JP2006008666A - 酸素同位体による標識方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明は、カルボキシル基含有化合物のカルボキシル基中の１又は２の酸素原子を１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識する方法を提供する。
【解決手段】
本発明の方法はカルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させることを特徴とする。


本発明の方法では活性剤を使用するため、カルボン酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと反応させる際に、強酸条件で行う、アルカリ加水分解を行う等の厳しい条件を含まなくても、反応を進行させることが可能である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、カルボキシル基を有する化合物の１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体での標識方法に関する。本発明の方法は活性剤を使用することを特徴とする。

核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）は、構造解析のための原子核を対象とする共鳴法である。個々の原子核の共鳴を分光して観察するため、電子の雲の広がりが類似している原子であっても明確に区別することができる。^１Ｈ、^１３Ｃ及び^１５Ｎを用いたＮＭＲによる構造解析の研究が進められている。

生体成分、中でもアミノ酸はタンパク質を構成しうる重要な成分であり、多くのタンパク質が生物学的機能の解明とともに、ＮＭＲを用いた高次構造の解析が報告されつつある。アミノ酸、糖などの生体成分において酸素原子は非常に重要な原子であるにもかかわらず、^１７Ｏ ＮＭＲのスペクトロスコピーは十分に開発されていない。その理由の１つとして、同位体^１７Ｏの天然存在度が０．０３８％と極めて低いことが挙げられる。ＮＭＲに用いられ得る水素、炭素、窒素、酸素の原子核の性質について要約した表１を参照されたい。

表１より^１７Ｏの天然存在度は、^１３Ｃの１．１０％及び^１５Ｎの０．３６６％と比較しても著しく低いことがわかる。よって、^１７Ｏ ＮＭＲの測定のためには測定化合物中の酸素原子を^１７Ｏで標識して、人為的に化合物中の^１７Ｏを富化させることが必須である。

カルボキシル基を有する化合物、例えばアミノ酸、の^１７Ｏ富化は、アミノ酸をＨ_２ ^１７Ｏと反応させ、カルボキシル基中の酸素原子を^１７Ｏと交換することによって行うことができる。しかしながら、上記交換反応は自然にはほとんど進行しないため、触媒等を用いて強制的に進行させる必要がある。本発明前は、Ｈ_２ ^１７Ｏを塩化水素ガスで飽和させた強酸条件下で反応を行う（非特許文献４）、あるいは、カルボキシル基をアルキルエステル化しておいてから水酸化ナトリウムを用いたアルカリ加水分解を行う（非特許文献２、３、５）等の条件下で行われていた。しかしながら、カルボキシル基の酸性条件下での交換反応ではトリプトファン、システイン、アスパラギン、グルタミンの分解が起こること、並びに、アルキルエステル体のアルカリ加水分解では光学活性のアミノ酸のラセミ化が起こることが避けられない、等の問題があった。

よって、より緩和な条件下で、カルボキシル基を有する化合物を１７酸素（^１７Ｏ）等の酸素同位体で標識する方法が希求されていた。
Ｊｏｈｎ Ｊｏｎｅｓ, Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ．３５ Ｗ．Ｂｏｙｋｉｎ， １７Ｏ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｐ．２８−２９ Ｓｔｅｉｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ＆ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ， ３２， １２０−１２１ （１９８１） Ｓｔｅｉｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １８， ３２４−３３３ （１９８１） Ｉ．Ｐ． Ｇｅｒｏｔｈａｎａｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２３， ６５９−６６５ （１９８５）

本発明は、カルボキシル基含有化合物のカルボキシル基中の１又は２の酸素原子を１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識する、新規な方法を提供することを目的とする。本発明の方法はカルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させることを特徴とする。

本発明の一態様において、活性剤は好ましくは、ペプチド合成におけるカップリング試薬又は反応促進添加剤である。あるいは、活性剤は好ましくは、トリアゾール誘導体又はテトラアルキルウロニウム誘導体である。

本発明において、カルボン酸活性エステルは、好ましくは、ペンタフルオロフェニルエステル、パラニトロフェニルエステル、２，４，６−トリクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから選択されるエステルである。

本発明はまた、本発明の方法で１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された、カルボキシル基含有化合物を提供することを目的とする。
本発明はさらに、ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、
１）アミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
２）当該標識アミノ酸中のカルボキシル基を、固相に結合したアミノ酸若しくはペプチドのＮ末端アミノ基と反応させる
ことを含む。

本発明はさらにまた、本発明の方法で製造された、ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチドを提供することを目的とする。

本発明はまた、カルボキシル基中の１又は２の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された標識アミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。本発明の製造方法は、
１）末端アミノ基が保護基で保護されているアミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
２）得られた保護基を有する標識アミノ酸から保護基を脱離させる
ことを含む。

