JP2005533999A - 受容体滞留時間を測定するリガンドの同定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、受容体の本来の機能の調節に応答する疾患の治療においてｉｎ ｖｉｖｏで有効であると予測される、その受容体に対するリガンドを同定する目的で、リガンドのその受容体上での受容体滞留時間をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定するアッセイの使用に関するものである。

Description

方法
本発明は、臨床的に有効であると予測されるリガンドを同定する手段として受容体の占有を測定するアッセイを用いることに関するものである。特に、本発明は、長い受容体滞留時間を抗ウイルス活性、特に抗ＨＩＶ活性の指標として用いて、ＣＣＲ５受容体のリガンドを同定することに関するものである。

研究及び開発により多くの金銭をかけているにもかかわらず、患者まで到達する新薬の数がめったに投資に釣り合わないことから、超大型の薬剤を創り出すことはますます困難になっている。潜在的な新薬の脱落は概して安全性の問題に起因し、そして発見から臨床まで化合物が残る割合は、薬品産業が直面する最も差し迫った問題の一つになってきている。

臨床相に至るまでの費用は、およそ２０００万ドル（ほぼ１３００万ポンド）となり得る。１０〜１５化合物毎に対してたった一つが臨床相に残る。ひとたび化合物が十分なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示し、そして動物においてすでに試験されたなら、費用は急に上昇する。

健常ボランティアにおける第一相試験には、一試験化合物につき平均２０００万ドル（１３００万ポンド）の費用がかかり、そして二つの化合物のうちおよそ一つが脱落する。適当な用量を検討するためのヒトにおける第二相試験では、一化合物につき平均して４０００万ドル（２６００万ポンド）の費用がかかり、そして二つのうちおよそ一つが脱落する。有効性をプラセボまたは他の頻用される製品に対して決定する、大きな患者集団における世界各国での第三相二重盲検試験には、平均５億６０００万ドル（３億６０００万ポンド）の費用がかかる。５億６０００万ドルの第三相試験は、製品の総費用の７０％であり、そして、残る可能性は平均してたった５８％である。

新薬の最終段階は、承認または登録のための出願である。検討された何千もの患者には、それぞれ平均５０ページのファイルがあり、そして費用は約１億３００万ポンドである。さらに、厳密でそして厳格なガイドラインにより、新薬のおよそ７４％だけが承認されることになる。

したがって、残る可能性のほとんどないこれらの化合物を臨床段階に進む前に脱落させることが重大である。薬物安全性評価、臨床における前例、及び分子の安全性またはメカニズムについての知識のみならず、薬物動態及び薬物代謝試験も、すべて、臨床における潜在性について化合物を評価する際に貴重でそして不可欠なデータを提供する。しかしながら、化合物の潜在的な臨床有効性を開発初期に予測することが、明らかに望ましい。

ＨＩＶに誘導されるＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）は、ほぼ２０年前に最初に記載されたにもかかわらず、非常に大きな集団の病気であり続けている。２００２年の終わりまでに世界中に４０００万人以上のＨＩＶ感染者がいたと推定される（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ。ＡＩＤＳ流行性の最新情報：２００２年１２月、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎａｉｄｓ．ｏｒｇ／ｗｏｒｌｄａｉｄｓｄａｙ／２００２／ｐｒｅｓｓ／ｅｐｕｐｄａｔｅ．ｈｔｍｌ）。

ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、免疫系細胞を攻撃し、身体に感染及び疾
患を撃退する能力を失わせる。感染の過程で、ＣＤ４ Ｔ細胞（感染と戦う白血球）は無能力となりそして殺され、その数が減少する。大部分の場合において、ＨＩＶ−１の感染は進行性の疾患、そして最終的にはＡＩＤＳ及び死をもたらす。

残念なことに、現在利用可能である最も強力な薬物治療をもってしても、ＨＩＶ−１がこれまでに遭遇した最も急速に変異するウイルスの一つであるという事実にも一部起因し、ＨＩＶ−１を抑制することは、依然として信じられないほど苛立たしい課題である。最近の開発により、ＨＩＶ−１の複製を低減させる、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）として知られる強力な３剤カクテルが使用されるようになった。ＨＡＡＲＴは、現在のところ、ウイルスのライフサイクルにおける二つの異なる段階を標的とし、そして、少なくとも１つのウイルスプロテアーゼの阻害剤と組み合わせた、２つまたは３つのウイルス逆転写酵素阻害剤からなる。この併用抗レトロウイルス療法は、多くの患者においてウイルス量の劇的な低減を生じ、ＣＤ４細胞が減少する速度を減少させ、そしてＡＩＤＳへの進行を減少させる。しかしながら、これらの薬剤のいくつかの副作用プロファイルによって長期のアドヒアランスは困難となり、そして薬剤耐性の出現が重大な問題となる。さらに、感受性試験は、最良の治療でさえも完全にウイルスの複製を抑制できないことを示す。ＨＩＶ−１は信じられないほど速い速度で変異するため、いかなるウイルス複製によっても薬剤耐性変異体が出現する可能性が与えられる。ひとたびＨＩＶ−１が変異すると、感染個体に対して実行可能な治療の選択肢はほとんど残らない。

現在のところ、ほとんどの患者は、不耐性または耐性のいずれか（または両方の組み合わせ）により、最終的には既存の３種類の薬剤の併用療法に失敗するであろうし、それゆえに、より耐容性良好でありそして便利に投与されるＨＩＶ−１／ＡＩＤＳ治療用薬剤に対して、高い医学的必要性が残ったままである。一つの新しいアプローチは、宿主細胞での侵入阻害を介するものであり、この一例はＣＣＲ５共受容体の遮断を介するものである。

−ヒト細胞に侵入するには、ＨＩＶ−１は表面抗原分類（ＣＤ）ＣＤ４受容体及びＣＤ４ Ｔ細胞表面に位置するケモカイン共受容体（ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれか）に結合しなければならない。ＣＤ４受容体のみへの結合は、細胞をＨＩＶ−１感染に対して感受性にするのに十分でない。マクロファージ指向性（Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ分離株は、サブタイプに関係なく、β−ケモカイン受容体ＣＣＲ５を主に利用し、そしてＲ５ウイルスと称される。Ｒ５ウイルスは選択的に伝染し、そして初期の無症候性疾患において優位である。ＣＣＲ５からＣＸＣＲ４へケモカイン受容体の利用が切り替わることは、無症候性感染からＡＩＤＳへの移行を示している可能性がある。共受容体の切替が病気の進行に寄与するのか、あるいは病気の進行の結果として生じるのかは、分かっていない。

ＣＣＲ５を介した阻害は、二つの理由によりとりわけ魅力的な薬物標的である。まず第一に、上述のように、新たな感染を確立するウイルスは概してＣＣＲ５指向性である。したがって、ＣＣＲ５を介した感染の阻害に成功すると、伝染の確率を有意に減少できる可能性がある。第二に、ＣＣＲ５遺伝子における自然発生的な３２塩基対の欠失（ＣＣＲ５Δ３２）についてホモ接合性であり、そしてそれゆえにＣＣＲ５受容体を欠失する個体は、見かけ上は免疫学的に正常である。これらの個体はＨＩＶのＲ５株による感染に対しても耐性であり、そしてこのＣＣＲ５欠失についてヘテロ接合性である人では、ＡＩＤＳ及び死への進行がより遅いことが示されている。異なった遺伝子多型の頻度は、集団間で変わる。ＣＣＲ５Δ３２は、北ヨーロッパで最も優勢であり（１６％の対立遺伝子頻度）、南ヨーロッパ出身の個体においてはあまり一般的でなく（４％）、そしてアフリカの集団においては極めて稀である。白人人種の約１％は、ＣＣＲ５Δ３２についてホモ接合性であり、そして実験的「ノックアウト」動物のヒトにおける同等物に事実上相当する。

ケモカイン受容体は、主として免疫系細胞の表面に見つけられる７回膜貫通型分子である。これらの受容体分子がそのリガンド、すなわちケモカイン、に結合すると、最終的には免疫系細胞を組織損壊部位または疾患部位に誘導する結果となる。

ＣＣＲ５（ＣＣケモカイン受容体５）は、マクロファージ指向性（Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ−１株に対する主要な共受容体であり、そしてミクログリア指向性ＨＩＶ−１初代分離株に対する主要な共受容体であるとも思われる。ＣＣＲ５受容体の推定生理学的リガンドは、ケモカイン類であるマクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）である。第二細胞外ループからなる単一領域がケモカイン結合に主に関与するように思われるが、ＨＩＶ−１共受容体活性にはＣＣＲ５の複数の細胞外領域が関与している。

ＨＩＶ感染のマクロファージ指向期において、ウイルスはマクロファージを好み、マクロファージ表面上の分子ＣＤ４及びＣＣＲ５に（ウイルスのｇｐ１２０タンパク質を介して）結合することによってマクロファージに侵入する。しかしながら、最終的には、ＨＩＶ−１は両指向性となることが可能である。このような株は、ＣＤ４を保有するＴ細胞上にあるＣＸＣＲ４タンパク質を認識することが可能なｇｐ１２０分子を産生する。この期には、ＨＩＶ−１はマクロファージとＴ細胞の両方に感染する可能性がある。さらにその後、ウイルス集団の大分部はその嗜好性をＣＸＣＲ４受容体に切り替える可能性があり、Ｔ指向性（Ｔ−ｔｒｏｐｉｃ）となる。Ｔ指向性のウイルスは感染したＴ細胞を容易に破壊し、免疫系の崩壊及びＡＩＤＳの発症に寄与する。あるいは、ＨＩＶ−２の特定の株などのいくつかのウイルスは、ＣＸＣＲ４に付着することが可能であり、直ちにＡＩＤＳへと導く。

生物学的に機能的なＣＣＲ５受容体がなくても宿主に有害であるようにみえないことから、ＣＣＲ５欠失の保護的効果を模倣するよう薬剤を開発できるのではないかという希望がある。野生型で発現する受容体を、適切に構築されたこれらの分子のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて遮断することが、可能性に含まれる。アナログが強力で非毒性であって優れた薬理学的プロファイルを示し、そして経口投与可能であることを確実にすることが、依然として課題である。

強力なＣＣＲ５のアンタゴニストである化合物は、例えば、特許出願ＷＯ ００／３８６８０、ＷＯ ００／３９１２５またはＥＰ １０１３２７６において同定されており、その開示を本明細書では参照によって援用する。しかしながら、我々の研究では、前臨床試験においてＣＣＲ５アンタゴニストの高い結合親和性が示されても、必ずしも化合物の同等に高い抗ウイルス活性、特に優れた臨床有効性に変換されないことが明白となってきている。実際に、公知の前臨床的方法を用いて臨床有効性を予測することは依然として課題であり、臨床試験において、潜在的に有効でない化合物の不必要でそして費用のかかる使用を招く結果となる。

