JP2005532059A - ホログラフィックセンサーを用いた微生物の検出 - Google Patents

Abstract

細胞の検出方法であって、
センサーを含む装置中に細胞を固定すること、及び、増殖培地を導入すること、及び、上記センサーの光学特性の変化を検出することを含み、
上記センサーは細胞増殖産物に対して感受性がある
ことを特徴とする方法。
本発明に使用するのに適切な装置は、センサー並びに試料及び増殖培地の入口を含むチャンバーを有し、かつ、チャンバー内又は装置内の他の箇所に抗体を固定する手段を含んでいて流体とセンサーが接触している。

Description

本発明は、例えばホログラフィックセンサーを用いることによる、細胞の検出に関する。

細胞、特に病原性細胞の迅速な識別は、診断学及び生体防御において極めて重要である。この過程において補助的に使用できる競合技術としてはＥＬＩＳＡやＰＣＲ等数多くあるが、微生物病原体の最終的な識別には依然として時間がかかり、実験によって実施するものである。

炭疽菌等の病原体を検出するためには、ＥＬＩＳＡキットを使用できる。このキットは対象生物に対する特異性が高く、近縁のバチルス属との交差反応を示さない。しかしながら、このキットはそれほど感度が高くない、というのは、偽陰性反応を防ぐために１０，０００個単位の細胞を要するのである。この量は、炭疽菌等の微生物の人間への感染量を超える。

ＰＣＲ法によって、疾患を引き起こす病原体を短時間で迅速に正確に識別できる。しかしながら、この方法は残念ながら周囲からの混入に対しても感度が高いため、多くの場合に試料の前処理が必要となる。また、この方法には費用がかかり、熟練を要する。

上記方法はどちらも、伝統的な微生物学的技術とは容易に適合しない。これらの方法は、多量の純粋な試料中の微生物を同定するために使用してよい場合があるが、細胞を培養して従来の微生物学的技術で識別する研究アッセイには直接的に容易に匹敵するものではない。また、生細胞を捕獲して最終的に識別する手段として使用することもできない。

ホログラフィックセンサーは、様々な検体を検出するために使用できる。特許文献１には、体積ホログラムを基盤とするホログラフィックセンサーが開示されている。このセンサーは、その全体に光変換構造を有する検体感受性マトリックスを含む。この変換構造の物理的配列のために、上記センサーが発する光信号は、検体と相互作用又は反応した結果起こる検体感受性マトリックス中での体積変化又は構造配列変化に対して非常に感度が高い。
ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９５２６４９９

本発明の要約
本発明のある態様は、光学センサーを含む装置中に細胞を固定すること、及び、増殖培地を導入することを含む細胞の検出方法である。上記センサーは、細胞増殖産物に対して感受性があり、上記センサーの光学特性の変化を検出する。細胞は抗体を使用して固定されていることが好ましい。

本発明の別の態様は、本発明の方法に使用するのに適切な装置であって、センサー及び増殖培地及び試料入口を含むチャンバーを有し、かつ、チャンバー内又は装置内の他の箇所に抗体を固定する手段を任意に含んでいて流体とセンサーが接触している装置である。上記装置は、緩衝溶液、及び、チャンバーの試料入口に連結する出口を有する容器を含むことが好ましい。抗体は、チャンバーの壁又は磁気粒子に固定してよい。

本発明によれば、ＥＬＩＳＡ法と同程度の特異性で、対象生物を迅速かつ正確に識別できる。検出は、広い範囲の条件下、例えば感染濃度において実施できる。本発明の装置は、操作が簡単である可能性があり、かつ、標準的な研究技術に適合する可能性がある。本発明の装置をＰＣＲ法と直接適合させることによって、実験による診断方法との統合が十分可能である。

好ましい実施形態の記載
細胞は、増殖培地を使用してチャンバー内で保持でき、試料が混合物でない場合には特に良好に保持できる。細胞は、適切な手段によって、例えば抗体等の剤を使用して、固定してよい。その後、所定の微生物増殖培地の範囲内で、かつ、ホログラフィックセンサーの存在下で、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて細胞を培養してよい。発芽の際に増殖培地中に放出される産物についても検出できる。微生物胞子の発芽及びその後の増殖には、一般的に、特定の栄養素及び二価イオンの存在、並びに、特定範囲のｐＨが要求される。発芽に必要な条件は、増殖に必要な条件とは異なる可能性がある。