本発明はさらに、本発明の方法で製造された標識アミノ酸の、無細胞系又は生細胞系のタンパク質合成における使用を提供する。

酸素同位体での標識方法
本発明は、カルボキシル基含有化合物のカルボキシル基中の１又は２の酸素原子を１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識する方法を提供する。本発明の方法は、カルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させることを特徴とする。以下、本発明の標識方法の一態様として、１７酸素（^１７Ｏ）での標識方法を例に説明するが、１８酸素（^１８Ｏ）での標識方法としても同様に適用可能である。以下、本明細書において特に明示しない限り、「１７酸素（^１７Ｏ）」と記載した場合には、「１７酸素（^１７Ｏ）及び／又は１８酸素（^１８Ｏ）」の酸素同位体を含む。さらに、「Ｈ_２ ^１７Ｏ」と記載した場合には、特に明示しない限り、「Ｈ_２ ^１７Ｏ及び／又はＨ_２ ^１８Ｏ」を意味する。

（１）活性剤
カルボキシル化合物の^１７Ｏ富化は、カルボキシル基を含む化合物をＨ_２ ^１７Ｏと反応させ、カルボキシル基中の酸素原子を^１７Ｏと交換することによって行うことができる。しかしながら、上記交換反応は自然にはほとんど進行しない。よって、本発明は上記反応を促進するために、カルボキシル基を活性エステルとしてＨ_２ ^１７Ｏとの反応の際に活性剤を存在させることを特徴とする。

本発明の一態様において、活性剤は好ましくは、ペプチド合成におけるカップリング試薬又は反応促進添加剤である。あるいは、活性剤は好ましくは、トリアゾール誘導体又はテトラアルキルウロニウム誘導体である。ペプチド合成におけるカップリング試薬または反応促進添加剤とは、ペプチド合成におけるアミド結合形成時に反応促進に作用する、あるいはペプチド合成の原料となるアミノ酸の活性エステルの形成を触媒あるいは促進する物質である。

ペプチド合成におけるカップリング試薬または反応促進添加剤は、例えば、トリアゾール誘導体、テトラアルキルウロニウム誘導体等を含む。
また、トリアゾール誘導体、テトラアルキルウロニウム誘導体（例えば、テトラメチルウロニウム誘導体）は、ペプチド合成におけるカップリング試薬、反応促進添加剤等の機能を有する。

好ましい活性剤の例としては、非限定的に、具体的には１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＣＡＳ ２５９２−９５−２）、６−クロロ−１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＣＡＳ ２６１８９−１９−６）、３−ヒドロキシ−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン（ＣＡＳ ３９９６８−３３−７）、（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ ５６６０２−３３−６）、（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ １２８６２５−５２−５）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ ９４７９０−３７−１）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＣＡＳ １２５７００−６７−６）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ ３３０６４５−８７−９）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＣＡＳ ３３０６４１−１６−２）、２−（３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ １４８８９３−１０−１）、２−（シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＣＡＳ １３６８４９−７２−４）、２−スクシンイミドイル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート等が含まれる。

好ましくは、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール又は６−クロロ−１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールである。最も好ましくは１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（CAS 2592-95-2）であり、例えば、ノババイオケム社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎａｙ）より購入することが出来る。

限定されるわけではないが、活性剤は、好ましくはカルボン酸活性エステルに対して、０．１から１００倍モル、最も好ましくは１から１０倍モル使用される。
（２）カルボン酸活性エステル
本発明において、カルボキシル基は、Ｈ_２ ^１７Ｏとの反応を促進するために、エステル化によって活性化されていることが好ましい。限定されるわけではないが、活性エステルは、ペンタフルオロフェニルエステル、パラニトロフェニルエステル、２，４，６−トリクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、シアノメチルエステル等を含む。好ましくは、ペンタフルオロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。これらの活性エステルは、ペプチドの固相合成の際にアミノ酸を活性化するために有用なエステルとして知られている（非特許文献１）。

本発明において、１７酸素等の酸素同位体で標識されるカルボキシル基は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂肪酸、脂質、糖脂質、プロテオグリカン、コレステロール及びステロイドからなるグループから選択される、生体成分又は生体成分関連分子中のカルボキシル基である。これらの生体成分又は生体成分関連分子は生体においてしばしば重要な生物学的機能を担っており、^１７Ｏ ＮＭＲによる高次構造の決定は、生物学的機能の解明のためにも有用である。

本発明の方法を用いて、アミノ酸中のカルボキシル基中の酸素、あるいは、ペプチド若しくはタンパク質中のアミド結合中の酸素を１７酸素で標識することが可能である。あるいは、本発明の方法は、アミノ酸又はペプチド若しくはタンパク質中のアミノ酸残基中の側鎖のカルボキシ基における酸素の標識にも適用可能である。側鎖カルボキシル基をＨ_２ ^１７Ｏと活性剤の存在下で反応させる場合、標的の側鎖カルボキシル基以外の他の官能基を予め保護基で保護しておくことにより、特定部位の酸素のみを特異的に標識することも可能である。