本発明は、リガンドまたはモジュレーターによる受容体のオフセット時間または機能的な占有が、リガンドまたはモジュレーターのｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性及び薬力学へ指針を与えるという観測に基づいている。特に、出願人は、受容体への非常に類似した結合親和性を有する化合物が、受容体上において著しく異なる滞留時間を示すことを発見したが、このことは抗ウイルス効力の改良につながる可能性がある。このように、本発明の目的は、良好な薬力学及び改良された効力に対する潜在性、ならびにその結果として化合物の臨床有効性を、前臨床データからより正確に予測し得る方法を提供することである。

ある側面から、本発明は、受容体の本来の機能の調節に応答する疾患の治療においてｉｎ ｖｉｖｏで有効であると予測される、その受容体に対するリガンドを同定する目的で、リガンドのその受容体上での受容体滞留時間をｉｎ ｖｉｔｒｏにて測定するアッセイを用いることにある。

別な言い方をすれば、本発明は、受容体の本来の機能の調節に応答する疾患に対して高い効力及び／または臨床有効性を有するリガンドを同定する方法に関するものであって、リガンドの受容体上での滞留時間を測定しそして所望の結合滞留に基づいてリガンドを選択することを含む方法に関するものである。

本明細書では、受容体に対する「リガンド」とは、受容体に結合し、そしてそれによって受容体の本来の機能を調節するあらゆる化合物を指す。この語には、限定されるわけではないが、ペプチド、修飾ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び、合成化合物、天然化合物または小有機分子といった小分子リガンドが含まれる。あるいは、リガンドは、抗体もしくは抗体フラグメント、または、核酸もしくは核酸由来物質であってもよい。

本明細書では、「滞留時間」とは、リガンドがその受容体に結合している状態に費やされる平均時間、すなわち、リガンドのその受容体に対する「オン」状態と「オフ」状態の間の平均時間を指す。別な言い方をすれば、この語は、リガンドが結合した結果として、ケモカインなどの天然のリガンドまたはＨＩＶ糖タンパク質などの侵入分子が結合できない状態に受容体がある間の時間を指す。

滞留時間は「受容体の占有」ともみなされ、そしてリガンドのオフ速度、解離速度またはオフセット速度を測定するいずれの方法によって測定されてもよい。典型的な方法は、標識リガンドを、例えば受容体を発現している細胞またはこのような細胞由来の膜調製物といった適切な受容体とともに平衡に達するまでインキュベートする工程を含む。次いで、過剰の非標識リガンドを加え、そして受容体に結合している標識リガンド量を所望の時間間隔で測定する。標識は、リガンドのその受容体への結合に影響を与えないいずれの検出可能なタグであってもよい。好ましくは、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐまたは^１２５Ｉといった放射性標識がリガンドに組み込まれ、最も好ましくは^３Ｈである。

好ましくは、受容体滞留時間は、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、またはより好ましくは、少なくとも９時間である。特に、リガンドの受容体上における機能的な占有が長ければ長いほど、そのリガンドの臨床効果は長くなり、それによって患者に投与される必要のある投与回数が低減する。

本発明によって同定されるリガンドは、受容体に対するアゴニストであってもよいが、しかし、好ましくはアンタゴニストである。好ましくは、受容体はＧタンパク質共役受容体であり、最も好ましくはケモカイン受容体ＣＣＲ５である。

リガンドの受容体滞留時間（または臨床有効性）は、抗ウイルス活性、好ましくは抗ＨＩＶ活性の予測因子であってもよい。
特に、本発明は、アンタゴニストのＣＣＲ５上での滞留時間を測定しそして長い滞留時間を有するリガンドを選択することによって、強力な抗ウイルス活性及び臨床有効性を示すであろうＣＣＲ５アンタゴニストを選択する方法を提供する。

別の側面から、本発明は、受容体に対する多数のリガンドのそれぞれの受容体滞留時間を測定することを含み、そして、滞留時間が少なくとも一つの他のリガンドの滞留時間よりも長い少なくとも一つのリガンドをさらなる研究のために選択することを含む研究方法
に関するものである。

さらなる側面から、本発明は、与えられた受容体に対する多数のリガンドをその受容体と接触させ、各リガンドの受容体結合親和性及び受容体滞留時間を測定し、その測定された結合親和性及びその受容体滞留時間の産物であるランク値を各リガンドに割り当て、そして選ばれた切り捨てランク値よりも大きなランク値を有する一つ以上のリガンドをさらなる研究のために選択する、ことを含む研究方法にある。

効力及び／または臨床有効性は、リガンドがその標的受容体に滞留している間に示す機能的な効果に関連する。これは、例えばＴ細胞へのウイルス侵入を阻害するなどの、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストが有する可能性のあるいかなる効果であってもよい。好ましい態様において、その効果とは、抗ウイルス効果、好ましくは抗ＨＩＶ効果である。

所望の滞留時間は、ある条件については短くてもよく、またある条件については長くてもよい。本発明の好ましい態様において、所望の滞留時間は少なくとも一時間、好ましくは少なくとも三時間、さらに好ましくは少なくとも六時間であり、最も好ましくは少なくとも九時間である。

その上さらなる側面において、本発明は、本発明の方法によって選択されたリガンドに関するものである。
「受容体」の語は、幅広く理解されるべきであり、受容体、酵素、イオンチャネル、接着分子、抗体を非限定的に含む、先に定義したようなリガンドに対する結合部位を含むいかなる分子に関連してもよい。好ましくは、受容体は細胞中または細胞上に見られる受容体であり、その細胞は好ましくは哺乳動物細胞、よりいっそう好ましくはヒト細胞である。好ましくは、受容体は細胞表面受容体であり、よりいっそう好ましくはＧタンパク質共役受容体、よりいっそう好ましくはケモカイン受容体である。本発明に対する最も好ましい受容体は、ＣＣＲ５ケモカイン受容体である。

「結合親和性」の語は、競合アッセイなど、当該技術分野において周知の従来の結合アッセイによって測定されてもよい、リガンドの結合に関するものである。典型的には、目的の受容体を発現している細胞から得た膜調製物を、この受容体に対する公知の標識リガンドとともに、可能な総結合の約５０％を与える標識リガンド濃度でインキュベートすることになる。試験化合物が結合に関して標識リガンドと競合する能力を測定するために、パラレルアッセイチューブ中には、非標識の競合する試験リガンドが種々の量で含まれる。次いで、競合曲線を、用いた試験リガンドの濃度をｘ軸上に、そして結合した標識量をｙ軸上にプロットして作成する。このような実験から、Ｋ_Ｄ、ＩＣ_５０（すなわち、標識リガンドの５０％を置換する競合するリガンドの濃度）またはＩＣ_９０（すなわち、標識リガンドの９０％を置換する競合するリガンドの濃度）値を算出してもよい。当業者が用いて算出するのに精通しているであろう、そしてどの基本的な薬理学の教科書にも見つけることが可能な、リガンドの結合親和性を表す多くの方法がある。

「ケモカイン受容体」とは、走化性サイトカインであるタンパク質、すなわち白血球走化性因子として白血球を引き付ける能力を有するタンパク質の大きなファミリーに対する受容体を指す。ケモカイン類はある重要な構造的特徴を共有し、そして、そのほとんどがＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する受容体ファミリーに結合する。ケモカイン類及びその受容体は炎症性及び感染性疾患の病態生理学の中核を成し、そして、ケモカイン類及びその受容体の活性を調節、好ましくはアンタゴナイズする活性がある薬剤は、こういった炎症性及び感染性疾患の治療において有用である。

「ＣＣＲ５」とは、β−ケモカイン類であるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの細胞受容体であるケモカイン受容体を指す。ＣＣＲ５は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０に結合し、ＨＩＶ感染における重要な受容体であるとも確認されている。ＣＣＲ５に関する背景の手引きは、ＷＯ ９７／３２０１９に見つけることが可能であり、本明細書ではその開示を参照によって援用する。

「ＨＩＶ」とは、ＡＩＤＳを引き起こす病原体であると推測される、ヒト免疫不全ウイルスを指す。この件に関しては豊富な文献があり；元はＨＴＬＶ−ＩＩＩと称されたＨＩＶの最も初期の文献の一つは、Ｒａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３，２７７−２８４，１９８５に記載されている。

本発明は、例として、以下の図を参照して、さらに記載されるであろう。
本発明は、４つの化合物を用いて例証されており、ここで：
−化合物Ａは、ＷＯ ０１／９０１０６における実施例４で；
−化合物Ｂは、ＷＯ ０１／３８６８０における実施例３４で；
−化合物Ｃは開示されておらず；そして
−化合物Ｄは、ＰＣＴ／ＩＢ／０３／０１２２０における実施例３３である。

（実施例１：化合物のＣＣＲ５への結合）
化合物を、”Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０，１４７−１５２（１９９６）”に開示された手順にしたがい、ＣＣＲ５親和性に関してアッセイして試験した。化合物Ａ〜Ｄはすべて、ＣＣＲ５との結合に対するＩＣ_５０が１０ｎＭ未満であった（データは示さない）。
（実施例２：ケモカインを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションのアンタゴニストに依存した阻害）
１．ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションを動的に阻害することによってＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）解析により測定される、３００．１９細胞上でのＣＣＲ５の機能的な占有
アンタゴニストによるＣＣＲ５受容体の物理的な占有は、放射性リガンドの解離試験を用いて測定可能である。全細胞におけるＣＣＲ５受容体上でのアンタゴニストの機能的な占有は、対応するケモカインを介した受容体のインターナリゼーションのアンタゴニストに依存した阻害を測定することによって評価することが可能である。これらの測定は、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）の技術を用いて行うことが可能である。細胞洗浄によってアンタゴニストを除去した後の、ケモカインを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションの阻害の延長が、ＣＣＲ５の機能的な占有の測定値である。

方法
すべてのアッセイ／試薬は、特に明記しない限り、室温にて行った／使用した。
細胞培養： ３００．１９細胞（組換えによりヒトＣＣＲ５を発現しているマウス前Ｂ細胞系）を、７５ｃｍ^２細胞培養フラスコ中の増殖培地中で、３７℃にて２〜３日間、加湿された５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素インキュベーターで培養した。細胞継代に関しては、懸濁細胞を１ｘ１０^５〜２ｘ１０^５個に分割することをルーチンで行った。