捕獲の際、細胞活性を監視することによって検出できる。センサーは、光学的に観察できるという意味で、「光学的」なものである。一般的に、センサーはホログラフィックセンサーである。ホログラフィックセンサーは、生分解性酵素等の種、又は、ｐＨ及び酸化還元電位の非常に小さな変化を検出するために使用できる。例えば、ｐＨ感受性ホログラフィック素子を使用することによって酸性の種を検出できる。ｐＨが変化すると、ホログラフィック素子が拡大又は縮小して、その結果として反射波長の色が変化する。使用されるセンサーは、ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９５２６４９９又はＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９９６３４０８に記載される型のもの（その内容は、参照として本明細書中に組み込まれている）であってよい。

本発明の方法は、生物戦に使用される大腸菌、カンピロバクター菌及び生物テロに使用される対象である病原体（例えば）、並びに、環境上及び医学的な監視対象である病原体（例えばレジオネラ菌及びサルモネラ菌）を検出するために使用できる。上記以外で検出できる可能性のある微生物には、リステリア菌、並びに、（例えば炭疽菌、バチルス・チューリンゲンシス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｇｉｉ、バチルス・メガテリウム及び枯草菌等の）バチルス属の微生物が含まれる。

完全な細胞を検出した例としては、レジオネラ病（レジオネラ症）及びポンティアック熱に関与する微生物であるレジオネラ・ニューモフィアが挙げられる。レジオネラ・ニューモフィア血清群１は、人間の疾患に影響を与えることが非常に多く、通常水性環境中に見られる。この微生物は、日常の水処理によってほとんど残存できず、暖かくよどんだ水の中で多く増殖する。この微生物は、適切なモノクローナル抗体で固定できる。例えば、熱耐性レジオネラ・ニューモフィア血清群１のリポ多糖抗原を認識するＩｇＧ３クラス精製マウスモノクローナル抗体が市販されている。

その後、固定した細胞を培養して、代謝産物を検出する。１つの方法としてはｐＨ感受性ホログラムの使用が挙げられる；レジオネラ・ニューモフィアは馬尿酸を加水分解して安息香酸を生成し、ホログラムの拡大及び色の変化を引き起こす。同様の方法を、ペニシリンを加水分解する生物の能力を検出するために使用できる。更にペニシリンが生成しても、レジオネラ・ニューモフィア固有のβ−ラクタマーゼによって加水分解されるであろう。そして、結果として生じるペニシロ酸は、ｐＨ感受性ホログラムを使用することによって検出できる。別の方法としては、レジオネラ・ニューモフィアが内因性の酸化活性を有していて適切な基質から過酸化水素を生成する、という事実を利用した方法もある。過酸化水素はヨウ素と反応してヨウ化物イオンを生成する。生成したヨウ化物イオンが銀と反応してヨウ化銀が生成することから、銀粒子を含むホログラフィックセンサーはヨウ素の存在下で過酸化水素を検出するために使用できる。ホログラムは、この機構により、添加された過酸化水素及び酵素的に生成した過酸化水素に対して反応できる。

上述するように、ｐＨセンサーを使用してもよい。これによって、栄養源、例えば微生物中の炭水化物の利用に関与するｐＨ変化を検出できる。

デンプンを基盤とするホログラフィックセンサーを、増殖産物としてアミラーゼを生成する細胞を検出するために使用してよい。というのは、アミラーゼはデンプンの分解を引き起こすからである。バチルス属は増殖中に比較的多量のアミラーゼを産生するという特徴があるため、デンプンを基盤とするセンサーは特に適切である。

本発明は、胞子の検出、及び、その発芽の監視に特に適切である。

例えば、バチルス属の胞子は一般的に、発芽中にＣａ^２＋を（例えばジプリコリン酸（ｄｉｐｌｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）塩として）放出する。カルシウムイオンはポリＨＥＭＡ−ポリＭＩＤＡホログラフィック支持媒体に結合し、媒体の濃縮及び再生波長のシフトを引き起こす。このような支持媒体を使用することによって、バチルス胞子の発芽を検出できる。