本発明の方法は、また、糖、オリゴ糖又は多糖中の糖残基におけるカルボキシル基中の酸素を標識するために使用することも可能である。１７酸素標識されたカルボキシル基は、遊離のカルボキシル基でよく、あるいは、標識後にカルボン酸エステルを形成してもよい。

本発明の方法は、同様に、糖タンパク質、糖脂質及びプロテオグリカンから選択される複合糖質中のカルボキシル基中の酸素を標識するために使用してもよい。糖タンパク質は、糖鎖が、タンパク質中のアスパラギン酸残基（Ｎ−結合型）又はセリン若しくはスレオニン残基（Ｏ−結合型）を介してタンパク質に結合したものをいう。糖脂質は、スフィンゴシンなどの脂質に糖が結合したものである。プロテオグリカンは、硫酸化糖又はウロン酸を含む二糖繰り返し単位を持つ糖鎖であるグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を含む糖蛋白複合体である。いずれの複合糖質も当業者に周知である。

本発明の標識方法は、脂肪酸、脂質、コレステロール及びステロイド等のその他の生体成分又は生体成分関連分子の標識にも使用可能である。
本発明の標識方法に使用しうるカルボン酸活性エステルは、好ましくはアミノ酸の活性エステルである。即ち、１７酸素標識されるカルボキシル基は、好ましくはアミノ酸、ペプチド又はタンパク質中のカルボキシル基である。アミノ酸、ペプチド又はタンパク質中のカルボキシル基の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏと活性剤の存在下で反応させる場合、アミノ酸中のアミノ基、又はペプチド若しくはタンパク質中の末端アミノ基若しくは側鎖アミノ基を、予め保護基で保護しておく。

アミノ基の保護基は、好ましくは、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）及び４−メトキシベンジルオキシカルボニル基（ＭｅＯＣＢｚ）からなるグループから選択される。これらの保護基は、ペプチドの固相合成の際に遊離アミノ酸のアミノ基の保護基として一般に知られている。これらの保護基は、１７酸素標識の反応後、保護基の種類に応じた公知の方法によって除去してもよい。例えば、Ｆｍｏｃ保護基は、ピペリジンで室温で数時間処理することにより、容易に除去することができ、好ましい。Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸、あるいはそのペンタフルオロフェニルエステルは例えば、ノババイオケム社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入することができ、あるいは、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸及びペンタフルオロフェノールからＦｍｏｃ−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルを合成することによって、調製することも可能である。

（３）本発明の標識方法
本発明の方法は、カルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏと活性剤の存在下で反応させる。カルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルとＨ_２ ^１７Ｏとの反応は、限定されるわけではないが、好ましくは１時間ないし１０日、より好ましくは１時間ないし１０時間、反応温度は、好ましくは、室温ないし５０℃、より好ましくは室温である。好ましくは反応物を攪拌する。

カルボキシル基中の酸素原子と^１７Ｏとの交換反応は自然にはほとんど進行しないため、触媒等を用いて強制的に進行させる必要がある。本発明前は、Ｈ_２ ^１７Ｏを塩化水素ガスで飽和させた強酸条件下で反応を行う（非特許文献４）、あるいは、カルボキシル基をでアルキルエステル化しておいてから水酸化ナトリウムを用いたアルカリ分解を行う（非特許文献２、３、５）等の条件下で行われていた。しかしながら、カルボキシル基の酸性条件下での交換反応ではトリプトファン、システイン、アスパラギン、グルタミンの分解が起こること、並びに、アルキルエステル体のアルカリ加水分解では光学活性のアミノ酸のラセミ化が起こることが避けられない、等の問題があった。

本発明において、適当な活性剤の使用により、カルボン酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏと反応させる際に、強酸条件で行う、アルカリ加水分解を行う等の厳しい条件を含まなくても、室温という緩和な条件下で反応を迅速に進ませることが可能となった。例えば、酸素同位体酸素標識されるカルボキシル基がアミノ酸、ペプチド又はタンパク質中のカルボキシル基であり、そして、当該アミノ酸中のアミノ基、又はペプチド若しくはタンパク質中の末端アミノ基若しくは側鎖アミノ基が、９−フルオレニルメトキシカルボニル基等の保護基で保護されている場合、アミノ酸若しくはアミノ酸残基の分解およびラセミ化を抑制することができる（実施例４）。本発明の標識方法において、副反応が抑えられること、並びにラセミ化若しくは異性化が抑制されることは、他のカルボキシル基含有の生体成分又は生体成分関連分子の標識化においても必要なことである。