細胞調製： 使用した各７５ｃｍ^２フラスコから得た細胞を、卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、最小容量のＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）培地（材料を参照されたい）中に再懸濁し、セデックス細胞計数器（材料を参照されたい）でカウントし、そして同じ培地中に希釈することによって細胞密度を５ｘ１０^６／ｍｌに調整した。

アンタゴニスト、抗体、及びケモカインの調製： ＣＣＲ５アンタゴニストを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１ｍＭの濃度で溶解し、そして、１０ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度でｉｎ ｓｉｔｕにおけるＦＡＣＳアッセイ試験を可能とするように、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）細胞培地中に希釈した。

抗ＣＣＲ５抗体（２Ｄ７−材料を参照されたい）を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１０で希釈した。ＩｇＧ２ａ抗体（アッセイ用アイソタイプ対照−材料を参照されたい）を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１０で希釈して用いた。抗２Ｄ７フィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗マウス二次抗体（材料を参照されたい）を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０で希釈して用いた。

ＣＣＲ５についての対応するアゴニストのケモカインリガンドであるＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を、ＰＢＳ中に可溶化した。凍結乾燥した材料（１０μｇ−材料を参照されたい）をＰＢＳ中に再懸濁して、１００μＭの濃度とした。次いで、最終濃度が１０００ｎＭ（アッセイにおいて１００ｎＭの最終濃度）となるように、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）中に希釈した。

５ｘ１０^６細胞／ｍｌの３００．１９細胞（１００μｌ）を各アッセイチューブに加えた。ＣＣＲ５アンタゴニスト（１０μｌ）またはビヒクル（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ））を、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて１０から１０００ｎＭまで濃度を変えてプロファイリングすることを可能とするように、適切なアッセイチューブに加えた。アンタゴニストの細胞への結合を可能とするため、チューブを４℃にて４５分間インキュベートした。アンタゴニストによるＣＣＲ５占有の延長を検討するため、試料を、存在するアンタゴニストと一緒のままにしておくか、または、遠心分離（卓上遠心分離機で１５００ｒｐｍ）しそして１０００μｌのＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）中で二度洗浄した。洗浄した試料の半分を１０００μｌの同じ培地中に再懸濁し、そして、ＦＡＣＳアッセイを通じて処理する前に、１時間半、回転プラットフォーム上に置いた。洗浄した試料のもう一方の半分は、洗浄しなかった試料（すなわち、アンタゴニストが存在）とともに、直ちに処理した。

ＣＣＲ５のインターナリゼーションを誘発するため、ＲＡＮＴＥＳ（１０μｌ）を試料に加えた後、続いて３７℃にて４５分間インキュベートした。試料を遠心分離し（卓上遠心分離機で１５００ｒｐｍ）、そして０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で二度洗浄した。洗浄した試料を４０μｌの同じバッファーに再懸濁した。次いで、２Ｄ７抗体またはアイソタイプ対照（１０μｌ）を試料に加えた後、抗体のＣＣＲ５への結合を可能にするため、続いて４℃にて４５分間インキュベートした。

次いで、試料を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで一度洗浄した後、続いて７５μｌのフィコエリトリン（ＰＥ）−ヤギ抗マウス二次抗体（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０で希釈）を加えて、結合を可能にするため４℃にて４５分間、暗所でインキュベートした。続いて、試料を遠心分離し（卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで５分間）、１００μｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で二度洗浄し、そして固定するため、１０００μｌの１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に再懸濁した。固定された細胞を、ベクトン・ディッキンソンのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいて処理し、ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションのアンタゴニストに依存した阻害及びその結果としての機能的なＣＣＲ５の占有を評価するために、各アッセイにおける細胞上の蛍光レベルを測定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒアッセイには、それぞれ４８８ｎｍ／５３０ｎｍの励起／発光波長を用い、供給者の取扱説明書にしたがってセル・クエスト・ソフトウエアを使用して実行した。

材料
培地：ＮａＨＣＯ_３含有、Ｌ−グルタミン非含有のＲＰＭＩ−１６４０培地 １ｘ５００ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：３１８７０−０２５）；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン ５ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：２５０３０−０２４）；ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン） ５ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：１５１４０−１２２）；ウシ胎児血清（ＦＢＳ） ５０ｍｌ −シグマ・アルドリッチ（カタログ番号：Ｆ７５２４）；１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー ５ｍｌ −シグマ Ｈ−０８８７；純２−メルカプトエタノール ２μｌ −シグマ Ｍ−３１４８。

２２５ｃｍ^２組織培養処理細胞培養フラスコ −コースター（Costar）（カタログ番号：３００１）；セデックス・イノヴァティス細胞計数器；イノヴァティス試料カップ（カタログ番号：６０００５００００）；加湿された３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーターセット；デンリーＢＲ４０１冷却遠心分離機。

アッセイ試薬：
アッセイバッファー：ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）；ＲＰＭＩ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：３１８７０−０２５）；ＦＢＳ −シグマ（カタログ番号：Ｆ７５２４）。

洗浄バッファー：０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ；ＢＳＡ−アルブミン、ウシ画分Ｖ −シグマ Ａ４５０３；Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋非含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：１４１９０−０９４）。

消耗品：ＤＭＳＯ組織培養グレード −シグマ（カタログ番号：Ｄ−８４１８）；アッセイチューブ：ミクロ遠心分離チューブ −コースター（カタログ番号：３６２１）；ＦＡＣＳチューブ：ファルコンチューブ −ベクトン・ディッキンソン（カタログ番号：３５ ２０５４）；ラボシステムズ・フィンピペット サーモ・ライフ・サイエンスイズ（カタログ番号：４５００／０９０／０５０）；１ｍｌピペットチップ −サーモ・ライフ・サイエンスイズ（カタログ番号：９４０１１０３）；２５０μｌピペットチップ −サーモ・ライフ・サイエンスイズ（カタログ番号：９４００２６３）；ＬＭＳ冷却インキュベーター；ベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ −セル・クエスト・ソフトウエア；１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ：ホルムアルデヒド −シグマ カタログ番号：Ｆ１６３５、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋非含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：１４１９０−０９４）；ＩＥＣミクロマックスＲＦ遠心分離機；ＲＡＮＴＥＳ −Ｒ＆Ｄシステムズ（カタログ番号：２７８−ＲＮ−０１０）；マウス抗ヒトＣＣＲ５モノクローナル抗体：２Ｄ７ −ファーミンジェン（カタログ番号：３６４６１Ａ）；アイソタイプ対照抗体：マウスＩｇＧ２ａ −ファーミンジェン（カタログ番号：３３０３１Ａ）；二次ＰＥ標識抗体：ＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体 −シグマ（カタログ番号：Ｐ９２８７）。

データ解析
蛍光データの取得に用いたセル・クエスト・ソフトウエアを、データ解析にも使用した。各アッセイ試料から得た細胞集団について、平均蛍光値を測定した。ＲＡＮＴＥＳを介したインターナリゼーションによる平均蛍光の減少を、ビヒクルを曝露した２Ｄ７抗体対照と相対的に測定した。これにより、ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５インターナリゼーションのアンタゴニストに依存した阻害を算出すること、及び、続いて種々のＣＣＲ５アンタゴニストによる機能的な占有を比較することが可能となった。

結果
３００．１９細胞によるＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションの化
合物Ｂに依存した阻害によって測定された機能的な占有を、図１に示す。ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションは、３００．１９細胞をケモカインとともにインキュベートした後の蛍光シフトに認められたように、明白であった。このインターナリゼーションの阻害は、試験されたすべての濃度で観察され、これは、ビヒクル対照におけるＣＣＲ５の（２Ｄ７抗体によって認識されるような）蛍光プロファイルと比較して、化合物Ｂがアッセイ（洗浄なし）を通じて存在したインキュベーションの蛍光を重ねることによって示される。この阻害の保持（すなわち、機能的なＣＣＲ５の占有）は、細胞洗浄によって化合物Ｂを除去後に認められた。阻害の動的な保持は、化合物Ｂを除去後に１．５時間回転インキュベートした後、すべての濃度において様々なレベルで認められた。

これらの結果は、３００．１９細胞におけるＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５の取込みの化合物Ｂに依存した阻害が、動的に保持されることを強調し、それゆえに、このアンタゴニストによるＣＣＲ５の機能的な占有を長期にわたり保持可能であることを示している。この機能的な占有の定量化を、各アッセイに対して蛍光シグナルの幾何平均を測定し、そしてＲＡＮＴＥＳを介したインターナリゼーションの阻害百分率を、阻害されないビヒクル対照と比較して算出することによって行った。化合物Ｂ、Ｃ及びＤに対する定量化を、その機能的な占有をこのアッセイにおいて測定し、そして緩徐に機能がオフセットする化合物を同定することを目的としたアッセイの有効性を示すために行った。この定量化の結果を、図３に示す。各試験条件下での阻害百分率を棒グラフにプロットし、そして付属の表中に一覧とした。ここで結果は一つ以上の実験から得られた平均値であり、エラーバーは範囲を示す。

上記のように、これらの実験において化合物Ｂは緩徐に解離するが、化合物Ｃはより急速に解離する。加えて、化合物Ｃは、その受容体のＩＣ_５０を十分超えた濃度においてさえも、受容体の最新化を完全には阻害しないことが明白である。このことは、放射性リガンド解離試験によって測定された、ＣＣＲ５からのオフセットと一致する（実施例３を参照されたい）。化合物Ｂは、過度の非標識化合物を加えると、ＣＣＲ５から緩徐に解離する（半減期＝３．５時間、図７）。反対に、化合物Ｃは、並列の放射性リガンド解離試験において比較的急速な解離を示した（半減期＝１５分、図８）。図３に示されたデータによると、化合物Ｄは、緩徐にオフセットするＣＣＲ５阻害剤である。

結論
このＦＡＣＳアッセイは、ＣＣＲ５の動的な占有に基づいて化合物を区別することを可能とし、そして緩徐及び急速にＣＣＲ５をオフセットする双方の化合物を同定するのに使用可能である。

２．ＭＩＰ−１βを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションを阻害することによってＦＡＣＳ解析により測定される、末梢血単核細胞上でのＣＣＲ５の機能的な占有
ＭＩＰ−１βを介したＣＣＲ５のインターナリゼーション（％占有）を、化合物Ａの複数回経口用量の投与について検討するために設計された臨床試験に参加した健常ボランティアより採取された全血クエン酸ＣＰＴ（細胞調製用チューブ）試料から調製された、ＣＤ４ Ｔリンパ球において評価した。

