JP2006038656A - 試料の分析方法、および分析器具 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、プロテインチップ等の固体基板にスポットされた抗原と、抗体と反応させる場合において、スポット中心部と周辺部における反応を均一化することに関する。
【解決手段】
本発明は、基板にスポットされた第一溶液を、これより大きな反応用孔にて覆い、反応用穴孔に第二溶液を供給し、第一溶液と第二溶液を反応させることに関する。これにより、第一溶液と第二溶液の反応を、スポット中心部と周辺部において略均一にでき、手軽かつ高精度に基板上で分析できる。
【選択図】図2
Description
10列×横10列のようにしてもよい。
Plasmon Resnance)装置を使用することも考えられる。SPRとは金属表面の励起状態である表面プラズモン波を共鳴励起する現象であり、2つの分子が結合・解離することによる質量変化の検出に利用することができる。質量変化を感知するため、標識を必要としない利点がある。更に固体基板上に補足した試料を質量分析装置により解析するためにも利用することができる。この場合、固体基板上に補足した試料に必要に応じて過剰なエネルギーを吸収するためのマトリックスを添加し,レーザー照射によって分子をイオン化した後に質量分析により試料の同定を行うことができる。
102を固体基板上に貼付けする。この際、固体基板上に固定された試料を、試薬用シール02の試薬用孔104が覆うようにする。本実施例では、スポット用シール101における1スポットグループに関連する、固体基板上に縦3列×横5列にてスポットされた
15個の試料が、一つの試薬用孔104に覆われるようにする。そして、二つの試薬用孔104内部に、2次抗体や3次抗体等の試薬205をそれぞれ添加する。これにより、1スポットグループに関連する15個の試料を、略同時・略同一条件で、同一の試薬と反応させることができる。また、試薬用孔104に異なる試薬を供給することにより、同一の固体基板上にて、異なる反応を、略同時に実施することができる。
抗原抗体反応に基づくタンパク質定量について、本実施例の効果を検証した。抗原抗体反応は、腫瘍マーカーであるヒトCEA(Carcinoembryonic antigen 癌胎児性抗原) 及びCRP(C-reactive protein C反応性プロテイン)の定量である。
(Polyvinyl Alcohol)などのポリマーを用いる。
本実験では、固体基板としてProteochip TypeA(Proteogen,Soul,Korea)を用いた。
Proteochipはカリックスクラウン誘導体の一種であるタンパク質結合試薬‘ProLinker’をスライドグラス(大きさ縦26mm×横76mm)上に結合したプロテインチップであり、特に抗体の固定化に優れ、抗体の抗原結合能力を保ったまま高密度かつ均一に固定化できる。また、スポット用シールとして、固体基板と同じ大きさの、縦26mm×横76mmの疎水性シート上に、直径2mmのスポット用孔を縦3列×横5列に5mm間隔で配置し、計15スポットを備えたスポットグループを2グループ備えたものを用いた。一方のスポットグループをCEA測定用、もう一方のスポットグループをCRP測定用とした。
(pH=7.4) を用いて100μg/mlに希釈した。これらを、マイクロピペッター
201を用いて1.5μlずつスポットした。
TypeAを50mlの洗浄溶液中に浸漬し、10分間振とうして未反応の抗体を取り除いた。洗浄後、濾紙により余分な水分を取り除いた。
50mlの3%BSAを含んだPBS(pH=7.4)にProteochip TypeAを浸漬し、1.5 時間穏やかに振とうした。ブロッキング溶液を捨てた後、50mlの洗浄溶液を加え、10分間振とうした。洗浄後、濾紙により余分な水分を取り除いた。
ヒト組換えCEA及びCRPを30%Glycerol,10%BSAを含んだPBS(pH=7.4 )を用いて1ng/ml〜1μg/mlに希釈した。これらの抗原溶液及びネガティブコントロールを、それぞれ対応する1次抗体を固定化したスポットに対し、マイクロピペッター201を用いて1.5μlずつスポットした。Proteochip TypeAを、隅に水滴203をいれた密閉容器204に入れ、37℃で1時間インキュベートして抗原を一次抗体と反応させた。抗原溶液を吸引によって除いた後、50mlの洗浄溶液中にProteochipTypeAを浸漬し、15分間振とうして未反応の抗原を取り除いた。窒素ガス吹き付けにより余分な水分を取り除いた後、スポット用シールを剥がした。
試薬用シールを、試薬用孔がProteochip TypeA のスポット領域と同位置になるようにして貼付けした。本実験では、試薬用シールは固体基板、及びスポット用シールと同じ大きさの、縦26mm×横76mmの疎水性シート上に、スポット用シールの一つのグループ内にある15個のスポット用孔を包含する大きさである縦15mm×横24mmの試薬用孔を、
1.5mm間隔で2つ並べて配置したものを使用した。
10%BSAを含んだPBS(pH=7.4)を用いてそれぞれ100μg/mlに希釈した。そして、これらを各試薬用孔内部に200μlずつ添加した。
CEA検出用のCy5標識ヤギ由来抗ウサギIgGポリクローナル抗体(Zymed
laboratories Inc, San Francisco,CA)、及びCRP検出用のCy5標識ロバ由来抗ヤギIgGポリクローナル抗体(Chemicon Inernational. Inc, Temecula,CA)を30%Glycerol ,10%BSAを含んだPBS(pH=7.4)を用いて2μg/mlに希釈した。そして、これらを各試薬用孔内部に200μlずつ添加した。
蛍光検出用スキャナーScan Array Express(Packard BioScience, Billerica,MA)を用いてProteochip TypeAをスキャンした。スキャンした画像の解析にはQuantumArray(Packard BioScience, Billerica,MA)を使用した。