本発明の方法により、穏やかな反応条件で効率よくカルボキシル基中の酸素を１７酸素で標識することが可能になった。本発明の方法において、カルボキシル基中の少なくとも１の酸素原子が標識される割合、標識率は使用するＨ_２ ^１７Ｏ−富化水の標識率により異なり、理論的には一回標識化の場合には、使用するＨ_２ ^１７Ｏ−富化水の標識率が上限となる。本明細書中の実施例1及び２で示すように、標識率２０．３％のＨ_２ ^１７Ｏ−富化水を使用し、Ｆｍｏｃ−Ａｌａにおいてカルボキシル基中の少なくとも１の酸素原子が標識された割合は、２０．９％（表３）であった。

なお、本発明の反応は、実際にはＨ_２ ^１７Ｏを含む水を使用する。反応に使用される水に含まれるＨ_２ ^１７Ｏの割合は限定されない。後述の実施例では、費用を考慮し、Ｈ_２ ^１７Ｏを２０．３％含む水を反応に使用した。Ｈ_２ ^１７Ｏは非常に高価であるが、その存在割合を高めるほど^１７Ｏの標識率は高まる。実施例２において少なくとも１の酸素原子が標識された割合は２０．９％であり、本発明の標識方法の反応はほぼ理論通り１００％進行しうることが理解される。なお、本発明の標識方法において用いるＨ_２ ^１７Ｏ溶液は、使用後に回収し繰り返し使用することも可能である。

本発明の標識方法は、上記標識のための工程を繰り返すことも含まれる。即ち、（１）カルボン酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ（又はＨ_２ ^１８Ｏ）と活性剤の存在下で反応させ；（２）得られた^１７Ｏ標識カルボン酸を活性エステルとし；（３）得られたカルボン酸の活性エステルを、さらに、Ｈ_２ ^１７Ｏ（又はＨ_２ ^１８Ｏ）と活性剤の存在下で反応させ；そして（４）上記（１）−（３）の工程を繰り返す、ことも本発明の範囲に含まれる。この標識工程を繰り返すことにより、カルボキシル基中の少なくとも１個の酸素原子が標識される割合が増大し、またカルボキシル基中の２個の酸素原子が同時に標識される可能性がある。

酸素の同位体として、^１７Ｏ以外にも^１８Ｏが存在する。本発明の方法は、^１８Ｏによるカルボキシル基の標識にも適用可能である。１８酸素（^１８Ｏ）標識体は、医療用トレーサー等としての用途が期待されている。

酸素同位体標識された化合物
本発明の方法は活性剤の使用により、穏やかな条件下でカルボキシル基の酸素同位体（１７酸素（^１７Ｏ）及び／又は１８酸素（^１８Ｏ）の標識を可能にした。よって、従来の厳しい反応条件では事実上、酸素同位体による標識が不可能であった化合物でも、本発明の方法によって標識が可能になった。よって、本発明の標識方法によって酸素同位体で標識された、カルボキシル基含有化合物も本発明に含まれる。

本発明のカルボキシル基含有化合物は、好ましくは、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂肪酸、脂質、糖脂質、プロテオグリカン、コレステロール及びステロイドからなるグループから選択される。

本発明の方法によって^１７Ｏ標識されたカルボキシル基を含む化合物は、例えば^１７Ｏ ＮＭＲによる構造解析に有用である。表１に示したように^１７Ｏがスピン５／２であり、原子核は正の電荷を帯びた回転楕円体である。原子核の電荷の楕円体状の分布である電子四極子モーメント（ｅｌｅｃｔｒｎｉｃ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍｏｍｅｎｔ）と電場勾配との相互作用によって、シグナル幅は広くなるため、一般に^１７ＯのＮＭＲ測定は困難である。しかしながら、電子四極子モーメントの問題は溶液ＮＭＲではなく、固体ＮＭＲを採用することによって、ある程度改善できる。

酸素同位体で標識された合成ペプチドを製造する方法
本発明はさらに、ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチドを製造する方法を提供する。本発明の標識方法でアミノ酸を標識し、当該アミノ酸をペプチドの固相合成に利用することによって、標識された合成ペプチドを製造することが可能である。

ペプチドの固相合成は特に限定されず、公知の方法を利用可能である。よって、本発明の合成ペプチドの製造方法は、一態様として
１）アミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
２）当該標識アミノ酸中のカルボキシル基を、固相に結合したアミノ酸若しくはペプチドのＮ末端アミノ基と反応させる
ことを含む。

あるいは、合成ペプチド中のＣ末端又は側鎖中の遊離のカルボキシ基を、本発明の方法を用いて標識してもよい。
本発明はまた、本発明の方法で製造された、ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチドを提供する。

酸素同位体で標識されたアミノ酸の製造方法
本発明はまた、カルボキシル基中の１又は２の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された標識アミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。本発明の製造方法は、
１）末端アミノ基が保護基で保護されているアミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
２）得られた保護基を有する標識アミノ酸から保護基を脱離させる
ことを含む。

