JP2005528397A - グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼの阻害剤 - Google Patents

Abstract

ヒトグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼの、およびアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼの優れたヒト阻害剤を設計し、合成し、特徴付ける。

Description

本出願はトランスホルミラーゼの阻害剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼおよびアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼの阻害剤およびそれらの使用に関する。

グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＦ Ｔｆａｓｅ）はデノボプリン生合成経路内の葉酸−依存性酵素である。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅは該経路の第３の工程で補因子１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸（１０−ホルミル−ＴＨＦ）を利用して、ホルミル基をその基質であるβ−グリシンアミドリボヌクレオチド（β−ＧＡＲ）の第一級アミンへ移動させる。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅは、それによりそれがホルミル移動を触媒する容易性についてメカニズム的に重要であり、ＤＮＡ前駆体プリンの合成におけるその役割について生物学的に重要であり、その触媒反応の鍵となるメカニズム特徴の描写について構造的に重要であり、化学療法薬剤設計について重要な標的として医薬的に重要である。

葉酸代謝の阻害剤は、核酸前駆体の生合成のその阻害の結果、癌の化学療法のための重要な剤を提供した（Ｎｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９，２６，７４−８１；およびＴａｋｉｍｏｔｏ，Ｃ．Ｈ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９７，２４，Ａ１８−４０−Ｓ１８−５１にレビューされている）。抗癌標的としてのＧＡＲ Ｔｆａｓｅのバリデーションは、最初の優れたかつ選択的阻害剤である５，１０−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）の発見に伴い１９８０年代に実現された（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２８，９１４−９２１）。この化合物は、メトトレキセート（ＭＴＸ）がほとんど効果を示さない、ネズミおよびヒトの固形腫瘍に対してインビボで効果的な活性を呈する。ＤＤＡＴＨＦの選択性はデノボプリン合成に対する腫瘍細胞の依存度によるものであり、他方、サルベージ経路はほとんどの正常な細胞におけるプリンの一次的源である。（６Ｒ）−ジアステレオマー、ロメトレキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）（ＬＴＸ、Ｋ_i＝６０ｎＭ）（図１３）は、最初に、その効果的な抗−新腫瘍活性の結果として（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，３２８−３３３）、もしくは、より最近では、葉酸を補った場合のその一般的な毒性の低下のため（Ｌａｏｈａｖｉｎｉｊ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １９９６，１４，３２５−３３５；およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００，４５，１０３−１１０）臨床試験を繰り返している。

ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ｐｕｒＮ）は、１１０ｋＤを超える分子量を持つｐｕｒＤ−ｐｕｒＭ−ｐｕｒＮによってコードされる三機能的酵素のＣ−末端に位置する。他の２つの酵素活性はＧＡＲシンテターゼ（ｐｕｒＤ）およびＡＩＲシンテターゼ（ｐｕｒＭ）であり、これは、デノボプリン生合成経路において工程２および５を表わす。該三機能的酵素の複雑性のため、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの生物学的および構造的研究の大部分は細菌源から単離されたタンパク質で行われてきた；大腸菌酵素はそのヒト対応物に対して３１％の全配列同一性を有するが、それは、活性部位内ではほぼ１００％まで増加する。２３ｋＤの分子量を持つ単機能性大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅは、長年、メカニズム研究のために、および最近では阻害剤の設計のためにヒト酵素についての有用な代替標的であった（Ｖａｒｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４０，２５０２−２５２４；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，６４３，６５９；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０００，１０，１４７１−１４７５；およびＢｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，８，１０７５−１０８６）。しかしながら、ヒト対細菌ＧＡＲ−Ｔｆａｓｅ機能の活性および機能におけるいずれの微細な点に対する理解も、哺乳動物ＧＡＲ Ｔｆａｓｅについてのいずれかの構造データの欠如によって妨げられてきた。例えば、葉酸補因子の哺乳動物ポリグルタミン化は、グルタメートテイルにおいてγ−カルボキシレート結合のみを伴い（Ｍｏｒａｎ，Ｒ．Ｇ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．）Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９８３，１６３，３２７−３３９；Ｓｈａｎｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５３，３１６−３２５；およびＭｃＧｕｉｒｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８４，３３，１３５５−１３６１）、他方、αおよびγポリグルタミン化が大腸菌および他の細菌系で観察される（Ｆｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３６３−１６３７１；およびＦｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３５６−１６３６２）；おそらくは、ヒトおよび大腸菌のＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造は、ポリグルタミン化テイルとの相互作用のこのような相違を反映しているはずである。

組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ）の我々の最近の構造は、ヒトおよび大腸菌酵素の間の多数の重要な差を明らかにした。組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅは、ｐＨ６．８未満で大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅで観察された二量体化とは対照的に、広いｐＨ値の範囲においてモノマーとして存在する。大腸菌ＧＡＲ ＴｆａｓｅにおけるｐＨ−非依存性秩序−無秩序転移を受ける活性部位ループ−へリックス（残基１１０〜１３１）は、ヒト酵素においてテストした全てのｐＨ範囲（ｐＨ４〜９）下で均一な立体配座を有する。大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅにおける基質−結合ポケットは常に広い範囲のｐＨ条件（ｐＨ３．５〜８）下で同一の立体配座を取るが、ヒト酵素におけるループ（残基８〜１４）は、基質結合を妨げるように見える低いｐＨにおいては開いた立体配座から閉塞した立体配座に変化する。最も重要なことには、結合した葉酸類似体と親密に相互作用する葉酸−結合ループは、リガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅにおいて大腸菌酵素について以前に記載されたものとは、異なる立体配座を採る。

グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ）は、デノボプリン生合成にとって中枢的な酵素である。プリンはＤＮＡおよびＲＮＡの非常に重要な構成要素であるので、プリン生合成経路における酵素の阻害は、抗腫瘍侵襲についての効果的なアプローチであると提唱されている（Ｄｉｖｅｋａｒ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７５，１１，３１９；Ｍｏｒａｓ，Ｒ．Ｇ．Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１，５８，６５；およびＢｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３４，ｐ４７９）。（６Ｒ）−５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ロメトレキソール、（６Ｒ）−ＤＤＡＴＨＦ）が、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの効果的な阻害剤として作用する有効な抗腫瘍剤である（Ｋ_i＝０．１ｍＭ）という開示は、抗腫瘍侵襲についての有望な標的としてのプリン生合成およびＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害を確立した。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅは（６Ｒ）−１０−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（１）を用いて、ホルミル基を、その基質であるグリシンアミドリボヌクレオチドの第一級アミンへ転移させる（２ａ，ＧＡＲ；図１）。この１炭素転移はプリンのＣ−８炭素の取り込みを構成し、それは、２つのホルミル移転移反応の最初の反応である。２番目のホルミル転移反応も１を使用して、ホルミル基を、その基質であるアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドのＣ−５アミンへ転移させるアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ）によって触媒される（２ｂ，ＡＩＣＡＲ；図１）。（Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７，２２９，６１３；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９５９，２１，１９９；Ｆｌａｋｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７，２２９，６０３；Ｆｌａｋｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７，２２８，２１５；Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７，２２９，６２７；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｎｓ；Ｂｌａｉｒ，Ｊ．Ａ．Ｅｄ．，Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎ，１９８３；ｐｐ２４７−２５０；Ｂａｇｇｏｔｔ，Ｊ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９，１８，１０３６；Ｒａｙｌ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，２２２５；Ｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９９１，１０６，１９７；Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９１，１０９０，３５１；Ｓｚａｂａｄｏｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９４，３３，１４２３７；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８１，２０，３３７；Ａｉｂａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，２１２３９；およびＥｂｂｏｌｅ Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２，８２７４）。ここに、我々は、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの効力のある阻害剤を同定する我々の継続的な取り組みにおける１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）の調製および評価を詳細に説明する。

以前の研究においては、ホルミル基を転移することができないアルデヒド含有葉酸ベースの阻害剤を分析した。（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８３１；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８３９；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８４７；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８５３；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，６４３；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，８，１０７５；およびＢｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０００，１０，１４７１）。従って、Ｎ１０の炭素原子での置換は、補因子類似体からのホルミル基の移動を妨げ、酵素阻害に対するユニークな機会を供する。これは、ホルミル転移四面体型中間体を模倣するアルデヒドのｇｅｍ−ジオール結合を介しての酵素の競合阻害、またはＧＡＲまたはＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの酵素集合強結合阻害剤を供するための活性部位における基質の共有結合捕捉いずれかを伴うこともあり得る。（Ｌｉ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９１，１，３５３；５−ＤＡＣＴＨＦでの関連研究については、Ｂｉｇｈａｍ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９９３．３５，１２８９；Ｉｎｇｌｅｓｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８９，３２，９３７；およびＩｎｇｌｅｓｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９１，４７，２３５１参照）。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、β−ＧＡＲおよび１０−ホルミル−５，８，１０−トリデアザ葉酸（１０−ホルミル−ＴＤＡＦ）、すなわち現在までに検討された阻害剤のうち最も効力があるものの共結晶化は、アルデヒド阻害剤（Ｋ_i＝２６０ｎＭ）が、ホルミル転移に関与する四面体型中間体を模倣するその水和物としての活性部位において結合する（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３）。従って、基質β−ＧＡＲとの酵素集合イミン付加体またはＧＡＲ Ｔｆａｓｅ活性部位残基の求核体との共有結合付加体は観察されず、優れた阻害活性は、阻害剤アルデヒド水和物と酵素活性部位の触媒的に重要な残基との水素結合相互作用によって生じることもあり得る。これらの努力にかかわらず、１０−ホルミル−ＴＤＡＦを含めたこれらのシリーズにおける優れたＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤のいずれも、酵素阻害能力のそのレベルに合致する細胞傷害性活性を示さず、これは部分的には、それらの不安定性、および還元葉酸キャリアーによる効果的でない転移に起因することもあり得るという観察である。

多数の報告が、（６Ｒ）−５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸の非環式類似体を記載してきた（４、ロメトレキソールまたは（６Ｒ）−ＤＤＡＴＨＦ、図２）。（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０，１９９７；Ｓｏｋｏｌｏｓｋｉ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９１，２８，３９；Ｓｈｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２，３５，１１０９；Ｂｉｇｈａｍ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２，３５，１３９９；Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，３２１８；Ｍｕｌｌｉｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９２，４３，１６２７；Ｊａｎｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，４７，１０６７；およびＨａｂｅｃｋ Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５，４８，３２６）。ＤＤＡＴＨＦの非環式誘導体５（図２、Ｘ＝ＣＨ₂）を含めたこれらの類似体のいくつか（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｔｅｌｏｃｙｃｌｅｓ １９８９，２８，１１６９）は、４の優れた細胞傷害性および酵素阻害特性を保持することが示されている。加えて、Ｃ−１０における置換基（例えば、１０−メチルおよび１０−ヒドロキシメチルを持つ４のいくつかの類似体は、４に対して同等または増大した生物学的活性を呈する（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，１９）。

初期阻害剤：
一連の初期化合物を合成し、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの潜在的阻害剤として評価した。４つの化合物（３、１４、１５および１７）は、プリンデノボ生合成経路の阻害を介する選択的細胞障害性を示す培地プリンの不存在下で優れた生物学的活性（０．２０ｍＭ未満のＩＣ₅₀値）を有するものとして同定された。調べた化合物のいずれも大腸菌ＧＡＲ ＴｆａｓｅまたはヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅのサブマイクロモルのインビトロ阻害を示さなかったが、細胞内ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害を介して特異的に強力な細胞障害性活性を示すことを、プリンおよびＡＩＣＡＲ救済実験は示している。

引き続いてのアッセイを行い、ポリグルタミン化、および／または還元型葉酸キャリアー輸送が、インビトロ酵素活性と比較して細胞生物学活性の有意な増加に関与するかを決定した。還元型葉酸活性輸送が損なわれたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸ）に対する剤（３、１４、１５および１７）の細胞傷害性活性の欠如は、これらの剤が、生物学的活性に対する還元型葉酸キャリアーを必要とし、ホリルポリグルタミン酸シンターゼを欠くＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-に対するそれらの不活性が、それらのポリグルタミン化が活性にも必要であることを立証することを示す。γ−ペンタグルタミン酸誘導体２１および２２は、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対してわずかに増加した結合親和性しか示さないが、ヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対してはより有意な４倍（２１）および１４０倍（２２）に増加した結合親和性を示しており、大腸菌ＧＡＲ ＴｆａｓｅよりもヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対する親和性が１０倍程度高い阻害剤であるという結論に至った。ペンタグルタメートについてのこれらの観察は、興味深いものであるが、一次作用点としてのＧＡＲ Ｔｆａｓｅと矛盾していた。ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する阻害剤の続きの試験により、それら、およびγ−ペンタグルタメートが異例の細胞傷害性効力をもたらす大腸菌酵素に比べて、予想外にヒトに対してより効力があることがわかった。

改良型阻害剤：
ここで、我々は、組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅを特異的に阻害するが（Ｋ_i＝１５ｎＭ）、調べた他の葉酸−非依存性酵素に対して不活性である（Ｋ_i＞１００μＭ）、改良型葉酸類似体、すなわち、１０−トリフルオロアセチル−５，１０−ジデアザ−非環式−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ、１０１）を設計するための構造に基づくアプローチの使用法を開示する。さらに、化合物１０１は腫瘍細胞増殖の優れた阻害剤であり（ＩＣ₅₀＝１６ｎＭ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）、これは、臨床試験中であるＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤であるロメトレキソールに対して１０倍の改良を示す。従って、この葉酸類似体１０１はＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する公知の最も優れたかつ選択的阻害剤の１つである。有効な活性をもたらすので、化合物１０１は、還元型葉酸キャリアーによって効果的に細胞内に輸送され、ポリグルタミン化によって細胞内に隔離される。１．９８Å解像度における葉酸類似体１０１を伴ったヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶構造は、基質の不存在下で補因子または補因子類似体で決定されるべきいずれかのＧＡＲ Ｔｆａｓｅの第一の構造を表わす。大腸菌およびリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造の双方において高い柔軟性を示す葉酸結合ループ１４１〜１４６は、葉酸結合部位において結合１０１上に非常に規則正しく並べられている。この葉酸類似体および他の葉酸類似体−基質結合構造への天然補因子のコンピュータードッキングは、どのようにして天然補因子１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸がＧＡＲ Ｔｆａｓｅと相互作用をするかのモデルに対する理論的な基準を提供し、この葉酸類似体結合立体配置が阻害剤設計のためのこれまでで最良の鋳型を表わすことを示唆する。