また、胞子プロテアーゼ活性を監視することによって発芽を検出することもできる。胞子の細胞壁は一般的にペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の厚い層を含み、この層は特異的な内因性酵素の活性化によって分解できる。適切なペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｎｏｇｌｙｃａｎ）マトリックスをホログラフィックセンサー中に組み込むことによって、これらの酵素を検出できる。

本発明の装置は、試験試料を入れる入口（蓋が押し上げ式になった穴等）を含む。試料は、入口又はその近傍に配置できる綿球の中に又はこの綿球に付着させてよい。流体は綿球を通り、ここで試料を集めて増殖チャンバー内へ運搬するであろう。試料は、流体（例えば緩衝溶液）によって、センサー（好ましくは、増殖培地を添加する前に生物を捕獲する固定剤（例えば抗体））を含む増殖チャンバーに運搬されることが好ましい。また、細胞は、適切なフィルターを使用して固定してもよい。抗体は、チャンバーの１つ以上の壁に、又は、増殖チャンバー上流の磁気粒子上に固定してよい。必要であれば、上記粒子は装置中の磁石を使用してチャンバーに運搬してよい。また、（細胞とセンサーが共に流体と接触していれば、すなわち、細胞産物が流れてセンサーと接触できれば）細胞はセンサー上流に固定してもよい。その後、増殖培地を装置内に供給して、センサーを観察することによって、特異的に結合している生物の増殖を検出できる。ホログラム特性の変化は、例えばＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９５２６４９９に記載されるように、任意の適切な装置を使用することによって観察できる。

本発明の装置は、細胞捕獲チャンバーを複数含むことが好ましい。試験試料を基本増殖培地と混合してよく、これを、乾燥した炭素源及び窒素源並びにホログラフィックセンサーをそれぞれ含む発酵ウェル中に添加することが可能である。磁気粒子を使用する場合、細胞をそれぞれ磁気帯で逆行させることによって、試験生物が固定された粒子を捕獲することが好ましい。上記装置は、増殖チャンバーの下流に、不要な過剰量の試料を回収するためのウェルを更に含む。

本発明の装置の実施形態を、図６及び図７を参照して例示によって記載する。図６は上記装置の透視図で、入口２を有するユニットの中に挿入でき、流体アレイ３を含む構成部分上に配置した綿球１を示す。使用する際、綿球に集めた試料は、ポンプ（図示せず）操作により、流体管で連結した１つ以上の増殖チャンバーを含む流体アレイ３へ運搬できる。

上記装置は、光学読み取り器中に直接挿入できるように設計されている；図７は、読み取り器４中に挿入した図６の装置を示す。流体アレイは読み取り器本体中に露出しており、このため、１種以上の測定（例えばホログラフィーの再生波長）を実施できる。

本発明を、付随する図面を参照し、例示によって記載する。

微生物培養物中の枯草菌を検出した。この微生物の代謝産物であるプロテアーゼは、ゼラチンを基盤とするホログラフィックセンサーを分解する。ゼラチン支持媒体は、分解されると次第に海綿状になって拡大する。

上記ホログラムを含むキュベット中に指数増殖期中期の培養物（栄養培地中）を接種し、１０分間隔で１５時間、３０℃においてピーク波長を反射分光計で測定した。プロテアーゼ陽性であるという結果が、赤方偏移したピーク波長によって示された。図１は、１５時間の反射ピーク波長の赤方偏移を示す。

微生物培養物中のバチルス・メガテリウムを検出した。発芽の際、上記微生物は（ジプリコリン酸に結合した）Ｃａ^２＋を放出する。Ｃａ^２＋はポリＨＥＭＡ−ＭＩＤＡホログラフィック支持媒体に結合し、同時にポリマーの縮小及び再生波長のシフトを引き起こす。

ポリＨＥＭＡ中にＭＩＤＡを１０〜１２モル％含むホログラフィックセンサー化合物を、栄養培地中で平衡にした。その後、バチルス・メガテリウムの胞子を約１０^８個／ｍＬの割合で添加した。反射分光計を使用して、１分間隔で５０分間、２５℃においてピーク波長を測定した。また、発芽を示す吸光度変化であるセンサーの吸光度変化も検出した。また、発芽マトリックスの吸光度変化も検出した。