本発明の製造方法は、任意の天然若しくは非天然のアミノ酸の製造方法に適用可能である。アミノ酸の活性エステルは、本明細書中の「酸素同位体での標識方法 （２）カルボン酸活性エステル」の項目で一般的に記載した通りである。また、アミノ基の保護基、及びその脱離方法についても、上述した通りである。

本発明はさらに、本発明の方法で製造された標識アミノ酸の、無細胞系又は生細胞系のタンパク質合成における使用を提供する。無細胞系又は生細胞系のタンパク質合成システムは当業者に周知である。例えば、無細胞系のタンパク質合成システムは、細胞抽出液、目的タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源、緩衝液等を含む。生細胞系のタンパク質合成システムは、大腸菌、酵母等の微生物又は動物細胞等を形質転換細胞とし、アミノ酸等を含む培地中で培養し、タンパク質を合成するシステムである。本発明の方法で製造された標識アミノ酸は、任意のタンパク質合成システムにおいて、酸素同位体で標識されたタンパク質の合成のために使用可能である。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１ ^１７ Ｏ−標識Ｆｍｏｃ−アミノ酸、 ^１７ Ｏ−標識ペプチド及び ^１７ Ｏ−標識遊離アミノ酸の合成
（１）材料
Ｈ_２ ^１７Ｏを含む水は、日本酸素株式会社（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓａｎｓｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸のペンタフルオロフェニルエステル、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸のワング（Ｗａｎｇ）樹脂、並びに無水Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）は、ノババイオケム社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入し、さらに精製することなく使用した。ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃ_１８カートリッジは、ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）より購入した。

（２）^１７Ｏ−富化Ｆｍｏｃ−アミノ酸の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリンを例として、そのカルボキシル基への^１７Ｏ標識の導入について、以下に詳述する。

Ｎ_２ガス下で、１．５２３ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−バリン ペンタフルオロフェニルエステル及び４２１ｍｇの無水ＨＯＢｔを４．０ｍＬのＴＨＦに溶解し、直後に５００μＬのＨ_２ ^１７Ｏ−富化水（標識率２０．３％）を溶液に加えた。混合物を室温で、１０日間攪拌した。反応は随時、^１Ｈ ＮＭＲでモニターした。反応終了後、溶媒を減圧下で蒸発乾固させ、白色生成物を得た。ＴＨＦを伴う過剰量のＨ_２ ^１７Ｏ溶液を次回の使用のために回収した。

粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１００：１（ｖ／ｖ）酢酸エチル：酢酸）によって精製し、そして、７９１ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌ−バリン［^１７Ｏ］を得た。この生成物の溶液ＮＭＲ及び質量分析の結果は、計算値と一致した。

同様の方法により、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン［^１７Ｏ］も合成した。
以上の方法は、原則として、タンパク質を構成する全てのアミノ酸に適用可能である。
（３）^１７Ｏ−標識ペプチドの固相ペプチド合成
（２）で合成した^１７Ｏ−富化Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は、^１７Ｏ−富化ペプチドの合成に直接使用することができる。^１７Ｏ−富化アラニン成分を含むジペプチド、ＡＬＡ［^１７Ｏ］−ＡＬＡ及びＡＬＡ［^１７Ｏ］−ＶＡＬをＷａｎｇ樹脂上の固相ペプチド合成によって合成した。ＡＬＡ［^１７Ｏ］−ＶＡＬの合成法を以下に記載する。

Ｗａｎｇ樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｌ−バリン６８５ｍｇを、反応管に装填し、無水ＤＭＦによって洗浄した。樹脂に固定された生成物を５．０ｍＬのピペリジン／ＤＭＦ（２：８）溶液で処理した。混合溶液を約１時間振盪し、そして溶媒を濾過によって除去した。

窒素下で、１９１ｍｇの^１７Ｏ−富化Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン及び９０ｍｇの無水ＨＯＢｔを、４．０ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解した。次いで、当該アミノ酸溶液に、９８μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを加えた。室温で約１時間、反応を進行させた。

前記Ｗａｎｇ樹脂に固定されたＬ−バリンを、前記^１７Ｏ−富化Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニンを含むアミノ酸溶液で、反応管中で処理し、混合物を３日間ゆっくり振盪した。溶媒を濾過によって除去した後、樹脂を５．０ｍＬのピペリジン／ＤＭＦ（２：８）溶液で処理した。樹脂を無水ＤＭＦ、イソプロピルアルコール及び無水ジクロロメタンで洗浄した。次いで、９５％ＴＦＡ水性溶液に３時間懸濁した。樹脂を濾過によって除去した。濾過物をフラスコ中に集め、溶媒を蒸発乾固した。１４３ｍｇの粗生成物を得、そして、^１Ｈ ＮＭＲによってＡＬＡ−ＶＡＬの生成を確認した。