本発明の１つの態様は以下の構造式：

によって表わされる化合物にを対象としている。前記構造式において、Ｒ¹は−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ＝ＮＮＭｅ₂、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり、Ｒ²は−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、グルタミル、およびオリゴグルタミルよりなる群から選択される基であり、Ｒ³は−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、グルタミルおよびオリゴグルタミルよりなる群から選択される基であり；各グルタミルは、独立して、式−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴）（ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁵によって表わされ、式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は、各々、独立して、−ＯＨおよび−ＯｔＢｕよりなる群から選択される基であり、各オリゴグルタミルは少なくとも１つの末端グルタミル、および１および４の間の非末端グルタミル残基を有し、各末端グルタミルは、独立して、式−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴）（ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁵によって表わされ、ここに、Ｒ⁴およびＲ⁵は、各々、独立して、−ＯＨおよび−ＯｔＢｕよりなる群から選択される基であり、各非末端グルタミルは、独立して、式−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁶）（ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁷によって表わされ、式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は、各々、独立して、−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、末端グルタミルおよび非末端グルタミルよりなる群から選択される基であり、但し、Ｒ⁶およびＲ⁷の少なくとも一方は末端グルタミルまたは非末端グルタミルいずれかである。本発明の好ましい実施形態の２つにおいて、化合物は以下の構造式：

によって表わされる。

さらなる好ましい実施形態において、請求項１に記載の化合物は以下の構造式：

によって表わされる。前記構造式において、Ｒ⁸は−Ｃ（Ｏ）Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり；およびＲ⁹およびＲ¹⁰は、各々、独立して、−Ｈおよび−ｔＢｕよりなる群から選択される基である。

さらなる好ましい実施形態において、請求項１に記載の化合物は以下の構造式：

によって表わされる。前記構造式において、Ｒ⁸は−Ｃ（Ｏ）Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり；およびＲ⁹およびＲ¹⁰は、各々、独立して、−Ｈおよび−ｔＢｕよりなる群から選択される基である。

本発明のもう１つの態様は、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害濃度の前記いずれかの化合物と接触させる工程を含む、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害する方法を対象にしている。

本発明のもう１つの態様は、アミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害濃度の前記いずれかの化合物と接触させる工程を含む、アミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害する方法を対象としている。

本明細書中で示す仕事は、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅについての完全な構造ベースの薬物設計サイクル：構造、分析、合成、および次いで構造に戻される評価を表わす。補因子類似体１０−ホルミル−ＴＤＡＦおよび基質β−ＧＡＲ（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）との複合体における大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの構造は、阻害剤が水和ｇｅｍ−ジオールとして結合し、ホルミル転移中間体を模倣するように酵素と相互作用することを明らかにする（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）。この構造の洞察に基づき、新しい化合物１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）を設計し、合成して、結合部位におけるｇｅｍ−ジオールの形成を促進し、それを安定化させた。新しく設計された化合物は、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの選択的かつ非常に効果的な阻害剤であることが判明し、これまでに記載されている最も優れた葉酸類似体を表わす。さらに、１０１はＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、ＴＳおよびＤＨＦＲに対して不活性であった。この化合物は代替補因子として作用するが、ホルミル転移は不可能である。天然葉酸補因子に対するその構造的類似性は、細胞傷害性アッセイによって確認されるように、細胞葉酸輸送系、ならびにＦＰＧＳの基質として許容されるであろうことを示唆した。最も重要なことには、該化合物は化学的に安定である。全てのこれらの特性により、この化合物は化学療法薬としてインビボ研究のための手がかりになる。

この化合物をｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅで結晶化させ、その構造を、関連葉酸類似体、１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）を持つ大腸菌構造と比較した（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）。これらの２つの構造の葉酸−結合ループは、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１４２およびＶａｌ１４３の側鎖についての少数の最小の差と非常に類似しており、大腸菌構造おけるこのループのより高い柔軟性によって最も引き起こされやすい。他の重要な差が細菌およびヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの構造間で見出されたが、葉酸−結合ポケットの立体配座は高度の類似性を有し、この特定の大腸菌ＧＡＲ複合体から得られた情報が阻害剤設計について有益である。

高い解像度においてリガンドが結合していないおよび阻害剤−結合ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造の現在の有効性は、阻害剤結合に際して微妙な変化を示す。最も劇的な変化は、葉酸−結合ループ１４１〜１４６で起こり、これは、阻害剤との鍵となる相互作用を形成する。この立体配座により密に固定されたＨｉｓ１０８およびＡｓｎ１０６の隣にＡｓｐ１４４を並置する。Ｈｉｓ１０８およびＡｓｎ１０６は、種々の構造において一致する位置および立体配座を有するので、阻害剤結合へのＡｓｐ１４４の移動は、最終的には、恐らくは、ホルミル転移反応において触媒およびプロトンシャトリングの用意ができた立体配座への１つの構造内への完全な反応トライアッドに似ている。

ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）の座標は、天然葉酸補因子のドッキングシミュレーションのアポ・ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅよりもかなり良好なモデルを提供する。アポタンパク質に対するより好都合でないドッキングエネルギーおよびこの構造における葉酸補因子の不適切な位置決定は、葉酸−結合ループが立体配座変化を受けて、恐らく、誘導適合により葉酸／葉酸類似体を適合させることを示唆する。ヒトおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ双方については、葉酸結合ループの１つの特定の立体配座は最もエネルギー的に有意であることが判明し、これは、１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦと複合したｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶構造は、天然葉酸補因子との相互作用についての合理的な「スナップショット」を示している。これらの組み合わせた結晶学的および計算的研究は、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅホルミル転移メカニズムの我々の理解、およびＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤の引き続いての生成の設計を大いに促進する。

［初期阻害剤］
グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ）およびアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ）の潜在的阻害剤としての１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）の合成を本明細書中に開示する。アルデヒド３、対応するγ−およびα−ペンタグルタメート２１および２５および関連剤を、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅを含めた葉酸−依存性酵素の阻害につき評価した。阻害剤は、それらの酵素阻害能力（各々、大腸菌ＧＡＲおよびヒトＡＩＣＡＲ ＴｆａｓｅにつきＫ_i（３）＝６および１ｍＭ）を超える優れた細胞傷害性活性（３についてのＣＣＲＦ−ＣＥＭ ＩＣ₅₀＝６０ｎＭ）を呈することが判明した。培地プリンにより細胞傷害性が救済され、ピリミジン培地では救済されないことは、優れた細胞傷害性活性が選択的プリン生合成阻害に由来することを示しており、ＡＩＣＡＲモノホスフェートによる救済は、その細胞障害性活性が、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害と比べて選択的にＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害に由来することを立証した。アルデヒド３を含めた優れた細胞傷害性化合物は、還元葉酸キャリアー（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸ）またはホリルポリグルタミン酸シンターゼ（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-）が欠乏したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対する活性を喪失し、これは、それらの優れた活性は還元された葉酸キャリアー輸送およびポリグルタミン化双方を必要とすることを立証する。予期せぬことに、ペンタグルタメートは、驚くべきことに、同様の大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するＫ_iを呈し、ヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対するＫ_iを中程度に増強したに過ぎなかった。表面においては、これは、当初は、３および関連化合物の優れた細胞傷害性活性が、単に、効果的な輸送およびポリグルタミン化に由来する阻害剤の優先的細胞内蓄積によるものであることを示唆した（すなわち、約１００倍高い細胞内濃度）。しかしながら、組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する阻害剤の引き続いての試験によると、それら、および対応するγ−ペンタグルタメートは、予期せぬことに、それらの例外的細胞傷害性能力の主な原因にもなる大腸菌酵素と比べて、ヒトに対してかなり効力があることが明らかになった（３についてのＫ_iは、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対して６ｍＭ、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対して１４ｎＭ）。

化学反応
１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）の合成は、公知のＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン６の−１．３−ジブロモプロパンでのアルキル化（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９７６，３；Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９７８，１１１，１３３７；およびＣｏｒｅｙ，Ｅ．ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９７８，１１１，１３６２）を介した方法で達成された。６のＬＤＡ脱プロトン化（ＴＨＦ、−７８℃、３０分）および過剰の１，３−ジブロモプロパンでの引き続いての処理（１０当量、ＨＭＰＡ、−７８℃、２時間、５２％）により、鍵となる中間体７を得た（図３）。シアノ酢酸エチルの予め形成されたナトリウム塩（ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、３０分）を７でアルキル化して（ＤＭＦ、２５℃、２．５時間、４９％）、８を得た。塩基性条件下でのグアニジンの遊離塩基による環化（１．１当量、ＣＨ₃ＯＨ、２５℃、１２時間、５２％）により、所望のピリミジン９を得た。９のＬｉＯＨによる処理（３．０当量、３：１ ＣＨ₃ＯＨ−Ｈ₂Ｏ、２５℃、１２時間、８８％）により、正確にカルボン酸１０を得て、これを、Ｌ−グルタミン酸ジーｔｅｒｔブチル塩酸塩とカップリングさせて（ＥＤＣｌ、ＮａＨＣＯ₃、ＤＭＦ、２５℃、１２時間）、１１を得た。ジメチルヒドラゾンの引き続いての加水分解を完了して、ｐＨ７に緩衝化したＴＨＦ−Ｈ₂Ｏ中でＣｕＣｌ₂による処理（５．０当量、０℃、１時間、３９％）によって感受性アルデヒド１２を得た。アルデヒド１２を得ることに加えて、酸化的脱ホルミル化産物１３（２１〜４４％、図４）も得た。１２の脱保護はトリフルオロ酢酸による処理によって完了し（１：５ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、８９％）、１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）を得た。トリフルオロ酢酸での処理による１３の酸性触媒脱保護（１０当量、ＣＨＣｌ₃、１２時間、８３％）により１４を得た（図４）。

さらに、安定なＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン１１も同様に、トリフルオロ酢酸での処理によるジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの酸性触媒脱保護によって１５に変換した（１：４ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、定量的）（図３）。比較目的で、アルデヒド１２をＮａＢＨ₄でアルコール１６まで還元し（３．０当量、ＣＨ₃ＯＨ、４時間、８８％）、引き続いてトリフルオロ酢酸による１６の脱保護（１：１０ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、９８％）を行い、公知のアルコール１７を得た（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，１９）（図５）。

３および関連化合物の優れた細胞傷害性活性の原因を立証するために、さらに３および１５の対応するγ−およびα−ペンタグルタメートを調製した。γ−ポリグルタメートのみが真核生物で見出されたが、大腸菌を含めた細菌は２つのγおよび引き続いてのαグルタメート結合を含む葉酸コンジュゲートを生じる（すなわち、ｐＡＢ（γ−Ｇｌｕ）₂−（α−Ｇｌｕ）_n）（Ｆｅｒｏｎｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３５６；およびＦｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３６３）。該結合の性質の重要性を立証するために、γ−およびα−ペンタグルタメート双方を調製した。カルボン酸１０をｔｅｒｔ−ブチルエステル保護γ−ペンタグルタメート１８の公知の遊離アミンとカップリングさせて（Ｓｔｙｌｅｓ，Ｖ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９９０，２７，１８０９）（ＥＤＣｌ、ＮａＨＣＯ₃、ＤＭＦ、２５℃、４８時間、３１％）、１９が得られ（図６）、ならびにｔｅｒｔ−ブチルエステル保護α−ペンタグルタメート２３の公知の遊離アミンとカップリングさせて（Ｒｅｉｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｉｎｆ．Ｔｅｘｔ．Ｔｅｎｓｉｏａｃｔｉｖｏｓ １９７８，２１，３３７；およびＭａｒｉｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９０，３６，３７４）（ＥＤＣｌ、ＮａＨＣＯ₃、ＤＭＦ、２５℃、４８時間、２２時間）、２４を得た（図７）。１９のジメチルヒドラゾンの引き続いての加水分解を達成して、ｐＨ７に緩衝化されたＴＨＦ−Ｈ₂Ｏ中のＣｕＣｌ₂での処理によって（５．０当量、０℃、１時間、４８％）感受性アルデヒド２０を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルの引き続いての脱保護を、トリフルオロ酢酸での処理（１：４ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、１００％）によって達成して、１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ γ−ペンタグルタメート２１を得た。同様にして、２４のジメチルヒドラゾンの加水分解を完了して、ｐＨ７に緩衝化されたＴＨＦ−Ｈ₂Ｏ中のＣｕＣｌ₂での処理（５．０当量、０℃、１時間）によって対応する感受性アルデヒドを得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルの引き続いての脱保護は、トリフルオロ酢酸での処理（１：４ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、２４から２２％）によって達成して、１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ α−ペンタグルタメート２５を得た。同様に、直接的比較のために（図６および７）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの酸性触媒脱保護によって（１：４ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃、１２時間、１００％）、各々、Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン１９および２４を２２および２６に変換した。

ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、ＡＩＣＡＲ ＴｆａｓｅおよびＤＨＦＲ阻害
化合物３、９〜１２、１４、１５、１７、２１、２２、２５および２６を、まず、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、ヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、および大腸菌ＤＨＦＲの阻害につきテストし、結果を図９に表わす。１１を例外として、全ての化合物は一桁の大きさのＫ_i範囲（１．９〜４８ｍＭ）内でＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害を示した。また、化合物３および１２は、驚くべきことに、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅで観察されたＫ_iと匹敵する、１ｍＭの等しいＫ_i値を持つＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの効果的な阻害剤であることが判明した。グルタメートによる相乗作用のこの欠如（３対１２）は、酵素阻害特性が３および１２におけるアルデヒドの存在によって支配されていることを示唆する。この例外的な所見は、ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに関連して後にさらに議論する。ジメチルヒドラゾン１５（対１１）のより従来のグルタメート相乗作用が観察された。１５によるＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害は、アルデヒド３のそれと匹敵することが示されたが（Ｋ_i＝６ｍＭ）、１５は、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対して３よりも３０倍低い効果であった。また、３におけるアルデヒド、対応するアルコール１７およびノルケトン１４のこの重要性の代表は、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対してかなりに活性が低く、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対して不活性であった。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害が、一般に、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅよりも大きかったことを除いて、同様な観察が、アルデヒドから作られるの阻害剤の関連シリーズでなされた（ＣＨＯ≧ＨＣ＝ＮＮＭｅ₂＞ＣＨ₂ＯＨ≧Ｃ＝Ｏ）。これは１４、１５および１７で観察されたが、アルデヒド３は、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対してわずかにより優れていることが判明した。

