にはカラマツのオガクズを用い、これに小麦粉を7%混合し、水を加えて水分を60%に調製した。これを850ccのポリプロピレンの栽培ビンに520g充填し、直径20mmの接種孔を市販の穴あけ機を用いて栽培ビンの中央に1つ空けた後110℃で3時間高圧殺菌した。その後、培地温度が30℃以下まで下がるのを待って種菌を接種し、これを23℃、湿度65%で培養した。接種後、49日ほどでハナビラタケの菌糸が充満した。これに菌掻きを行い、栽培ビンのふたを取って、温度19℃、湿度90%の栽培室に移した。その後、ハナビラタケの子実体原基の形成が240本中240本見られ、その形成率は100%であった。菌掻きから収穫までの期間は約56日間であった。子実体形成の見られた栽培ビン240本つき1本のあたりの平均収量は約100gであり、全収穫量は24.0kgであった。
ハナビラタケUT−21(FERM P−19769)を接種した以外は、実施例1と全く同様にして栽培した。子実体原基の形成率は99.6%であり、栽培ビン239本につき1本あたりの平均収量は約100gであり、全収穫量は23.9kgであった。
ハナビラタケUT−31(FERM P−19770)を接種した以外は、実施例1と全く同様にして栽培した。子実体原基の形成率は99.2%であり、栽培ビン238本につき1本あたりの平均収量は約96gであり、全収穫量は22.8kgであった。
ハナビラタケUT−33(FERM P−19771)を接種した以外は、実施例1と全く同様にして栽培した。子実体原基の形成率は99.6%であり、栽培ビン239本につき1本あたりの平均収量は約90gであり、全収穫量は21.5kgであった。
実施例1〜4と同様にして、NS422、NS424(以上、財団法人日本きのこ研究所より入手)、UT-15 UT-19 UT-23 UT-35(以上、ユニチカ株式会社保有菌株)を栽培し、β-グルカン含有量を測定した。乾燥重量100gあたりのβ-グルカン含量は、それぞれ33.6g、37.7g、43.0g、43.4g、44.0g、41.1gであった。
Claims (9)
- βグルカンを子実体乾燥重量100gあたり48.0g以上含むことを特徴とするハナビラタケ。
- βグルカンを乾燥重量100gあたり48.0g以上含む子実体を形成しうるハナビラタケ。
- ハナビラタケが、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−18(FERM P−19768)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−21(FERM P−19769)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−31(FERM P−19770)及びハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−33(FERM P−19771)並びにこれらの変異株からなる群から選択される菌株である請求項1記載のハナビラタケ。
- ハナビラタケが、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−18(FERM P−19768)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−21(FERM P−19769)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−31(FERM P−19770)及びハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−33(FERM P−19771)並びにこれらの変異株からなる群から選択されるハナビラタケ。
- ハナビラタケが、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−18(FERM P−19768)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−21(FERM P−19769)、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−31(FERM P−19770)又はハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−33(FERM P−19771)との対峙試験において帯線を形成しない菌株である請求項1記載のハナビラタケ。
- ハナビラタケが、ハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−18(FERM P−19768)、ハナビラタケ(Sparassiscrispa)UT−21(FERM P−19769)、ハナビラタケ(Sparassiscrispa)UT−31(FERM P−19770)又はハナビラタケ(Sparassis crispa)UT−33(FERM P−19771)との対峙試験において帯線を形成しないハナビラタケ。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のハナビラタケを、大鋸屑に栄養分を添加した培地に接種し、培養・生育工程を経て、βグルカンを子実体乾燥重量100gあたり48.0g以上含む子実体を形成させた後、該子実体を収穫することを特徴とするハナビラタケの人工栽培方法。
- RAPD(Random Amplified polymorphic DNA)解析を用いてハナビラタケの系統を識別することを特徴とするハナビラタケの系統識別方法。
- RAPD(Random Amplified polymorphic DNA)解析が、プライマー対として、配列agcagcgcctca、配列ggcatggccttt又は配列ccgcagttagatを用いてPCR法を行い、電気泳動によりDNAパターンを比較する方法である請求項8記載のハナビラタケの系統識別方法。
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