図3(a)〜(c)に、本実施例におけるCEAとCRPの測定結果を示す。図3(a)は蛍光検出で得られたスキャン画像のイメージ図、図3(b),図3(c)はそれぞれ
CEA,CRPのシグナル強度を数値化したグラフである。
606は、縦15mm×横24mmの長方形状であり、1.5mm 間隔で2つ並べて配置されている。
701を固体基板105に貼付けし、スポット用孔に試料を滴下し、固体基板上に試料を固定化する。そして、一体型シール701の一部を折れ目に従って折り曲げ、形成された試薬用部位702を、試薬との反応工程に用いる。
702を形成しているが、例えば、一体型シール701の一部を切り取って試薬用部位
702を形成してもよい。
Claims (19)
- 試料の分析方法であって、
スポット用孔を備えたスポット用部材を基板に配置し、
スポット用孔に第一溶液を供給し、
スポット用孔より大きな反応用孔を備えた反応用部材を基板に配置し、基板にスポットされた第一溶液を反応用孔により覆い、
反応用孔第二溶液を供給し、第一溶液と第二溶液とを反応させる方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記スポット用部材が複数のスポット用孔を備え、
反応用孔が、基板にスポットされた複数の第一溶液を覆い、
反応用孔に第二溶液を供給し、複数の第一溶液を略同時に反応させる方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記スポット用部材が複数のスポット用孔を備え、
前記反応用部材が複数の反応用孔を備え、
基板にスポットされた複数の第一溶液を、複数の反応用孔により分割するように覆い、
複数の反応用孔に2種類以上の溶液をそれぞれ供給し、複数の第一溶液を2種類以上の溶液と反応させる方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、基板に貼付けできるシールである方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、直接的又は間接的に、剥離可能に積層され、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が積層された状態において、スポット用孔に第一溶液を供給し、
前記反応用部材から前記スポット用部材を剥離した後に、反応用孔に第二溶液を供給する方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、直接的又は間接的に固定され、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が固定された状態において、スポット用孔に第一溶液を供給し、
スポット用部材を基板から実質的に除去した後に、反応用孔に第二溶液を供給する方法。 - 請求項1記載の分析方法であって、
前記第一溶液が、タンパク質を含有し、
前記第二溶液が、タンパク質と反応する試薬を含有する方法。 - 試料の分析方法であって、
基板に第一溶液をスポットし、
スポットされた第一溶液より大きな反応用孔を備えた反応用部材を基板に配置し、基板にスポットされた第一溶液を反応用孔により覆い、
反応用孔に第二溶液を供給し、第一溶液と第二溶液とを反応させる方法。 - 請求項8記載の分析方法であって、
基板に複数の第一溶液をスポットし、
反応用孔が、基板にスポットされた複数の第一溶液を覆い、
反応用孔に第二溶液を供給し、複数の第一溶液を略同時に反応させる方法。 - 請求項8記載の分析方法であって、
前記反応用部材が複数の反応用孔を備え、
基板に複数の第一溶液をスポットし、
基板にスポットされた複数の第一溶液を、複数の反応用孔により分割するように覆い、
複数の反応用孔に2種類以上の溶液をそれぞれ供給し、複数の第一溶液を2種類以上の溶液と反応させる方法。 - 請求項8記載の分析方法であって、 前記第一溶液が、タンパク質を含有し、
前記第二溶液が、タンパク質と反応する試薬を含有する方法。 - 請求項8記載の分析方法であって、
スポット用孔を備えたスポット用部材を基板に配置し、スポット用孔に第一溶液を供給し、基板に第一溶液をスポットする方法。 - 基板に配置でき、スポット用孔を備えたスポット用部材と、
基板に配置でき、スポット用孔より大きな反応用孔を備えた反応用部材とを含む分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材が、複数のスポット用孔を備え、
前記反応用部材が、複数のスポット用孔を覆える大きさの反応用孔を備える分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材が、複数のスポット用孔を備え、
前記反応用部材が、複数の反応用孔を備える分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、基板に貼付けできるシールである分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、直接的又は間接的に積層され、
前記スポット用部材が前記反応用部材より剥離可能であり、
スポット用孔と反応用孔が重なっている分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材及び前記反応用部材が、直接的又は間接的に固定され、
前記スポット用部材が、前記反応用孔の中に納まり、
前記反応用孔の中から、前記スポット用部材を、実質的に除去できる分析器具。 - 請求項13記載の分析器具であって、
前記スポット用部材が、タンパク質を含有する第一溶液を、基板上の所定位置に供給する為の部材であり、
前記反応用部材が、タンパク質と反応する試薬を含有する第二溶液を、基板上の所定位置に供給する為の部材である分析器具。
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