化合物Ａは、ＣＣＲ５アンタゴニストであり、そしてＭＩＰ−１βのＣＣＲ５受容体への結合及びそれに続くＣＣＲ５受容体のインターナリゼーションを妨げる。ＭＩＰ−１βの曝露を受けた、安定化剤処理（全ＣＣＲ５）末梢血単核細胞と非処理（最大インターナリゼーション）末梢血単核細胞の、ＣＣＲ５の細胞表面上での発現の違いによって、細胞表面上に存在する非結合のＣＣＲ５の比率は、化合物Ａのいずれの所与の血漿中濃度においても評価されるであろう。次いで、このデータを、化合物Ａの異なる用量において得られる受容体の占有度を評価するのに用いることが可能である。

方法
化合物Ａの単回用量投与（３ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ及び１００ｍｇ）に続き、複数回経口用量として同用量、すなわち３ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ及び１００ｍｇそれぞれを１０日間１日２回投与、またはプラセボについて、１８〜４５歳の健常男性被験者で検討した。

被験者を、六つのコホート（コホート１、４及び６のみから得られたデータを本明細書に例示する）のうちの一つに割り付けた。これらの六つの各コホート内で、適切な投与計画にて化合物Ａを投与、またはプラセボを投与されるように、被験者を割り付けた。コホートは：−
コホート１：化合物Ａ １００ｍｇを１日２回、またはプラセボ；
コホート４：化合物Ａ ２５ｍｇを１日２回、またはプラセボ；
コホート６：化合物Ａ ３ｍｇを１日２回もしくは１０ｍｇを１日２回、またはプラセボ；
である。

投与に先立ち、実験室安全性試験を含む試験及びジェノタイプ評価用に、血液試料を採取した。各被験者に、第１日の８時から１０時の間に化合物Ａまたはプラセボを投与した。第２日には投薬しなかった。化合物Ａを含む溶液を、座っているかまたは立っている状態の被験者に、水とともに総容量２５０ｍＬにて服用させた。下記のように、投与前、及び投与後に続く４８時間後（第３日）まで間隔をおいて、血液試料を採取した。

第３〜１１日に、被験者に、朝８時から１０時の間及び晩２０時から２２時の間に、化合物Ａまたはプラセボを第１日と同じ手順にしたがって投与した。化合物Ａの最低血漿中濃度を測定するため、各日において、化合物Ａの最初の投与直前に血液試料を採取した。

第１２日に、第１日と同じ手順にしたがって、化合物Ａまたはプラセボが投与された；第１２日に被験者は一回のみ投薬された。投与前、及び投与後に続く７２時間後まで間隔をおいて、血液試料を採取した。

被験者は最終投与２４時間後に退院したが、最終投与後７〜１０日の間に、フォローアップの身体検査のために再来院した。
コホート１の被験者から得た血液試料を、以下の時間に（４ｍｌクエン酸ＣＰＴチューブに）採取した：
第１日に、化合物Ａ １００ｍｇを単回投与後０（ベースライン）、４、１２、２４及び４８時間。

第１２日に、化合物Ａ １００ｍｇを単回投与時０時間（ベースライン）及び投与後２４、４８、５９、７２、９７及び１２０時間に、さらに試料を採取した。
コホート４の被験者について、追加の試料を、第１日に化合物Ａ ２５ｍｇを単回投与後８、１８、５２及び６４時間に採取した。第１２日に、追加の試料を、化合物Ａ ２５ｍｇを単回投与後１４４、１６８及び２４０時間に採取した。

コホート６の被験者について、第１日に化合物Ａ ３または１０ｍｇを単回投与時０時間（ベースライン）及び投与後４、８、１２、１８、２４及び４８時間に；第３日に投与後４及び１６時間；第４〜１１日に化合物Ａ ３または１０ｍｇを１日２回投与後２時間、それから、第１２日に化合物Ａ ３または１０ｍｇを単回投与時０時間（ベースライン）及び投与後８、１２、２４、４８、９６及び１２０時間及び１４４時間に、試料を得た。

化合物Ａまたはプラセボの初回投与に先立ち、ＥＤＴＡ加血液試料６ｍｌも採取した。
ＣＤ４陽性リンパ球集団上に残留したＣＣＲ５受容体の発現を、処理されたクエン酸ナトリウムＣＰＴ抗凝固化全血試料のフローサートメトリー解析によって測定した。

材料
クエン酸ナトリウムＣＰＴ（４ｍｌ採取）血液チューブ（ベクトン・ディッキンソン。カタログ番号３６２７６０）、試料処理チューブ（１２ｘ７５ｍｍ丸底ポリスチレン）及びキャップ（押し込み式）（ザルスタッド・Ｌｔｄ、それぞれカタログ番号５５．４７６及び６５．８０９．５０４）。

試薬
１０ｘ 濃縮ＰＢＳ；１０％パラホルムアルデヒド；１０％アジ化ナトリウム溶液；凍結乾燥ＢＳＡ；ＭＩＰ−１βワーキング溶液（−７０℃にて冷凍保存したアリコット）；ＣＣＲ５安定化溶液（ＰＢＳ中に６００ｎＭの化合物Ａを含む）；安定化対照溶液（ＰＢＳ）;ＣＣＲ５及びＩｇＧアイソトープ対照抗体カクテル（２〜８℃にて保存）
試薬の調製
１ｘ ＰＢＳ（２〜８℃にて１ヶ月安定）
１０ｘ ＰＢＳ １００ｍＬ
脱イオン水 ８９９ｍＬ
１０％アジ化ナトリウム脱イオン水溶液 １ｍＬ
ｐＨ７．４
１ｘ １％ＢＳＡ添加ＰＢＳ（２〜８℃にて２週間安定）
１ｘ ＰＢＳ １Ｌ
乾燥凍結ＢＳＡ １０ｇ
ｐＨ７．４
１％パラホルムアルデヒド（２〜８℃にて２週間安定）
１ｘ ＰＢＳ １８０ｍＬ
１０％パラホルムアルデヒド ２０ｍＬ
０．５％パラホルムアルデヒド（２〜８℃にて２週間安定）
１ｘ ＰＢＳ １９０ｍＬ
１０％パラホルムアルデヒド １０ｍＬ
ＣＣＲ５安定化溶液の調製：
対照安定化溶液はＰＢＳである。

１．ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ化合物Ａのストック溶液；
２．１ｘ ＰＢＳでストック溶液を１：５００に希釈して、２０μＭ溶液（２μｌ／ｍｌ ＰＢＳ）を作り；
３．１ｘ ＰＢＳで２０μＭ溶液を１：２０に希釈して、１０００ｎＭ溶液（１μＭ）を作り；
４．１ｘ ＰＢＳで１０００ｎＭ溶液を３：２に薄めて、６００ｎＭ溶液を作る。

１００ｎＭの最終濃度に到達させるには、６００ｎＭの薬物溶液（安定化溶液）を血漿中に１：６で加えるべきである。プロトコールにしたがって、細胞を多くした血漿２５０μＬに安定化溶液５０μＬを加えるべきである。対照安定化溶液を、相当するチューブに同様な比率で加えるべきである。安定化溶液は、各コホートについて新たに作られるべきであり、そして薬物が溶液中にあることを確実にするため、使用に先立ちボルテックスされるべきである。

試料の処理：
１．リンパ球の多い血漿を、スイング・アウト・ローターにて１５５０ｇで２５分間遠心分離することにより分離した。

２．チューブを数回穏やかに反転させることによって、細胞のバフィーコート層を血漿中に再懸濁した（ｘ５）。
３．細胞を多くした血漿２５０μｌを、三つの別々にラベルした１２ｘ７５ｍｍ丸底ポリスチレンチューブにピペットで入れた。［チューブ１（対照）、チューブ２（全ＣＣＲ５）及びチューブ３（ＣＣＲ５ ＭＩＰ１β）］
４．ＣＣＲ５安定化溶液５０μｌをチューブ２に加え、一方、対照安定化溶液５０μｌをチューブ１及び３に加えた後に、中の設定で２秒間軽くボルテックスし、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。

５．すべてのチューブを、スイング・アウト・ローターにて４００ｘｇで５分間遠心分離して、細胞と上清を分離し、次いでデカントした。
６．すべてのチューブに、１５μＬのＭＩＰ−１βワーキング溶液を加え、次いで中の設定で２秒間穏やかにボルテックスして、液体中にペレットを再懸濁した。次いで、チューブを、５％二酸化炭素、９８％湿度の雰囲気中で、キャップをせずに３７℃にて４５分間インキュベートした。

７．ＰＢＳ中の０．５％パラホルムアルデヒド１ｍｌを各チューブに加え、中の設定で２秒間ボルテックスし、そして室温にて１０分間暗所でインキュベートした。
８．次いで、２ｍＬのＢＳＡ添加ＰＢＳをすべてのチューブに加え、スイング・アウト・ローターにて４００ｘｇで５分間チューブを遠心分離して細胞を沈澱させた後に、上清をデカントした。

９．抗体試薬（５０μｌ）を以下の様式で加えた：
チューブ１に − ＭｓＩｇＧ Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）及びＣＤ４０−フルオレセイン（ＦＩＴＣ）（対照）を加えた。

チューブ２及び３に − ＣＣＲ５−ＰＥ及びＣＤ４−ＦＩＴＣ（全ＣＣＲ５及びＣＣＲ５ ＭＩＰ１β）を加えた。
１０．次いで、すべてのチューブを中の設定で２秒間ボルテックスし、そして室温にて暗所で２０分間インキュベートした。

１１．２ｍＬのＢＳＡ添加ＰＢＳをすべてのチューブに加えた。４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清をデカントし、次いでＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドを０．５ｍｌ加え、そして中の設定で２秒間ボルテックスして、ペレットを再懸濁した。

１２．最後に、チューブに適切にキャップをし、解析するまで２〜８℃にて保存した。
結果
第１日に化合物Ａまたはプラセボを単回経口投与され、続いて第３〜１２日に１日２回投与された健常男性被験者について、計画上の各時点における、全血（ＣＰＴ）試料から調製されたＣＤ４ Ｔ細胞表面上でのＣＣＲ５受容体の平均占有百分率、及び対応する標準偏差（ＳＤ）を、表１に供する。