興味深いことには、アルデヒドγ−ペンタグルタメート２１およびジメチルヒドラゾンγ−ペンタグルタメート２２は、期待したほど、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する親和性において大きな増加を示さなかった。双方のγ−ペンタグルタメート誘導体は、モノグルタメート阻害剤と比較すると、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対して２〜３倍高い結合親和性を呈するに過ぎない。効力における同様な中程度の４倍増加が、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対してアルデヒドγ−ペンタグルタメート２１対３で観察され、他方、ジメチルヒドラゾン２２は、１５に対してかなり高い実質的１４０倍増加を呈した。さらに、双方のγ−ペンタグルタメート誘導体は、ＧＡＲ ＴｆａｓｅよりもＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対して約１０倍高い結合親和性を呈する。

大腸菌において２つのホリルポリグルタミン酸シンターゼ活性（αおよびγ双方）があることが以前示されているので（Ｆｅｒｏｎｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３５６；およびＦｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３６３）、α−ペンタグルタメート誘導体２５および２６も合成し、評価した。アルデヒドα−ペンタグルタメート２５は、各々、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対してアルデヒドモノグルタミン３よりも３〜１６倍低い能力であった。同様に、ジメチルヒドラゾンα−ペンタグルタメート２６は、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対してヒドラゾンモノグルタメート１５よりも４倍低い能力であったが、他方、それはＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対して４倍より優れており、双方は、対応するγ−ペンタグルタメート２２よりも１〜二桁の大きさだけ低い能力であった。従って、γ−ペンタグルタメートはα−ペンタグルタメートよりも顕著により優れていた。しかしながら、２２対ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅを例外として、γ−ペンタグルタメートは対応するモノグルタメートほど有意に顕著に優れた酵素阻害剤ではなかった。興味深い一方で、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するこの反応は、化合物の機能的能力に合致しないことが判明した。

ＤＨＦＲの阻害についてテストした化合物のいずれも活性を呈さず、これは、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ対ＤＨＦＲについての選択性を立証している。

細胞傷害性活性
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対して、添加されたヒポキサンチンの存在下（＋）および不存在下（−）の双方において、化合物３、９〜１２、１４、１５、１７、２１、２２、２５および２６を細胞傷害性活性について調べた（図９）。前駆体物質（９〜１２）の細胞傷害性活性は、該アッセイを培地プリン（ヒポキサンチン）またはピリミジン（チミジン）の存在下、または不存在下で行ったかに拘わらず、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対して比較的低く、かつ均一であった。一方、ロメトレキソールと同様にアルデヒド３は、プリンを補足した培地中で培養したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対して活性を示さない。しかしながら、ロメトレキソールおよびアルデヒド３はいずれもプリンが培地中に存在しない場合、強い細胞傷害性活性を呈する（各々、ＩＣ₅₀＝０．１５ｍＭおよび０．０６〜０．０７ｍＭ）。ピリミジンではなく、プリンの存在に対するこの感度は、アルデヒド３の活性が、デノボプリン生合成経路における酵素のその阻害に由来することを示す。

重要なことには、３の酸化的脱ホルミル化によって得られた分解産物１４は、３に対する効力においてわずかに優れていないかまたは大体等しいに過ぎないことが判明し（ＩＣ₅₀＝０．１０ｍＭ）、また、それは選択的プリン救済を呈した。なおより重要なことには、安定なＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン１５およびアルコール１７は、共に、アルデヒド３またはケトン１４のそれと少なくとも同程度の大きさ、またはそれを超えるプリン感受性細胞傷害性能力（各々、ＩＣ₅₀＝０．０３ｍＭおよび０．０３ｍＭ）を呈した。３、１４、１５または１７での各場合において、ヒポキサンチン（１００ｍＭ）での細胞傷害性の逆行の結果、ＩＣ₅₀値のａ³１０³〜１０⁴変化がもたらされ、これは、活性がプリン生合成の選択的阻害を介して観察されることを示す。

アルデヒドペンタグルタメート誘導体２１および２５、およびジメチルヒドラゾンペンタグルタメート誘導体２２および２６は、恐らく、細胞膜を通過することが難しいため、ほとんど、または全く細胞傷害性活性を示さない。

ＡＩＣＡＲ救済実験は３、１４、１５および１７を用いて行い、それらの細胞傷害性活性の原因をさらに解明した（図１０）。各場合において、ヒポキサンチン（１００ｍＭ）またはＡＩＣＡＲモノフォスフェート（１００ｍＭ）での細胞傷害性の逆行または救済の結果、ＩＣ₅₀値のａ³１０³〜１０⁴増加がもたらされた。これは、活性が、恐らくは、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害を介して、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ酵素段階より前のプリン生合成の選択的阻害を介して観察されることを示す。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するこの選択的感度は阻害剤１４、１５および１７の予期された作用であり、他方、アルデヒド３および対応する（３からの）γ−ペンタグルタメート２１および（１５からの）２２は、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対する作用においてより効果的であるか、または少なくとも同程度効果的であると予測される。

３、１４、１５および１７の優れた細胞傷害性活性が、細胞膜を透過する還元葉酸輸送に依存する程度は、突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＭＴＸ）に対してアッセイすることによって立証された（図１１）。この細胞系は、損なわれた還元葉酸キャリアーを有することが示された（Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９，４９，２４５５）。３および１５を含めた全ての優れた阻害剤は、この突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸ細胞系に対する細胞傷害性活性を喪失し（ＩＣ₅₀＞１００ｍＭ）、これは、還元葉酸キャリアー輸送がそれらの生物学的活性に必須であることを示す。

最後に、優れた細胞傷害性化合物がポリグルタミン化に依存する程度は、ホリルポリグルタミン酸シンターゼ（ＦＰＧＳ）を欠く突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-）に対してアッセイすることによって立証された（該ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-細胞系は、親切にも、Ｇ．Ｐ．Ｂｅａｒｂｓｌｅｙ教授（エール大学）から提供された）（図１１）。３および１５を含めた全ての優れた阻害剤は、この細胞系に対して細胞傷害性活性を喪失し、これは、阻害剤のポリグルタミン化がそれらの生物学的活性に必須であることを示す。

ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害。これまでの研究において、４つの鍵となる阻害剤３、１４、１５および１７は、培地プリンおよびＡＩＣＡＲに対して感受性があることが判明し、細胞内への還元葉酸キャリアー輸送を必要とし、ポリグルタミン化を必要とする例外的に優れた細胞傷害性活性を呈した（例えば、３ ＩＣ₅₀＝６０ｎＭ）。機能的効力のこのレベルは、酵素阻害活性をほぼ１００倍超えており（３対大腸菌ＧＡＲ ＴｆａｓｅについてはＫ_i＝６ｍＭ）、これは、細胞傷害性効力の増強は阻害剤の細胞内蓄積に依存する可能性を示唆する。しかしながら、ヒトＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅは、標的であるＧＡＲ Ｔｆａｓｅに合致しないγ−ペンタグルタメートによってより強力に阻害されることが判明し、これは、輸送およびポリグルタミン化による細胞内蓄積が回答の一部に過ぎないことを示唆する。その結果、阻害剤を組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ）に対して調べ、顕著かつ前例のないアルデヒド阻害剤３に対する感度が観察された。

組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する３、１４、１５および１７、ならびに３および１５の対応するα−およびγ−ペンタグルタメート（化合物２１、２２、２５および２６）の試験の結果を、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する結果と共に図１２にまとめる。顕著には、阻害剤は、元の設計で予測されたであろうｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する傾向を呈した。モノグルタメートでは、アルデヒド３はｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの例外的に優れた阻害剤であることが判明し（Ｋ_i＝１４ｎＭ）、それは対応するジメチルヒドラゾン１５（Ｋ_i＝１７０ｎＭ）よりも約１０倍優れており、対応するアルコール１７（Ｋ_i＝１．７ｍＭ）よりも１００倍優れており、および分解ケトン１４（Ｋ_i＝１３ｍＭ）よりも１０００倍優れていた。３および１５のγ−ペンタグルタメート（２１および２２）は、対応するα−ペンタグルタメート２５および２６よりも約３〜４倍優れていた。アルデヒド３のγ−ペンタグルタメートはｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するその顕著な効力を増強しなかったが（３対２１）、ヒドラゾン１５のγ−ペンタグルタメートは効力を５倍増加させた（１５対２２）。最も顕著には、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するγ−ペンタグルタメートの効力は、３および１５で観察された細胞傷害性能力に匹敵し、それらの標的がＧＡＲ Ｔｆａｓｅであって、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅではないことを示す実験と合致する。

阻害剤に対する大腸菌対ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの反応におけるこの顕著な差は、ヒト酵素の予期せぬ選択的阻害の第一のそのような証明を表わす。全体として、葉酸結合部位のコアを形成する２０の酵素残基があり、１２は葉酸結合を安定化させるためにそれらの側鎖を提供する。これらの１２は、１つの保存的Ｌｅｕ−１４３（大腸菌）対Ｖａｌ−１４３（ヒト）置換を除いてヒトおよび大腸菌酵素において同一である。これは、大腸菌およびヒト酵素の間で阻害剤の差異がほとんど観察されないという予測に導いた。ヒト対大腸菌酵素に対して４００倍を超えて優れる３での結果は、これが必ずしも当てはまらないことを示す。

実験
４−［１−ジメチルヒドラゾノ−５−ブロモペント−２−イル］安息香酸メチル（７）
０℃まで冷却したＴＨＦ（１３ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（１．８２ｍＬ，１３．０ミリモル，１．５当量）の溶液をｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ，４．５０ｍＬ，１１．２ミリモル，１．３当量）で処理し、０℃にて３０分間、および−７８℃にて２０分間攪拌した。ＴＨＦ（３．９ｍＬ）中の６（１．９１ｇ，８．６５ミリモル，１．０当量）の溶液を滴下し、得られた溶液を−７８℃にて３０分間攪拌した。ＨＭＰＡ（５．５ｍＬ）中の１，３−ジブロモプロパン（８．７９ｍＬ，８６．５ミリモル，１０．０当量）の溶液を添加し、混合物を−７８℃にて２時間攪拌した。飽和水性ＮＨ₄Ｃｌ（１０ｍＬ）の滴下によって反応混合物をクエンチし、２５℃まで加温した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ₂Ｏ（２’５０ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，５’１５ｃｍ，７０％ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）により７（１．５５ｇ，５２％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ３４１．０８５６（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₁₅Ｈ₂₁ＢｒＮ₂Ｏ₂は３４１．０８５９を必要とする）。

４−［６−カルボエトキシ−６−シアノ−１−（ジメチルヒドラゾノ）ヘクス−２−イル］安息香酸メチル（８）
０℃にて、無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮａＨ（６０％分散，０．２１１ｇ，５．２８ミリモル，１．２当量）の懸濁液をシアノ酢酸エチル（０．６１ｍＬ，５．７ミリモル，１．３当量）で滴下処理した。溶液を０℃にて３０分間攪拌し、ナトリウム塩が透明な溶液として形成した。この溶液を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の７（１．５０ｇ，４．４０ミリモル）の溶液で処理した。得られた反応混合物を２５℃にて２．５時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ₂Ｏ（３’５０ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，４’１５ｃｍ，６０％ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）により８（０．７９８ｇ，４９％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ３７４．２０６６（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₀Ｈ₂₇Ｎ₃Ｏ₄は３７４．２０７４を必要とする）。

４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］安息香酸メチル（９）
２５℃にて、ＣＨ₃ＯＨ（０．８７ｍＬ）中のＮａ金属（０．０３５ｇ，１．５４ミリモル，２．２当量）の溶液をグアニジン塩酸塩（０．０７３ｇ，０．７６９ミリモル，１．１当量）で処理した。溶液を２５℃にて３０分間攪拌し、次いで、ＣＨ₃ＯＨ（０．８７ｍＬ）中の８（０．２６１ｍｇ，０．６９８ミリモル）の溶液で処理した。溶液を２５℃にて１２時間攪拌した。過剰のＮａＯＣＨ₃をＨＯＡｃ（０．０４５ｍＬ）の添加によって中和した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，３’１５ｃｍ，１０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により９（０．１４０ｇ，５２％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４０９．１９６３（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₁₉Ｈ₂₆Ｎ₆Ｏ₃は４０９．１９６４を必要とする）。