図２は発芽に対する応答を示すグラフであり、吸光度（ＯＤ）及び波長の読み取り値を示す。ＯＤ及びλの両方が減少しており、このことは、Ｃａ^２＋に誘導されてホログラフィック支持媒体へ結合したことを示す。この結果から、発芽は最初の１０分以内に生じたことが示唆される。

デンプン／アクリルアミドホログラフィックセンサーを使用することによって、増殖期のバチルス・メガテリウムを検出した。バチルス属は増殖中に比較的多量のアミラーゼを産生するという特徴がある。アミラーゼはデンプンを基盤とするホログラフィック支持媒体を分解する。

センサー部を、栄養培地１８００μＬで３０℃において平衡にした。その後、増殖期のバチルス・メガテリウム（一晩培養）２００μＬを添加した（残留するアミラーゼを除去するために、細胞を遠心分離して新しい培地中に再度懸濁し、その後キュベットに添加した）。センサーの反射ピーク波長を、１５分毎に約１６時間記録した。

結果を図３中に示す。波長のシフトは最初は比較的小さいが、時間が経つと増加した。この遅れは、ホログラフィック支持媒体中の残留グルコースの存在によるものである可能性がある。

ＭＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡを６％含む支持媒体化合物を有するホログラフィックセンサーを使用して、栄養培地中のバチルス・メガテリウム胞子の増殖を検出した。センサー、栄養培地及びｐＨ探子を含むキュベット中に胞子２００μＬを（〜１０^８個／ｍＬの割合で）添加した。ホログラフィーの再生波長及びｐＨを約１２５分間測定した。

結果を、図４及び図５中に示す、すなわち、各グラフはそれぞれ発芽に対する応答を示す。λとｐＨの間の相関は良好であり、発芽の程度を正確に反映している。

枯草菌によるプロテアーゼの生成を示すグラフ。 バチルス・メガテリウムの発芽を示すグラフ。 バチルス・メガテリウムの増殖を示すグラフ。 バチルス・メガテリウム胞子の増殖（再生波長）を示すグラフ。 バチルス・メガテリウム胞子の増殖（ｐＨ）を示すグラフ。 本発明の装置の透視図。 読み取り器中に挿入した本発明の装置。

符号の説明

１、綿球
２、入口
３、流体アレイ
４、読み取り器

Claims (14)

1. 細胞の検出方法であって、
   センサーを含む装置中に細胞を固定すること、及び、増殖培地を導入すること、及び、前記センサーの光学特性の変化を検出することを含み、
   前記センサーは細胞増殖産物に対して感受性がある
   ことを特徴とする方法。
2. 細胞は磁気粒子に固定されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 細胞は胞子細胞である
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 細胞は微生物細胞である
   ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 微生物は、炭疽菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｇｉｉ、枯草菌、バチルス・メガテリウム、レジオネラ・ニューモフィア、野兎病菌、ペスト菌、サルモネラ菌、大腸菌、リステリア菌、バチルス・チューリンゲンシス及びカンピロバクター菌から選択される
   ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 細胞は抗体を使用して固定されている
   ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. センサーはホログラフィックセンサーである
   ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項６に記載の方法に使用するのに適切な装置であって、
   センサー及び増殖培地及び試料入口を含むチャンバーを有する
   ことを特徴とする装置。
9. チャンバー内又は装置内の他の箇所に抗体を固定する手段を含んでいて、流体とセンサーが接触している
   ことを特徴とする請求項８に記載の装置。
10. 抗体はチャンバーの壁に固定されている
    ことを特徴とする請求項９に記載の装置。
11. 磁気粒子に固定された抗体を更に含み、
    前記手段によって磁場を得ることができる
    ことを特徴とする請求項９に記載の装置。
12. 緩衝溶液を含む容器を、試料入口と連結して更に含む
    ことを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 前記チャンバーを複数含む
    ことを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載の装置。
14. センサーはホログラフィックセンサーである
    ことを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載の装置。

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