結論
ＣＣＲ５の占有は、用量に相関した。１００ｍｇを１日２回投与されたボランティアでは、投与期間を通じて９０％を超えるＣＣＲ５受容体の占有が示されたが、一方、３ｍｇを投与されたこれらの被験者では、平均受容体飽和度は、＜８０％であった。
（実施例３：ＣＣＲ５上での化合物の滞留時間の測定）
アンタゴニストによるＣＣＲ５受容体の物理的な占有を、放射性リガンド解離試験を用いて測定してもよい。放射性標識アンタゴニストを、ＨＥＫ−２９３細胞上に発現したＣ
ＣＲ５またはその膜調製物とともに、平衡になるまでインキュベートする。続いて、解離、したがって物理的な占有または滞留時間を、解離した放射性標識アンタゴニストの再結合を防ぐために過度の非標識アンタゴニストを加えることによって測定する。このように、非標識アンタゴニストを加えた後に、全細胞または膜上に保持された放射性標識を経時的にカウントすることにより、解離を測定することが可能である。

方法
細胞培養： （標準の技術により作出された）ＣＣＲ５を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて２〜３日間、培地（材料を参照されたい）中で５０〜７０％の密集度となるよう、２２５ｃｍ^２細胞培養フラスコ中で培養した。最大限の密集度ではＣＣＲ５の発現が低下して凝集する傾向があるため、細胞は低密度で培養された。結合アッセイに用いた各２２５ｃｍ^２フラスコを、培地を除去しそして室温のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）２０ｍｌに入れ換えることにより、一度洗浄した。上清を除去し、そして、室温の結合バッファー（材料を参照されたい）１０ｍｌの存在下で培養フラスコの側面を軽く叩くことにより、細胞を取り除いた。細胞を５０ｍｌ遠心分離チューブに入れた。さらに１０〜２０ｍｌの結合バッファー（室温）を培養フラスコ中に加え、次いで、残りの細胞を回収するため遠心分離チューブに移した。細胞を、２０℃にて３５０ｇで１０分間遠心分離した。細胞を、３ｍｌの結合バッファーに再懸濁し、修正ヌーバウアー血球計数器にてカウントし、そして２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度となるように再懸濁した。

膜の調製： 結合アッセイに用いた各２２５ｃｍ^２フラスコを、培地を捨てそして２０ｍｌのＰＢＳ（室温）に入れ替えることにより一度洗浄し、そして５〜１０ｍｌのＰＢＳ（室温）中に再懸濁した。細胞を５０ｍｌ遠心分離チューブに移した。さらに１０〜２０ｍｌの結合バッファー（室温）を培養フラスコに加え、次いで、残りの細胞を回収するため遠心分離チューブに移した。細胞を、４℃にて３５０ｇで１０分間遠心分離した。細胞を室温の溶解バッファー（材料を参照されたい）１５ｍｌ中に再懸濁し、そしてポリトロン手持ち式ホモジナイザーでホモジナイズした（氷上で５〜１０秒間、高の設定で３〜４回）。ホモジネートをオークリッジチューブに移し、そしてベックマン超遠心分離機（Ｔ８６５ローター中）で、４℃にて２５０００ｒｐｍ（４０，０００ｇ）で３０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを最小容量の溶解バッファー（室温）中に再懸濁した。タンパク質濃度を、タンパク質用のブラッドフォード・マイクロアッセイを用いて見積り、そして結合バッファー中で０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。これによって、各放射性リガンドの結合アッセイに用いられることになる膜タンパク質１２．５μｇを加えることが可能となった。

化合物の調製： １〜２ｍｇの化合物Ａ、ＢまたはＣを、１０ｍＭの濃度となるように１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、そして、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて０．４１ｎＭ〜５０μＭの濃度範囲で結合アッセイに化合物を加えることを可能とするよう、結合バッファーで希釈した。２０μｌの［^３Ｈ］化合物Ａ（６２．５μＭ、比放射能１６Ｃｉ／ｍｍｏｌ及び放射活性濃度１ｍＣｉ／ｍｌ）を、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて０．４１〜１００ｎＭの濃度範囲で結合アッセイに放射性リガンドを加えることを可能とするよう、結合バッファーで希釈した。同様な希釈を、［^３Ｈ］標識化合物Ｂ及びＣについて行った。

解離試験： 結合バッファー（２５μｌ）を９６ウェルアッセイプレートのウェルに加え、続いて５０μｌの細胞または細胞膜調製物を加えた。放射性リガンドの結合を可能にするため、［^３Ｈ］化合物Ａ、ＢまたはＣ希釈物（２５μｌ）を指定されたウェルに加えた。アッセイにおける非特異的な放射性標識の結合を測定するため、放射性標識体を加える前に、非標識化合物（［^３Ｈ］化合物濃度の１００倍）を、結合バッファーの代わり
に指定されたウェルに（２５μｌ）加えた。反応混合物は、対の一方に解離を測定するために非放射性標識化合物を加え、そしてもう一方に結合対照として作用させるために結合バッファーを加えることを可能とするため、デュプリケートで用意した。この対照は、ＣＣＲ５または膜／細胞が変性した結果として生じる解離の原因を説明するために用意した。［^３Ｈ］化合物を加えた後、プレートを室温にて１時間インキュベートした。これによって、ＣＣＲ５への放射性リガンドの結合が平衡に達することが可能となった。このインキュベーション後に、非標識化合物の希釈物２５μｌを解離用ウェルに加えた。結合後に室温にて４８時間までインキュベーションした後、ウェルの中身を回収した。

細胞及び膜を回収するために、ユニフィルタープレートを、２５ｍｌのブロッキング剤（室温）（材料を参照されたい）を加えることによって３０分間ブロッキングした。ユニフィルタープレートを５０ｍｌの洗浄バッファー（室温）で一度洗浄し、吸引することによって反応物を回収し、そしてパッカード・ハーベスターにてプレートを洗浄バッファー（室温）で三回洗浄した（１ｍｌ／ウェル）。ユニフィルタープレートを一晩かけて乾燥させた。マイクロシンチ０（５０μｌ−室温）を各ウェルに加え、そして各プレートの上にトップシールカバーを置いた。ＮＸＴ・パッカード・トップカウント・シンチレーションカウンターで、プレートを読み取った（１ウェルにつき１分間）。

材料
増殖培地： ２００ｍＭ Ｌ−グルタミン ５ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：２５０３０−０２４）を含む、ピルビン酸ナトリウム含有、Ｌ−グルタミン非含有、ピリドキシン含有のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ） １ｘ５００ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：２１９６９−０３５）；ペニシリン／ストレプトマイシン ５ｍｌ（ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン １０ｍｇ／ｍｌ） −シグマ（カタログ番号：Ｐ−７５３９）；ウシ胎児血清（ＦＣＳ） ５０ｍｌ −ＰＡＡ・ラボラトリーズ、オーストリア（カタログ番号：Ａ１５−０４２）；及び、５０ｍｇ／ｍｌジェネテシン ６．５ｍｌ −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：１０１３１−０１９）
２２５ｃｍ^２ 組織培養処理細胞培養フラスコ −コースター（カタログ番号：３００１）
Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋非含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） −ギブコ・ＢＲＬ（カタログ番号：１４１９０−０９４）。

細胞計数板、改良ヌーバウアー −ウェーバー・サイエンティフィック・インターナショナル（カタログ番号：ＡＣ１０００）
結合バッファー： 蒸留水中の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ −シグマ（カタログ番号：Ｈ−０７６３）。１ｍＭ ＣａＣｌ_２ −シグマ（カタログ番号：Ｃ−３８８１）。５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２ −シグマ（カタログ番号：Ｍ−１０２８）。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） −シグマ（カタログ番号：Ａ−４５０３）。バッファーはｐＨ７．４（２Ｍ
ＨＣｌ）に調整し、そして０．２μｍのフィルターに通した。

溶解バッファー： 蒸留水中の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ −シグマ（カタログ番号：Ｈ−０７６３）。１ｍＭ ＣａＣｌ_２ −シグマ（カタログ番号：Ｃ−３８８１）。５０ｍｌの溶解バッファーにつきコンプリート^ＴＭプロテアーゼ阻害剤１錠 −ベーリンガー・マンハイム（カタログ番号：１ ６９７ ４９８）。バッファーはｐＨ７．４（２Ｍ塩化水素）に調整し、そして０．２μｍのフィルターに通した。

洗浄バッファー： 蒸留水中の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ −シグマ（カタログ番号：Ｈ−０７６３）。０．５Ｍ ＮａＣｌ −シグマ（５Ｍ溶液 カタログ番号：Ｓ−５１５０）。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） −シグマ（カタログ番号：Ａ−４５０３）。バッファーはｐＨ７．４（２Ｍ ＨＣｌ）に調整し、そして０．２μｍのフィルターに
通した。ストック溶液は１Ｍにて作製され（ＨＥＰＥＳ、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２）、そして室温にて保存され、上記のバッファーは一回毎に新たに調製された。ブロッキング剤：蒸留水中の０．３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ） −シグマ（カタログ番号：Ｐ−３１４３）。

消耗品： ＤＭＳＯ組織培養グレード −シグマ（カタログ番号：Ｄ−２６５０）。ポリプロピレン製ディープウェルブロック（１ｍｌ／ウェル） −ポールベア（カタログ番号：２１９００８）。マルチチャンネルピペット −ラボシステムズ・フィンピペット（カタログ番号：４５１０−０００／０２０／０３０／０４０／０５０）。１ｍｌピペットチップ −シグマ（カタログ番号：Ｐ７１７４）。２５０μｌピペットチップ −シグマ（カタログ番号：Ｐ７０４９）。マルチチャンネルピペット用試薬リザーバー −コースター（カタログ番号：４８７０）。パッカード・フィルトレート・ユニバーサル・ハーベスター（９６ウェルヘッド）。底を密閉されたパッカード・ユニフィルターＧＦ／Ｂ ９６ウェルフィルタープレート −パッカード（カタログ番号：６００５１７７）。マイクロシンチ０ −パッカード（カタログ番号：６０１３６１１）。トップシール−Ａ マイクロプレート貼付用粘着シールフィルム −パッカード（カタログ番号：６００５１８５）。ＮＸＴ・パッカード・トップカウント・シンチレーションカウンター。

結果
図６に示されるように、化合物Ａの５０％は、過剰の非標識化合物Ａとともに９時間インキュベートした後になお結合していた。化合物Ｂの５０％は３時間後になお結合していたが（図７）、化合物Ｃの５０％は１５分後になお結合していた（図８）。
（実施例５：抗ウイルス活性）
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）における化合物の抗ＨＩＶ活性を、これらの細胞をＨＩＶ（分離株Ｂａ−Ｌ）に感染させ、そして５日間インキュベートした後に上清の逆転写酵素（ＲＴ）活性の化合物に依存した低下を測定することによって試験した。