４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］安息香酸（１０）
３：１のＣＨ₃ＯＨ−Ｈ₂Ｏ（１．６３ｍＬ）中の９（０．０６３ｇ，０．１６３ミリモル）の溶液をＬｉＯＨ−Ｈ₂Ｏ（０．０２１ｇ，０．４８９ミリモル，３．０当量）で処理し、２５℃にて混合物を１２時間攪拌した。混合物をＨ₂Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、水性層をＥｔＯＡｃ（３’３ｍＬ）で洗浄した。１Ｍ塩酸の添加によって、水性層をｐＨ＝４まで酸性化した。溶液を減圧下で濃縮し、残渣をトルエン（３’５ｍＬ）で処理して、痕跡量のＨ₂Ｏを除去し、１０（０．０５３ｇ，８８％）を得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ３９５．１８２４（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₁₈Ｈ₂₄Ｎ₆Ｏ₃は３９５．１８２４を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１１）
ＤＭＦ（０．３１ｍＬ）中の１０（０．０２９ｇ，０．０７８ミリモル）およびＬ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（０．０３４ｇ，０．１１７ミリモル，１．５当量）の溶液をＮａＨＣＯ₃（０．０２０ｇ，０．２３４ミリモル，３．０当量）、続いてＥＤＣｌ（０．０４５ｇ，０．２３４ミリモル，３．０当量）で処理した。反応混合物を２５℃にて１２時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＣＨＣｌ₃（５ｍＬ）に溶解させ、飽和水溶性ＮａＨＣＯ₃（２ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，２ｍｍプレート，１０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により１１（０．０１７ｇ，３６％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ６１４．３６７８（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₃₁Ｈ₄₇Ｎ₇Ｏ₆は６１４．３６６６を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ホルミル−ブト−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１２）
０℃まで冷却したＴＨＦ（０．９ｍＬ）およびｐＨ７の水性リン酸塩緩衝液（０．０２ｍＬ）中の１１（３０ｍｇ，０．０４９ミリモル）の溶液をＨ₂Ｏ（０．３ｍＬ）中のＣｕＣｌ₂（３３ｍｇ，０．２４４ミリモル，５．０当量）の溶液で処理した。溶液を０℃にて１時間攪拌し、その後、ｐＨ８の飽和水溶性ＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ溶液（２０ｍＬ）の滴下によってそれをクエンチした。溶液をＣＨＣｌ₃（３’２０ｍＬ）で抽出し、Ｎ₂でパージし、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，１ｍｍプレート，２０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により１２（１１ｍｇ，３９％；典型的には２１〜４４％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５９４．２９０４（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₉Ｈ₄₁Ｎ₅Ｏ₇は５９４．２９０４を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−オキソ−ブト−１−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１３）
１２を供する反応からより高いＲ_fスポットとして得られた。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，１ｍｍプレート，２０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により１３（１２ｍｇ，４４％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５８０．２７３０（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₈Ｈ₃₉Ｎ₅Ｏ₇は５８０．２７４７を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ホルミル−ブト−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（３）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（０．２０ｍＬ）中の１２（２．９ｍｇ，０．００５１ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．０４ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。Ｅｔ₂Ｏ（１ｍＬ）を添加し、沈殿が形成された。沈殿をＥｔ₂Ｏ（３’１ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して３−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（２，６ｍｇ，８９％）を黄褐色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４８２．１６５２（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₁Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₇は４８２．１６７０を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−オキソ−ブト−１−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（１４）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（０．１２ｍＬ）中の１３（３．３ｍｇ，０．００５９ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．０１ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。Ｅｔ₂Ｏ（１ｍＬ）を添加し、沈殿が形成された。沈殿をＥｔ₂Ｏ（３’１ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して１４−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（２．７ｍｇ，８３％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４４６．１６７４（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₀Ｈ₂₃Ｎ₅Ｏ₇は４４６．１６７６を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（１５）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（０．２０ｍＬ）中の１１（７．５ｍｇ，０．０１２２ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．０５ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。反応を減圧下で濃縮した。生成物をＥｔ₂Ｏ（１’１ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して１５−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（７．５ｍｇ，１００％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５２４．２２４８（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₃Ｈ₃₁Ｎ₇Ｏ₆は５２４．２２３３を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ヒドロキシペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１６）
０℃にて、ＣＨ₃ＯＨ（０．１１ｍＬ）中の１２（６．１ｍｇ，０．０１０７ミリモル）の溶液をＮａＢＨ₄（１．２ｍｇ，０．０３２ミリモル，３．０当量）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて２時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＣＨＣｌ₃（２ｍＬ）で希釈し、飽和水溶性ＮＨ₄Ｃｌ（１ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（１ｍＬ）で順次洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，１ｍｍプレート，８％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により１６（５．４ｍｇ，８８％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５７４．３２６３（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₉Ｈ₄₃Ｎ₅Ｏ₇は５７４．３２４１を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ヒドロキシペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（１７）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（０．２０ｍＬ）中の１６（４．２ｍｇ，０．００７３ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．０２ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。Ｅｔ₂Ｏ（１ｍＬ）を添加し、沈殿が形成された。沈殿をＥｔ₂Ｏ（３’１ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して、１７−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（４．１ｍｇ，９８％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４８４．１８２４（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₁Ｈ₂₇Ｎ₅Ｏ₇は４８４．１８０８を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミン酸ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１９）
水性ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の１０（９０ｍｇ，０．２４ミリモル）および１８⁴⁴（２４２ｍｇ，０．２４ミリモル，１．０当量）の溶液をＮａＨＣＯ₃（６１ｍｇ，０．７３ミリモル，３．０当量）、続いてＥＤＣＩ（１３９ｍｇ，０．７３ミリモル，３．０当量）で処理し、２５℃にて１２時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和水溶性ＮａＨＣＯ₃（２’２０ｍＬ）、続いて飽和水溶性ＮａＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，３’１５ｃｍ，１０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により１９（１０２ｍｇ，３１％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ１３５４．７８４４（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₆₇Ｈ₁₀₇Ｎ₁₁Ｏ₁₈は１３５４．７８６８を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ホルミル−ブト−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミン酸ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２０）
０℃まで冷却されたＴＨＦ（０．４３ｍＬ）およびｐＨ７水性リン酸塩緩衝液（０．０９ｍＬ）中の１９（４１ｍｇ，０．０３０ミリモル）の溶液をＨ₂Ｏ（０．１５ｍＬ）中のＣｕＣｌ₂（２０．４ｍｇ，０．１５ミリモル，５．０当量）の溶液で処理した。溶液を０℃にて１．５時間攪拌し、その後、ｐＨ８飽和水溶性ＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ溶液（５ｍＬ）の滴下によってそれをクエンチした。溶液をＣＨＣｌ₃（３’１０ｍＬ）で抽出し、Ｎ₂でパージし、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，１ｍｍプレート，８％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により２０（１９ｍｇ，４８％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ１３１２．７３１２（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₆₅Ｈ₁₀₁Ｎ₉Ｏ₁₉は１３１２．７２８６を必要とする。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミン酸（２２）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（１．００ｍＬ）中の１９（２５ｍｇ，０．０１９ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮した。固体残渣をＥｔ₂Ｏ（３’５ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して、２２−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（２１ｍｇ，１００％）を黄褐色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ１０１８．４１０２（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₄₃Ｈ₅₉Ｎ₁₁Ｏ₁₈は１０１８．４１１２を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ホルミル−ブト−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−γ−グルタミン酸（２１）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（１．００ｍＬ）中の２０（１６ｍｇ，０．０１２ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮した。固体残渣をＥｔ₂Ｏ（３’５ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して、２１−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（１３ｍｇ，１００％）を黄褐色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ９７６．３５７０（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₄₁Ｈ₅₃Ｎ₉Ｏ₁₉は９７６．３５３０を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミルーＬ−α−グルタミン酸ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２４）
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の１０（７．５ｍｇ，０．０２０ミリモル）および２３⁴⁵（２０．２ｍｇ，０．０２０ミリモル，１．０当量）の溶液をＮａＨＣＯ₃（５．１ｍｇ，０．０６０ミリモル，３．０当量）、続いてＥＤＣＩ（１１．６ｍｇ，０．０６０ミリモル，３．０当量）で処理し、２５℃にて４８時間攪拌した。反応物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和水溶性ＮａＨＣＯ₃（５ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，２ｍｍプレート，１０％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により２４（６．０ｍｇ，２２％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ１３７６．７７３０（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₆₇Ｈ₁₀₇Ｎ₁₁Ｏ₁₈は１３７６．７６８７を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−（ジメチルヒドラゾノ）ペント−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミン酸（２５）
０℃まで冷却されたＴＨＦ（０．２ｍＬ）およびｐＨ７水性リン酸塩緩衝液（０．０４ｍＬ）中の２４（１９ｍｇ，０．０１４ミリモル）の溶液をＨ₂Ｏ（０．０７ｍＬ）中のＣｕＣｌ₂（９．４ｍｇ，０．０７０ミリモル，５．０当量）の溶液で処理した。溶液を０℃にて１時間攪拌し、その後、ｐＨ８飽和水溶性ＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ溶液（５ｍＬ）の滴下によってそれをクエンチした。溶液をＣＨＣｌ₃（３’５ｍＬ）で抽出し、Ｎ₂でパージし、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。ＰＣＴＬＣ（ＳｉＯ₂，１ｍｍプレート，８％ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）によりベースライン不純物を除去した。単離された生成物をＣＨＣｌ₃（１．００ｍｌ）に溶解させ、０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、２５℃にて１２時間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮した。固体残渣をＥｔ₂Ｏ（３’５ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して、２５−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（３．４ｍｇ，２４からの２つの工程にわたり２２％）を黄褐色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ９７６．３５１７（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₄₁Ｈ₅₃Ｎ₉Ｏ₁₉は９７６．３５３０を必要とする）。

Ｎ−｛４−［５−（２，４−ジアミノ−６（１Ｈ）−ピリミジノン−５−イル）−１−ホルミル−ブト−２−イル］ベンゾイル｝−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミン酸（２６）。
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（１．００ｍＬ）中の２４（５．４ｍｇ，０．００４０ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。溶液を０℃にて２時間、および２５℃にて１２時間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮した。固体残渣をＥｔ₂Ｏ（３’５ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して２６−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（４．５ｍｇ，１００％）を黄褐色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ１０１８．４１５７（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₄₃Ｈ₅₉Ｎ₁₁Ｏ₁₈は１０１８．４１１２を必要とする）。

ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、およびＤＨＦＲ阻害
ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害を５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの不存在下で行い、１０ｎＭ酵素、２５ｍＭ阻害剤および２２．５ｍＭの補因子でスクリーニングした以外は、ＧＡＲおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害実験は従前に詳細²⁸に詳説されているように行った。ＤＨＦＲ阻害実験は、１０ｎＭ酵素、３０ｍＭ Ｈ₂Ｆ、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび３０ｍＭ阻害剤にて従前に詳説されているように行った。

［改良型阻害剤の設計］
活性部位求核体またはＧＡＲ／ＡＩＣＡＲ基質アミンいずれかと潜在的に相互作用し得る求電子官能基を取り込む葉酸ベースの阻害剤は従前に開示されている（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８３９−１８４６；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，６４３−６５９；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０００，１０，１４７１−１４７５；Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，８，１０７５−１０８６；Ｂｏｇｅｒ Ｄ．Ｌ．らＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０およびＢｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８４７−１８５２）。これらのうち最も重要なのは葉酸ベースの阻害剤１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０）であった。阻害剤−酵素複合体のＸ線およびＮＭＲ実験は、阻害剤がそれらのｇｅｍ−ジオールとして結合したことを明らかとした（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９９，３８，１６７８３−１６７９３）。ｇｅｍ−ジオールの形成はホルミル転移四面体中間体を模倣し、阻害剤とタンパク質の間に強い水素結合相互作用を提供する。

１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）は比較的優れたＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤であるが（Ｋ_i＝２６０ｎＭ）、それは、低い安定性、還元葉酸キャリアーによる効果的のない輸送、およびＦＰＧＳによる非効率的な細胞内ポリグルタミン化を含めた特性の組合せに帰される効果的な細胞傷害性活性を呈しなかった（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０）。対照的に、１０３のキナゾリンをジアミノピリミジノンで置き換える１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）は効果的なＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤であるのみならず、優れた細胞傷害性薬剤である（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ ＩＣ₅₀＝６０ｎＭ）。還元葉酸キャリアーによる効果的な輸送およびＦＰＧＳによる効果的なポリグルタミン化は、その細胞内蓄積を促進することによって細胞傷害性活性に寄与することが判明した。さらに、１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ（３）は、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（Ｋ_i＝６μＭ）と比較して、ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対してＫ_i＝１４ｎＭ）に対して顕著に選択的であることが判明した。それにもかかわらず、鍵となるホルミル基の容易な酸化的脱カルボニル化は化学的不安定性を３にもたらし、そのインビボ有用性を減じた。

可逆的酵素阻害剤としてのトリフルオロメチルケトンの使用は、最も顕著には、セリンプロテアーゼの分野にて幅広い適用を見てきた（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，Ｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９７６，５，２７１−３０６；Ｂｒｏｄｂｅｃｋ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９７９，５６７，３５７−３６９；およびＧｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５，２４，１８１３−１８１７）。ここで、トリフルオロメチルケトンを導入して、化合物３のアルデヒドを置き換えた。トリフルオロメチルケトンは、ホルミル基よりも大きな程度だけ求電子カルボニルのｇｅｍ−ジオール形成を安定化するように働くことができ、よって、ホルミル転移反応の四面体中間体を模倣することによって活性部位の結合を促進することができる。Ｎ１０を炭素で置き換えることによって、阻害剤はホルミル転移を妨げるが、葉酸結合部位に競合的に結合することができる（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０）。そのような阻害剤は、ホルミル転移反応に関与する葉酸−依存性酵素、例えば、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対する増強された親和性を呈し、従って、これらの酵素対チミジル酸シンテターゼ（ＴＳ）などのメチルまたはメチレン転移に関与する酵素に向けての選択性を呈する。

３のように、類似体１０１は還元葉酸キャリアーによって細胞内に輸送され、それを効果的に隔離するＦＰＧＳに対する基質となる。また、１０１は、アルデヒド３と比較して、強化された化学的安定性および薬理学的特性を呈することも想定される。従って、化合物１０１の展開は、改良された安定性、還元葉酸キャリアーまたは葉酸−結合膜タンパク質輸送系を含む経路によって細胞に侵入する能力、ＦＰＧＳによるポリグルタメート化形態への細胞内での効率的な変換、およびその標的酵素に対する阻害剤の選択性および親和性の最適化を含めた多数の因子の評価を必要とした。

ここに、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの種々のＸ線構造から得られた知識を適用して、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅのきつく結合する特異的阻害剤として作用する改良型化合物を設計した。基質および１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３、図１３）、非転移性ホルミル基を担う補因子類似体との複合体における大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）の以前の構造（大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ Ｋ_i＝２６０ｎＭ）は、阻害剤が酵素活性部位において水和されたアルデヒド（ｇｅｍ−ジオール）として結合して（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）、ホルミル転移四面体中間体を模倣することを明らかとした。