（４）^１７Ｏ−富化遊離アミノ酸の合成
^１７Ｏ−富化遊離Ｌ−アミノ酸は、^１７Ｏ−富化ＦｍｏｃＬ−アミノ酸中の保護基を除去することによって容易に得ることができる。典型的な実験例として、２５０ｍｇの^１７Ｏ−富化Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリンを５．０ｍＬのピペリジン／ＤＭＦ（２：８）溶液で、室温にて数時間処理し、そして溶媒を減圧下にて蒸発させた。残渣を蒸留水に溶解し、そして、ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃ_１８カートリッジによって精製し、１０１ｍｇの遊離^１７Ｏ−バリンを得た。溶液^１Ｈ ＮＭＲによってＬ−バリンの生成を確認した。

保護基がアミノ酸の側鎖に結合している場合には、Ｆｍｏｃ−保護基の除去の前若しくは後に、側鎖保護基の切断工程が必要である。
実施例２ アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ）とジペプチド（Ａｌａ−Ｖａｌ）における ^１７ Ｏによる標識率
目的
本実施例では、実施例１で作成した本発明の^１７Ｏ標識体であるアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ）とジペプチド（Ａｌａ−Ｖａｌ）における^１７Ｏによる標識率を確認する。標識率は、ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法質量分析：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）において、標識体における第一同位体ピーク（１ｓｔ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｐｅａｋ）第二同位体ピーク（２ｎｄ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｐｅａｋ）のピーク面積値を用いて求めた。

測定サンプル
＊Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（Ｃ_１８Ｈ_１７ＮＯ_４）； ３１１．１１５７４７８Ｄａ（精密な分子量） 非標識体、^１７Ｏ標識体
＊Ａｌａ−Ｖａｌ（Ｃ_８Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_３）； １８８．１１６０８２３ Ｄａ（精密な分子量） 非標識体、^１７Ｏ標識体
上記分子量は、^１２Ｃ：１２、^１Ｈ：１．００７８２５、^１４Ｎ：１４．００３０７４、^１６Ｏ：１５．９９４９１５、^１８Ｏ：１７．９９９１６、として、計算を行った（理化学辞典ｐ．１５３２に記載）。

方法
（１）乾固したサンプルを５０％ アセトニトリルに溶解する。
（２）溶解物を適宜、５０％アセトニトリル、０．１％ギ酸溶液で希釈する。

（３）ＨＰＬＣのポンプを用いて、５０％アセトニトリル、０．１％ギ酸溶媒を５μｌ／分でＭＳへ送液し、（２）の希釈サンプルを１μｌ装填した。ＥＳＩ−ＭＳ測定は、正イオンモードでｍ／ｚ１００−１０００の範囲で行った。Ｆｍｏｃ−Ａｌａの非標識体及び^１７Ｏ標識体、並びにＡｌａ−Ｖａｌの非標識体及び^１７Ｏ標識体の各々について、５回ずつ測定を行った。

結果
正イオンモードで測定した結果、分子量関連イオンピークを確認できた。図１は、ジペプチドＡｌａ−Ｖａｌの非標識体と標識体のマススペクトルを示す。マススペクトルのＨ付加イオンピークのピーク面積の値を用いて、標識率の解析を行った。

具体的には、^１７Ｏを新たな同位体元素Ｘと仮定して、その同位体存在比を以下の表２のように設定した。

例えば、^１７Ｏ標識Ａｌａ−Ｖａｌの標識率ｘはＣ_８Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_２Ｘとし、マススペクトルから実測される第一同位体ピーク（図１ｂにおいて、ｍ／ｚ：１８９．１２４）と第二同位体ピーク（図１ｂにおいて、ｍ／ｚ：１９０．１２９）の面積比を用いて以下のように算出した。

同様にＦｍｏｃ−Ａｌａについて行った。これらの結果を表３に示す。

表３の１−４は各々、
１．非標識（対照）のＦｍｏｃ−Ａｌａ、
２．非標識（対照）のＡｌａ−Ｖａｌ、
３．^１７Ｏ標識（本発明）のＦｍｏｃ−Ａｌａ、
４．^１７Ｏ標識（本発明）のＡｌａ−Ｖａｌ
の値を示す。

表１に示したように、Ｃ、Ｈ、Ｎ及びＯは一定の割合で天然同位体^１３Ｃ、^２Ｈ、^１５Ｎ及び^１７Ｏが存在する。表３の１−ａの理論値２０．８１０及び２−ａの理論値１０．００２の値は、（非標識（対照））のＦｍｏｃ−Ａｌａおよび（非標識（対照））のＡｌａ−Ｖａｌの天然同位体存在度から算出した、第一同位体ピークと第二の同位体ピークの面積比の理論値を示す。例えば２−ａの１０．０は、上記化学式１において、標識率ｘ＝０の場合に「３×^１７Ｏの天然同位体存在度（０．０３８）／^１６Ｏの天然同位体存在度（９９．７６２）」を用いて算出される強度比の理論値である。１−ｂ及び２−ｂに示すピーク面積比の平均値はほぼ理論値と一致した。