方法
抗ウイルスアッセイに用いたＨＩＶ−１ Ｂａ−Ｌ及びＩＩＩＢウイルスは、ＡＩＤＳ試薬プロジェクト、ＮＩＢＳＣ、ポッターズ・バー、ハーツ、英国から得た（管理用参照品ＡＲＰ１１８及びＡＲＰ１０１）。ウイルスは、−８０℃にて１ｍｌバイアル中に保存した。ＨＩＶ−Ｂａ−Ｌウイルスを増殖させるため、ストック（１ｍｌ）を−８０℃貯蔵庫から取り出して、３７℃のインキュベーターで１０分間、急速に解凍した。ウイルスストック（０．５ｍｌ）を、完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン添加）中の細胞密度１．０ｘ１０^７／ｍｌの新鮮ＰＢＬ（最終濃度１．５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で３日間前刺激したもの）１ｍｌとともに、２４ウェルプレートの標識されたウェルに入れた。感染を可能にするため、２４ウェルプレートを、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて１時間インキュベートした。１時間後に、このプレートから得た細胞及び上清を、２５℃にて２２５ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を捨てた。室温のＲＰＭＩ １６４０増殖培地１０ｍｌ中に細胞を懸濁し、そして２５ｃｍ^２組織培養フラスコに移した。ＩＬ−２を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。感染したＰＢＬ培養物を、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで、３７℃にて３日間、垂直に立ててインキュベートした。第３日に、５ｍｌの新鮮ＲＰＭＩ １６４０増殖培地を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２とともに加えた。

７日後に、感染した細胞を８０ｃｍ^２組織培養フラスコに移した。ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中のＩＬ−２刺激されたＰＢＬ（１．０ｘ１０^７細胞／ｍｌ）７ｍｌをさらに加え、そして加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで、第１０日までインキュ
ベートした。第１０日に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含有する新鮮ＲＰＭＩ １６４０増殖培地（２５ｍｌ）を加え、続いて穏やかに混合した。二つのトップ８０ｃｍ^２組織培養フラスコに、培養物を分けて入れ、そして加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて第１５日までインキュベートした。

ウイルスの増殖を逆転写酵素によって測定し（ＲＴアッセイ）、そしてＲＴアッセイから得られた上清２０μｌにつき４０００ｃｐｍ以上のカウントを、活性であると判断した。感染した培養物を未使用の８０ｃｍ^２組織培養フラスコに分割して入れることによって、細胞をさらに増殖させた後に、１３ｍｌの新鮮なＩＬ−２刺激されたＰＢＬ（１．０ｘ１０^７細胞／ｍｌ）／ｍｌを加えた。フラスコを、加湿された５％ ＣＯ_２雰囲気中で、３７℃にて大１８日までインキュベートした。第１８日に、２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０増殖培地（ＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌ含有）を加えた。培養物を、加湿された５％ＣＯ_２の雰囲気中で、３７℃にて第２３日までインキュベートした。第２３日に上清（２０μｌ）におけるＲＴカウントが５０００ｃｐｍよりも大きければ、ウイルス試料は活性であると判断した。これらの上清を２５℃にて８５０ｇで１０分間遠心分離することによって清澄にし、そして得られた上清を混合し、そして−８０℃にて保存するために４ｍｌ及び１ｍｌのクライオチューブに等分した。

ウイルスの滴定
組織培養感染用量５０（tissue culture infectious dose 50）（ＴＣＩＤ_５０−細胞の５０％を感染させるのに必要であると考えられるウイルス粒子数）を、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈの等式（（１９３８） Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７，４９３−４９７）により、ＨＩＶ Ｂａ−Ｌストック（１９９９年１２月１７日に回収）について（ＨＩＶ感染の陽性マーカーとしてＲＴを用いて）算出した。ＨＩＶ−１ Ｂａ−Ｌ（１９９９年１２月１７日に回収）ウイルスストックの滴定では、この方法を用いて、ＴＣＩＤ_５０ ５．７６ｘ１０^４／ｍｌが得られた。すべての滴定は、新たにプールされたＰＨＡ刺激されたＰＢＬ中で、冷凍−解凍したウイルスストックを用いて行われた。ＰＢＬを調製するために、細胞を２５℃にて５００ｇで１０分間遠心分離することによってペレットにし、１００μｌの細胞を取り出した後に細胞解離溶液（材料を参照されたい）１００μｌ及び０．４％（ｖ／ｖ）トリパンブルー１００μｌを加えることによって、生存度を検査した。生存（非着色）細胞を、コヴァ計数板（材料を参照されたい）でカウントした。＞９５％の生存度を示した細胞懸濁液のみを、アッセイに進めた。生存細胞を、２．０ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度となるように、ＲＰＭＩ増殖培地（ＰＢＬ培養のために１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２を加えた）中に再懸濁した。増殖させた冷凍ＨＩＶ Ｂａ−Ｌストック（２ｘ１ｍｌ）を、３７℃インキュベーターで１０分間急速に解凍した。一方の試料は滴定評価に進められ、もう一方の試料は抗ウイルス試験に、並行して進めた。

適定のために、解凍して増殖させたウイルスストック２５μｌを、ＲＰＭＩ増殖培地中で８ｘ０．５対数系列希釈を行った。各ウイルス希釈物（２０μｌ）を、１８０μｌのＰＢＬとともに９６ウェルアッセイプレートに移した。アッセイプレートを、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の雰囲気中で３７℃にて５日間インキュベートし、その後、ＴＣＩＤ_５０の測定を可能とするために、上清の１００μｌを回収しそしてＲＴ活性を試験した。滴定されたウイルスは、ＲＴカウントが非感染の細胞カウントよりも大きかった（標準偏差の２倍より大きかった）場合に、ウイルス感染力に関して陽性であると判断した。ウイルスの力価を、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（（１９３８） Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７，４９３−４９７）によって報告された方法を用いて算出した。これにより、抗ウイルスアッセイ及びそれに続く化合物の抗ウイルス力価試験に対するウイルスの投入量を標準化することが可能となる。

単球含有ＰＢＬ培養物の調製
北ロンドン輸血センターより、ＨＩＶ及びＨＢＶ血清陰性ドナーから得られた、単一ドナーのＰＢＬ含有バフィーコートを供給された。血清学的性状は、北ロンドン輸血センターサービスにより測定された。ＰＢＬを、個々に分けそして培養増殖させた四つのバフィーコート試料から調製した。四つのバフィーコート（５０ｍｌ）のそれぞれを、等量の無菌リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）とともに、８０ｃｍ^２組織培養フラスコに移した。細胞懸濁液のアリコット（２５ｍｌ）を、別の５０ｍｌ遠心分離チューブ中のフィコール−パック２５ｍｌの上に静かに重ねた。２５℃にて１０００ｇで３０分間遠心分離した後、赤血球層と血漿層の間から、ピペット操作によってＰＢＬ層を取り出した。分離したＰＢＬを未使用の遠心分離チューブに移し、そして、ＰＢＳ（４℃）及び４℃にて８５０ｇで１０分間遠心分離することで、二度洗浄した。混入した赤血球は、９ｍｌの無菌水を、ｘ１０ハンクス緩衝塩類溶液（材料を参照されたい）とともにＰＢＬペレットに加えることによって除去した。ＰＢＳ（４℃）を、最終容量４５ｍｌとなるように加えた。ＰＢＬを、４℃にて５００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、３０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０増殖培地（室温）中に懸濁した。

細胞の生存度を上記のように検査し、そして＞９５％の生存度を示した細胞懸濁液のみを、抗ウイルスアッセイへと進めた。細胞懸濁液を、１．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを添加されたＲＰＭＩ １６４０増殖培地を加えることによって、１ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度となるように調整した。抗ウイルスアッセイの準備として、細胞（５０ｍｌ）を８０ｃｍ^２組織培養に移し、加湿された５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）インキュベーターで３７℃にて３日間インキュベートした。

単球非含有ＰＢＬの分離及び増殖
ＰＢＬを調製し、上記のトリパンブルー染色により生存度を試験した。＞９５％の生存度であったＰＢＬ調製物を、８０ｃｍ^２培養フラスコに、総容量５０ｍｌ及び細胞密度１ｘ１０^６／ｍｌとなるように移した。単球のフラスコ表面への接着を促進させるため、フラスコを、加湿された５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）インキュベーターで、３７℃にて１時間インキュベートした。非接着ＰＢＬを、５０ｍｌ遠心分離チューブに注意深くデカントし、そして２５℃にて５００ｇで１０分間遠心分離することによりペレットにした。ＰＢＬペレットを、１．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを含有する新鮮ＲＰＭＩ １６４０増殖培地を加えることによって、１ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度となるように調整した。抗ウイルスアッセイの準備として、細胞（５０ｍｌ）を８０ｃｍ^２組織培養に移し、加湿された５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）インキュベーターで３７℃にて３日間インキュベートした。

ＰＢＬ（単球含有または非含有）における抗ウイルスアッセイ
ＰＨＡ刺激された細胞培養物を、穏やかに振盪することによって分散させ、そして５０ｍｌ無菌遠心分離チューブに移した。細胞を、２５℃にて５００ｇで１０分間遠心分離することによってペレットにし、そして５０ｍｌのＲＰＭＩ増殖培地中に再懸濁した。細胞生存度を、前述同様に検査した。＞９５％の生存度を示した細胞懸濁液のみを、抗ウイルスアッセイへと進めた。細胞を感染させるために、力価の分かっている増殖させたＢａ−Ｌストックを、１．０ｘ１０^６細胞につきストック２５０μｌの割合でＰＢＬ細胞ペレットに加えて、ＴＣＩＤ_５０は５．７６ｘ１０^４／ｍｌ、続いて１．０ｘ１０^６細胞につき１２５μｌのＲＰＭＩ増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２含有）を加えた。次いで、細胞を、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて１時間インキュベートし、続いて２５℃にて５００gで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＲＰＭＩ増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２含有）中に、２．０ｘ１０^５／ｍｌの密度で再懸濁した。感染した細胞懸濁液の１．８ｍｌのアリコットを、２００μｌの化合物を含有する２４ウェルアッセイプレートに移した。アッセイプレートにおける化合物の最終濃度範囲は、０〜１００ｎＭ（０．１％ＤＭＳＯ）であった。アッセイプレートを、加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターに、３７℃にて５日間入れた。

非感染ＰＢＬ対照は、抗ＨＩＶ阻害剤ＲＡＮＴＥＳを含有する陽性対照とともに、０〜１００ｎＭ及び０〜３３ｎＭの濃度範囲で、並行して処理した。５日間インキュベートした後、逆転写酵素活性によるウイルス収率の定量および続く化合物の抗ウイルス力価の測定のために、各ウェルから得られた上清２００μｌを９６ウェルプレートに移した。