多数の一連の関連する候補阻害剤の合成および評価の結果として、主に、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体構造に基づき、改良型葉酸類似体、１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）（図１３）の設計、合成、および評価をここに開示する。この化合物はヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する選択性かつ密接な結合親和性を呈し（Ｋ_i＝１５ｎＭ）、細胞傷害性アッセイにおいてロメトレキソールよりも少なくとも１０倍効力がある。該類似体はさらにｐＨ７〜８において優れた安定性および溶解性を示し、それを動物モデルにおけるインビボ抗腫瘍テストに対して優れた候補とする多数のさらなる特性を保有する。生理学的ｐＨでの１．９８Å解像度における阻害剤を伴ったヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶構造は、活性結合部位内での阻害剤の詳細な相互作用および幾何学を規定し、天然葉酸補因子の結合のメカニズムを探索するためのコンピュータードッキング実験のために最良のモデルを提供する。１０−ホルミル−ＴＨＦ（図１３）の結合部位へのドッキングは、触媒トライアッド（Ｈｉｓ１０８、Ａｓｐ１４４およびＡｓｎ１０６）によって果たされる中枢的な役割についてのカイネティックおよび突然変異誘発データからの結論を強く支持し、将来阻害剤設計の基礎となるためのより生理学的に関連するモデルを提供する。

阻害剤の合成および化学的性質
１０１の合成は図１５に概説するように達成された。既知の酸塩化物１０５（Ａｒａｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）１９９７，４５，１９８４−１９９３）を、トリフルオロ酢酸無水物（ピリジン，ＣＨ₂Ｃｌ₂，−６０℃，４時間）の反応に続いて水性クエンチ（９５％）により対応するトリフルオロメチルケトン１０６に変換した（Ｂｉｏｖｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，１２８５−１２８８；およびＢｉｏｖｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，２５７３−２５８４）。１０６の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）スペクトルは、δ３．３４および３．１におけるベンジル性メチレンプロトンに対応するピーク、ならびにエノールメチンに対応するピークの不存在を明瞭に示し、これは、この化合物がＣＤ₃ＯＤ中ではヘミケタールとして存在することを示し、これは、さらに、¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）によって確認された。１０６のＮ，Ｎ−ジメチルヒドラジンとの反応（氷酢酸，無水エタノール，２５℃，４８時間，６４％）により、鍵となるＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン１０７が得られた。１０７の水素化ナトリウム脱プロトン化（ＤＭＦ，０℃，１５分）、および過剰な１，３−ジブロモプロパンでの引き続いての処理（６当量，ＤＭＦ，２５℃，２．５時間，６５％）により、モノアルキル化産物１０８が得られた。シアノ酢酸エチルの予め形成されたナトリウム塩（水素化ナトリウム，ＤＭＦ，０℃，３０分）を１０８でアルキル化して（ＤＭＦ，２５℃，２時間）、１０９（７１％）が得られ、塩基性条件下でのグアニジンの遊離塩基（１．２当量，ＣＨ₃ＯＨ，２５℃，１時間）での処理により所望のピリミジノン１１０（図１５）が得られた。１１０の水酸化リチウムでの処理（３当量，３：１ ＣＨ₃ＯＨ−Ｈ₂Ｏ，２５℃，２４時間）は、メチルエステルおよびジメチルヒドラゾンを共にきちんと加水分解し、１１１が得られ、これをＬ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩とカップリングさせて（ＥＤＣｌ，ＮａＨＣＯ₃，ＤＭＦ，２５℃，７２時間）、１１２が得られた。１１２の脱保護を、トリフルオロ酢酸での処理（１：４ ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＣＨＣｌ₃，２５℃，１２時間，１００％）により完了し、１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）が得られた。

最も重要なことには、かつ鍵となるホルミル基の容易な酸化的脱カルボニル化反応を共に受ける１０３および３（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０）とは異なり、１０１は、空気の存在下でｐＨ７〜８の緩衝液中で安定であり、７日後も分解または反応を示さなかった。１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）をＣＤ₃ＯＤ中の¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲによって特徴付けした場合、ケトンまたはエノールの形態は観察されず、１０１は専らヘミアセタールの形態で見出された。この挙動は、恐らくは、溶媒依存性であるが、これらの実験によると、１０１が、水性緩衝液中で、かつアッセイ条件下ではおそらく水和物の形態（ｇｅｍ−ジオール）で存在することを示している。最後に、分離可能なＣ１０ジアステレオマーの証拠は１０１では観察されず、これは、２つのジアステレオマーが迅速な平衡にあることを示す。

ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害
１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）は、他の密接に関連する葉酸ベースのＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤と比較して、ＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害に関してアッセイした（図１６）。化合物１０１はｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの非常に効果的な阻害剤であり、Ｋ_iは１５ｎＭである。重要なことには、該化合物は、それに対して１．９μＭのＫ_iで１００倍作用の弱い大腸菌酵素よりはむしろヒト酵素に対して選択性を示し、これは、ｒｈＧＡＲおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅでの過去の観察と合致する。１０１（Ｋ_i＝１５ｎＭ）は対応するアルコール１０２（Ｋ_i＝９００ｎＭ）よりも大まか６０倍優れており、Ｃ１０置換基を全く欠くＤＤＡＣＴＨＦ（Ｋ_i＝１．７μＭ）よりも１００倍優れていることが判明し、これは、ｇｅｍ−ジオールアルコールの各々が活性部位結合に寄与することを示す。阻害は三官能性酵素につきテストしなかったが、以前のデータは、組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅが無傷ヒト三官能性酵素に対して匹敵する活性を有することを示した（Ｐｏｃｈ，Ｍ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９８，１２，１７−２４；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５およびＳａｎｇｈａｎｉ，Ｓ．Ｐ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１０５０６−１０５１６）。

１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）、ならびにその対応するアルコール１０２はＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対して特異的阻害剤であるが、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、ＤＨＦＲおよびチミジル酸シンテターゼ（ＴＳ）を含めた他の葉酸−依存性酵素に対して不活性である（Ｋ_i＞１００μＭ）。これらの観察は、１０１がその優れた細胞傷害性活性をピリミジンではなくプリンの阻害、生合成を介して、かつＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの作用の前のステップにおいて誘導することを示す後のデータと合致する。

生物学的活性
１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）およびその対応するアルコール２を、添加されたヒポキサンチン（プリン）またはチミジン（ピリミジン）の存在（＋）および不存在（−）下でＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞傷害性活性について調べた（図１７）。化合物１０１は、プリン（ヒポキサンチン）が培地中に存在しない場合、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対して優れた細胞傷害性活性（ＩＣ₅₀＝１６ｎＭ）を呈する。さらに、それはロメトレキソール（ＩＣ₅₀＝２３０ｎＭ）よりも約１４倍優れており、培地プリンの存在下では不活性であった（ＩＣ₅₀＞１００μＭ）。ピリミジン（チミジン）ではなくプリンの存在に対するこの感受性は、１０１の細胞傷害性活性が、デノボプリン生合成経路において酵素の阻害に由来することを示す。これにより、既に開示されたヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害剤が最も強力ではない場合、最も強力なものの１つに１０１を位置づける。関連アルコール１０２（ＩＣ₅₀＝１．１μＭ）およびＣ１０置換基を欠くＤＤＡＣＴＨＦ（ＩＣ₅₀＝２．７μＭ）は、培地プリンの存在に対してやはり感受性である細胞傷害性活性を呈しており、しかしながら、共に、ケトン１０１よりもかなり作用が劣る。

また、ＡＩＣＡＲ救済実験を１０１およびその対応するアルコール１０２で行って、それらの細胞傷害性活性の源をさらに規定した。各場合、ヒポキサンチン（１００μＭ）またはＡＩＣＡＲモノホスフェート（１００μＭ）での細胞傷害性の逆行または救済の結果、ＩＣ₅₀が１０³〜１０⁴増加をもたらした（データは示さず）。従って、観察された活性は、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ酵素段階より前のプリン生合成の選択的阻害によるものであり、ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害と合致する。ＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対するこの選択的感受性は、インビトロにおけるＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅに対するそれらの不活性に基づいて、阻害剤１０１および１０２の予測される挙動である。

１０１および１０２の細胞傷害性活性が細胞膜を透過しての還元葉酸輸送に依存する程度は、還元葉酸キャリアーが不足する突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＭＴＸ）（Ｓａｎｇｈａｎｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１０５０６−１０５１６）に対してアッセイすることによって立証された。レモトレキソールと同様に、１０１および関連するヒドロキシル化合物１０２は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸに対する活性を喪失し（データは示さず）、これは、還元葉酸キャリアーが活性に必要であることを示し、それらが輸送に対する効果的な基質であることを意味する。

同様に、細胞傷害性活性に対するＦＰＧＳポリグルタミン化の重要性は、ＦＰＧＳが不足したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-）に対する阻害剤を調べることによって立証された。ロメトレキソールと同様に、１０１および関連するヒドロキシル化合物１０２（程度は低い）はこの細胞系に対する活性を欠如し、または喪失し（データは示さず）、これは、恐らくは、酵素阻害性活性を直接的に増強することによって、および／または細胞からの拡散を妨げることによる阻害剤の細胞内蓄積の結果としてのいずれかにより、ポリグルタミル化が阻害剤の活性に必要であることを示す。

Ｘ線構造決定
生理学的ｐＨ７において１０１と共結晶化したｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶構造は、サーチモデルとしてｐＨ８．５においてリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）を用いるＭＲによって、１．９８Å解像度で決定された（図１８）。結晶空間群は非対称単位当たり２つの分子を持つＰ３₁２１であるが、ダイマー相互作用は観察されず、これは、酵素が常にモノマーとして結晶化するヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの他の構造と合致する。２つのモノマーは非常に似た構造（０．４Åの主鎖ＲＭＳＤ）を有し、各々は、葉酸−結合部位において結合した阻害剤１０１を含む（図１８）。複合体の最終モデルは、無秩序により解釈できない最後の３つの残基を持つ、三官能性タンパク質からの残基８０８〜１００７を含む。残基のナンバリングはリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅについてのそれと同一である（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５）。

１０１および１０２の細胞傷害性活性が細胞膜を透過する還元葉酸輸送に依存する程度は、還元葉酸キャリアーが欠乏した突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＭＴＸ）（Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９，４９，１９５９−１９６３）に対してアッセイすることにより立証された。ロメトレキソールのように１０１および関連するヒドロキシル化合物１０２は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸに対する活性を喪失し（データは示さず）、これは、還元葉酸キャリアーが活性に必要であることを示し、それらが輸送に対して効果的な基質であることを意味する。

また、予備的１．８Å解像度構造が、ｐＨ５において１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）に結合したヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅに関して得られている。唯一の主な差は基質結合ポケットにおける以前に観察された立体配座異性であり、ここに、該ポケットはｐＨ５では基質に接近できないが、ｐＨ７では開いている（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５）。葉酸−結合部位は２つの構造において同一である（葉酸−結合ループ１４０〜１４６の主鎖ＲＭＳＤは０．０８Åである）。

全体的構造
ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅおよび１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）の間の複合体の全体的なトポロジーはｐＨ８．５における未リガンデッドタンパク質構造（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）と非常に似ている（図１８）（分子ＡおよびＢにつき０．８６Åおよび０．８９ÅのＲＭＳＤ）。分子Ｂは分子Ａ（３１．０Ųの平均Ｂ）よりもわずかに高い熱因子を有する（３５．３Ųの平均Ｂ）（図１９）。ループへリックス１１０〜１３１は、複合体構造（２４．５ŲのＢ値）においてかなり秩序立っており、これは、このループへリックスが、大腸菌酵素におけるｐＨ依存性秩序−無秩序転移とは異なり、ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅにおいて均一な立体配座を維持するという従来の結果と合致する（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５）（図１９）。基質β−ＧＡＲは結晶化スクリーニングにおいては存在せず、基質−結合部位は無機ホスフェートイオンによって占められていた（図１８）。葉酸−結合ループ１４１〜１４６が非常に高いＢ値を有する大腸菌複合体構造およびリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅとは異なり、ヒト酵素における同ループは、阻害剤に結合した場合、全体的構造（３３．０Ų）に対して匹敵するＢ値（３３．８Ų）を有する（図１９）。

阻害剤の結合
ＧＡＲ Ｔｆａｓｅの補因子結合ポケットは、該構造のＮ−末端モノヌクレオチド結合ドメインおよびＣ−末端半分の間の界面に位置する（図１８）。ＲおよびＳジアステレオマーが共に電子密度にモデル化できる（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）、１０−ホルミル−ＴＤＡＦと大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅおよび基質（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）の複合体と比較して、化合物１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦのＲ形態のみが、葉酸−結合部位で見出される（図１８）。葉酸補因子部位に対する結合部位は３つの部分：プテリジン結合裂目、ベンゾイルグルタメート領域、およびホルミル転移領域よりなる（図２０）。

プテリジン結合裂目
１０１のジアミノピリミジノン環は活性部位裂目に深く埋もれており、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）における１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）のキナゾリン環と同一の位置を占める。炭素単結合よりなるジアミノピリミジノン環からの結合ステムは、融合ベンゼン環の除去に起因して１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）におけるその対応物より長く、これによりタンパク質とＧＥＭ−ジオール相互作用を適正に保つために結合部位に適合させる場合に、さらに柔軟性に富むようになる。１０１のジアミノピリミジノン環は、１０３のキナゾリン環に対して約１５°傾いており、これは、Ｎ２を、Ｇｌｕ１４１の骨格カルボニル酸素の水素結合範囲（３．１Å）内に置く（図２０）。該ジアミノピリミジノン環は、１０３のキナゾリン環で以前に観察された鍵となる相互作用の全てを保存し、酵素とのさらなる鍵となる水素結合を供する。いくつかの疎水性残基は複素環を保持する深いキャビティーを囲う。疎水性ポケットは、一端に並んだＬｅｕ８５、Ｉｌｅ９１、Ｌｅｕ９２、Ｐｈｅ９６およびＶａｌ９７、および他端における葉酸−結合ループ１４１〜１４６よりなる。ジアミノピリミジノン環はＡｒｇ９０、Ｌｅｕ９２、Ａｌａ１４０、Ｇｌｕ１４１およびＡｓｐ１４４の主鎖アミドおよびカルボニルに対する６つの水素結合、および秩序立った水に対する２つの水素結合（Ｗ１８およびＷ７０）を作る（図２０）。