表３の３−ａ及び４−ａは、本発明の^１７Ｏ標識したＦｍｏｃ−Ａｌａ及びＡｌａ−Ｖａｌについて、第一同位体ピークと第二同位体ピークの面積比の実測値を示し、この数値をもとに計算した標識率を３−ｂ及び４−ｂに示す。

以下の化学式２に示すように、Ｆｍｏｃ−Ａｌａはカルボキシル基中の２箇所の酸素のうちいずれかが^１７Ｏで標識される可能性がある。また、本標識法を複数回繰り返せば双方に^１７Ｏが標識される可能性がある。一方Ａｌａ−Ｖａｌでは、^１７Ｏ標識され得るのはＦｍｏｃ−Ａｌａ由来の１箇所の酸素のみである。

実施例３ Ｉｌｅ［ ^１７ Ｏ］の ^１７ Ｏ ＭＡＳＮＭＲスペクトロスコピー
実施例１の方法で作成した遊離のＩｌｅ［^１７Ｏ］を用いて、^１７Ｏ ＭＡＳＮＭＲを行った。^１７Ｏ ＭＡＳＮＭＲスペクトロスコピーを図２に示す。

具体的には、測定はＣｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｓ社製 Ｉｎｆｉｎｉｔｙ４００ ＮＭＲ分光器を使用し、酸素とプロトンの共鳴周波数は各々５４．２０７ＭＨｚ及び３９９．８８ＭＨｚである。粉末状態の試料をジルコニウムローターに詰めて、室温で測定を行った。試料の回転周波数は１２ｋＨｚであった。化学シフトの基準やＲＦ強度の設定には、Ｈ_２Ｏを使用した。繰り返し時間は５秒であった。

図２のスペクトルは、基本的に^１７ＯＨとＣ＝^１７Ｏの２成分からなる粉末パターンである。図２中の星印は、ジルコニウムローター（ＺｒＯ_２）由来のシグナルである。
実施例４ 本発明の標識方法では標識化中にアミノ酸のラセミ化が生じない
本実施例では、本発明の方法で得られたアミノ酸は標識化中に異性化を起こしていない、ことが示された。

試料の調製
（１）実施例１で得られた^１７Ｏ−バリンのうち１０ｍｇを、０．１Ｍ酢酸水溶液に溶解した。

（２）１００ｍｇのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）と１００ｍｇのｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴＡ）を１０ｍＬのメタノールに溶解した。
（３）６１．４ｍｇのホウ酸を１０ｍＬの水に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調製した。

（４）１００μＬの（１）と、２０μＬの（２）と１００μＬの（３）を混合し、室温で５分ほど置いた。
（５）混合溶液の１００μＬをＨＰＬＣに装填した。

ＨＰＬＣの条件
カラム： ＹＭＣ ＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８ （ＨＳ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ）
溶媒： （Ａ）リン酸緩衝液（１／１５ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝６．４），（Ｂ）メタノールで（Ａ）：（Ｂ）＝５４：４６の等傾
流速： １．０ｍＬ／分
検出波長： ３４０ｎｍ
結果
実施例１で得られた^１７Ｏ−バリンをｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴＡ）及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）と反応させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した（参考文献：Ｎｉｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４０２，３８７、１９８７）。結果を図３に示した。

図３において、対照としたＤＬ−バリンでは等価な２本のピークが観察された（図３ａ）のに対し、^１７Ｏ−バリンではＬ体由来の１本のピークしか見られなかった（図３ｂ）。実施例１で得られた^１７Ｏ−バリンの最初の原料はＦｍｏｃ−Ｌ−バリン ペンタフルオロフェニルエステルであったことから、本発明の標識反応中には異性化（ラセミ化）が起こっていないことが確認された。

実施例５ 標識Ｆｍｏｃ−Ｌ−（Ｏ−第三級ブチル）セリンの製造
本実施例では、標識Ｆｍｏｃ−Ｌ−（Ｏ−第三級ブチル）セリンを製造した。
具体的には、１．２６０ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−（Ｏ−第三級ブチル）セリン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ノババイオケム社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と４５０ｍｇの無水ＨＯＢｔを４．０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。直後に２００μＬのＨ_２ ^１７Ｏ富化水（標識率２０．３％）を加え、室温で４，５日間攪拌した。反応終了後、減圧下で蒸発固化させ、白色生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１００：２（ｖ／ｖ）酢酸エチル：酢酸）によって精製し、標識Ｆｍｏｃ−Ｌ−（Ｏ−第三級ブチル）セリンを得た。