逆転写酵素アッセイ
ＨＩＶ感染細胞培養物におけるＲＴ活性の直接測定によるウイルス収率の定量を、アマシャムのシンチレーションプロキシミティアッセイキット（材料を参照されたい）を用いて行った。ＲＴ活性は、ＳＰＡビーズの表面に連結したビオチン標識ＤＮＡプライマーへの［^３Ｈ］ＴＴＰの取り込みをモニターすることによってアッセイされた。ＲＴアッセイのための試薬容量は、行われる予定のアッセイ数によって決まった。１００のアッセイを可能とするために、１ｍｌの［^３Ｈ］ＴＴＰストック（３７００ＫＢｑ）を２ｍｌのアッセイキットバッファー中に希釈し、そして無菌水５ｍｌ及びアッセイキットからのＳＰＡビーズ１ｍｌとともに、８０ｃｍ^２培養フラスコに移した。この溶液を完全に混合し、そして８０μｌのアリコットをＲＴ反応プレートの各ウェルに加えた後、続いてＨＩＶ感染ＰＢＬの上清２０μｌを加えた。反応プレートを密封し、そして３７℃インキュベーターに１時間入れた。

ＲＴ反応を止めるために、アッセイキットの停止バッファー（２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８）を１００μｌ加えた。プレートを、４℃にて２５０ｇで１０分間遠心分離した。ビーズの定着を可能にするため、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて２０分間インキュベーションした後、１４５０マイクロベータ液体シンチレーションカウンターを用いて、各ウェルにつき６０秒間にわたってシンチレーションを測定した。非感染対照試料のバックグラウンドカウントを、感染試料のカウントから差し引いた。

上清のＲＴレベルがアッセイに関して線形性の範囲内にあることを確認するため、ＨＩＶ感染細胞試料と並行して精製組換えＲＴ試料について行うことにより、ＲＴ活性に対する検量線を作成した。ＲＴ検量線用に、組換え逆転写酵素ストック（１０Ｕ／μｌ−材料を参照されたい）２０μｌを解凍し、そして４℃の完全ＲＰＭＩ １６４０培地９９８０μｌで希釈した。酵素は、検量線用に４℃の完全ＲＰＭＩ １６４０培地中の系列希釈物（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１及び０．１５ｍＵ／μｌ）を作製するのに使用するまで、−２０℃にて保存した。各酵素希釈物（２０μｌ）は、ＲＴアッセイにおいてデュプリケートで資料採取した。

細胞毒性アッセイ
ＰＢＬ中の化合物の潜在的な非特異的細胞毒性について、見かけの抗ウイルス活性の考えられる原因として検討した。アッセイを、プロメガの比色定量分析細胞増殖キット（材料を参照されたい）を用いて、９６ウェル形式で行った。このアッセイでは、電子カップリング（electron-coupling）試薬であるフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を併用すると、テトラゾリウム化合物である３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）が、生細胞中のデヒドロゲナーゼ活性によって低減し、ホルマザンが生成される。４９２ｎｍにおけるホルマザンの吸光度は、培養物中の生細胞の密度と直接的に比例する。このアッセイを、抗ウイルスアッセイにおいて使用されたＰＢＬと並行して、別に培養された非感染ＰＢＬにおいて行った。ＰＢＬを、ＨＩＶ感染させる前に、抗ウイルスアッセイに関して記載したように細胞毒性アッセイ用に調製した。ＰＢＬを、最終密度２ｘ１０^５細胞／ｍｌとなるように新鮮培地中に懸濁した。２０μｌの化合物に加えて、細胞懸濁液（１８０μｌ）を９６ウェルプレートに移し、ｉｎ ｓｉｔｕにおける最終濃度範囲を０〜１０μＭ（０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）とした。アッセイプレー
トを、加湿された５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）インキュベーターで、３７℃にて５日間インキュベートした。このインキュベーション後に、細胞毒性アッセイキットからのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物４０μｌを各ウェルに加え、そして３７℃の加湿された５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターで、暗所にて３日間インキュベートした。次いで、プレートを手で揺すり、そして、４９２ｎｍにおける吸光度を分光光度的に測定して、細胞の生存度及び化合物の非特異的細胞毒性を評価した。

データ解析
ＲＴ活性またはｐ２４レベルの低減の（化合物なしの対照との相対的な）百分率を化合物の濃度（対数目盛り）に対してグラフにプロットすることによって、抗ウイルス活性を決定した。ＩＣ_５０値及びＩＣ_９０値を、各濃度におけるデュプリケートのデータポイントに対して、マイクロソフトエクセルの近似曲線オプションを用いて決定した。独立して調製された化合物の試験濃度範囲に対するＩＣ_５０値及びＩＣ_９０値を決定し、そして、標準ソフトウエアパッケージを用いて幾何平均を算出した。これらの実験を、異なるＰＢＬ細胞調製物で独立して繰り返し、そしてＩＣ_５０値及びＩＣ_９０値の全体幾何平均を、９５％信頼区間とともに算出した。同じ解析を、抗ウイルスの基準であるＲＡＮＴＥＳについて行った。化合物またはＲＡＮＴＥＳの濃度範囲外に脱落した個々のＩＣ_５０値及びＩＣ_９０値は、幾何平均ＩＣ_５０及びＩＣ_９０のさらなる算出には含めなかった。

材料
ＨＩＶ−１ Ｂａ−Ｌ株： 細胞を含まない上清を、ＡＩＤＳ試薬プロジェクト（ＮＩＢＳＣ、ポッターズ・バー、ハーツ、英国）から得た。

ＲＡＮＴＥＳ： Ｒ＆Ｄシステムズから得た（カタログ番号 ２７８−ＲＮ−０１０または２７８−ＲＮ−０５０）。
細胞解離溶液： （シグマ、１ｘ濃度、Ｃ５７８９ ロット５９Ｈ０８９０）
細胞培地： ＲＰＭＩ培地をシグマから（カタログ番号：ＲＯ８８３）、Ｌ−グルタミンをライフ・テクノロジーズから（カタログ番号：２５０３０−０２４）、ＰＢＬ細胞用のＦＣＳをシグマから(カタログ番号：Ｆ２５２４ バッチ７７Ｈ３３９９）、ペニシリン及びストレプトマイシンをライフ・テクノロジーズから（カタログ番号 １５１４０−１２３）得た。

ＰＢＬ培地用添加物： 無菌水中に１ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁され、そして最終濃度１．５μｇ／ｍｌで用いられたＰＨＡ、ミューレックス −アボット・ラボラトリーズ（カタログ番号：ＨＡ１６）。０．１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加４ｍＭ塩酸に溶解して２μｇ／ｍｌ（およそ６０００Ｕ／ｍｌ）とし、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで用いられたヒト組換えＩＬ−２。 −Ｒ＆Ｄシステムズ（カタログ番号：２０２−ＩＬ−０５０）
ＰＢＬ分離試薬： 北ロンドン輸血センター（コリンデール・センター）より供給されたバフィーコート、ファルマシア・バイオテックからのフィコール−パック溶液（カタログ番号：１７−０８４０−０２）、シグマからのＰＢＳ（カタログ番号：Ｄ８５３７）、シグマからの無菌蒸留水（カタログ番号：Ｗ−３５００）
逆転写酵素アッセイキット： アマシャム・ライフ・サイエンスからのＱｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイ系（カタログ番号：ＴＲＫ １０２２）。アマシャムから２００Ｕ（１０Ｕ／μｌ）として供給された組換えＨＩＶ逆転写酵素（カタログ番号：Ｔ３６１０Ｙ）
細胞毒性アッセイキット： セルタイター９６（登録商標） ＡＱ_{ｕｅｏｕｓ}非放射活性アッセイ −プロメガ（カタログ番号：Ｇ５４３０）
消耗品： ２４ウェル無菌平底ファルコンプレート −ベクトン・ディッキンソン（カタログ番号：３０４７）。９６ウェル無菌平底ファルコンプレート −ベクトン・ディッキンソン（カタログ番号：３０７２）。ウェルにつき容量２ｍｌのポリプロピレン製無菌９６スクエアウェルプレート（ベックマン・コールター、カタログ番号６０９６８１
）。細胞計数板 −コヴァ・バイオスタット・ダイアグノスティックス（カタログ番号：８８７１４４）。

結果
抗ウイルスアッセイにおいて、化合物Ｄは１ｎＭのＩＣ_９０を、化合物Ａ及び化合物Ｂは約２ｎＭの抗ウイルスアッセイにおけるＩＣ_９０を有するが、一方、化合物Ｃは＞１００ｎＭの抗ウイルスアッセイにおける力価を有する。

結論
化合物Ａ〜Ｄが、ＣＣＲ５に対して非常によく似た結合親和性を有するにもかかわらず、抗ウイルス効果は、解離速度の遅いリガンドまたはＣＣＲ５上での滞留時間が長いリガンドに対して顕著に向上する。したがって、リガンドのＣＣＲ５上での滞留時間は、機能的活性、この場合は抗ウイルス活性、に対するリガンドの力価の予測因子として用いられてもよく、そして抗ウイルス剤としてのリガンドの臨床的有効性を予測する。
（実施例６：ＨＩＶ感染患者における、化合物Ａを用いた短期の単剤治療のウイルス量に対する効果）
ウイルスを直接的に標的とする標準的な抗レトロウイルス剤に関して、（血漿中ウイルス量の減少によって測定されるような）抗ウイルス効果と血漿中薬物濃度との間に直接的な関連がある。したがって、見込みのある臨床有効用量範囲は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルスデータ、すなわちＩＣ_５０及びＩＣ_９０に基づいて選択されることが可能である。しかしながら、このアプローチに対しては、ＣＣＲ５受容体の飽和度のほうがより優れた有効性の予知因子である可能性があり、そして血漿中薬物濃度と直接的に相関しない可能性があるとの議論もなされ得る。

健常ボランティア試験から得られたデータにより、薬物濃度が抗ウイルスＩＣ_９０をはるかに下回って急速に落ちる２５ｍｇの用量においてさえも、投与後２４時間よりも長い間、基本的には受容体の完全な飽和が、達せられることが示された。したがって、本試験の論理的根拠は、とりわけ、ＣＣＲ５受容体の飽和度がｉｎ ｖｉｖｏにおける抗ウイルス効果と関連するかどうかを決定することであった。