１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）のキナゾリン環においては、葉酸プテリジン環のＮ８は炭素によって置き換えられる。この窒素は、認識および葉酸−結合酵素との相互作用において鍵となる役割を担うことが提案されており、水素結合ドナー−アクセプター−ドナーアレイの一端を形成する。炭素による置換はＧＡＲ Ｔｆａｓｅに対する結合を排除しないが、その存在は、葉酸輸送システムおよび／またはＦＰＧＳによる基質認識に寄与するように見える。しかしながら、１０１のジアミノピリミジノン環状はこの窒素（Ｎ８）を維持し、その結果、優れた生物学的特性を呈する。１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ複合体においては、このアミノ基は、Ａｒｇ９０のカルボニル酸素（２．８Å）および秩序立った溶媒分子Ｗ７０（２．７Å）に対して水素結合を形成する（図２０）。

グルタメートテイル：
葉酸のベンゾイルグルタメート基の役割は未だ十分には理解されていない。しかしながら、ベンゾイルグルタメートテイルを含まない１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ１０１化合物はＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ双方に対して不活性である。１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ複合体においては、ｐ−アミノベンゾエート部位は疎水性ポケット中に位置し、Ｉｌｅ９１およびＳｅｒ１１８の側鎖の間に挟まれている。カルボニル基の電子密度はよく規定されており、フェニル環と同一平面にある。グルタメートテイルはｐ−アミノベンゾエート平面に対してほとんど垂直であって、ジアミノピリミジノン環の脂肪族ステムに平行な向きである（図２０）。

グルタメート部位は予測されるように溶媒に露出されているが、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体構造におけるその柔軟性とは対照的に、顕著によく秩序立った構造を呈する（図２０）。単一グルタメートは、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅについてのグルタメート（化合物１１１）を含まない類似体１０１の阻害の欠如によって示されるように、きつい結合に対して実質的に寄与することができる（データは示さず）。従って、この複合体における１０１のグルタメートは、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅとの以前の葉酸類似体複合体において見出されるように、同一表面ポケットにおけるその好ましい位置を反映することができる（図２１）。

大腸菌においては、２つの区別されるポリグルタミル化活性はαまたはγカルボキシレートいずれかを介してのアミド結合を含む（Ｆｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３６３−１６３７１；およびＦｅｒｏｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，１６３５６−１６３６２）。これらのグルタメート位置のいずれかは、分岐カルボニルが結合ポケットに面するように、Ａｒｇ６４に対する塩橋を介して固定することができ；従って、ａまたはｇ位置いずれかにおけるさらなるグルタメート部位は容易に収容することができる。ＢＷ１４７６Ｕ８９（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，２４９，１５３−１７５）および１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）複合体（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）において、γ−グルタメートカルボキシレートはＡｒｇ６４とで塩橋を形成し、α−カルボキシレートは溶媒に面しており、α−ポリグルタメート化類似体についての阻害剤立体配座を反映する（図２１）。しかしながら、エポキシド−由来葉酸類似体複合体構造（ＰＤＢ暗号１ＪＫＸ）（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１３５３８−１３５４７）において、α−グルタメートカルボキシレートは、代わりに、大腸菌酵素と塩橋を形成し、γ−ポリグルタメート化コンフォーマーとの好ましい相互作用を示す。いくつかの場合、明白な好ましい結合の向きは観察されず、従って、グルタメートテイルは、ＤＡＴＨＦおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体（Ａｌｍａｓｓｙ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９，６１１４−６１１８）のように、これらの結晶構造において無秩序となる傾向がある。

この問題は、全てのグルタメートが以前のグルタメートのγカルボキシレートにおいて付加される真核生物においては単純化される。ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体における１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦのグルタメートテイルは明確な密度を呈する（図２０）。塩橋（２．７Å）は、γ−カルボキシレートが溶媒に面するように（図２１）、グルタメートα−カルボキシレートおよびＡｒｇ６４の間に形成される（図２０）。ここに観察されるさらなる相互作用は、Ｉｌｅ９１骨格アミドおよびα−グルタメートカルボキシレートの間に水素結合を含む（２．８Å）（図２０）。

ホルミル転移領域およびｇｅｍ−ジオール構造：
阻害剤１０１のＧＡＲ Ｔｆａｓｅへのきつい結合のための鍵となる相互作用は、ホルミル転移領域で見出される。ケトン酸素の隣の濃い密度は、ケトンが、大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅとの１０−ホルミル−ＴＤＡＦおよびβ−ＧＡＲ複合体（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）と同様に、ｇｅｍ−ジオールに水和することを示す。

ｇｅｍ−ジオールは、ホルミル転移領域、特に、ホルミル転移反応において２つの必須の残基であるＡｓｐ１４４およびＨｉｓ１０８との広範な相互作用を形成する（図２０）。Ａｓｐ１４４カルボキシレートは、ｇｅｍ−ジオールの水酸基の各々に対して水素結合する（２．５Åおよび２．７Å）。Ｈｉｓ１０８のイミダゾール環におけるＮ３もまたｇｅｍ−ジオールの双方の水酸基とで水素結合を形成する（ＯＡ１（２．７Å）およびＯＡ２（３．１Å））。加えて、ＯＡ２もまたＧｌｙ１１７の骨格カルボニル酸素と潜在的水素結合（３．０Å）を作る。該酵素および阻害剤との間の広範な水素結合相互作用は、ヒドロキシル基のうちの１つを欠く１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦの対応するアルコール（図１３、化合物１０２）が、なぜ約５０倍作用が低いかを説明する。

葉酸−結合ループ
ＧＡＲ Ｔｆａｓｅについての阻害剤設計の主な挑戦の１つは、ホルミル転移のための鍵となる残基（Ａｓｐ１４４）を含む葉酸−結合ループ１４１〜１４６の構造異性である。異なる条件下では、このループは種々の立体配座を示す（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，２４９，１５３−１７５；Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９９，３８，１６７８３−１６７９３；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５；Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００１，４０，１３５３８−１３５４７；およびＳｕ．Ｙ．，ら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８１，４８５−４９９）（図２２）。例えば、ｐＨ３．５における大腸菌ＧＡＲの絶対的モノマー突然変異体（Ｅ７０Ａ）（ＰＤＢ暗号２ＧＡＲ）において、このループは葉酸−結合ポケットに折り畳まれ（閉じた立体配座）、葉酸結合位置を占め（図２２）、一方、ｐＨ７．５においては（ＰＤＢ暗号３ＧＡＲ）（Ｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８１，４８５−４９９）、結合ポケットが葉酸または葉酸類似体に接近可能なように離れる（図２２）。１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）および基質との大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）（Ｇｒｅａｓａｅｙ，Ｓ．ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１６７８３−１６７９３）において、葉酸−結合ループは、Ａｓｐ１４４および水和したアルデヒドの間の水素結合を通じてｇｅｍ−ジオール構造を安定化させる。エポキシド由来類似体複合体（ＰＤＢ １ＪＡＸ）においては、該ループはさらにもう１つの立体配座を有し（図２２）、そこでは、Ａｓｐ１４４相互作用は、阻害剤への直接的水素結合の代わりに、秩序立った溶媒分子のクラスターを介して媒介される（Ｇｒｅａｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１３５３８−１３５４７）。

ｐＨ８．５におけるリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）において、このループはｐＨ４．２におけるを除き「半分開いている状態」（ＰＤＢ暗号１ＭＥＯ）、これらの残基は無秩序である（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５）（図２２）。残基１４１〜１４６が非常に高いＢ値を有するか、無秩序であるこれらの多数立体配座は、いずれの構造がコンピュータ−計算およびドッキング実験で最適であるかを決定するのを問題とする。しかしながら、この柔軟なループは、葉酸−類似体、１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦの結合に際してヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅにおいて安定化する（図２２）。該ループは全酵素（３３．０Ų）に対して匹敵するＢ値（３３．８Ų）を持つ優れた密度を呈し（図１９）、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１４２およびＶａｌ１４３の側鎖の向きを除き、１０−ホルミルＴＤＡＦとの大腸菌酵素複合体に対して同一の立体配座を有する。

ループ立体配座のこれらの変化は、酵素との大部分の阻害剤相互作用を提供するのを助ける。Ｇｌｕ１４１およびＡｓｐ１４４の骨格カルボニル酸素は、ジアミノピリミジノン環を直接的に固定するのに関与し、一方で、水分子（分子ＡにおけるＷ１８および分子ＢにおけるＷ２７）は、骨格アミドと葉酸−結合ループおよびジアミノピリミジノン環のカルボニルとの間の相互作用を媒介する。しかしながら、最も重要なことには、ループの先端におけるＡｓｐ１４４は阻害剤との鍵となる相互作用を供する。Ａｓｐ１４４の側鎖は約９０°回転しリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造と比較して、５．５ÅのＲＭＳＤ）、葉酸−結合ポケットにフリップして、ｇｅｍ−ジオールとで水素結合を形成し（図２２）、それをＨｉｓ１０８の付近に置く（図２２）。柔軟なＨｓｐ１４４とは対照的に、Ｈｉｓ１０８は、Ｌｙｓ１１５の主鎖カルボニル酸素（２．８Å）およびＳｅｒ１１０の水酸基（３．０Å）とのその相互作用によってしっかりと固定される。Ａｓｐ１４４の移動は、Ｈｉｓ１０８との塩橋の形成を促進し、これは、ホルミル転移反応に不可欠であるように見える（Ｓｈｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１００２４−１００３１）。高度に秩序立った葉酸−結合ループおよび阻害剤とのその広範な相互作用は、この構造が計算ドッキングのための優れた鋳型であることを示唆する。

葉酸補因子のドッキング
天然補因子１０−ホルミル−ＴＨＦは不安定であって、共結晶化研究に適していない。従って、計算ドッキングを用いて、酵素および天然補因子の間の相互作用を調べた。１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦとのヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体の座標を用い、６つのドッキングクラスターを得た。ドッキングエネルギー−１９．０ｋｃａｌ／モルおよび−１５．５ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーを持つ最低エネルギークラスターはまた最も大きく、全てのコンフォーマーのほぼ半分（４９％）に相当する（図２３）。対照的に、１１ものクラスターが、アポヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）で得られたが、これはコンフォーマーのたったの１５％に相当する最も優勢なクラスターを備え、あまり好ましくないドッキングエネルギー（−１６．４ｋｃａｌ／モル）を有する（図２３）。さらに、アポヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ鋳型と共にドッキングすると、公表されたキネティックおよび構造データとは矛盾して、プテリジン環が葉酸結合ループ（１４１〜１４６）およびＨｉｓ１０８の間に挿入される。鋳型としてのｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）複合体との補因子の最良のコンフォーマーにおいて、ホルミル基は、隣接するＡｓｐ１４４と共に、Ｈｉｓ１０８（３．０Å）およびＡｓｎ１０６（３．２Å）に水素結合し、これは、潜在的に、Ｈｉｓ１０８のプロトン化を安定化させる（図２２）。ドッキングされた葉酸補因子のこの立体配座は提案されたメカニズムを強く支持する（Ｓｈｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１００２４−１００３１；およびＳｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８１，４８５−４９９）。従って、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）鋳型は、メカニズムの研究および構造ベースの薬物設計のためにかなり適している。

ヒトおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ双方への葉酸結合を比較するために、４つの異なる大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造について包括的なドッキング分析を行った（図２３）。最低のドッキング（−１７．７ｋｃａｌ／モル）および結合エネルギークラスター（−１４．５ｋｃａｌ／モル）が、１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）および基質β−ＧＡＲとの大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）で観察された。多重基質付加体複合体（ＰＤＢ暗号１ＧＡＲ）に関しては、唯一のクラスターであるＢＷ１４７６Ｕ８９が得られた。しかしながら、葉酸と阻害剤の基質部位の間の共有結合炭素および硫黄リンカーは活性部位を歪める可能性があり、その結果、より好都合でないドッキングエネルギー（ドッキングＥ＝−１６．９ｋｃａｌ／モル）がもたらされる。同様に、エポキシド−由来阻害剤複合体（ＰＤＢ暗号１ＪＫＸ）もまた鋳型としてより好都合ではない（ドッキングＥ＝−１５．５ｋｃａｌ／モル）。最悪の場合がアポ大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅで見出され、１８クラスターの散乱が伴い、そのいずれも合理的な葉酸−結合位置を有さず、ドッキングエネルギーは最低エネルギークラスターで−１３．９ｋｃａｌ／モルに過ぎなかった。この場合、ドッキングされた葉酸プテリジン環はその位置を逆転させ、基質−結合ポケットに結合し、これは、明らかに、葉酸類似体および大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体構造と矛盾する。

種々のヒトおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造（各々、ｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦおよびｅＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０−ホルミル−ＴＤＡＦ−β−ＧＡＲからの鋳型）からの最良のドッキング結果の比較は、葉酸−結合部位および葉酸補因子が類似の立体配座を有することを示す（図２２）。わずかの差（１４０〜１４６における０．４ÅのＲＭＳＤ）は、主に大腸菌構造におけるこのループのより高い柔軟性によって引き起こされる。葉酸補因子については、プテリジン環は、主として、タンパク質の骨格に対して水素結合を形成する。ホルミル基はＨｉｓ１０８、Ａｓｐ１４４およびＡｓｎ１０６、ホルミル転移触媒トライアッドに近い（図２２）。ドッキングは、Ｈｉｓ１０８、Ａｓｐ１４４およびＡｓｎ１０６が、酵素ホルミル転移反応にとって中枢的であることを確認する。

材料および方法
材料
Ｌ培地および寒天はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ゲイザーズバーグ，メリーランド州）から入手した。全ての共通の緩衝液および試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（セントルイス，ミズリー州）から購入した。