生成物の溶液ＮＭＲ及び質量分析の結果は計算値と一致した。^１７Ｏによる標識率を確認した結果、２０．０％であった。
本実施例より、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルも本発明の方法における活性エステルとして有用であることが示された。さらに、本発明は、その一態様において、強酸条件を使用しないことを特徴の一つとしている。本実施例において、アミノ酸側に酸性条件下で脱離する保護基を適用しても、保護基は保持されることが示された。これは、例えば本実施例で得られたアミノ酸を使用したペプチドの化学的合成反応（固相ペプチド合成を含む）に使用する時に、再度側鎖を保護する必要がなく、有用である。

図１は、ジペプチドＡｌａ−Ｖａｌの非標識体と標識体のマススペクトルを示す。縦軸は、相対存在量（Ｒｅｌ．Ｉｎｔ）（％）を示す。横軸は、ｍ／ｚ、原子質量単位を示す。図１ａは非標識体、図１ｂは^１７Ｏ標識体の結果を示す。 図２は、Ｉｌｅ［^１７Ｏ］の^１７Ｏ ＭＡＳＮＭＲスペクトロスコピーを示す。横軸は、化学シフトを示し、単位はｐｐｍである。 図３は、ＯＰＴＡ、ＡｃＣｙｓ及びＤＬ−バリン若しくは^１７Ｏ−バリンから形成されたジアステレオマー誘導体のＨＰＬＣパターンを示す。図３ａのＤＬ−バリン由来の誘導体では、ＨＰＬＣパターンに２本のピークが観察された（左ピーク１４分；右ピーク１８分）。図３ｂの^１７Ｏ−バリン由来の誘導体では、１本のピークのみ観察された。

Claims (17)

1. カルボキシル基含有化合物のカルボキシル基中の１又は２の酸素原子を１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識する方法であって、カルボキシル基含有化合物（カルボン酸）の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させることを特徴とする、カルボキシル基含有化合物の酸素同位体による標識方法。
2. 酸素同位体が１７酸素（^１７Ｏ）である、請求項１に記載の標識方法。
3. 活性剤が、ペプチド合成におけるカップリング試薬又は反応促進添加剤である、請求項１に記載の標識方法。
4. 活性剤が、トリアゾール誘導体又はテトラアルキルウロニウム誘導体である、請求項１に記載の標識方法。
5. 活性剤が、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール又は６−クロロ−１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の標識方法。
6. 活性エステルが、ペンタフルオロフェニルエステル、パラニトロフェニルエステル、２，４，６−トリクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから選択されるエステルである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の標識方法。
7. 酸素同位体標識されるカルボキシル基が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂肪酸、脂質、糖脂質、プロテオグリカン、コレステロール及びステロイドからなるグループから選択される、生体成分又は生体成分関連分子中のカルボキシル基である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の標識方法。
8. 酸素同位体標識されるカルボキシル基がアミノ酸、ペプチド又はタンパク質中のカルボキシル基であり、そして、当該アミノ酸中のアミノ基、又はペプチド若しくはタンパク質中の末端アミノ基若しくは側鎖アミノ基が、保護基で保護されている、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の標識方法。
9. 保護基が、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基及び４−メトキシベンジルオキシカルボニル基からなるグループから選択される、請求項８に記載の標識方法。
10. カルボン酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと、室温ないし５０℃の条件下で反応させる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の標識方法。
11. カルボン酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと反応させる際に、強酸条件で行う、又はアルカリ加水分解を行うという条件を含まないことを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の標識方法。
12. 請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の標識方法で１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された、カルボキシル基含有化合物。
13. アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂肪酸、脂質、糖脂質、プロテオグリカン、コレステロール及びステロイドからなるグループから選択される、請求項１２に記載のカルボキシル基含有化合物。
14. ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチドを製造する方法であって、
    １）アミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
    ２）当該標識アミノ酸中のカルボキシル基を、固相に結合したアミノ酸若しくはペプチドのＮ末端アミノ基と反応させる
    ことを含む、酸素同位体で標識された合成ペプチドの製造方法。
15. 請求項１４に記載の製造方法で製造された、ペプチド結合中の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された合成ペプチド。
16. カルボキシル基中の１又は２の酸素原子が１７酸素（^１７Ｏ）又は１８酸素（^１８Ｏ）の酸素同位体で標識された標識アミノ酸の製造方法であって、
    １）末端アミノ基が保護基で保護されているアミノ酸の活性エステルをＨ_２ ^１７Ｏ又はＨ_２ ^１８Ｏと活性剤の存在下で反応させ、
    ２）得られた保護基を有する標識アミノ酸から保護基を脱離させる
    ことを含む、酸素同位体で標識された標識アミノ酸の製造方法。
17. 請求項１６の方法で製造された標識アミノ酸の、無細胞系又は生細胞系のタンパク質合成における使用。
    

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