方法
ＣＤ４ Ｔ細胞カウントが＞２５０細胞／ｍｍ^３でありそして血漿中ウイルス量が＞５０００コピー／ｍｌの、無症候性ＨＩＶ血清陽性の男性被験者２４名に、化合物Ａ ２５ｍｇを１日１回、１００ｍｇを１日２回、またはプラセボを、１０日間投与した。主な除外基準は、肝酵素異常、ＣＤ４ Ｔ細胞カウント ＜２５０細胞／ｍｍ^３、ウイルス量 ＜５０００コピー／ｍｌ、及びＣＸＣＲ４または両指向性ＨＩＶの存在であった。

受容体の飽和度
受容体の飽和度を、上述のＣＣＲ５／ＭＩＰ−１βのインターナリゼーションアッセイを用いて、以下の時点において評価した：
第１日：０（朝の投与前）及び投与後４時間
第５日：朝の投与前
第１０日：投与前及び投与後１２時間
第１１、１２、１３、１５、１９及び４０日
ウイルス量
標準として、検出下限値が４００コピー／ｍｌのＲＴ−ＰＣＲ（ロシュ、アンプリコア
ｖ１．５）アッセイを用いて、ウイルス量を測定した。測定値が＜４００コピー／ｍｌの試料に対しては、検出下限値が５０コピー／ｍｌの超高感度の方法を用いた。試料は、以下の時点において採取した：
第１日：０（朝の投与前）及び投与後４、１２及び１８時間
第２〜１０日：０（朝の投与前）
第１１、１２、１３、１５、１９、２２、２５及び４０日
結果
１００ｍｇを１日２回投与された患者におけるＣＣＲ５受容体の平均飽和度は、投与期間を通じて９０％を超えたが、２５ｍｇを１日１回投与された被験者においては、平均受容体飽和度は、第１０日の投与前（定常状態）までに、＜８０％に落ちた。投与群毎の経時的な（初回投与後時間の）受容体飽和度を、図９に示す。

１００ｍｇの化合物Ａを１日２回投与された８人の患者のうち７人で、ウイルス量が＞１ｌｏｇ_１０減少する、良好なウイルス量の反応が示された。この群における、ベースラインから第１１日までに減少したウイルス量の平均は、１．２００ｌｏｇ_１０であった。１００ｍｇ １日２回投与群の一名の被験者では、ウイルス侵入の共受容体としてＣＣＲ５及び／またはＣＸＣＲ４を用いたウイルスの共存が第１日に示され、化合物Ａに反応しなかった。この個体が解析から除外されるならば、１００ｍｇ群におけるウイルス量の減少は１．４１９ｌｏｇ_１０である。２５ｍｇ １日１回投与群では、ウイルス量の平均低減は０．４２５ｌｏｇ_１０であることが示された（表２）。投与終了後（第１１日以降）に、ウイルス量は時間とともにベースラインへ戻り、そして第４０日までにほとんどの患者ではベースラインに戻っていた。

結論
１００ｍｇを１日２回投与された患者におけるＣＣＲ５受容体の平均飽和度は、投与期間を通じて９０％を超えたが、２５ｍｇを１日１回投与された被験者では、第１０日の投与前までに、平均受容体飽和度は＜８０％に落ちた。１００ｍｇを１日２回投与された被験者では、ベースラインから第１１日までのウイルス量の平均減少が１．２００ｌｏｇ_１０であり、そして２５ｍｇを１日１回投与された被験者では、反応の証拠があった。

臨床データは、化合物Ａが、短期の単剤療法として投与された場合に強力な抗ウイルス効果を示したことを示しており、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるデータ及びその臨床有効性の予測をサポートする。

上記に示された実施例から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＣＲ５の滞留時間または占有時間は、ｉｎ ｖｉｖｏでの受容体の占有と関連する可能性がある。さらに重要なことには、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受容体の占有により同定されたリガンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方においてウイルス量の有意な減少を示す。このように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であると予測されるリガンドを同定するのに、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おけるリガンドのその受容体上での占有の測定値を用いてもよい。

ＨＩＶのシナリオにおいてこの理論が試験されそして証明されたが、一方で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける受容体の占有から推定されるリガンドの臨床有効性を予測することを、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、喘息、肺気腫、鼻炎及び慢性副鼻腔炎を含む呼吸器障害を含む、他のＣＣＲ５を介した医学的適応症に広げてもよいことが認識されるであろう。

ＣＣＲ５またはＣＣＲ５ケモカインとの関連性が確立された他の状態には、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、限定するわけではないが特に、心臓、肺、肝臓、腎臓及び膵臓移植などの固形臓器移植（例えば、腎臓及び肺の同種移植）に対する移植片拒絶、子宮内膜症、Ｉ型糖尿病、糸球体疾患などの腎疾患、肝臓、肺及び腎線維症などの線維症、慢性膵炎、炎症性肺疾患、ＨＩＶ脳炎などの脳炎、慢性心不全、乾癬、脳卒中、肥満、ＡＩＤＳ関連痴呆及びアルツハイマー病などの中枢神経系疾患、貧血、粥状硬化プラーク、アトピー性皮膚炎、慢性膵炎、非ホジキンリンパ腫、カポージ肉腫、黒色腫及び乳癌などの癌、ならびに、侵害受容性疼痛及び神経障害性疼痛（例えば、末梢神経性疼痛）などの疼痛が含まれる。

ＣＣＲ５受容体の調節と関係する感染症には、急性及び慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＨＣＶ感染、腺ペスト、敗血性ペスト及び肺ペスト、天然痘などのポックスウイルス感染症、トキソプラズマ感染症、ミコバクテリア感染症、シャーガス病などのトリパノソーマ感染症、肺炎、ならびにサイトスポリジウム感染症が含まれる。

図１は、ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５の３００．１９細胞中へのインターナリゼーション及び種々の濃度の化合物Ｂによるインターナリゼーション阻害のＦＡＣＳ蛍光を重ねたものを示す：化合物を除去していない（Ａ）、洗浄による化合物除去後（Ｂ）、ならびに、除去及び１．５時間の回転インキュベーション後（Ｃ）。ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションによる蛍光シフトは、トレースＤによって示され、そしてビヒクル対照（化合物またはＲＡＮＴＥＳなし、すなわち全ＣＣＲ５）は、トレースＥによって示される。アイソタイプ対照はトレースＦによって示される。 図２は、ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５の３００．１９細胞中へのインターナリゼーション及び種々の濃度の化合物Ｃによるインターナリゼーションの阻害に対する、ＦＡＣＳ蛍光のオーバーレイを示す：化合物を除去していない（Ａ）、洗浄による化合物除去後（Ｂ）、ならびに、除去及び１．５時間の回転インキュベーション後（Ｃ）。ＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションによる蛍光シフトは、トレースＤによって示され、そしてビヒクル対照（化合物またはＲＡＮＴＥＳなし、すなわち全ＣＣＲ５）は、トレースＥによって示される。アイソタイプ対照はトレースＦによって示される。 図３は、インキュベーション後に洗浄工程が続く場合（＋ｗａｓｈ）、または化合物非存在下での１．５時間のインキュベーションが続く場合（＋ｃｈａｓｅ）における、化合物Ｂ、Ｃ及びＤによるＲＡＮＴＥＳを介したＣＣＲ５のインターナリゼーションの相対的な阻害（ビヒクル対照に対する％）を示すグラフである。 図４は、プラセボまたは化合物Ａ １００ｍｇ、２５ｍｇ、及び、３ｍｇまたは１０ｍｇの経口用量を単回で、溶液としてそれぞれ投与されたコホート１、４及び６の被験者における、第１日のＣＤ４ Ｔ細胞上での平均ＣＣＲ５占有率％を示すグラフである； 図５は、プラセボまたは化合物Ａ １００ｍｇ、２５ｍｇ、及び、３ｍｇまたは１０ｍｇの経口用量を１日２回、溶液としてそれぞれ第３〜１２日に投与されたコホート１、４及び６の被験者における、第１２日のＣＤ４ Ｔ細胞上での平均ＣＣＲ５占有率％を示すグラフである； 図６は、化合物Ａの解離曲線である； 図７は、化合物Ｂの解離曲線である； 図８は、化合物Ｃの解離曲線である； 図９は、化合物Ａ ２５ｍｇ、１００ｍｇまたはプラセボを投与された、無症候性ＨＩＶ血清陽性の男性被験者における、経時的なＣＣＲ５受容体の飽和度を示すグラフである。

Claims (21)

1. 受容体の本来の機能の調節に応答する疾患の治療においてｉｎ ｖｉｖｏで有効であると予測される、その受容体に対するリガンドを同定する目的で、リガンドのその受容体上での受容体滞留時間をｉｎ ｖｉｔｒｏにて測定するアッセイの使用。
2. 滞留時間が少なくとも１時間である、請求項１に記載の使用。
3. 滞留時間が少なくとも３時間である、請求項１に記載の使用。
4. 滞留時間が少なくとも６時間である、請求項１に記載の使用。
5. 滞留時間が少なくとも９時間である、請求項１に記載の使用。
6. 受容体がＣＣＲ５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. リガンドがＣＣＲ５アンタゴニストである、請求項６に記載の使用。
8. 疾患がウイルスによる感染である、請求項６または請求項７に記載の使用。
9. ウイルスがＨＩＶである、請求項８に記載の使用。
10. 受容体に対する多数のリガンドのそれぞれの受容体滞留時間を測定することを含む研究方法であって、そして、滞留時間が少なくとも一つの他のリガンドの滞留時間よりも長い少なくとも一つのリガンドをさらなる研究のために選択することを含む研究方法。
11. 与えられた受容体に対する多数のリガンドをその受容体と接触させ、各リガンドの受容体結合親和性及び受容体滞留時間を測定し、その測定された結合親和性及びその受容体滞留時間の産物であるランク値を各リガンドに割り当て、そして選ばれた切り捨てランク値よりも大きなランク値を有する１またはそれより多くのリガンドをさらなる研究のために選択する、ことを含む研究方法。
12. 受容体の本来の機能の調節に応答する疾患に対して高い効力及び／または臨床有効性を有するリガンドを同定する方法であって、リガンドの受容体上での滞留時間を測定しそして所望の滞留時間に基づいてリガンドを選択することを含む方法。
13. 滞留時間が少なくとも１時間である、請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
14. 滞留時間が少なくとも３時間である、請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
15. 滞留時間が少なくとも６時間である、請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
16. 滞留時間が少なくとも９時間である、請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
17. 受容体がＣＣＲ５である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. リガンドがＣＣＲ５アンタゴニストである、請求項１７に記載の方法。
19. 臨床有効性が抗ウイルス活性である、請求項１２に記載の方法。
20. 抗ウイルス活性が抗ＨＩＶ活性である、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法により選択されるリガンド。

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