１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１）の合成および特性
４−（３，３，３−トリフルオロ−２−オキソプロピル）安息香酸メチル（１０６）
既知の酸塩化物１０５（３７．７ｇ，１７７ミリモル）を水性ＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍＬ）に溶解させ、−６０℃まで冷却した。無水トリフルオロ酢酸（７７．０ｍＬ，５４３ミリモル，３当量）を攪拌溶液にゆっくりと添加した。無水ピリジン（３０．０ｍＬ，３７１ミリモル，２当量）を滴下し、反応混合物を−６０℃にて４時間攪拌した。Ｈ₂Ｏ（３５ｍＬ）を攪拌溶液に滴下することによって反応をクエンチし、続いて、２５℃まで加温した。反応混合物をＨ₂Ｏ（６００ｍＬ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）の間に分配した。有機層を１Ｎ ＨＣｌ（２×５００ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（５００ｍＬ）で洗浄し、続いて、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により１０６（４１．３ｇ，９５％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ２４５．０４３６（Ｍ−Ｈ⁺，Ｃ₁₁Ｈ₉Ｆ₃Ｏ₃は２４５．０４３１を必要とする）。

４−（３，３，３−トリフルオロ−２−ジメチルヒドラゾノプロピル）安息香酸メチル（１０７）
化合物１０６（３５．６ｇ，１４５ミリモル）を無水ＥｔＯＨ（６００ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドラジン（５５．０ｍＬ，７２４ミリモル，５当量）をこの溶液に添加し、続いて、氷酢酸（８．３０ｍＬ，１４５ミリモル，１当量）を添加し、混合物を２５℃にて４８時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，２：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により１０７（２６．８ｇ，６４％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ２８９．１１６６（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₁₃Ｈ₁₅Ｆ₃Ｎ₂Ｏ₂は２８９．１１５８を必要とする）。

４−［４−ブロモ−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−ジメチルヒドラゾノエチル）ブチル］安息香酸メチル（１０８）
０℃にて、ＮａＨ（６０％分散、２．３４ｇ，５８．６ミリモル，６当量）を無水ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中の１０７（１６．７ｇ，５８．１ミリモル）の攪拌溶液に添加した。溶液を０℃にて１５分間攪拌した。１，３−ジブロモプロパン（３５．０ｍＬ，３４５ミリモル，６当量）を素早く反応物に添加し、冷却浴を取り除いた。反応混合物を２５℃にて２．５時間攪拌した。反応を飽和水性ＮＨ₄Ｃｌ（１５０ｍＬ）の添加によってクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）およびＨ₂Ｏ（４００ｍＬ）の間に分配した。有機層をＨ₂Ｏ（２×５００ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（１×５００ｍＬ）で洗浄し、続いて、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により１０８（１５．４ｇ，６５％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４０９．０７２３（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₁₆Ｈ₂₀ＢｒＦ₃Ｎ₂Ｏ₂は４０９．０７３３を必要とする）。

４−［４−シアノ−４−エトキシカルボニル−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−ジメチルヒドラゾノエチル）ブチル］安息香酸メチル（１０９）
０℃にて、無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）中のＮａＨ（６０％分散，２６．０ｇ，６５５ミリモル，１８当量）の懸濁液をシアノ酢酸エチル（７０．０ｍＬ，６５７ミリモル，１８当量）で滴下処理した。反応混合物を０℃にて３０分間攪拌し、ナトリウム塩を透明な溶液として形成した。このアニオンを無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）中の１０８（１４．４ｇ，３５．７ミリモル）の溶液で処理した。反応混合物を２５℃にて２時間攪拌し、その後、飽和水性ＮＨ₄Ｃｌ（５０ｍＬ）の添加によってクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で希釈し、Ｈ₂Ｏ（５×４００ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（４００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。過剰のシアノ酢酸エチルを留去し、残存する生成物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，７：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃによって精製し、１０９（１１．２ｇ，７１％）を黄色油として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４６４．１７６８（Ｍ＋Ｎａ⁺，Ｃ₂₁Ｈ₂₆Ｆ₃Ｎ₃Ｏ₄Ｎａは４０９．１７６８を必要とする）。

４−［４−（２，４−ジアミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−ジ−メチルヒドラゾノエチル）ブチル］安息香酸メチル（１１０）
ナトリウム金属（０．７１ｇ，３０．９ミリモル，２当量）を無水ＣＨ₃ＯＨ（１５ｍＬ）に添加し、反応混合物を２５℃にて１０分間攪拌して、ＮａＯＣＨ₃を得た。グアニジン−ＨＣｌ（１．４７ｇ，１５．４ミリモル，１当量）を添加し、反応混合物を２５℃にて３０分間攪拌した。別途、１０９（６．７８ｇ，１５．４ミリモル）を無水ＣＨ₃ＯＨ（１５ｍＬ）に溶解させ、この溶液を素早く攪拌反応混合物に添加した。得られた反応混合物を還流下で１６時間攪拌した。反応混合物を直接ＳｉＯ₂プラグに適用した。３：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃで洗浄することによって不純物を除去した。生成物を引き続いて１０：１ ＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨで洗浄することによって溶出させて、１１０（３．９１ｇ，５６％を黄褐色固体として得た。ＭＡＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ４５５．２００１（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₀Ｈ₂₅Ｆ₃Ｎ₆Ｏ₃は４５５．２０１３を必要とする）。

４−［４−（２，４−ジアミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）−１―（２，２，２−トリフルオロアセチル）ブチル］安息香酸（１１１）
３：１ ＣＨ₃ＯＨ−Ｈ₂Ｏ（８０ｍＬ）中の１１０（２．１１ｇ，４．６４ミリモル）の溶液をＬｉＯＨ−１Ｈ₂Ｏ（０．５９ｇ，１３．９ミリモル，３当量）で処理し、反応を２５℃にて２４時間攪拌した。反応混合物をＨ₂Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、水性層をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で洗浄した。水性層を１Ｎ塩酸の添加によってｐＨ＝４に酸性化した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＮｅＣＮ（３×１００ｍＬ）で処理して、痕跡量のＨ₂Ｏを除去し、１１１（１．８４ｇ，１００％）が得られ、これをさらに精製することなく用いた。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ３９９．１２７５（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｆ₃Ｎ₄Ｏ₄は３９９．１２７５を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ブチル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１１２）
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１１１（１．８４ｇ，４．６２ミリモル）およびＬ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（１．７１ｇ，４．７６ミリモル，１当量）の溶液をＮａＨＣＯ₃（１．４１ｇ，１６．８ミリモル，４当量）、続いてＥＤＣｌ（１．７１ｇ，８．９ミリモル，２当量）で処理した。反応混合物を２５℃にて４８時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣をＣＨＣｌ₃（３００ｍＬ）に懸濁させ、飽和水性ＮａＨＣＯ₃（２×３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，１０：１ ＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨ）により１１２（１．２９ｇ，４４％）を黄色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ６４０．２９７５（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₃₀Ｈ₄₀Ｆ₃Ｎ₅Ｏ₇は６４０．２９５２を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジンー５−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ブチル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（１０１）
０℃まで冷却されたＣＨＣｌ₃（１２０ｍＬ）中の１１２（１．２９ｇ，２．０２ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸（３５ｍＬ）で処理した。反応混合物を加温し、２５℃にて１２時間攪拌した。反応を減圧下で濃縮した。Ｅｔ₂Ｏ（７５ｍＬ）を添加し、沈殿が形成された。沈殿を収集し、Ｅｔ₂Ｏ（３×７５ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して１０１−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ（１．３０ｇ，１００％）を白色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５２８．１７０９（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₂Ｈ₂₄Ｆ₃Ｎ₅Ｏ₇は５２８．１７０１を必要とする）。

Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジアミノ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシエチル）ブチル］ベンゾイル｝−Ｌ−グルタミン酸（１０２）
−２０℃にて、無水ＣＨ₃ＯＨ（０．５ｍＬ）中の１１２（０．０１０ｇ，０．０１６ミリモル）の溶液をＮａＢＨ₄（０．００１２ｇ，０．０３１ミリモル，２．０当量）で処理した。反応混合物を−２０℃にて３０分間攪拌し、その後、それをＨ₂Ｏ（１ｍＬ）の添加によってクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈し、Ｈ₂Ｏ（２×１ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、減圧下で濃縮した。０℃にて、得られた生成物（０．００９ｇ，０．０１４ミリモル）を４Ｎ ＨＣｌ−ジオキサン（２ｍＬ）で処理し、溶液を加温し、２５℃にて３時間攪拌した。反応をＮ₂でパージし、次いで、減圧下で濃縮した。Ｅｔ₂Ｏ（１ｍＬ）を添加し、沈殿が形成された。沈殿を収集し、Ｅｔ₂Ｏ（３×１ｍＬ）で粉砕し、真空中で乾燥して１０２−ＨＣｌ（０．００４ｇ，１０１から９０％）を黄色固体として得た。ＭＡＬＤＩＦＴＭＳ（ＤＨＢ）ｍ／ｚ５３０．１８３８（Ｍ＋Ｈ⁺，Ｃ₂₂Ｈ₂₆Ｆ₃Ｎ₅Ｏ₇は５３０．１８５７を必要とする）。

組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅタンパク質調製
組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ｐｕｒＮ）構築体は、ヒト三官能性酵素（ｐｕｒＤ−ｐｕｒＭ−ｐｕｒＮ）からの残基８０８〜１０１０を含む。Ｃ−末端にヘキサ−ヒスチジンタグを持つＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌクローニング部位を用い、遺伝子をｐｅｔ２２Ｂベクターにサブクローニングした。プラスミドを大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄに形質転換した。タンパク質を発現させ、従前に記載されているように精製した（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，１４２０６−１４２１５）。タンパク質の収率は、精製後に、ＬＢブロス１リットル当たり３０ｍｇよりも大きく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価すると少なくとも９８％純度であった。精製されたタンパク質は阻害アッセイ、細胞傷害性アッセイおよび結晶化実験で用いた。

ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害アッセイ
葉酸類似体についてのＫ_i値は従前に記載されているように測定した（Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８１７−１８３０）。簡単に述べると、各化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、次いで、アッセイ緩衝液中に希釈した。低濃度のＤＭＳＯは酵素活性に影響しなかった。従って、全てのアッセイは、２６℃にて、合計容量１ｍＬの緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）中で１０μＭの１０−ホルミル−５，８−ジデアザ葉酸（ｆＤＤＦ）、２０μＭ阻害剤を混合することによって行い、反応は、７６ｎＭ 大腸菌またはヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの添加によって開始した。アッセイでは、ホルミル基のβ−ＧＡＲへの転移から得られたｆＤＤＦの脱ホルミル化（２９５ｎｍにおいてΔε＝１８．９ｍＭ^-1ｃｍ^-1）をモニターする。もし阻害剤が活性であることが判明すれば、異なる固定濃度（例えば、４，８．１２．１６，２０．３２μＭにおける一連の１／ｖ_i対１／［ＧＡＲ］を作成して、競合阻害についてのミカエリス−メンテン方程式を用いてＫ_iを決定した。

細胞傷害性アッセイ
従前に記載されているように（Ｂｏｄｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，５，１８４７−１８５２）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭヒト白血病細胞を用いて化合物の細胞傷害性活性を測定した。２つの突然変異体細胞系であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＭＴＸおよびＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-を用いて、各々、還元葉酸活性輸送系およびホリルピログルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）に対する依存性を測定した（Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９，４９，２４５５−２４５９）。

結晶化およびデータ収集
１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＣＴＨＦ（１０１）との複合体におけるヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶は、２μＬシッティングドロップにおいて蒸気拡散の方法によって得られた。１６ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質溶液を３倍モル過剰の阻害剤と混合した。４℃における７日後に、ＰＥＧ４Ｋ、０．２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．７〜７．０の溶液から針型の結晶が得られた。データは単結晶からＡＤＳＣ ２×２ ＣＣＤディテクターで収集し、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＳＳＲＬ）にてビーム−ライン９−２で−１７９℃において２０％グリセロールによって凍結保護した。データ組をＨＫＬ２０００で処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９７，２７６，３０７−３２６）。結晶空間群は４．５ųＤａ^-1のＭａｔｔｈｅｗｓ係数（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１９６８，３３，４９１−４９７）を持つ非対称格子当たり２つの分子を伴った三方晶Ｐ３₁２１であり、７５％の比較的高い溶媒含有量に対応し、これは、むしろ脆い結晶に合致する。データ収集および処理についての統計値は図１４にまとめる。

また、１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）と複合体化したヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅは、非対称格子（Ｖｍ＝４．５ųＤａ^-1）当たり４つの分子を除き、ｐＨ７．０結晶に対して同様の単位格子（ａ＝ｂ＝１２６．０７Å，ｃ＝９４．０２Å）を持つ三方晶空間群Ｐ３₁にて（図１４）、ｐＨ５．０〜５．５でＭＰＥＧ５５００、１００ｍＭ酢酸ナトリウム中で結晶化させた。

構造ソリューションおよび構造精密化
１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）との複合体におけるヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの結晶構造を、ＣＣＰ４パッケージからのプログラムＡｍｏＲｅにおけるサーチモデル（ＣＣＰ４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９４，Ｄ５０，７６０−７６３）としてのリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）を用いる分子置換（ＭＲ）（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ，１９７２，Ｇｏｒｄｏｎ ＆ Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって決定した。初期改良は、プログラムＣＮＳ（Ｍａｒａｎｇｏｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ １９９０，３１，２３９−２４６）を用いて行った。葉酸阻害剤の位置は、第１ラウンドの改良の後においてさえＦｏ−Ｆｃマップで明瞭であった。阻害剤モデルをＯを用いて電子密度にビルトインし（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９１，Ａ４７，１１０−１１９）；ケトン酸素に隣接する強い密度は、阻害剤の水和形態が結合していることを示唆した。２倍の非結晶学的拘束を、他のＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造において異なることが確かめられた柔軟性領域（残基２１〜２６，５８〜６３，１４１〜１４６および１９０〜２００）を除いて、分子ＡおよびＢの改良で用いた。最終改良は、ＣＣＰ４ ＲｅｆｍａｃプログラムからのＴＬＳ改良（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００１，Ｄ５７，１２２〜１３３）を用いて行った。最終Ｒ_crystおよびＲ_freeは、各々、２２．３％および２４．７％である。最終モデルはＰｒｏｃｈｅｃｋ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９３，２６，２８３−２９１）によって評価し、異常値がないＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの最も好都合な領域において９２．６％の残基を有する。図１８、２０および２２をＢｏｂｓｃｒｉｐｔ（Ｅｓｎｏｕｆ，Ｒ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ．１９９７，１５，１３２−１３４）で創製し、Ｒａｓｔｅｒ３Ｄでレタリングした（Ｍｅｒｒｉｔｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９４，Ｄ５０，８６９−８７３）。図２１はＰＭＷで作成した（Ｃｏｏｎ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｎｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｙｔｈｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２００１，Ｌｏｎｇ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。最終改良統計値は図１４に示す。座標および構造因子は受入暗号１ＮＪＳにてＰＤＢに寄託した（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００，２８，２３５−２４２）。

補因子の自動ドッキング
補因子１０−ホルミル−ＴＨＦの計算ドッキングについてのＧＡＲ Ｔｆａｓｅの２つのヒトおよび４つの大腸菌鋳型を、阻害剤座標を除いてアポおよびリガンド複合体構造から抽出した。ヒト組換えＧＡＲ Ｔｆａｓｅについては、ｐＨ８．５における公表されたアポ構造（ＰＤＢ暗号１ＭＥＪ）および１０１とのその複合体をコンピュータードッキング実験で用いた。大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅについては、ｐＨ７．５におけるアポ構造（ＰＤＢ暗号１ＣＤＥ）、およびＢＷ１４７６Ｕ８９とのその複合体（ＰＤＢ暗号１ＧＡＲ）、エポキシドベースの阻害剤および基質（ＰＤＢ暗号１ＪＫＸ）、および１０−ホルミル−ＴＤＡＦ（１０３）および基質（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）を補因子ドッキングで用いた。非極性水素を重原子と組み合わせ、Ｋｏｌｌｍａｎ電荷を割り当てた（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８４，１０６，７６５−７８４）。その報告された高いｐＫ_a（Ｓｈｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，８７７６−８７８２）のため、Ｈｉｓ１０８は電荷＋１で十分にプロトン化された。１０−ホルミル−ＴＨＦが形成され、ＩＮＳＩＧＨＴＩＩで最小化した［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．］。全ての原子のＧａｓｔｅｉｇｅｒ電荷を加え、非極性水素を組み合わせた（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９８０，３６，３２１９−３２２８）。ＡｕｔｏＤｏｃｋ ３．０．５（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９０，８，１９５−２０２；およびＭｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｕｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，１９，１６３９−９３６−１６６２）、柔軟性のあるリガンドのタンパク質標的への自動ドッキング用のプログラムのスートを用いて、天然補因子１０−ホルミル−ＴＨＦを活性部位にドッキングした。ドッキングシミュレーションは、エネルギー評価についての迅速なグリッドベースの探索方法と共にＬａｍａｒｋｉａｎ遺伝子アルゴリズムを用いて行った。ＡｕｔｏＤｏｃｋのＡｕｔｏＴｏｒｓユーティリティを用いて、リガンド中の１１の回転可能な結合および１０の芳香族炭素を帰属決定した。ドッキング用のパラメーターは以下の通りである：１００のトライアル、１５０の集団サイズ、ランダム開始位置および立体配座、０．５Åの転換工程、１５°の回転工程、１のエリティズム、０．０２の突然変異率、０．８の交差率、０．０６の局所的サーチ速度、および５０００万エネルギー評価。最終的なドッキングされた立体配座は、１．５Å根平均自乗偏差（ＲＭＳＤ）のトレランスを用いてクラスター化した。

略語：
ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ；１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ、１０−トリフルオロアセチル−５，１０−ジデアザ−非環式−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸；ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミド−リボヌクレオチドトランスホルミラーゼ；１０−ホルミル−ＴＨＦ、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸；β−ＧＡＲ、β−グリシンアミドリボヌクレオチド；ＤＨＦＲ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ；ＤＤＡＴＨＦ、５，１０−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸；ＦＰＧＳ、ホリルポリグルタミン酸シンテターゼ；１０−ホルミル−ＴＤＡＦ、１０−ホルミル−５，８，１０−トリデアザ葉酸；１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ、１０−ホルミル−５，１０−ジデアザ−非環式−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸；ＴＳ、チミジル酸シンテターゼ；ｆＤＤＦ、１０−ホルミル−５，８−ジデアザ葉酸；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＳＳＲＬ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＲＭＳＤ、根平均自乗偏差；ＭＲ、分子置換。

プリンの生合成においてＧＡＲ Ｔｆａｓｅによって触媒される反応を示す模式図である。生合成経路には２つのホルミル転移反応がある。第二のホルミル転移はアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ）によって達成される。 ロメトレキソール（４）、（６Ｒ）−５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（（６Ｒ）−ＤＤＡＴＨＦ）、および４の類似体である非環式誘導体５の構造を示す。 非転移性ホルミル基を有する１の類似体である１０−ホルミル−ＤＤＡＣＴＨＦ３の合成を示す模式図である。 １１からの１２および１３双方の形成を示す模式図である。１３は、ジメチル−ヒドラゾンを加水分解するこの反応における酸化的脱ホルミル化の結果として生じる副生成物である。 反応の標準的な組を用いるアルデヒド１２からの公知のアルコール１７の生成を示す模式図である。 γ−ペンタグルタメート結合を有する葉酸類似体の合成を示す模式図である。これは、これらの化合物についてのこの結合の性質の重要性を確立するであろう。γ−ポリグルタメートのみが真核生物で見出されてきた。 α−ペンタグルタメート結合を有する葉酸類似体の合成を示す模式図である。 選択された化合物でのＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、ＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅ、およびＤＨＦＲ阻害を示す表である。濃度はμＭ単位である。 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系に対する、添加されたヒポキサンチンの存在（＋）および不存在（−）下、双方におけるインビトロ細胞傷害性活性について化合物３、９〜１２、１４、１５、１７、２１、２２、２５および２６をテストした結果を示す表である。 ＡＩＣＡＲの存在下でインビトロ細胞傷害性活性につき特徴ある化合物をテストした結果を示す表である。 ２つの異なる細胞系に関してこれらの化合物が有する効力の欠如を示す２つの表である。突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＭＴＸ）は、損なわれた還元葉酸キャリアーを有することが示された。この細胞系に対する活性の欠如は、還元葉酸キャリアー輸送を有することが、類似体の生物学的活性に必須であることを示す。第二の表は、ホリルポリグルタミン酸シンターゼ（ＦＰＧＳ）を欠く突然変異体ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系（ＣＥＭ／ＦＰＧＳ^-）を示す。３および１５を含む全ての効力ある阻害剤は、この細胞系に対する細胞傷害性活性を喪失し、これは、阻害剤がそれらの生物学的活性に関してポリグルタミン化に依存することを示す。 ２つの異なる酵素、組換えヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅおよび大腸菌Ｔｆａｓｅに対する化合物の活性を示す表である。 天然補因子１０−ホルミル−ＴＨＦおよび他の阻害剤と共に、改良型ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ阻害剤１０１の構造を示す。 データ収集、およびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで調べた１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）との複合体におけるヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅの単結晶から得られたデータで用いた改良統計値を示す表である。括弧に入れた¹番号は最高解像度シェルを示す。²Ｒ_sym＝［Ｓ_h，Ｓ_i│Ｉ_i（ｈ）−＜Ｉ（ｈ）＞│／Ｓ_hＳ_iＩ_i（ｈ）］×１００、ここに、＜Ｉ（ｈ）＞は反射のＩ（ｈ）観察の平均である。³Ｒ_cryst＝Ｓ_h││Ｆ₀│−│Ｆ_c││／Ｓ_h│Ｆ₀│、ここに、Ｆ₀およびＦ_cは観察されたおよび計算された構造因子振幅である。⁴Ｒ_free（％）は、改良からランダムに省略されたデータの５％を除き³Ｒ_crystと同一である。 化合物１０１の合成で用いた工程を示す模式図である。この模式図は、図３で示された模式図と類似である。 ５つの化合物による大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、ｒｈＧＡＲ ＴｆａｓｅおよびｒｈＡＩＣＡＲ Ｔｆａｓｅの阻害を示す表である。 細胞膜を透過する損なわれた還元葉酸輸送を有する突然変異体細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭに対する選択された化合物のＩＣ₅₀を示す表である。 生理学的ｐＨ７において１０１で共結晶化されたｒｈＧＡＲ Ｔｆａｓｅの立体図である。図１８Ａは、葉酸結合部位に結合した阻害剤のより綿密な立体図である。阻害剤結合部位における阻害剤、触媒残基および秩序立った水分子は、１９Ａｎｉおけると同一の色模式図を用いてボールおよびスティックにて示す。 １０−ホルミル−ＴＤＡＦおよび基質との複合体におけるリガンドが結合していないヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ、大腸菌ＧＡＲ、Ｔｆａｓｅ、ならびに１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）との複合体におけるヒトＧＡＲ ＴｆａｓｅのＢ値の比較を示す表である。 ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ−１０−ＣＦ₃ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）相互作用の４つの別々の図である。２０Ａは、２ｓが境界である２Ｆ_o−Ｆ_c電子密度に重ねられた阻害剤１０１の最終改良モデルを示す。阻害剤およびヒトＧＡＲ Ｔａｓｅの鍵となる相互作用は、タンパク質側鎖および阻害剤の３つの部位：ジアミノピリミジノン間、トリフルオロアセチル基およびベンゾイル−グルタメートテイルの間にある。２０Ｂは、阻害剤１０１およびＧＡＲ Ｔｆａｓｅのジアミノピリミジノン環の間の相互作用を示す。潜在的水素結合を、Åで表わした距離にてダッシュ線を用いて描く。 大腸菌およびヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅとの複合体における葉酸類似体のグルタメートテイルの向きを示す図である。半透明溶媒の接近可能な表面はタンパク質のリボンダイアグラムに重ねてある。図２１Ａは、α−ポリグルタメート化形態についての好ましい立体配座を示す。示された構造は、１０−ホルミル−ＴＤＡＦおよびβ−ＧＡＲでの大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）の間の複合体構造を表わす。α−カルボキシレートが溶媒に暴露されるので、塩橋がＡｒｇ６４およびγ−カルボキシレートの間に形成される。図２１Ｂは、γ−ポリグルタメート化形態についての好ましい立体配座を示す。示された構造は、１０１とのヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ複合体を表わす。そのγ−カルボキシレートが溶媒に暴露するので、塩橋は、今や、Ａｒｇ６４およびα−カルボキシレートの間にある。 ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ葉酸−結合ループ１４１〜１４６の一連の４つの立体図である。図２２Ａは、葉酸−結合ループ１４１〜１４６の構造異性を示す。異なる大腸菌およびヒト構造からの１４１〜１４６ループは、ボールおよびスティックにて示されたＡｓｐ１４４とのヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０１複合体に重ねられている。阻害剤１０−ＣＦ３ＣＯ−ＤＤＡＣＴＨＦ（１０１）はボールおよびスティックによって表わされる。図２２Ｂは、ヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅにおける葉酸−結合ループが阻害剤１０１の結合に際して秩序立ったものとなることを示す。ループの２Ｆ_o−Ｆ_c電子密度マップは、ボールおよびスティックにおいて重ねられた改良された座標を持つ２ｓにおいて境界となる。図２２Ｃは、天然補因子葉酸とヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅとのドッキング相互作用を示す。触媒トライアッド（Ａｓｎ１０６、Ｈｉｓ１０８およびＡｓｐ１４４）は、補因子のホルミル基と非常に隣接して、ホルミル転移反応を促進する。図２２Ｄは、天然葉酸補因子とドッキングされたヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（鋳型としてのヒトＧＡＲ Ｔｆａｓｅ／１０１）および大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ（ＰＤＢ暗号１Ｃ２Ｔ）の重ね合わせを示す。双方の場合における最低エネルギークラスターは、タンパク質および補因子双方の立体配座において実質的類似性を共有する。 葉酸補因子のヒトおよび大腸菌ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ構造への計算ドッキングの表である。

Claims (7)

1. 以下の構造式：
   

   

   ［式中、
   Ｒ¹は−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ＝ＮＮＭｅ₂、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり；
   Ｒ²は−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、グルタミルおよびオリゴグルタミルよりなる群から選択される基であり、
   Ｒ³は−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、グルタミルおよびオリゴグルタミルよりなる群から選択される基であり、
   各グルタミルは、独立して、式：−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴）ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁵によって表わされ、ここに、Ｒ⁴およびＲ⁵は、各々、独立して、−ＯＨおよび−ＯｔＢｕよりなる群から選択される基であり、
   各オリゴグルタミルは少なくとも１つの末端グルタミルおよび１および４の間の非末端グルタミル残基を有し、
   各末端グルタミルは、独立して、式：−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴）ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁵によって表わされ、ここに、Ｒ⁴およびＲ⁵は、各々、独立して、−ＯＨおよび−ＯｔＢｕよりなる群から選択される基であり、
   各非末端グルタミルは、独立して、式：−ＮＨＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｒ⁶）（ＣＨ₂）₂Ｃ（Ｏ）Ｒ⁷によって表わされ、ここに、Ｒ⁶およびＲ⁷は、各々、独立して、−ＯＨ、−ＯｔＢｕ、末端グルタミルおよび非末端グルタミルよりなる群から選択される、
   但し、Ｒ⁶およびＲ⁷の少なくとも１つは末端グルタミルまたは非末端グルタミルのいずれかである」
   によって表わされる化合物。
2. 以下の構造式：
   

   

   によって表わされる請求項１に記載の化合物。
3. 以下の構造式：
   

   

   によって表わされる請求項１に記載の化合物。
4. 以下の構造式：
   

   

   ［式中、
   Ｒ⁸は−Ｃ（Ｏ）Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり、および
   Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、各々、独立して、−Ｈおよび−ｔＢｕよりなる群から選択される基である］
   によって表わされる請求項１に記載の化合物。
5. 以下の構造式：
   

   

   ［式中、
   Ｒ⁸は−Ｃ（Ｏ）Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃よりなる群から選択される基であり、および
   Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、各々、独立して、−Ｈおよび−ｔＢｕよりなる群から選択される基である］
   によって表わされる請求項１に記載の化合物。
6. グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害濃度の請求項１〜５に記載の化合物に接触させる工程を含むグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害する方法。
7. アミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害濃度の請求項１〜５に記載の化合物と接触させる工程を含むアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼを阻害する方法。
   
   

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